Teoretický úvod: FOTOTROPISMUS. Praktikum fyziologie rostlin

Transkript

1 Teoretický úvod: FOTOTROPISMUS Praktikum fyziologie rostlin 1

2 Teoretický úvod: FOTOTROPISMUS Fototropismus náleží mezi vitální ohybové pohyby rostlin. Řadí se mezi pohyby paratonické povahy, tj. je vyvolán vnějším podrážděním. Tak jako další tropismy (např. gravitropismus či tigmotropismus) je i fototropismus orientován vůči stimulu, v tomto případě směru dopadajícího slunečního záření. Pozitivní fototropismus nadzemní části rostliny zprostředkovaný ohybem stonku ve směru světelného zdroje záření byl předmětem zkoumání již od antických dob, podrobněji se jím zabýval v 19. století i Charles Darwin. Směr dopadajícího světla je registrován receptory modrého světla, fototropiny. V Arabidopsis thaliana byly nalezeny dva receptory, phot1 a phot2. Významný posun v pochopení přenosu signálu o směru světleného záření vedoucí k orientovanému růstu přinesly pokusy holandského botanika F. Wenta v roce 1926, který pomocí ohybových pokusů s koleoptilemi ovsa zjistil, že za orientovaný růst je zodpovědný hormonální faktor produkovaný vzrostným vrcholem stonku, později označený jako auxin (z řec. auxein = růst). Obr. 1: Model signální kaskády vedoucí k fototropní odpovědi. Fototropiny (s doménami L1, L2 a KD) mění po stimulaci modrým světlem konformaci a fosforylací aktivují další složky signální kaskády, a to buď přímo PKS4 a ABCB19 (1 šipka) nebo nepřímo PIN, NPH3 a H + ATPáza (2 šipky). Vytvoření auxinového gradientu a reorientace mikrotubulů vedou následně k asymetrickému růstu (převzato z Fankhauser a Christie 2015). Mechanismus, který vede k laterální distribuci auxinu a tím ke stimulaci růstu na straně odvrácené od světla, není dosud plně objasněn (Obr. 1). Jsou v něm zapojeny proteiny zodpovědné za transport auxinů, tzv. PIN3 proteiny, u nichž se po změně směru osvětlení mění laterální 2

3 distribuce v endodermis etiolovaného stonku (příp. hypokotylu). Na osvícené straně je PIN3 lokalizován na vnitřní stranu endodermis, zatímco na straně odvrácené, kde se auxin akumuluje, je rovnoměrně rozmístěn na vnitřní i vnější stranu endodermis (Obr. 2). Vedle tvorby auxinového gradientu napříč stonkem (hypokotylem) hraje důležitou roli také reorganizace mikrotubulárního cytoskeletu. Výsledkem je asymetrický (anizotropní) růst ohyb stonku. Obr. 2: Model fototropní odpovědi hypokotylu. Na zastíněné straně (vlevo) je vysoká aktivita PID kinázy, která fosforyluje auxinový transportér PIN3, a tak umožňuje směřování PIN3 (červeně) na vnitřní i vnější stranu endodermálních buněk. Na osvětlené straně světelný signál (žlutě) vede k represi PID, nižší hladina fosforylace PIN3 způsobí přednostní lokalizaci na vnitřní stranu endodermis. Auxin se transportuje do míst s intenzívnější modrou barvou, kde Literatura: Ding, Zhaojun; Galvan-Ampudia, Carlos S.; Demarsy, Emilie; et al., Light-mediated polarization of the PIN3 auxin transporter for the phototropic response in Arabidopsis, NATURE CELL BIOLOGY, 13, 4, , Fankhauser, Christian; Christie, John M., Plant Phototropic Growth, CURRENT BIOLOGY, 25, 9, R384-R389, Friml, Jiří, Wisniewska, Justyna, Benková, Eva, Mendgen, Kurt, Palme, Klaus, Lateral relocation of auxin efflux regulator PIN3 mediates tropism in Arabidopsis, Nature, 415, ,

