MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie BIOLOGICKÝ PŮVOD BUNĚK CHRONICKÉ LYMFOCYTÁRNÍ LEUKÉMIE.

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie BIOLOGICKÝ PŮVOD BUNĚK CHRONICKÉ LYMFOCYTÁRNÍ LEUKÉMIE. Brno 2010 Petra Davidová

Prohlašuji, že jsem předloženou bakalářskou práci vypracovala samostatně za použití literatury uvedené v seznam literatury. Souhlasím s uložením této bakalářské práce v knihovně PřF MU v Brně, případně v jiné knihovně MU, s jejím veřejným půjčováním a využitím pro vědecké, vzdělávací nebo jiné veřejně prospěšné účely, a to za předpokladu, že převzaté informace budou řádně citovány a nebudou využívány komerčně. V Brně 10. května 2010... Petra Davidová

Bakalářskou práci jsem vypracovala v Centru molekulární biologie a genové terapie při Interní hematoonkologické klinice Fakultní nemocníce Brno. Ráda bych poděkovala své konzultantce RNDr. Jitce Malčíkové, PhD. za cenné a odborné rady a přívětivý přístup. Dále bych ráda poděkovala svému vedoucímu bakalářské práce RNDr. Lence Fajkusové, CSc. a dalším pracovníkům Centra za pomoc při zpracování.

Obsah Abstrakt...8 Úvod...9 1. Imunitní systém...10 1. 1. Základní pojmy...10 1. 2. Charakteristika imunitního systému...10 1. 3. Druhy imunitního systému...11 1. 3. 1. Nespecifický imunitní systém...11 1. 3. 2. Specifický imunitní systém...11 1. 4. Hlavní složky imunitního systému...12 1. 4. 1. Molekuly imunitního systému...12 1. 4. 1. 1. CD molekuly přítomné na povrchu lymfocytů...12 1. 4. 2. Tkáně a orgány imunitního systému...13 1. 4. 3. Buňky imunitního systému (imunocyty)...16 1. 5. Imunitní reakce založené na protilátkách...17 1. 5. 1. Protilátkové reakce vyvolané antigeny nezávislými na T lymfocytech...17 1. 5. 2. Protilátkové reakce vyvolané antigeny závislými na T lymfocytech...18 2. B lymfocyty...20 2. 1. Antigenně specifický receptor B lymfocytů...20 2. 2. Struktura imunoglobulinových řetězců...21 2. 3. Fyziologický vývoj B lymfocytů...22 2. 3. 1. Vývojová stádia B lymfocytu nezávislá na antigenu...22 2. 3. 1. 1. Sekundární přeskupování genových segmentů...25 2. 3. 2. Vývojová stádia B lymfocytu závislá na antigenu...27 2. 4. Podskupiny B lymfocytů u člověka a inbredních kmenů myší... 28 2. 4. 1. Dělení B lymfocytů u člověka... 29 2. 4. 2. Dělení B lymfocytů u inbredních kmenů myší... 29 2. 4. 3. Charakteristika jednotlivých skupin B lymfocytů... 29 2. 4. 3. 1. B-1 lymfocyty... 29 2. 4. 3. 2. B-2 lymfocyty... 30 2. 4. 3. 3. B lymfocyty marginální zóny... 30 2. 4. 3. 4. Cirkulující paměťové IgM + IgD + CD27 + B lymfocyty... 31 2. 4. 3. 5. Trazientní B lymfocyty... 32

3. Chronická lymfocytární leukémie...34 3. 1. Biologické podskupiny CLL...34 3. 2. Prognostické markery CLL...35 3. 3. Statika versus dynamika CLL...36 3. 4. Monoklonální B lymfocytóza...37 3. 5. Léčba CLL...38 4. Buněčný původ CLL...39 4. 1. Historický pohled na identifikaci CLL buněk...39 4. 2. Antigenně zkušené CLL buňky...40 4. 3. Interklonální a intraklonální rozmanitost CLL buněk...41 4. 4. B buněčný receptor CLL buněk...41 4. 5. Problém antigenní stimulace...42 4. 6. Úloha mikroprostředí...43 4. 7. Fyziologický protějšek CLL...44 4. 7. 1. Fyziologický protějšek U-CLL...44 4. 7. 1. 1. Lidský ekvivalent k B-1 lymfocytům inbredních kmenů myší...45 4. 7. 1. 2. Tranzientní B lymfocyty...45 4. 7. 2. Fyziologický protějšek M-CLL...46 4. 7. 2. 1. Folikulární paměťové B lymfocyty...46 4. 7. 3. Společný fyziologický protějšek CLL...46 4. 7. 3. 1. Cirkulující paměťové IgM + IgD + CD27 + B lymfocyty a B lymfocyty marginální zóny...47 Závěr...49 Literatura...50

Seznam zkratek Ab Ag AID APC buňka ATM BAFF protilátka (antibody) antigen aktivací indukovaná cytidin deamináza (activation-induced cytidine deaminase) antigen prezentující buňka (antigen presenting cell) gen ataxia telangiectasia mutated B-buněčný aktivační faktor (B-cell activating factor) BCL-6 gen B-buněčného lymfomu (B-cell CLL/lymphoma 6) BCR CD CDR CLL CSR FM FR GC Ig IgV H IS MBL MHC MZ B-buněčný receptor (B-cell receptor) povrchový diferenciální znak buněk (cluster of differentiation) oblast určující komplementaritu imunoglobulinu (complementarity determining region) chronická lymfocytární leukémie (chronic lymphocytic leukaemia) izotypový přesmyk (class switch recombination) folikulární plášť (folicular mantle) základní úsek imunoglobulinu, kostrová oblast (framework region) germinální centrum (germinal center) imunoglobulin (immuniglobulin) gen pro těžkéhý řetězec imunoglobulinu (immunoglobulin heavy variable region genes) imunitní systém (immune system) monoklonální B lymfocytóza (monoclonal B-cell lymphocytosis) hlavní histokompatibilní komplex (major histocompatibility complex) marginální zóna (marginal zone) RAG1/2 rekombinační aktivační geny 1/2 (recombination activating genes 1/2) SHM Tc lymfocyt somatické hypermutace (somatic hypermutation) cytotoxický T lymfocyt (cytotoxic T lymphocyte)

TD antigen Th lymfocyt TI antigen antigen závislý na T lymfocytech (thymus-dependent antigen) pomocný T lymfocyt (helper T lymphocyte) antigen nezávislý na T lymfocytech (thymus-independent antigen) TP53 gen regulující buněčný cyklus a apoptózu (tumor protein p53) V, D, J, C segmenty imunoglobulinových genů ZAP-70 δ-asociovaný protein 70 (zeta-chain (TCR) associated protein kinase 70kDa)

