Teoretický úvod: GRAVITROPISMUS. Praktikum fyziologie rostlin

Transkript

1 Teoretický úvod: GRAVITROPISMUS Praktikum fyziologie rostlin 1

2 Teoretický úvod: GRAVITROPISMUS Gravitropismus koenové špiky náleží mezi vitální ohybové pohyby rostlin. adí se mezi pohyby paratonické povahy, tj. je vyvolán vnjším podráždním. Tak jako další tropismy (nap. fototropismus i thigmotropismus) je i gravitropismu orientován vi stimulu, v tomto pípad zemské tíži. Pozitivní gravitropismus koene zprostedkovaný ohybem koenové špiky ve smru gravitaního vektoru byl pozorován již v experimentech Charlese Darwina a jeho syna Francise (1881). Tato schopnost je u rostlin dležitá pro jejich ukotvení v pd, primárn souvisí se zprostedkováním dostupnosti živin, které koeny pijímají z pdy. V celém procesu ohybu koenové špiky hrají dležitou roli statocyty, buky v centrální ásti koenové epiky obsahující statolity v podob plastid asto obsahujících pesýpavý škrob (Obr. 1). Jedním z objevitel tohoto pesýpavého škrobu byl na konci 19. století Prof. Bohumil Nmec, zakladatel ústavu, na nmž práv probíhají tato praktika. Obr. 1: Tídenní semenáek Arabidopsis thaliana rostoucí ve tm umístný na 24 h horizontáln ohýbá koenovou špiku smrem dol (a). Zvtšená ást koenové špiky (b, c) s koenovou epikou. Fialov jsou Lugolovým roztokem (trijodid draselný) oznaeny buky obsahující plastidy (amyloplasty) obsahující pesýpavý škrob, tyv. statocyty. Schematické zobrazení statocytu (d) s bunným jádrem (N), vakuolou (V), statolitovým amyloplastem (A) a endoplazmatickým retikulem (ER). Pevzato z Morita (2010). Mechanismus, kterým dochází k pedání informace od plastid se škrobem (amyloplast) pesouvajících se v koenové špice ve smru gravitaního vektoru, stále není pesn poznán. Zapojeny jsou v nm složky aktinového cytoskeletu a následná signální kaskáda vyvolávající pesun auxinového penašee PIN3 v bukách kolumely koenové epiky z pvodn spodní plazmatické membrány na pvodn laterální plazmatickou membránu. Tento pesun zpsobí, že 2

3 auxin je dopraven do povrchových pletiv na spodní stran koene a tato strana se pak prodlužuje mén než horní strana. Následkem je ohyb koene smrem dol (Obr. 2). Obr. 2: Pesun auxinu bhem gravistimulace koenové špiky semenáku Arabidopsis thaliana. Auxinový penaše PIN3 pvodn distribuuje auxin (zelená barva) picházející do koenové špiky seshora rovnomrn do obou laterálních smr. Amyloplasty se škrobem jsou též orientovány na spodní stran statocyt. Po položení koene horizontáln se pesunou jak amyloplasty, tak PIN3 na spodní stranu a auxin (zelená barva) je pumpován smrem dol (A). Po ase se koen ohýbá smrem dol. Koncentrace auxinu lze nepímo sledovat pomocí zeleného fluorescenního proteinu (GFP) pipojeného za promotorem, který je citlivý na auxin (DR5::GFP). Fluorescence GFP se po gravistimulaci jasn pesouvá na spodní stranu koene, což naznauje pesun auxinu (B). Pevzato z Michniewicz a kol. (2007). Literatura: Darwin, C. and Darwin, F. (1881). The power of movement in plants. New York: D. Appleton and Company, 1, 3, and 5 Bond Street. Michniewicz, M., Brewer, P.B., Friml, J. (2007). Polar Auxin Transport and Asymmetric Auxin Distribution Source: The Arabidopsis Book, Number 5. Published By: The American Society of Plant Biologists URL: Morita, M.T. (2010). Directional Gravity Sensing in Gravitropism. In Annual Review of Plant Biology 61, S. Merchant, W.R. Briggs, and D. Ort, eds, pp Rashotte, A.M., DeLong, A., and Muday, G.K. (2001). Genetic and chemical reductions in protein phosphatase activity alter auxin transport, gravity response, and lateral root growth. Plant Cell 13, Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., and Guilfoyle, T.J. (1997). Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell 9,

4 Zadání praktických úloh k tématu: GRAVITROPISMUS Pehled úloh k vypracování: Úkol 1: Role auxinu v gravitropickém ohybu koene rostlin 1a) Prokažte pesun auxinu na spodní ást koene semenáku Arabidopsis thaliana, který je vystaven psobení gravitaní síly kolmo na pvodní smr rstu. 1b) Prokažte dležitost smrovaného toku auxinu v tomto procesu pomocí inhibitoru transportu auxinu z bunk, kyseliny 1-N-naftylftalamové (NPA) 4