4 Zadání praktických úloh k tématu: FOTOTROPISMUS Přehled úloh k vypracování: Úkol 1: Role auxinu ve fototropickém ohybu hypokotylu rostlin 1) Lokalizujte auxinová maxima v rostlině pomocí reportérového genu (DR5::GUS) 2a) Prokažte přesun auxinu na zastíněnou stranu hypokotylu semenáčků Arabidopsis thaliana (s reportérovým genem DR5::GFP), které byly vystaveny jednostrannému osvětlení kolmo k původnímu směru růstu. 2b) Prokažte důležitost směrovaného toku auxinu v tomto procesu pomocí inhibitoru transportu auxinu z buněk, kyseliny 1-N-naftylftalamové (NPA). 4

5 Úkol 1: Role auxinu v fototropickém ohybu hypokotylu rostlin Cíl: Demonstrovat význam fytohormonu auxinu v regulaci růstu a vývoje rostliny. Hypotéza, kterou během práce ověříme: Směrovaný tok auxinu je nezbytný pro fototropickou odpověď rostliny. Nezbytnost lze prokázat s použitím specifického inhibitoru transportu auxinu, pohyb auxinu lze vizualizovat pomocí reportérových genů. Dílčí úlohy: 2) Lokalizujte auxinová maxima v rostlině pomocí reportérového genu (DR5::GUS) 2a) Prokažte přesun auxinu na zastíněnou stranu hypokotylu semenáčků Arabidopsis thaliana (s reportérovým genem DR5::GFP), které byly vystaveny jednostrannému osvětlení kolmo k původnímu směru růstu. 2b) Prokažte důležitost směrovaného toku auxinu v tomto procesu pomocí inhibitoru transportu auxinu z buněk, kyseliny 1-N-naftylftalamové (NPA). Princip: Dosáhněte obou cílů pomocí mikroskopického sledování lokalizace genové exprese řízené auxinem v pletivech hypokotylu mladých rostlin Arabidopsis thaliana. Rostliny jsou pro účely tohoto experimentu transformovány fúzními genovými konstrukty obsahujícími syntetický promotor (tzv. DR5) citlivý na hormon auxin (Ulmasov a kol., 1997). Tento promotor je buď translačně spojen s genem kódujícím zelený fluorescenční protein (GFP) (Obr. 3) anebo s genem kódujícím enzym ß-glukuronidázu (GUS) (Obr 4). Pouze tam, kde je dostatek auxinu se spustí exprese buď GFP a nebo enzymu GUS. Lokalizace GFP se dá pozorovat přímo fluorescenčním mikroskopem. Aktivita GUS naproti tomu způsobí vytvoření modré sraženiny, pokud se přidá k rostlinám chromogenní substrát X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-glucuronide). V rostlinách se normálně proteiny GFP a GUS nevyskytují a proto se oba úspěšně využívají (v translačních fúzích) pro sledování lokalizací aktivit promotorů či přímo lokalizací proteinů. Inhibitor NPA (kyselina 1-N-naftylftalamová) je znám pro svou schopnost blokovat aktivitu přenašečů auxinu z buněk, které jsou zodpovědné za přesun auxinu po jednostranném osvícení. Dle 5