Abstract Chronic lymphocytic leukaemia (CLL) is the most common leukaemia in the Western world. It is characterized by the monoclonal expansion of small mature-looking B cells that accumulate in the blood, bone marrow, and lymphoid organs, and have a remarkable phenotypic homogeneity. CLL can be subdivided into two groups with distinctive clinical and biological behaviour based on presence (M-CLL) or absence (U-CLL) of somatic mutations in the variable regions of the immunoglobulin heavy chain (IgV H ) genes. Pathogenic mechanisms involve multiple external (for example, microenvironmental stimuli and antigen drive) and internal (genetic and epigenetic) events that are crucial for transformation, progression and evolution of CLL. The cellular origin of CLL is still debated. According to current knowledge, the normal B cell counterpart of CLL is deduced based on IgV H genes mutated CLL cells derive from post- GC memory B cells and unmutated CLLs most likely derive from antigen-activated B cells that acquire features of memory B cells without undergoing of somatic hypermutation process. Abstrakt Chronická lymfocytární leukémie (CLL) je nejběžnější leukémií v západním světě. Je charakteristická monoklonální expanzí malých zralých B lymfocytů s pozoruhodně homogenním fenotypem, které se hromadí v krvi, kostní dřeni a lymfatických orgánech. CLL můžeme rozdělit na případy se somaticky mutovanými (M-CLL ) nebo nemutovanými (U-CLL) geny pro těžké řetězce imunoglobulinů (IgV H ), které se liší v klinickém a biologickém chování. Do mechanismu patogeneze jsou zapojeny jak vnější faktory (podněty z mikroprostředí a setkání s antigenem), tak vnitřní faktory (genetické nebo epigenetické), které jsou klíčové pro transformaci, progresi a evoluci CLL. Buněčný prekurzor CLL buněk je stále diskutovaný. Podle současných poznatků se původ CLL buněk odvozuje na základě IgV H oblastí mutované CLL buňky vychází z post-gc buněk a nemutované CLL buňky nejpravděpodobněji vychází z antigenně-aktivovaných B lymfocytů, které získaly vlastnosti paměťových buněk bez toho, aby prodělaly proces somatických hypermutací. 8

Úvod Leukémie představují skupinu nádorových onemocnění, které se projevují zhoubnou transformací krevních buněk. Obecně se rozlišují čtyři základní typy. Podle rychlosti průběhu nemoci se dělí na akutní, resp. chronické, podle typu krvetvorných buněk na lymfocytární, resp. myeloidní. Chronická lymfocytární leukémie (CLL) je nejčastěji diagnostikovanou leukémií dospělého věku v západním světě. Vyskytuje se zejména u starších osob ve věku nad 50 let, postihuje častěji muže než ženy. V současnosti je CLL považována za nevyléčitelnou chorobu, jejíž klinický průběh je značně heterogenní. Až donedávna se předpokládalo, že B lymfocyty CLL jsou funkčně inertní, imunologicky naivní, s minimální schopností proliferace a poruchou apoptózy, v důsledku čehož dochází k jejich pasivní akumulaci. Nicméně, tato představa je nyní minulostí, a studie ukazují, že CLL buňky vychází ze zralých, imunokompetentních B lymfocytů, které se již setkaly s antigenem. V současnosti je velmi kontroverzní otázkou fyziologický protějšek CLL buněk. Některé studie odkazují na přítomnost dvou alternativních prekurzorů, a to na základě různého stupně citlivosti CLL buněk k antigenu nebo přítomnosti specifických molekul na jejich povrchu. Naopak, expresní profilování překvapivě ukázalo, že obě skupiny leukemických buněk pochází ze společného protějšku. Podobně sporné otázky panují kolem subpopulací B lymfocytů u člověka. Mnoho živočišných experimentálních modelů slouží k lepšímu pochopení fyziologického vývoje a k potenciální funkční diferenciaci jednotlivých subpopulací B lymfocytů u člověka. Jak u inbredních kmenů myší, tak i u člověka jsou důležitými kritérii pro dělení B lymfocytů anatomické umístění, charakteristický imunofenotyp na povrchu buňky, profil genové exprese a funkční vlastnosti. 9

1. Imunitní systém Imunitní systém (IS) je jeden ze základních homeostatických mechanismů zajišťující integritu organismu. Představuje difúzní, nepřesně ohraničený orgán, který se skládá z mnoha tkání, různých druhů buněk a molekul. Je součástí neuro endokrino imunitního systému a u dospělého člověka váží přibližně 1 kilogram. Jedna z hlavních funkcí imunitního systému je získávání informací z vnějšího i vnitřního prostředí, jejich zpracování a adekvátní imunitní odpověď, jejímž výsledkem je zpravidla navození imunitní reakce, při imunopatologických reakcích však vede k poškození vlastních buněk a struktur (Ferenčík et al., 2004). 1. 1. Základní pojmy Antigen (Ag) je látka, která má schopnost vyvolat specifickou imunitní odpověď - tvorbu protilátek, výkonných a regulačních buněk - a specificky reagovat s produkty této odpovědi. Nejběžnějšími antigeny jsou cizorodé látky z vnějšího prostředí (exoantigeny) a antigeny pocházející ze samotného organismu (autoantigeny). Jako superantigen se označuje exoantigen, který nespecificky vyvolá aktivaci velkého počtu lymfocytů bez ohledu na jejich antigenní specifitu. Protilátky (Ab) jsou rozpustné imunoglobuliny s vazebnou specifitou k určitému antigenu. Jsou produkovány B lymfocyty jako odpověď na stimulaci antigenem. Epitop je malá oblast antigenu, která je rozpoznávána imunitními receptory. Imunokomplexy jsou koplexy antigenu s protilátkami a komplementovými fragmenty. Antigen prezentující buňky (APC) mají schopnost pohltit antigen, rozložit ho na imunogenní fragmenty a ty prezentovat v komplexu s hlavními histokompatibilními molekulami II. třídy (MHC II. třídy) T lymfocytům. Mezi nejdůležitější APC buňky patří monocyty/makrofágy, dendritické buňky a B lymfocyty. 1. 2. Charakteristika imunitního systému Mezi základní charakteristiky imunitního systému patří především schopnost rozeznání cizích molekulárních struktur od struktur vlastních. Vlastní struktury na povrchu buněk jsou za fyziologických podmínek plně tolerovány, jen v případě vlastních, ale funkčně změněných struktur (nádorová transformace, buňky infikované viry), dochází k jejich rozložení (Ferenčík et al., 2004). Tolerance imunitního systému spočívá v odstranění nebo umlčení všech klonů z repertoáru antigenně specifických lymfocytů, které by rozeznávaly vlastní struktury. Naproti 10

tomu, cizí antigen je rozpoznán imunitním systémem a vyvolá imunitní reakci, dochází k aktivaci jednotlivých složek imunitního systému a k eliminaci antigenu. Schopnost organismu reagovat na opakované podání stejného antigenu efektivněji a rychleji, se nazývá imunologická paměť, která je význačnou vlastností antigenně-specifické části IS. Snížení zranitelnosti imunitního systému náhodnými malými poruchami je zajištěno redundancí. Neméně významné charakteristiky imunitního systému jsou amplifikace selektivní imunitní odpovědi, přesná kontrola imunitní odpovědi a také genetický polymorfismus, díky kterému je IS schopen reagovat na široké spektrum antigenů. 1. 3. Druhy imunitního systému Imunitní systém můžeme rozdělit do dvou základních skupin: nespecifická (vrozená, inátní) a specifická (získaná, adaptivní) imunita. Obě skupiny pak dále zahrnují složku humorální, která představuje různé sérové proteiny a sekretované molekuly, a buněčnou, tvořenou různými druhy buněk (Hořejší, Bartůňková, 2009). Společně, nespecifický a specifický imunitní systém poskytuje pozoruhodně efektivní obranný systém. 1. 3. 1. Nespecifický imunitní systém Nespecifické mechanismy imunitního systému jsou evolučně starší, vyskytují se v různé míře u všech mnohobuněčných organismů (Hořejší, Bartůňková, 2009). Jsou přítomny v organismu již od narození a jejich aktivita nezávisí na předchozím setkání s antigenem, mohou tedy působit ihned po styku organismu s antigenem. Jsou založeny na rozpoznání chemických struktur, které jsou přítomné na povrchu mnoha patogenů, ale nejsou přítomny na povrchu vlastních buněk. Buněčný nespecifický systém je reprezentován fagocytujícími buňkami (monocyty, makrofágy, eozinofilní a neutrofilní fagocyty), jež slouží k pohlcení, likvidaci a případně prezentaci patogenu, a buňkami NK (z angl. natural killers). Humorální nespecifický systém je tvořen komplementovým systémem, lektiny, interferony a dalšími sérovými proteiny. 1. 3. 2. Specifický imunitní systém Specifické mechanismy imunitního systému jsou evolučně mladší (známy až u obratlovců) a jsou založeny na klonálním anticipačním systému. Imunitní systém je schopen předvídat setkání s jakýmkoliv antigenem přítomností řádově desítek milionů individuálně odlišných B a T lymfocytů, které se navzájem liší v detailech svých vazebných míst antigenně specifických povrchových receptorů. Podstatou specifické imunitní reakce je vznik specifických protilátek, 11

