Buněčné kultury Primární kultury - odvozené přímo z excise tkáně buněčné linie z různých organizmů, tkání explantované kultury jednobuněčné suspense lze je udržovat jen po omezenou dobu během kultivace ztrácejí diferenciační charakteristiky, které mají in vivo
Kontinuální kultury jednobuněčný typ kultury Buněčné kultury jsou udržované pasážováním limitovaný počet pasáží (přibližně 30 50, replikativní senescence) diploidní počet chromosomů, určitý stupeň diferenciace pasážovatelné bez omezení transformované (nádorové buňky) odvozené z nádorových tkání klinických případů transformované virovým onkogenem, chemickým kancerogenem.
Buněčné kultury Závislost na tkáni, ze které byly získané suspense, monolayer Suspensní forma leukemie, lymfomy Monolayer růst na podložce; buňky k sobě přiléhají fibroblasty, solidní nádory (viz monolayer HeLa buněk / karcinom děložního čípku pasážované více než 50 let) Monolayer
Buněčné kultury Kultivace normálních buněk Kontaktní inhibice Omezený počet generací Typické antigenní determinenty Aerobní metabolismus Nutnost růstových faktorů v mediu Diploidní počet chromosomů Specifický buněčný tvar Kultivace nádorových buněk Ztráta kontaktní inhibice Neomezený růst kultura je nesmrtelná Změny v povrchových antigenech (MHC, TSTA, fetální antigeny ) Anaerobní metabolismus Nízké nároky na růstové faktory v kultivačním mediu Změněný počet chromosomů
Kultivace buněk Sterilní podmínky Nutriční požadavky Definované typy medií dostupné komerčně Balancovaný roztok anorganických solí - obohaceno karbohydráty, vitaminy, proteiny a peptidy, lipidy a mastnými kyselinami, stopové prvky, serum Ph 7.2 7.4 (7.0-7.7), pufrovaný systém (indikátor bikarbonát): CO 2, atmosféra: 5-10% CO 2 chemicky (HEPES) nepotřebují CO 2 atmosféru Teplota Uchovávání zmrazení (méně než 135 o C tekutý nitrogen), kryoprotektiva
Cytogenetické vyšetření Lymfocyty Fibroblasty Buňky kostní dřeně Trofoblasty Buňky plodu izolované z amniové tekutiny Nádorové buňky..
TKÁŇOVÉ (buněčné) KULTURY Práce ve sterilním prostředí
TKÁŇOVÉ KULTURY Kultivace buněk v definovaném prostředí
HeLa buňky Proliferující buňky - monolyer Zánik kultivovaných buněk - apoptóza
Metoda FISH FISH spojení postupů klasické cytogenetiky a technologie molekulární genetiky jednovláknová (denaturovaná) sonda DNA vazba k cílové sekvenci na principu komplementarity použití v interfázi i mitóze sonda označena fluorochromem (Texas Red, FITC ) sondy centromerické alfa satelitní sekvence DNA přítomné v oblasti centromery (počet chromosomů) sondy lokus-specifické váží se na vybraný lokus (mikrodelece, translokace) sondy malovací (celochromosomové) směs fragmentů DNA konkrétního chromosomu, nelze použít v interfázi, pouze v metafázi (strukturní aberace inserce, translokace, marker chromosomy, ring-chromosomy)
Karyotyp norma, G-pruhování
FISH mnohobarevné pruhování
Sarkom kosterního svalu-hypotetraploidie okrouhlé až vřetenovité maligní buňky mitoticky aktivní
Multispektrální analýza - cytogenetická metoda využívající přístupy molekulární genetiky Přesná identifikace každého chromosomu, chromosomových párů původ rekombinovaných chromosomů, které se často nacházejí v nádorových buňkách zpracování vyžaduje použití několika technik založených na poznatcích fyziky, chemie (Fourierova spektroskopie) přístrojové vybavení - zařízení pro zobrazení spektra barev vybuzeného elektrickým nábojem, optický mikroskop
SPEKTRÁLNÍ KARYOTYPOVÁNÍ (a) Normální lidský karyotyp - každý chromosom má odlišné zbarvení. (b) Spektrální karyotypování chromosomů otce a dítěte s mentální retardací. Translokace mezi chromosomem 1 a 11. (c) ataxia (postižení svalů), translokace mezi chromosomy 4 a 12. (d) Náhodné chromosomální přestavby v buňkách nádoru prsu.