6 lokalizace GFP či GUS se pokuste určit, které rostliny předložené do experimentu jsou ovlivněné NPA a které jsou kontrolní. zdroj světla zdroj světla Obr. 3: Exprese DR5::GFP v hypokotylu rostlin Arabidopsis po stimulaci jednostranným osvětlením, převzato z Ding et al. (2011). Obr. 4: Exprese DR5::GUS v hypokotylu Arabidopsis po stimulaci jednostranným osvětlením, (a) rostliny kontrolní a (b) rostliny ošetřené inhibitorem transportu auxinů (NPA), převzato z Friml et al. (2002). Laboratorní postup: Potřeby pro úlohy: Semenáčky Arabidopsis thaliana DR5::GUS pěstované in vitro na kontrolním pevném médiu 4 dny ve tmě. Semenáčky Arabidopsis thaliana DR5::GFP pěstované in vitro na kontrolním pevném médiu a na médiu s 10 µm NPA (kyselinou 1-N-naftylftalamovou). Složení kultivačního média: 1% sacharóza, 1% agar, 2,15g/l MS salts Sigma M5524, ph 5.7. Označení obou variant je 1 a 2, varianta s NPA může být 1 i 2. 1 M Fosfátový pufr, ph=7.2: 100 ml pufru s ph 7.2 vznikne smícháním 28 ml 1M KH 2 PO 4 a 72 ml K 2 HPO 4. Barvící roztok obsahující 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-glucuronide (X-Gluc). Složení: 0,1 M fosfátový pufr, 0,5 mm Hexakyanoželezitan draselný (červená krevní sůl) K 3 [Fe(CN) 6 ], 0,5 mm Hexakyanoželeznatan draselný (žlutá krevní sůl) K 4 [Fe(CN) 6 ], X-Gluc 1 mg/ml, 0,1% Tween 20. Provedení úlohy 1: 1) Pinzetou odeberte 4 semenáčky Arabidopsis thaliana DR5::GUS a přeneste je do cca 1 ml fosfátového pufru (ph 7,2) v připravených komůrkách. Do komůrek předem napipetujte pufr, aby rostlinky během manipulace nevyschly. 2) Rostliny dvakrát krátce propláchněte 1ml fosfátového pufru (odsajte stávající roztok pipetou a napipetujte nový). 6

7 3) Odsajte fosfátový pufr a pipetujte 0,5ml barvícího roztoku. Ponechte min 30 minut barvit při 37 C (lze provést ve vodní lázni nebo v sušárně). Barvící roztok připravte do mikrozkumavky smícháním (směs protřepejte na vortexu): 0,5 ml fosfátového pufru 7 µl zás. roztoku červené krevní soli 7 µl zás. roztoku žluté krevní soli 5 µl zás. roztoku X-gluc 4) Po 30 minutách barvení rostlin DR5::GUS zkontrolujte přítomnost modrého zabarvení na invertovaném mikroskopu a v případě, že je již dostatečně vidět, nasnímejte oblasti, ve kterých je patrné. Do protokolu popište, kde se v rostlině vyskytuje lokálně vyšší koncentrace auxinu. Provedení úlohy 2a a b: 1) Prohlédněte si růst semenáčků DR5::GFP v jednotlivých variantách. Etiolované rostliny v obou variantách kultivačního media byly po dobu h před začátkem praktik vystaveny jednostrannému osvětlení kolmo k původnímu směru růstu. Původní směr růstu i směr osvětlení je označen na miskách (provedl vedoucí praktika). Zhodnoťte růst rostlin v jednotlivých variantách (bez NPA x s NPA; osvětlené x neosvětlené) 2) Přeneste 4 rostliny DR5::GFP z každé varianty na mikroskopické sklíčko do kapky vody a pomocí fluorescenčního mikroskopu a připojené kamery nasnímejte fluorescenci v pletivech hypokotylu. Nezapomeňte na sklíčkách označit varianty, ze kterých jste rostliny odebírali. 3) Určete, u kterých rostlin DR5::GFP je patrný přesun GFP signálu v hypokotylu a popište, jak se projevila aplikace NPA do media. Vyhodnocení experimentu: V protokolu popište experiment svými slovy, doplňte obrazovou dokumentaci. Vysvětlete, jakým způsobem se projevila aplikace NPA na experimentální rostliny. 7

8 Zkuste odpovědět na následující otázky: Dokážete vysvětlit princip vizualizace s pomocí GFP a GUS?? Byla by změna distribuce auxinu v hypokotylu patrná, pokud bychom provedli pozorování po dalších 16h od počátku jednosměrného osvětlování? 8