výkonných lymfocytů a lymfocytů s imunologickou pamětí, které jsou schopné reagovat jen s antigenem, který vyvolal jejich tvorbu. Tyto reakce nepůsobí okamžitě po styku určitého antigenu s imunitním systémem, ale až v horizontu 3-4 dnů. Humorálně zprostředkovaný specifický systém zahrnuje protilátky produkované B lymfocyty. Buněčný specifický systém je založen hlavně na T lymfocytech. 1. 4. Hlavní složky imunitního systému Buňky imunitního systému vznikají v kostní dřeni, kde mnoho z nich také zraje. Poté emigrují a cirkulují volně v krvi a lymfě nebo jsou organizovány do lymfatických tkání a orgánů, které vytváří vhodné mikroprostředí pro jejich diferenciaci, stimulaci antigenem a spolupráci s různými typy buněk. Nic z toho by se neuskutečnilo bez vzájemné interakce těchto buněk s různými molekulami. 1. 4. 1. Molekuly imunitního systému Nejdůležitějšími molekulami imunitního systému jsou zejména antigenně specifické receptory na povrchu B lymfocytů (B-buněčný receptor, BCR) a T lymfocytů (T-buněčný receptor, TCR). Důležitou úlohu hrají MHC glykoproteiny I. a II. třídy (z angl. major histocompatibility complex), u člověka se označují jako HLA (z angl. human leukocyte antigens). Zatímco HLA I. třídy vystavují na buněčném povrchu peptidové fragmenty proteinů produkované buňkou, HLA II. třídy váží peptidové fragmenty exogenních antigenů pohlcených buňkou. Fc receptory (FcR) na povrchu leukocytů, případně i jiných buněk, nesou vazebná místa pro Fc domény molekul imunoglobulinů. Tyto domény představují C-koncovou část obou těžkých řetězců a vznikají jejich proteolytickým štěpením. Dalšími důležitými molekulami jsou adhezivní a kostimulační molekuly, protilátky, cytokiny a jejich receptory, složky komplementového systému a receptory nespecifického rozpoznávání (např. Toll receptor, TLR). Tyto molekuly jsou buď součástí buněčné membrány, nebo jsou secernovány různými typy buněk (Hořejší, Bartůňková, 2009). 1. 4. 1. 1. CD molekuly přítomné na povrchu leukocytů Většina molekul na povrchu leukocytů se označuje CD názvoslovným systémem. CD systém (z angl. cluster of differentiation) v současnosti definuje několik stovek CD molekul. Jedná se o soubor buněčných povrchových znaků (antigenů), podle kterých se buňky mohou zařadit do diferenciačního a vývojového stádia nebo určit typ či jinou charakteristiku (Ferenčík et al., 12

2004). Řadíme zde různorodé molekuly nebo komplexy molekul, např. receptory, signalizační a adhezivní molekuly, látky účastnící se transportních procesů nebo molekuly s enzymatickou aktivitou. 1. 4. 2. Tkáně a orgány imunitního systému Lymfatický systém je tvořen lymforetikulární tkání, která se skládá ze dvou složek. První složku představují fixní retikulární buňky (retikulocyty) hvězdicovitého tvaru, navzájem se spojující svými výběžky. Spolu s retikulárními vlákny vytváří prostorovou síť. Dalšími fixními buňkami jsou dendritické buňky a makrofágy. Druhá složka lymforetikulární tkáně vyplňuje prostory této trojrozměrné sítě. Do této skupiny řadíme volné buňky, mezi něž patří různá vývojová stádia lymfocytů, plazmatické buňky, granulocyty a volné makrofágy (histiocyty). Lymfatické (lymfoidní) orgány jsou organizované tkáně, kde vzájemné působení lymfocytů spolu s ostatními buňkami vytváří vhodné prostředí pro vývoj lymfocytu, zahájení specifických imunitních reakcí nebo pro poskytování pozitivních signálů k přežívání lymfocytů. Obecně se dělí na primární a sekundární lymfatické orgány (Janeway et al., 2001). Primární lymfatické orgány Primární (centrální) lymfatické orgány jsou představovány kostní dření a thymem. Jsou místem tvorby (hematopoézy) a dozrávání imunokompetentních buněk. Hematopoéza je proces tvorby, množení, diferenciace a uvolňování krevních elementů do periferie. Zajišťuje neustálou obnovu krevních buněk. Kostní dřeň se nachází v dřeňové dutině kostí. Je osídlena pluripotentními hematopoetickými buňkami, ze kterých regulovanou diferenciací vznikají různé typy krevních buněk. Vedle diferencujících buněk se zde nachází i imunokompetentní B a T lymfocyty, které zde vcestovaly krevním řečištěm. Kostní dřeň je nejen primárním lymfatickým orgánem ale i orgánem sekundárním. Brzlík (thymus) je endokrinní žláza produkující imunohormony, které jsou nepostradatelné při dozrávání T lymfocytů. Nachází za sternem (hrudní kostí) v dolní části krku. Velikost thymu je proměnlivá a závisí na věku, kolem puberty je největší, pak postupně dochází k involuci. Je tvořen dvěma laloky, na povrchu pokrytými vazivovým obalem. Každý lalok brzlíku je dále členěn dovnitř směřujícími přepážkami (septy) v menší laloky, které se skládají z vnější vrstvy korové (kortikální) a vnitřní vrstvy dřeňové (medulární). V kůře, která představuje přibližně 85 % hmotnosti žlázy, se nachází thymocyty, nezralé T lymfocyty v různých stádiích vývoje, dále epitelové buňky a makrofágy. 13