Chromosomální přestavby v buňkách nádoru Nádorové buňky mívají změněný počet a strukturu chromosomů Heteroploidní, pseudodiploidní počet chromosomů Chromosomální přestavby - delece, translokace, marker chromosomy, ring chromosomy, isochromosomy.. Změny v karyotypu náhodné, nenáhodné
Nádor plic mnohočetné náhodné přestavby
Náhodné chromosomální přestavby - nádor prsu Vyšetření chromosomů buněk nádoru prsu mnohočetné náhodné strukturní přestavby Karyotyp charakterizuje závažnost onemocnění, naznačuje prognózu, je vodítkem pro volbu terapie
Nenáhodné chromosomální přestavby v buňkách nádoru prsu Metoda FISH Protoonkogen Her-neu kóduje receptor pro epidermální růstový faktor s tyrosinkinasovou aktivitou amplifikace Her-neu Prognostický a diagnostický marker u karcinomů prsu i dalších nádorů (např. nádory močového měchýře) Centromera zeleně Her-neu - červeně
N-myc - neuroblastom Amplifikace sekvence DNA a) homogenně zbarvené oblasti (HSR) b) samostatné útvary - double minutes diagnostický a prognostický marker rodina protoonkogenů myc (virus myeloblastózy kuřat) N-myc neuroblastom L-myc malobuněčné karcinomy plic
Rodina protoonkogenů myc Rodina protoonkogenů myc regulace buněčného cyklu - geny časné odpovědi aktivace např. růstovými faktory amplifikace genu nenáhodná změna (kvantitativní změna zvýšené množství produktu) Kontaktní inhibice Růstové faktory
Nenáhodná chromosomální přestavba malobuněčný karcinom plic Diagnostika metodou FISH Mnohočetné kopie protoonkogenu L- myc Nepříznivá prognóza Mnohonásobná amplifikace tvoří oblak, jednotlivé signály jsou nesnadno detekovatelné
Chronická a akutní myeloidní leukemie Chromosomální diagnostika Molekulární diagnostika Detekce BCR-ABL fuzního genu a jeho transkriptu
Chronická myelogenní leukemie (CML) Filadelfský chromosom (Ph)
Filadelfský chromosom
Filadelfský chromosom Filadelfský (Ph) chromosom - reciproká translokace mezi chromosomem 9 a 22 Nenáhodný cytogenetický marker u 90% případů chronické myeloidní leukemie (CML) a u 5-20%případů akutní lymfocitární leukemie (ALL) 5% Ph negativních pacientů - cryptický fuzní gen BCR-ABL detekovatelný metodami molekulární genetiky 2.5% CML pacientů - negativní pro Ph chromosom i pro BCR-ABL fuzní gen Translokace - fuzní gen BCR-ABL, zlom v BCR ("breakpoint cluster region") genu na chromosomu 22 a ABL (Abelson onkogen) genu na chromosomu 9 Produkt fuzního genu je protein 210 kd, má transformační schopnosti
Burkittův lymfom
Burkittův lymfom translokace [der(8;14), der(2;8), der(8;22)] Translokace protoonkogenu myc do oblasti s vysoce aktivním promotorem
Translokace protoonkogenu c-myc [der(8;14)]
Genetický čip DNA čip - 1.5 x 1.5 cm křemíková nosná destička s mřížkou (v plastové kazetě) Uměle syntetizované krátké jednovláknové řetězce DNA o známé sekvenci nukleotidů (oligonukleotidové próby); až několik milionů Analyzovaný vzorek jednořetězcové DNA označené fluorescenčním barvivem Snímání skenerem, počítačová analýza Testování aktivity genů (intenzita záření jednotlivých prób po hybridizaci) Využití: genetika, farmakologie, imunologie, mikrobiologie (genové profily virů a bakterií)
DNA čipy - microarrays Moderní metoda analýzy DNA v několika lokusech současně Genové čipy obsahují velké množství sond, které hybridizují s různými oblastmi genomu Využití nanotechnologií manipulace se vzorky probíhá převážně roboticky a vyhodnocení je softwarové Klony DNA Testovaný vzorek Referenční vzorek Reverzní transkripce PCR amplifikace Purifikace Fluorescenční barvivo Hybridizace na mikrodestičce Počítačová analýza