Téma: FYTOHORMONY Santner et al. 2009 Praktikum fyziologie rostlin
Teoretický úvod: FYTOHORMONY Rostliny se vyvíjejí jako strukturovaný, organicky vyvážený a funkčně koordinovaný celek. Vývoj rostlin je ovlivňován mnoha faktory endogenními i podmínkami vnějšího prostředí. Mezi důležité faktory vnitřní koordinace patří fytohormony. Rostlinné hormony = fytohormony jsou přirozené metabolity rostlin, které regulují jejich růst a vývoj. Fytohormony působí ve velmi nízkých koncentracích - 1 M. Molekuly fytohormonů mají signální úlohu. Dle chemické povahy molekuly, funkce a účinků tvoří fytohormony několik přirozených skupin: auxiny, cytokininy, gibereliny, etylén, kyselina abscisová, kyselina jasmonová, brassiny (obr. 1). Jednotlivé fytohormony jsou syntetizovány určitými skupinami buněk, z nichž jsou transportovány do ostatních částí rostliny. Stejné nebo podobné efekty jako fytohormony mohou vyvolat i látky, které mají podobnou stavbu molekuly jako fytohormony - deriváty a strukturní analogy, které nejsou v rostlinách syntetizovány, ale mohou signál fytohormonu simulovat. Růstové a vývojové efekty mohou vyvolat i látky, které ovlivňují hladiny fytohormonů na úrovni jejich metabolismu - biosyntézy nebo odbourávání - nebo působí na jejich transport z míst, kde jsou v rostlině syntetizovány, do míst jejich účinku. Tyto látky ovlivňují sílu signálu v pletivech, která na signál reagují. Všechny tyto látky, včetně fytohormonů, se nazývají růstové látky = růstové regulátory = morforegulátory. auxin kyselina indolyl-3-octová cytokinin - izopentenylaminopurin gibereliny kyselina giberelová kyselina abscisová Obr. 1. Nejdůležitější rostlinné hormony
Efekty růstových látek jsou pleiotropní (mají větší množství různých projevů) a jsou dány jak typem růstové látky a její koncentrací, tak charakterem, vývojovým stadiem a fyziologickým stavem orgánu, pletiva nebo buňky, které na danou látku (signál) reagují. Změny v citlivosti buněk k fytohormonům jsou důležitou součástí regulace vývojových procesů. Funkce růstových látek se studuje dvěma základními přístupy: 1. je sledována endogenní hladina fytohormonu v průběhu určitého fyziologického procesu nebo za určitých podmínek; 2. jsou sledovány účinky dodané ( exogenní = aplikované) růstové látky. Stručná charakteristika nejdůležitějších skupin fytohormonů Auxiny Nejvýznamnějším přirozeným auxinem je kyselina indolyl-3-octová (IAA). Kromě IAA existují další přirozené (např. indolyl-3-máselná kys. (IBA)) i syntetické auxiny (2,4- dichlorfenoxyoctová kys. (2,4-D), -naftyloctová kys. (NAA)). IAA je syntetizována v mladých částech prýtu (apikální meristém, vyvíjející se listy, plody a semena), odtud je transportována polárním (bazipetálním) transportem do kořenů. V kořenové špičce se směr transportu otáčí a auxin je transportován akropetálně směrem do elongační zóny kořene. V rostlině se vytváří gradienty auxinu, které regulují řadu významných procesů. Nejdůležitější fyziologické účinky auxinu: ustavení polarity embryí regulace apikální dominance (auxin transportovaný z apikální části prýtu potlačuje prorůstání úžlabních pupenů) stimulace růstu stonku a koleoptile (stimulace elongace buněk), inhibice prodlužování kořenů stimulace tvorby postraních (laterálních ) kořenů regulace gravitropismu, fototropismu (obr. 2) SVĚTLO Obr. 2 Regulace fototropismu auxin je redistribuován do zastíněné části hypokotylu, kde stimuluje růst hypokotyl se ohýbá směrem ke světlu. Vizualizace distribuce auxinu pomocí reportérového genu DR5::GUS. Převzato z Taiz a Zeiger 2002
Cytokininy Syntetizovány v kořenech (především meristém kořene), následně transportovány do prýtu. Cytokininy jsou deriváty adeninu, nejzastoupenějším přirozeným cytokininem je zeatin, ale existují i další např. izopentenylaminopurin (ip) nebo dihydrozeatin (DZ). Nejpoužívanějším syntetickým cytokininem je BAP (6-benzylaminopurin). Nejdůležitější fyziologické účinky: regulace buněčného cyklu, stimulace proliferace buněk v tkáňových kulturách stimulace růstu prýtu, inhibice růstu kořenů oddálení senescence potlačení apikální dominance nadprodukce cytokininů je zodpovědná za tvorbu nádorů u rostlin (Obr. 3). Obr. 3. Nádory na stoncích bylin (levý obr.) a čarověníky na dřevinách (pravý obr.) vznikají nadprodukcí cytokininů vlivem patogenních mikroorganismů (Agrobacterium tumefaciens nádory, Corynebacterium fascians čarověníky). Převzato z Taiz a Zeiger 2002. Gibereliny Izoprenoidní látky s významem pro dlouživý růst. Poprvé popsány u rýže infikované houbou Gibberella fujikuroi, postižené rostliny vykazovaly abnormálně intenzivní dlouživý růst prýtu. Literatura: Buchanan, B., Gruissem, W. and Jones, R. (Eds.) - Biochemistry and Molecular Biology of Plants. American Society of Plant Physiologist. 2000. Taiz, L. and Zeiger, E. Plant Physiology. Sinauer Associates, Inc., Publichers. 2002.