Dřeň se skládá hlavně z thymocytů, makrofágů a Hassalových tělísek, což jsou koncentrické vrstvy oploštělých elementů retikulárních buněk. Dochází zde k odstranění většiny autoreaktivních klonů T lymfocytů, jeden z nejdůležitějších mechanismů vzniku tolerance na vlastní antigeny. Jakmile se T lymfocyty stanou zralými, putují do sekundárních lymfoidních orgánů do oblastí závislých na thymu (parakortikální oblast lymfatických uzlin, periarteriální pochvy v bílé pulpě sleziny, Peyerovy plaky). Sekundární lymfatické orgány Sekundární (periferní) lymfatické orgány jsou místem, kde probíhají důležité fáze antigenně specifických imunitních reakcí. Poskytují signály pro nepřetržitou cirkulaci lymfocytů, vhodné mikroprostředí a probíhá zde setkání lymfocytu s antigenem. Lymfatická tkáň tvořící anatomické celky zahrnuje lymfatické uzliny a slezinu. Rozptýlené funkční celky jsou představovány slizniční lymfoidní tkání MALT (z angl. mucosal-associated lymphoid tissue), která je tvořena lymfoidními buňkami v epitelové vrstvě a v lamina propria sliznic (Ferenčík et al., 2004). Lymfatické (mízní) uzliny jsou vysoce organizované lymfoidní struktury lokalizované v místech, kde se sbíhají cévy lymfatického systému. Jejich funkcí je sběr extracelulární tekutiny (lymfy) z tkání spolu s případnými antigeny a antigen prezentujícími buňkami, čímž brání rozptýlení antigenu v těle. Lymfa se s částí lymfocytů vrací zpět do krevního řečiště. Na povrchu uzliny se nachází vazivové pouzdro, z něhož vybíhají směrem dovnitř septa. Vlastní tkáň lymfatické uzliny tvoří tři funkční oblasti: oblast kortikální, parakortikální a medulární. Na povrchu kůry se nachází marginální sinus. Nejdůležitější strukturou kortikální oblasti jsou lymfatické folikuly (uzlíky). Lymfatické folikuly jsou kulovité útvary husté lymforetikulární tkáně, které jsou přítomné nejen v lymfatických uzlinách, ale i ve slezině, Peyerových plátech a mandlích. Představují vysoce organizované mikroprostředí a pro jejich další rozvinutí je nutný antigenní stimul. Primární lymfatické uzlíky obsahují zejména zralé klidové B lymfocyty, které nebyly stimulovány antigenem. Sekundární lymfatické uzlíky charakterizují germinální (zárodečná) centra, jež vznikají po stimulaci B lymfocytu antigenem. Anatomie lymfatického folikulu je na obrázku 1. Aktivované B lymfocyty uvnitř germinálního centra proliferují a diferencují na plazmatické buňky, čímž se uzlina několikanásobně zvětší. V parakortikální oblasti se vyskytují četné postkapilární venuly s vysokým endotelem, které umožňují lymfocytům přejít přes cévní stěnu. Nachází se zde T lymfocyty a dendritické buňky. 14

Převládajícím typem buněk v medulární oblasti jsou makrofágy, dendritické buňky, plně diferencované plazmatické buňky a T lymfocyty. Obr. 1. Anatomie lymfatického folikulu v lymfatických uzlinách (Chiorazzi et al., 2005, upraveno). Slezina se nachází v břišní dutině a představuje u člověka největší lymfatický orgán. Z imunologického hlediska je funkce sleziny v podstatě stejná jako v případě lymfatických uzlin - imunitní odpověď na antigeny - jen s tím rozdílem, že lymfoidní tkáň sleziny reaguje na antigeny přicházející krevní cestou. Na povrchu sleziny se nachází vazivové pouzdro, ze kterého se do nitra orientují přepážky (trabekuly). Vnitřní část můžeme rozlišit podle dvou druhů retikulárních tkání: červená a bílá pulpa. Červená pulpa vyplňuje prostor mezi bílými pulpami a je místem erytrocytů, trombocytů, granulocytů, makrofágů, lymfocytů a plazmatických buněk. Její hlavní funkcí je likvidace starých nebo poškozených erytrocytů, slouží také jako rezervoár erytrocytů, trombocytů a granulocytů. V bílé pulpě se nachází kulatá pole lymfoidní tkáně. Kolem arteriol se vytváří periarteriolární lymfatický kruh (PALS), který představuje oblast závislou na thymu, neboť se zde vyskytují převážně T lymfocyty. Tato oblast je připojena k lymfoidním folikulům. Kolem periarteriální lymfoidní tkáně a folikulů je pás označovaný jako marginální sinus, který je obklopen marginální zónou (Janeway et al., 2001). Marginální zóna tvoří rozhraní mezi červenou a bílou pulpou a obsahuje všechny buňky nutné k zahájení imunitní reakce po rozpoznání antigenu. Peyerovy plaky jsou organizované shluky lymforetikulární tkáně nacházející se v submukóze tenkého střeva. Na povrchu jsou pokryty specializovanými epitelovými buňkami (M buňky), které umožňují transport patogenních mikroorganismů a makromolekulárních složek potravy ze 15

střevního lumen k APC buňkám a T lymfocytům, a následné stimulaci B lymfocytů. Stejně jako v případě sleziny nebo lymfatických uzlin obsahuje oblasti závislé na thymu. 1. 4. 3. Buňky imunitního systému (imunocyty) Významnou složkou imunitního systému jsou bílé krvinky (leukocyty). Všechny druhy leukocytů vychází z pluripotentních hematopoetických kmenových buněk, jejichž charakteristickou adhezivní molekulou je CD34. Nachází se v kostní dřeni a zde jsou také v malém počtu udržovány po celý život dělením. Z pluripotentních buněk vznikají regulovanou diferenciací dvě základní linie: myeloidní a lymfoidní. Z myeloidní linie vznikají monocyty cirkulující v krvi, které po přestupu do tkání diferencují na makrofágy. Dále se tvoří dendritické buňky (DC), které jsou považovány za nejúčinnější buňky prezentující antigen, a tři druhy granulocytů - neutrofily, eozinofily a bazofily. Tkáňovou formou bazofilů jsou žirné buňky (mastocyty). Granulocyty mají poměrně krátkou životnost, jejich počet se zvyšuje v době zánětu nebo infekce. Většina myeloidních buněk má schopnost fagocytózy (makrofágy, monocyty, dendritické buňky a neutrofily) a řada z nich funguje jako buňky předkládající antigen T lymfocytům, čímž se uplatňují ve specifické části imunitního systému. Důležitými zástupci myeloidní linie jsou také červené krvinky (erytrocyty) a krevní destičky (trombocyty) (Hořejší, Bartůňková, 2009). Lymfoidní linie diferencuje tři důležité buňky imunitního systému, jsou to T a B lymfocyty (buňky) a NK buňky, které jsou vývojově bližší T lymfocytům než B lymfocytům (Hořejší, Bartůňková, 2009). T lymfocyty po svém vzniku v kostní dření migrují do thymu, kde získají imunokompetenci - typické morfologické a funkční vlastnosti. Jejich základní charakteristikou je přítomnost TCR receptorů a diferenciační znaky, molekuly CD2 a CD3 na jejich povrchu. Jsou zodpovědné za specifickou buněčnou imunitu. T lymfocyty jsou heterogenní populací složenou ze dvou základních subpopulací: pomocných (Th) lymfocytů a cytotoxických (Tc) lymfocytů. Pomocné T lymfocyty rozpoznávají exogenní antigeny, naproti tomu cytotoxické T lymfocyty rozeznávají nejčastěji imunogenní peptidy z endogenního antigenu. Kromě pomocných a cytotoxických T lymfocytů existuje ještě skupina paměťových T lymfocytů (Tm). Subpopulace Th lymfocytů, jejichž charakteristickým znakem je povrchová molekula CD4, není jednotná. Rozlišují se na dvě základní podskupiny Th1 a Th2. Lymfocyty Th1 mají na svém povrchu receptor pro IL-1 a regulačně zasahují především do zánětlivých reakcí, do buňkami 16