5 Úkol 1: Role auxinu v gravitropickém ohybu koene rostlin Cíl: Demonstrovat význam fytohormonu auxinu v regulaci rstu a vývoje rostliny. Hypotéza, kterou bhem práce ovíme: Smrovaný tok auxinu je nezbytný pro gravitropickou odpov rostliny. Nezbytnost lze prokázat s použitím specifického inhibitoru transportu auxinu, pohyb auxinu lze vizualizovat pomocí reportérových gen. Dílí úlohy: 1a) Prokažte pesun auxinu na spodní ást koene semenáku Arabidopsis thaliana, který je vystaven psobení gravitaní síly kolmo na pvodní smr rstu. 1b) Prokažte dležitost smrovaného toku auxinu v tomto procesu pomocí inhibitoru transportu auxinu z bunk, kyseliny 1-N-naftylftalamové (NPA). Rozhodnte, které ze dvou pedložených variant jsou kontrolní rostliny (DR5::GFP i DR5::GUS) a které jsou rostliny ovlivnné NPA. Princip: Dosáhnte obou cíl pomocí mikroskopického sledování lokalizace genové exprese ízené auxinem v bukách koenové epiky mladých rostlin Arabidopsis thaliana. Rostliny jsou pro úely tohoto experimentu transformovány fúzními genovými konstrukty obsahujícími syntetický promotor (tzv. DR5) citlivý na hormon auxin (Ulmasov a kol., 1997). Tento promotor je bu translan spojen s genem kódujícím zelený fluorescenní protein (GFP) (Obr. 2B) anebo s genem kódujícím enzym ß-glukuronidázu (GUS) (Obr 3). Pouze tam, kde je dostatek auxinu se spustí exprese bu GFP a nebo enzymu GUS. Lokalizace GFP se dá pozorovat pímo fluorescenním mikroskopem. Aktivita GUS naproti tomu zpsobí vytvoení modré sraženiny, pokud se pidá k rostlinám chromogenní substrát X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-Dglucuronide). V rostlinách se normáln proteiny GFP a GUS nevyskytují a proto se oba úspšn využívají (v translaních fúzích) pro sledování lokalizací aktivit promotor i pímo lokalizací protein. Inhibitor NPA (kyselina 1-N-naftylftalamová) je znám pro svou schopnost blokovat aktivitu penaše auxinu z bunk, které jsou zodpovdné za pesun auxinu po gravistimulaci. Dle lokalizace GFP i GUS se pokuste urit, které rostliny pedložené do experimentu jsou ovlivnné NPA a které jsou kontrolní. 5

6 !" #$" %! "& '() *' %" " & " ( % +,-./0#1)( 2 ()%"#/(( "345567# Laboratorní postup: Poteby pro úlohy 1a: Semenáky Arabidopsis thaliana DR5::GUS a DR5::GFP pstované in vitro na kontrolním pevném médiu a na médiu s 10 µm NPA (kyselinou 1-Nnaftylftalamovou). Složení kultivaního média: 1% sacharóza, 1% agar, 2,15g/l MS salts Sigma M5524, ph 5.7. Oznaení obou variant je 1 a 2, varianta s NPA mže být 1 i 2. 1 M Fosfátový pufr, ph=7.2: 100 ml pufru s ph 7.2 vznikne smícháním 28 ml 1M KH 2 PO 4 a 72 ml K 2 HPO 4. Barvící roztok obsahující 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-glucuronide (X-Gluc). Složení: 0,1 M fosfátový pufr, 0,5 mm Hexakyanoželezitan draselný (ervená krevní sl) K 3 [Fe(CN) 6 ], 0,5 mm Hexakyanoželeznatan draselný (žlutá krevní sl) K 4 [Fe(CN) 6 ], X-Gluc 1 mg/ml, 0,1% Tween % ethanol. Provedení úloh: 1) Pinzetou odeberte 4 semenáky Arabidopsis thaliana DR5::GUS a peneste je do cca 1 ml fosfátového pufru (ph 7,2) v pipravených komrkách. Komrky pedem oznate íslem varianty a napipetujte pufr, aby rostlinky bhem manipulace nevyschly. Rostlinám již byla 3-4 h ped zaátkem praktik zmnna poloha v gravitaním poli (misky byly ve vertikální poloze otoeny o 135 ). Pvodní gravitaní vektor je oznaen na miskách (provedl vedoucí praktika). Pozn: lze udlit i klasický stimul 90 (jako na obr. 1a a 2A), ale stimulace by nebyla tak rychlá jako pi výraznjším otoení o

7 2) Rostliny dvakrát krátce propláchnte 1ml fosfátového pufru (odsajte stávající roztok pipetou a napipetujte nový). 3) Odsajte fosfátový pufr a pipetujte 0,5ml barvícího roztoku do každé komrky. Ponechte 30 minut barvit pi 37 C (lze provést ve vodní lázni nebo v sušárn). Barvící roztok pipravte do falkonky smícháním (sms protepejte na vortexu): 2ml fosfátového pufru 28µl zás. roztoku ervené krevní soli 28µl zás. roztoku žluté krevní soli 20µl zás. roztoku X-gluc 4) Bhem této doby peneste rostliny 4 semenáky DR5::GFP na mikroskopické sklíko do kapky vody a pomocí fluorescenního mikroskopu a pipojené kamery nasnímejte fluorescenci v koenové špice. Nezapomete na sklíkách oznait varianty, ze kterých jste rostliny odebírali. 5) Po 30 minutách barvení rostlin DR5::GUS zkontrolujte pítomnost modrého zabarvení na invertovaném mikroskopu a v pípad, že je již dostaten vidt, jej nasnímejte. 6) Urete u kolika rostlin DR5::GFP a DR5::GUS je patrný pesun modrého zabarvení a rozhodnte, která varianta byla ovlivnna NPA. Vyhodnocení experimentu: V protokolu popište experiment svými slovy, doplte obrazovou dokumentaci. Vysvtlete, jakým zpsobem se projevila aplikace NPA na experimentální rostliny. Zkuste odpovdt na následující otázky: Dokážete vysvtlit princip vizualizace s pomocí GFP a GUS?? Byla by zmna distribuce auxinu v koenech patrná, pokud bychom provedli pozorování až následující den po zmn polohy v gravitaním poli? 7