Zadání praktických úloh k tématu: FYTOHORMONY Přehled úloh k vypracování: Úkol 1: Fenotypové projevy aplikace růstových látek 1a) Popište a zhodnoťte efekty růstových látek na klíčení a vývoj rostlin huseníčku (Arabidopsis thaliana L.) Úkol 2: Odpověď rostlin na působení ethylenu 2a) Popište a zhodnoťte efekt ACC na růst rostlin huseníčku (Arabidopsis thaliana L.). Pozorujte rostliny vykazující konstutivní odpověď na ethylen (ctr1 mutanti). Úkol 3: Transport auxinu v kořeni 3a) Pozorujte jak je rozváděn rostlinný hormon (také morfogen) auxin v kořenech rostlin huseníčku (Arabidopsis thaliana L.)
Úkol 1: Fenotypové projevy aplikace růstových látek Cíl: Sledovat vliv externí aplikace fytohormonů na růst a vývoj rostliny. Hypotéza, kterou během práce ověříme: Rostlinné hormony regulují růst a vývoj rostlinného těla. Jejich aplikace se projeví fenotypovou nebo vývojovou změnou. Dílčí úloha: 1a) Popište a zhodnoťte efekty růstových látek na klíčení a vývoj rostlin huseníčku (Arabidopsis thaliana L.) Princip: Semena klíčí a mladé rostliny byly kultivovány na mediích s přídavkem růstových látek. Klíčení i habitus mladých rostlin je přítomnými látkami ovlivněn. Kontrolní varianta je pěstována bez přídavků fytohormonů na 0,2%MS mediu. Laboratorní postup: Potřeby: rostliny huseníčku (kultivované in-vitro 2-3 týdny) agarová media s přídavkem růstových látek IAA = kyselina indolyl-3-octová - fytohormon auxin BAP = benzylaminopurin - růstová látka cytokininového typu GA 3 = kyselina giberelová - fytohormon giberelin ABA = kyselina abscisová fytohormon petriho misky černý papír měřítko Provedení: Materiál dostanete od vedoucího praktika. Jednotlivé varianty si dobře prohlédněte. Všímejte si efektů jednotlivých růstových látek a varianty porovnejte s variantou kontrolní i mezi sebou. Pro pozorování si rostliny umístěte pomocí pinzety do petriho misky, kterou podložíte černým papírem. U každé varianty připraveného souboru sledujte tato kriteria: a) klíčivost b) délka kořenového systému (změřte měřítkem) a rozsah jeho větvení
Úkol 2: Odpověď rostlin na působení ethylenu Dílčí úloha: 2a) Popište a zhodnoťte efekt ACC na růst rostlin huseníčku (Arabidopsis thaliana L.). Pozorujte rostliny vykazující konstutivní odpověď na ethylen (ctr1 mutanti). Princip: Ethylen je stresový hormon zapojený do regulace řady procesů: zrání plodů, opad listů, odpověď rostliny na nedostatek kyslíku (tvorba aerenchymu u mokřadních rostlin), ale i dlouživý růst. Rostliny ovlivněné zvýšenou koncentrací ethylenu vykazují trpasličí vzrůst mají kratší kořeny i nadzemní část. Kořeny jsou naopak silnější a tvoří delší kořenové vlásky. Zvýšenou koncentraci ethylenu lze navodit uzavřením rostliny do nádoby se zrajícím ovocem (jablko nebo banán) nebo aplikací ACC do media. ACC (1- aminocyklopropan-1-karboxylová kyselina) je přímým prekurzorem syntézy ethylenu. Působení ethylenu v rostlině zprostředkovávají receptory ethylenu proteinkinázy ETR1 a ERS. Součástí signální dráhy je také negativní regulátor CTR1. Jeho vyřazení z provozu se projeví trvalou (konstitutivní) odpovědí rostliny na ethylen. ctr1 mutanti Arabidopsis (ctr = constitutive triple response) jsou rostliny s trpasličím vzrůstem, krátkými kořeny a bohatě vyvinutým kořenovým vlášením. Laboratorní postup: Potřeby: rostliny huseníčku Col0 (kontrolní) a ctr1 mutanti (kultivované in-vitro 2 týdny) agarová media kontrolní a s přídavkem ACC petriho misky černý papír měřítko mikroskop Provedení: Materiál dostanete od vedoucího praktika. Jednotlivé varianty si dobře prohlédněte. Všímejte si především kořenového systému a srovnejte růst rostlin kontrolních a mutantních (délka kořenů, větvení). Kořeny pozorujte pod mikroskopem a zhodnoťte rozsah tvorby kořenových vlásků. Srovnejte fenotyp kontrolních rostlin kultivovaných v přítomnosti ACC a ctr1 mutantních rostlin na mediu bez přídavku ACC. Pozorování slovně komentujte v protokolech.