zprostředkované imunity, usmrcují intracelulární parazity a aktivují mikrofágy. Lymfocyty Th2 secernují IL-4, IL-5, IL-6 a IL-10 a účastní se hlavně regulace protilátkové imunitní odpovědi aktivací B lymfocytů (Rosypal, 2002). Tc lymfocyty s typickou povrchovou molekulou CD8 jsou výkonné buňky specifické buněčné imunity, které mají za úkol usmrtit buňky infikované viry, buňky s nevlastními histokompatibilními antigeny a nádorově transformované buňky (Ferenčík et al., 2004). B lymfocyty představují populaci buněk, která vzniká a zároveň i získává imunokompetenci v kostní dřeni. Odpovídají za specifickou protilátkovou imunitní odpověď a patří do skupiny antigen prezentujících buněk (podrobněji viz kapitola 2). Třetí hlavní populací buněk vyvíjející se z lymfoidní linie jsou buňky NK (z angl. natural killers). Exprimují charakteristické povrchové molekuly CD16 a CD56, ale ve srovnání s předchozími dvěma skupinami nemají na svém povrchu receptor pro antigen. Uplatňují se v nespecifické buněčné imunitě (Ferenčík et al., 2004). 1. 5. Imunitní reakce založené na protilátkách Tyto imunitní reakce jsou založené na rozpoznání antigenu povrchovým antigenně specifickým receptorem B lymfocytů. Jsou známy dvě základní skupiny antigenů, které se liší svou schopností aktivovat B lymfocyty: T-nezávislé (independentní) antigeny a T-závislé (dependentní) antigeny. 1. 5. 1. Protilátkové reakce vyvolané antigeny nezávislými na T lymfocytech Antigeny nezávislé na thymu (TI) aktivují B lymfocyty přímo, bez jejich zpracování APC buňkami. Charakteristickým znakem těchto reakcí je tvorba nízkoafinitních protilátek třídy IgM. Na základě způsobu aktivace B lymfocytů je dále dělíme do dvou podskupin. První skupinu TI-1 představují zejména bakteriální lipopolysacharidy (LPS), často nazývané mitogeny B buněk. Ve vyšších koncentracích se váží na receptor B lymfocytů pro LPS, dochází k nespecifické stimulaci velkého množství B lymfocytů a produkci polyreaktivních protilátek (Hořejší, Bartůňková, 2009). Důležitý rozdíl oproti dalším skupinám antigenů je, že mohou aktivovat nezralé i zralé B buňky (Janeway et al., 2001). Polyreaktivní protilátky se vyznačují heterogenitou, vytváří se populace několika typů molekul imunoglobulinů, jejichž vazebná místa mají různou afinitu a specifitu k jednotlivým epitopům kompletního antigenu (imunogenu). Každý epitop na molekule antigenu stimuluje jen určitý klon B lymfocytů k tvorbě protilátek. 17

Druhý typ TI-2 zahrnuje skupinu antigenů, které mají typickou strukturu. Jedná se o polymery, pro něž jsou charakteristické repetitivní základní jednotky. Příkladem jsou polysacharidové antigeny (mikrobiální povrchové sacharidy v obalu opouzdřených bakterií) nebo polymerní peptidy (flagelin tvořící bičíky některých bakterií). Antigeny se zkříženě váží na BCR receptor B lymfocytů, za spolupůsobení fragmentu C3d vážící se na molekulu CD21 na povrchu B buňky, vzniká dostatečně silný aktivační signál, který vyvolá buněčné dělení a diferenciaci. Tímto způsobem mohou být stimulovány jen zralé B lymfocyty, u nezralých B lymfocytů dochází k anergii. V případě TI-2 antigenů je nezávislost na Th lymfocytech neúplná. B lymfocyty sice nevyžadují přímý kontakt s pomocnými lymfocyty, ale potřebují některé cytokiny sekretující buď T lymfocyty nebo NK buňky či jiné zdroje (Hořejší, Bartůňková, 2009; Ferenčík et al., 2004). 1. 5. 2. Protilátkové reakce vyvolané antigeny závislými na T lymfocytech Protilátkové reakce závislé na thymu (TD) jsou charakteristické tím, že probíhají ve dvou fázích, které na sebe mohou (přirozená infekce) nebo nemusí (podávání opakovaných malých dávek antigenu s vhodným časovým odstupem-imunizace) bezprostředně navazovat. První fáze se označuje jako primární, druhá jako sekundární odpověď (Hořejší, Bartůňková, 2009). Proteinové antigeny nemohou přímo aktivovat B lymfocyty k tvorbě protilátek, musí být nejprve v buňkách prezentujících antigen rozloženy na imunogenní peptidy a až v této formě v komplexu s HLA II. třídy jsou rozeznány Th lymfocyty, které mohou aktivovat příslušné B buňky. Typickým znakem této odpovědi je vznik vysokoafinitních protilátek a paměťových lymfocytů (Ferenčík et al., 2004). První setkání s antigenem vede k primární imunitní reakci, během které se vytvoří protilátky schopné blokovat infekci. Antigeny jsou obvykle zachyceny APC buňkami (zejména dendritickými buňkami). Endocytózou antigenu a jeho rozštěpením uvnitř buňky vznikají imunogenní peptidy. Ty se váží do vazebného místa glykoproteinů HLA II. třídy. Takto vzniklý komplex se přesouvá na povrch APC buňky a tím účinně prezentuje antigen Th lymfocytům. Aktivované antigen prezentující buňky se lymfatickým systémem dostávají do lymfatických uzlin, krevním systémem pak do sleziny. Jakmile se zralá APC buňka setká se specifickým prekurzorem T lymfocytu, buňka Th rozpozná pomocí svého TCR receptoru fragment peptidu v komplexu s HLA II. třídy, což zaručí první signál potřebný k aktivaci Th lymfocytu. 18

Důležitý regulační signál, kterým se brání organismus proti snadné a potenciálně nebezpečné aktivaci lymfocytu, je princip druhého signálu. Přítomnost pouze prvního signálu obvykle vede k anergii a lymfocyt se stává funkčně neaktivní nebo dokonce dochází k jeho apoptóze. Až druhý (kostimulační) signál aktivuje lymfocyt k dělení a diferenciaci do příslušné efektorové populace. Kostimulační signál vzniká interakcí kostimulační molekuly CD28 na povrchu naivního T lymfocytu a jejího ligandu CD80 nebo CD86 na povrchu APC buňky v přítomnosti IL-4. Tato interakce má za následek opakovanou proliferaci a diferenciaci na klon efektorových zralých Th2 buněk (Hořejší, Bartůňková, 2009). V tutéž dobu i B lymfocyt rozpoznává stejný antigen a vystavuje antigenní peptidy v komplexu s HLA II. třídy. Také B lymfocyty potřebují k aktivaci druhý signál. Ten vzniká po rozpoznání stimulovaných B lymfocytů aktivovanými Th2 lymfocyty, které se vážou svým ligandem CD40L na kostimulační molekulu CD40 na povrchu B lymfocytu. Interakce CD40- CD40L je klíčová. Aktivovaný B lymfocyt se množí a diferencuje na plazmatické buňky produkující protilátky, které jsou účinné především při blokování šíření infekce. Některé B lymfocyty se přemění v paměťové buňky, které buď v přímé návaznosti, nebo s časovým odstupem iniciují sekundární protilátkovou reakci. Velká část těchto buněk je roznesena oběhovým systémem do různých míst v organismu, hlavně do kostní dřeně (podrobněji viz kapitola 2). Sekretované protilátky se váží na antigeny a vytváří imunokomplexy, které jsou zachycovány na povrchu folikulárních dendritických buněk (FDC) v primárních lymfatických folikulech. FDC slouží jako antigen prezentující buňky hlavně primárně stimulovaným B lymfocytům. Imunokomplexy mohou na svém povrchu uchovávat až několik let. Sekundární fáze protilátkové reakce nastane, pokud paměťové buňky, které vznikly při primární odpovědi, rozeznají antigen na povrchu folikulárních dendritických buněk. Specifické Th lymfocyty opět poskytují pomocné signály, tím se paměťové buňky aktivují a nastává nový cyklus dělení, diferenciace a selekce. Sekundární protilátková odpověď vede k dalšímu zdokonalení afinity a efektorových vlastností B lymfocytů. 19

2. B lymfocyty Název rozmanité populace B lymfocytů byl odvozen od specifického prostředí, ve kterém se tato lymfocytární skupina buněk vyvíjí. U savců je tímto orgánem kostní dřeň, u ptáků je místem vývoje Fabriciova bursa (lat. Bursa Fabricii), odtud pojmenování B lymfocyty. Během embryonálního vývoje jsou však B buňky generovány v jiných orgánech, jsou jimi játra a slezina, až po narození je jejich vznik a vývoj omezen na kostní dřeň. Během svého vývoje prochází B lymfocyty několika vývojovými fázemi, které jsou spojeny s velkou mortalitou nepotřebných buněk. Jejich nadměrná tvorba umožňuje velmi přísný výběr v procesu negativní a pozitivní selekce, a tím i dohled nad nově generovanými B lymfocyty. Dlouhodobě přežívají jen buňky požadovaného fenotypu, které mají schopnost okamžitě uskutečnit svou specifickou funkci. Po migraci z kostní dřeně jsou B lymfocyty zaneseny krevní cestou do sekundárních lymfatických orgánů, kde osidlují B-dependentní oblasti nebo recirkulují mezi nimi a čekají na setkání se svým specifickým antigenem. 2. 1. Antigenně specifický receptor B lymfocytů B-buněčný receptor se řadí do imunoglobulinové rodiny. BCR představuje multiproteinový komplex, který se skládá z vlastního povrchového imunoglobulinu (Ig) a invariantních asociovaných signalizačních řetězců. Imunoglobulin lze rozlišit na dva těžké (H, heavy) a dva lehké (L, light) řetězce, obecně lze tuto strukturu zapsat (H 2 L 2 ) n. Těžké řetězce se díky dvaceti hydrofobním aminokyselinám v C-terminální části zakotvují do membrány B buňky. Jako přídavné řetězce se uplatňují transmembránové proteiny Igα (CD79α) a Igβ (CD79β), které jsou nekovalentně spojeny s cytoplazmatickými protein-tyrosin kinázami (PTK) skupiny Src, jenž zabezpečují signalizaci. Jejich řetězce obsahují funkčně významné tyrozinové zbytky v ITAM sekvencích (z angl. immunoreceptor tyrosine-based activation motif). Po vazbě ligandu na BCR dochází k multimerizaci receptoru a vzájemné fosforylaci k sobě přiblížených asociovaných PTK v oblasti ITAM, čímž se kinázy aktivují. Aktivované kinázy následně fosforylují další cytoplazmatické proteiny a spustí složitou signalizační kaskádu. Pokud buňka dostane i ostatní potřebné signály, dochází k transkripci řady genů. Důležitou roli v signalizaci hrají membránové signalizační mikrodomény (angl. lipid rafts), které tvoří speciální oblasti v buněčné membráně bohaté na cholesterol, glykolipidy s dlouhými nasycenými zbytky mastných kyselin, fosfolipidy (PIP 2 ) a proteinkinázy (skupiny Src, G- proteiny). Membránové mikrodomény jsou schopny dynamicky měnit složení a obsah proteinů. 20

Po navázání ligandu receptory migrují do oblastí mikrodomén a agregují zde, čímž se cytoplazmatické konce řetězců imunoreceptorových komplexů dostanou do prostředí bohatého na PTK skupiny Src, fosforylují je a spouští signalizační kaskádu (Janeway et al., 2001). 2. 2. Struktura imunoglobulinových řetězců Imunoglobuliny jsou glykoproteiny, ve kterých peptidická část tvoří většinovou složku a zabezpečuje nejdůležitější biologické vlastnosti. Těžké a lehké řetězce jsou navzájem spojeny disulfidovými můstky a nekovalentními vazbami, čímž vytváří dvoustranně symetrickou strukturu. Jednotlivé řetězce imunoglobulinů jsou tvořeny několika prostorovými doménami, jež obsahují přibližně 100-120 aminokyselinových zbytků a jsou stabilizovány disulfidovou vazbou. První doména od N-konce polypeptidového lehkého (V L ) i těžkého (V C ) řetězce je variabilní. Variabilní oblast polypeptidu každého z řetězců je složena ze tří hypervariabilních úseků nebo také oblastí určující komplementaritu (CDR, z angl. complementarity determining region) a čtyř kostrových oblastí (FR, z angl. framework region). Hypervariabilní úseky jsou v primární struktuře velmi proměnlivé a tím podmiňují specifitu vůči antigenu, zatímco FR oblasti jsou úseky základní struktury, které jsou poměrně konzervativní (Rosypal, 2002). Ostatní domény směrem k C-konci řetězce jsou konstantní. Lehké řetězce molekul imunoglobulinů se skládají ze dvou domén. Variabilní (V L ) a konstantní (C L ) domény. Celkově L řetězec obsahuje přibližně 215 aminokyselinových zbytků a jeho molekulová hmotnost je asi 25 kda. Existují dva druhy lehkých řetězců: kappa κ a lambda λ, lišící se primární strukturou konstantních domén. Poměr výskytu řetězců κ: λ je pro konkrétní druh typický. Oba identické těžké řetězce jsou k sobě kovalentně připojeny pomocí disulfidových můstků v pantové oblasti imunoglobulinu. Těžké řetězce imunoglobulinu se skládají z jedné variabilní a 3-4 konstantních domén. Podle primární struktury jejich konstantních domén se dělí do pěti tříd (izotypů) IgM, IgD, IgG, IgA a IgE. Těžké řetězce se buď skládají z celkového počtu čtyř domén (V H, C H1, C H2 a C H3 ) u tříd IgG, IgA a IgD nebo pěti domén (V H, C H1, C H2, C H3 a C H4 ) u tříd IgM a IgE. Přibližná molekulová hmotnost H řetězce je mezi 50-75 kda, v závislosti na konkrétní izotypové třídě (Hořejší, Bartůňková, 2009). Struktura imunoglobulinu je schématicky zobrazena na obrázku 2. 21

Obr. 2. Schéma struktury imunoglobulinu. 2. 3. Fyziologický vývoj B lymfocytů Fyziologický vývoj B lymfocytů začíná u hematopoetické kmenové buňky v kostní dřeni, ze které regulovanou diferenciací vzniká celá populace B lymfocytů. Obecně lze rozdělit vývoj B lymfocytů na dvě hlavní fáze: první fáze je nezávislá na přítomnosti antigenu a dochází k tvorbě funkčního BCR, druhá fáze už je závislá na přítomnosti antigenu a B buňka podstupuje další vývojové změny, které vedou k tvorbě protilátek eliminujících antigen. Schématický přehled fyziologického vývoje B lymfocytu je na obrázku 4. 2. 3. 1. Vývojová stádia B lymfocytu nezávislá na antigenu Vývoj B lymfocytu je zahájen procesem primární přeskupování (rearrangement) genových segmentů (subgenů), který podle vývojového programu organismu vytváří strukturní geny kódující primární strukturu těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinu. Konečná sestava genu je výsledkem kombinace genových segmentů a je základním zdrojem rozmanitosti BCR. U člověka jsou sestavy subgenů pro H řetězce imunoglobulinu umístěny na chromozomu 14, geny kódující L řetězci imunoglobulinů jsou lokalizovány v genovém komplexu na chromozomu 22 v případě řetězce λ a na chromozomu 2 pro řetězec κ (Rosypal, 2002). Komplex subgenů kódující těžký řetězec imuniglobulinů u člověka obsahuje na svém 5 konci přibližně 51 sekvenčně podobných úseků V (variability), pak následuje skupina asi 27 úseků D (diversity), dále skupina 6 úseků J (joining) a na 3 konci jsou v tandemu uspořádány C (constant) segmenty kódující celou konstantní část konkrétního typu imunoglobulinového 22