Vyhodnocení experimentu: Pozorování v úkolu 1 a 2 slovně zhodnoťte. Charakterizujte fenotyp rostlin v jednotlivých variantách. Popište slovně efekty růstových látek.
Úkol 3: Transport auxinu v kořeni Cíl: Pozorovat transport endogenně přidávaného auxinu v kořeni huseníčku Hypotéza, kterou během práce ověříme: Kořen huseníčku je schopen přijímat endogenní auxin a rozvádět ho. Dílčí úlohy: 1a) Prokažte, že kořen huseníčku může přijímat exogenní syntetický auxin NAA (kyselina naftyloctová) a je schopen ho rozvádět. Princip: Dosáhněte vytčeného cíle pomocí mikroskopického sledování lokalizace genové exprese řízené auxinem v buňkách kořene mladých rostlin Arabidopsis thaliana. Rostliny jsou pro účely tohoto experimentu transformovány fúzními genovými konstrukty obsahujícími syntetický promotor (tzv. DR5) citlivý na hormon auxin (Ulmasov a kol., 1997). Tento promotor je translačně spojen s genem kódujícím enzym ß-glukuronidázu (GUS). Pouze tam, kde je dostatek auxinu se spustí exprese enzymu GUS. Aktivita GUS způsobí vytvoření modré sraženiny, pokud se přidá k rostlinám chromogenní substrát X-gluc (5-bromo-4-chloro-3- indolyl ß-D-glukuronid). V rostlinách se normálně protein GUS nevyskytuje a proto se úspěšně využívá (v translačních fúzích) pro sledování lokalizací aktivit promotorů či přímo lokalizací proteinů. Literatura: Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., and Guilfoyle, T.J. (1997). Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell 9, 1963-1971.
Laboratorní postup: Potřeby pro úlohu 3a: Semenáčky Arabidopsis thaliana DR5::GUS pěstované in vitro na pevném médiu ve vertikální orientaci. Složení kultivačního média: 1% sacharóza, 1,6% agar, 2,15g/l MS salts Sigma M5524, ph 5.7. Označení obou variant je 1 a 2, varianta s NPA může být 1 i 2. 1 M Fosfátový pufr, ph=7.2: 100 ml pufru s ph 7.2 vznikne smícháním 28 ml 1M KH 2 PO 4 a 72 ml K 2 HPO 4. Barvící roztok obsahující 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-glucuronide (X-Gluc). Složení: 0,1 M fosfátový pufr, 0,5 mm hexakyanoželezitan draselný (červená krevní sůl) K 3 [Fe(CN) 6 ], 0,5 mm hexakyanoželeznatan draselný (žlutá krevní sůl) K 4 [Fe(CN) 6 ], X- Gluc 1 mg/ml, 0,1% Tween 20. Agarózový bloček (0,5% agaróza) obsahující 10µM kyselinu naftyloctovou (NAA). 90% aceton Provedení úlohy: 1) Oddělte z agarózového bločku s NAA kousek o rozměrech cca 3x3x5 mm a přiložte ho na rozhraní hypokotylu a kořene rostlinky č.1 na vertikální agarové plotně. Oddělte další kousek přiložte ho ke špičce rostlinky č.2. Rostlinka č.3 zůstane neopůsobená a bude sloužit jako kontrola. Nechte ve vertikální poloze 2 hodiny. 2) Do komůrek barvicí destičky (máte na stole) napipetujte 1ml 90% acetonu. Rostlinky z vertikálních ploten přendejte pinzetou do 90% acetonu a nechte 15 minut fixovat v - 20 C. Nezapomeňte označit komůrky tak, aby bylo jasné, která rostlinka se v ní nachází (nejlépe čísly rostlinek). 3) Vyjměte rostlinky z acetonu a promyjte v nových komůrkách destilovanou vodou. Do vedlejších komůrek napipetujte 0,5ml barvícího roztoku. Ponechte 90 minut barvit při 37 C (v termostatu mimo praktikum). 4) Po 90 minutách barvení rostlin DR5::GUS zkontrolujte přítomnost modrého zabarvení na invertovaném mikroskopu a v případě, že je již dostatečně vidět, jej nasnímejte. 5) Vyhodnoťte svoje pozorování.
Vyhodnocení experimentu: V protokolu popište experiment svými slovy, doplňte obrazovou dokumentaci. Uveďte, jestli se liší vzor modrého zabarvení v závislosti na poloze bločku (tj. na špičce kořene a rozhraní kořen-hypokotyl).