řetězce. Na koncích V, D a J segmentů se nachází rekombinační signální sekvence (RSS), nutné pro enzymy provádějící V(D)J rekombinaci. Mezi jednotlivými C segmenty μ (kóduje izotyp IgM), δ (IgD), α (u člověka významné subtypy α 1 a α 2 kódující IgA), γ (subtypy γ 1 -γ 4 kódující IgG) a ε (IgE) - jsou přesmykové (switch) sekvence, důležité pro enzymy uskutečňující izotypový přesmyk. Struktura genových komplexů, které kódují oba lehké řetězce je obdobná, ale jednodušší, protože se skládá z menšího počtu V a J segmentů a neobsahuje úseky D (Rosypal, 2002). Za proces přeskupování subgenů je zodpovědný rekombinázový komplex tvořený dvěma proteiny, RAG1/2 (z angl. Recombination Activating Genes). Jakmile komplex enzymů rozpozná signální rekombinační sekvence, štěpí DNA, což vede k deleci úseků mezi V a J segmenty u lehkého řetězce a D-J a V-D úseků u těžkého řetězce. Konce vzniklé štěpením při spojování vybraných segmentů V L J L, V H D H a D H J H se označují jako kódující konce. Po spojení kódujících konců se vytváří kódující spoj, jehož podstatou je nepřesnost tvorby. Nukleotidová sekvence spoje je výsledkem zařazování P a N-nukleotidů. P-nukleotidy vytváří palindromatické oblasti, zatímco enzym terminální deoxyribonukleotidyltransferázy (TdT) zařazuje do kódujících spojů N-nukleotidy zcela náhodně bez matrice. Důsledkem zařazování N-nukleotidů do spojů může být neproduktivní přeskupení subgenů, kdy dochází k přerušení čtecího rámce, což se projeví ve ztrátě funkce imunoglobulinu. Je-li přeskupení genových segmentů produktivní, pak kódující spoj tvoří souvislý čtecí rámec, Ig řetězec je zcela funkční a nastane alelická exkluze, jejímž výsledkem je zastavení přeskupování subgenů na druhém chromozomu. Tento děj později proběhne i v případě genů pro IgL. Jelikož Cμ subgen je nejblíže přeskupenému produktu, vzniká těžký řetězec μ. Jakmile započne první fáze přeskupování genových segmentů, nachází se B buňka ve stádiu raného progenitoru B lymfocytu (pro-b). Nejprve dochází k D-J přeskupení probíhající paralelně na obou chromozomech, jenž má za následek vyštěpení úseku genového komplexu IgH mezi některým D a J segmentem. Následně pokračuje V-DJ přeskupení za delece obsáhlého úseku mezi náhodným V a vzniklým DJ segmentem. V této fázi se B buňka nachází ve stádiu pozdního pro-b lymfocytu. V okamžiku, kdy je pro-b lymfocyt schopen vytvořit aktivní μ řetězec, stává se B buňka velkým pre-b (pre-bi) lymfocytem a aktivita TdT se vypíná. V této fázi se syntetizuje H řetězec μ spolu s náhradním lehkým řetězcem (ψl), který se skládá z proteinů VpreB a λ5. Komplex μ řetězce, ψl řetězce a heterodimeru Igα/Igβ je integrován do membránových signalizačních mikrodomén velkého pre-b lymfocytu a označuje se jako pre-b receptor. 23

Podstatné je, že signalizace prostřednictvím pre-bcr je nezbytná pro potlačení VDJ rekombinace a zavedení alelické exkluze do lokusu pro těžký řetězec. Vyhovující pre-bcr tak signaluje pozitivní selekci a buněčné dělení (Constantinescu, Schlissel, 1997). Přeskupování genových segmentů pro lehký řetězec nastává ve fázi malého pre-b (pre-bii) lymfocytu. Nejprve dochází k přeskupování genů pro κ řetězec na obou chromozomech. Pokud není VJ rekombinace tohoto řetězce úspěšná, zahájí se stejné přeskupování genů pro řetězec λ. Současně se tvoří i cytoplazmatický μ řetězec. Pokud vznikne kompatibilní L a H řetězec, na povrchu B buňky se vystaví funkční IgM a buňka se stává nezralým B lymfocytem. Mezi Cμ a Cδ subgeny není přesmyková sekvence, tyto subgeny končí na různých polyadenylačních signálech. Prodlouženou transkripcí a následným alternativním sestřihem vzniká těžký δ řetězec, který se sdružuje s L řetězcem κ nebo λ. Vytvoří se povrchový IgD a buňka se stává zralým B lymfocytem, pro něhož jsou charakteristické dva receptory pro stejný antigen. Mechanismus primární VDJ rekombinace je zobrazen na obrázku 3. Obr. 3. Mechanismus primárního přeskupování genových segmentů pro těžký řetězec imunoglobinu probíhající v kostní dřeni u B lymfocytů. Nejprve v zárodečné sekvenci dochází k deleci rozsáhlého úseku mezi náhodně vybranými D a J genovými segmenty. Následuje V-DJ přeskupení, ve kterém se deletuje úsek mezi V a nově vzniklými DJ subgeny. Oba tyto procesy nastávají ve fázi pro-b lymfocytu. Jakmile B buňka syntetizuje μ těžký řetězec, který se spojí s náhradním lehkým řetězcem, B lymfocyt exprimuje se na svém povrchu pre-bcr a stává se pre-b lymfocytem. Pokud také úspěšně ukončí V-J přeskupení lehkého řetězce a vystaví na svém povrchu funkční BCR, stává se nezralým B lymfocytem (Chiorazzi et al., 2005, upraveno). 24

Jakmile B lymfocyt opustí mikroprostředí kostní dřeně, stává se tranzientním B lymfocytem. Takový lymfocyt migruje do periferních lymfoidních orgánů, kde jeho vývoj pokračuje přes další přechodná stádia charakterizovaná specifickými vývojovými markery. 2. 3. 1. 1. Sekundární přeskupování genových segmentů Přeskupování genových segmentů pro L i H řetězce je proces náhodný, a tak může docházet k tvorbě autoreaktivních receptorů. B lymfocyty musí při svém vývoji absolvovat několik pozitivních a negativních selekčních kontrolních bodů, aby se otestovala způsobilost nově vzniklého receptoru a zajistila se tvorba zralých B buněk s funkčně kompetentním neautoimunitním repertoárem. Nedávné imunologické modely udávají, že pokud se B buňce nepodaří naplnit oba tyto požadavky, přeruší svůj vývoj a podstoupí apoptózu v kostní dřeni. Naproti tomu, několik studií ukazuje, že pro B buňky exprimující na svém povrchu defektní a/nebo autoreaktivní receptor existuje alternativní záchranná cesta. Tímto mechanismem je úprava receptoru nebo také sekundární přeskupování genových segmentů (receptor editing). Sekundární V(D)J rekombinace mění zárodečnou sestavu a byla prokázána jak u subgenů pro H řetězec, tak u subgenů pro řetězec L, ačkoliv mechanismus je odlišný. V obou případech tento proces vyžaduje nepřetržitou expresi enzymů RAG1/2 a přispívá k pozitivní a negativní selekci během B lymfopoézy (Edry, Melamed, 2004). Úprava těžkého řetězce BCR při negativní selekci Jedním z mechanismů sekundárního přeskupování subgenů na lokusu pro H řetězec je výměna V H segmentů, studovaná na modelech myší. Sekundární přeskupení vyštěpí úsek stávajících V H segmentů a to jak na neproduktivní tak i na produktivní alele. Protože vystavení pre-b receptoru na povrchu buňky a jím zprostředkovaná signalizace jsou klíčové pro pozitivní selekci pozdního pro-b lymfocytu, musí tato výměna nastat ve fázi pro-b lymfocytu, kdy genové segmenty pro L řetězec jsou stále v zárodečné sestavě. Tato skutečnost je potvrzena i několika studiemi, které dokazují, že při sekundární rekombinaci mezi V H a VDJ segmenty se zařazují nové N- nukleotidy. Podnětem pro zahájení tohoto procesu je neschopnost vytvořeného μ řetězce párovat se s náhradním lehkým řetězcem (Edry, Melamed, 2004; ten Boekel et al., 1997). Alternativní možností je tvorba rozmanitějších pre-b receptorů, což přispívá k intraklonalní rozmanitosti B lymfocytů (Zhang et al., 2003). Jiným způsobem úpravy nevhodného primárního přeskupení D a J subgenů těžkého řetězce je sekundární přeskupení D H J H. Genový komplex D H J H kóduje Dμ protein, který se páruje s ψl řetězcem a přenáší signály nezbytné pro negativní selekci a zastavení vývoje B buňky. V případě 25

nefunkčnosti Dμ je pravděpodobné, že dojde k výměně přeskupeného segmentu kódující tento protein (Edry, Melamed, 2004). Úprava lehkého řetězce BCR při negativní selekci Ve stádiu nezralého BCR + B lymfocytu reagují buňky s vlastními antigeny kostní dřeně (např. MHC I. třídy, DNA, erytrocyty) a čelí přísnému procesu negativní selekce eliminující škodlivé autoreaktivní klony. Existují tři mechanismy zamezující autoreaktivitě: úprava receptoru, apoptóza a anergie (Wang et al., 2007; Edry, Melamed, 2004). Podle současných studií je právě sekundární V L J L rekombinace převládajícím mechanismem negativní selekce (Wang et al., 2007). Ačkoliv exprese IgM na povrchu lymfocytu by měla být signálem pro alelickou exkluzi na homologním chromozomu kódující L řetězec, nedávné studie odhalily, že opak je pravdou. V L J L rekombinace může pokračovat a tím nahradit existující genový komplex VκJκ novým přeskupenímci na druhé κ alele nebo na λ lokusu (Constantinescu, Schlissel, 1997; Edry, Melamed, 2004). Důležitou úlohu hraje mikroprostředí kostní dřeně, které podporuje úpravu receptoru a tím chrání nezralé B lymfocyty od programované buněčné smrti, jak bylo demonstrováno na modelech myší (Sandel, Monroe, 1999; Sandel et al., 2001). Modely Ig-transgenních myší vystavující na svém povrchu autoreaktivní BCR, který váže s vysokou afinitou autoantigeny v primárních lymfoidních orgánech, spouští vysokoafinitní B buněčnou signalizaci, což vede k okamžité apoptóze autoreaktivní buňky (Melchers, 2006). Předpokládá se, že nízkoafinitní autoreaktivní B lymfocyty přítomné v Ig-transgenních myších, které nejsou schopné vyvolat okamžitou apoptózu, se dostávají do stavu anergie. Bylo prokázáno, že anergické B lymfocyty vyžadují permanentní přítomnost autoantigenů, pokud mají přetrvat v tomto stavu. Odstranění autoantigenních vlivů mění tyto buňky na naivní B lymfocyty (Melchers, 2006). Osud autoreaktivních buněk může být ovlivněn lokální hladinou BAFF (B cell activating factor), neboť zvýšená hladina BAFF podporuje přežití a diferenciaci autoreaktivních anergických buněk. Významná skupina slezinných anergických autoreaktivních klonů byla identifikována jako tranzientní T3 populace nezralých B lymfocytů (z angl. transitional) vyskytující se u Ig-transgenních myší (Allman, Pillai, 2008). Úprava BCR při pozitivní selekci Dozrávání B buněk je omezeno také procesem pozitivní selekce. Pozitivní selekční signály jsou přenášeny B buněčným receptorem a jeho signálními komponentami. Správné poskládání a exprese oligomerního BCR vyvolá určitou bazální fosforylaci, která je vyžadována pro pozitivní selekci. Výsledkem dynamické rovnováhy mezi pozitivními a negativními signálními regulačními molekulami jsou tonické signály. Signály, které jsou příliš silné nebo naopak příliš 26

slabé zablokují vývoj a aktivují úpravu receptoru, zatímco přiměřené signály podporují pozitivní selekci B buňky (Edry, Melamed, 2004). 2. 3. 2. Vývojová stádia B lymfocytu závislá na antigenu Klíčovou událostí ve vývoji B lymfocytu při humorální imunitní reakci závislé na T lymfocytech je setkání se specifickým antigenem, jenž vyvolá aktivaci naivních folikulárních B lymfocytů (B-2). Subpopulace B-2 buněk se nachází uvnitř folikulů sleziny, lymfatických uzlin, Peyerových plátů a mandlí. Další vývoj B lymfocytu je závislý na afinitě BCR receptoru a v nedávné době byl navržen model, podle nějž existují tři vývojové cesty, kterými se může oligoklonální skupina aktivovaných B buněk vydat (Benson et al., 2007) Okamžitou lokální produkci protilátek poskytují ty B lymfocyty vystavující na svém povrchu vysokoafinitní BCR. Osud buňky se vyvíjí extrafolikulární cestou vedoucí k tvorbě krátce žijících plazmatických buněk poskytující počáteční ochranu organismu (Benson et al., 2007). Pokud je vazba povrchového imunoglobulinu k antigenu nízkoafinitní nebo průměrná, dostává buňka signál pro tvorbu sekundárních lymfoidních folikulů se zárodečnými centry, kde dochází ke germinální (GC) reakci (Benson et al., 2007). Germinální reakce je charakteristická masivní klonální expanzí a dvěma důležitými mutačními a selekčními procesy: somatickou hypermutací (SHM, z angl. somatic hypermutation) a izotypovým přesmykem (CSR, z angl. class switched recombination). SHM a CSR vyžaduje přítomnost enzymu aktivací indukovaná cytidin deamináza (AID), jehož exprese je specifická pro B lymfocyty nacházející se v germinálních centrech. N-terminální doména proteinu AID je zodpovědná za SHM, zatímco C-terminální doména je klíčová pro CSR (Marantidou et al., 2010). Somatické hypermutace probíhají ve fázi centroblastu ve tmavé zóně germinálního centra a předchází izotopovému přesmyku. Selekcí hypermutovaných genů variabilní oblasti imunoglobulinového receptoru vzniká populace B buněk, která vykazuje vyšší afinitu k antigenu, jenž vyvolal aktivaci B lymfocytu. Mutované B lymfocyty vstupují do tmavé zóny GC a stávají se z nich centrocyty, které podstupují CSR. Izotypový přesmyk nevratně vyštěpuje konstantní segmenty v oblasti IgH lokusu, což vede k náhradě stávajících imunoglobulinových izotypů IgM a IgD za další Ig třídy (IgG, IgA, IgE) s odlišnými efektorovými vlastnostmi. Centrocyty soutěží o antigeny na povrchu folikulárních dendritických buněk (FDC) a o folikulární pomocné T lymfocyty (Tfh). B lymfocyty germinálního centra intenzivně migrují mezi tmavou a světlou zónou. Přežívají jen ty B buňky, jejíchž nově syntetizovaný receptor vykazuje zvýšenou specifitu ve srovnání s ostatními. Centrocyty s nežádoucími mutacemi obvykle postoupí apoptózu. Výsledkem neúspěšné 27