PŘÍPRAVA, FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ VLASTNOSTI A VYUŽITÍ NANOČÁSTIC V BIOANALÝZE PREPARATION, PHYSICO-CHEMICAL PROPERTIES AND APLLICATION OF NANOPARTICLES IN BIOANALYSES Svobodová Ivona, Hezinová Věra, Lišková Marcela, Přikryl Jan, Maděránková Denisa, Klepárník Karel a Foret František Ústav analytické chemie AV ČR, v.v.i., Veveří 97, 602 00 Brno, ČR, svobodova@iach.cz Abstrakt Nanočástice jsou definovány jako struktury, u nichž nejméně jeden rozměr nepřesahuje velikost jednotek až stovek nanometrů. Nejčastěji studované a používané nanočástice jsou magnetické nanočástice, kovové nanočástice (např. Au, Ag, Ni) a polovodičové nanokrystaly. Polovodičové nanočástice, známé též jako kvantové tečky, jsou používány jako luminiscenční značky v analytické chemii, molekulární biologii a medicíně. Jsou tvořeny polovodičovým jádrem tvořeným kombinací prvků II. a VI. nebo III. a V. skupiny, které může být stabilizováno obalem (např. CdS, ZnS). Ve vodě rozpustné tečky jsou modifikovány polárními molekulami kovalentně vázanými na jejich povrchu. Připravili jsme řadu nanočástic na bázi CdTe o velikosti 2,5 až 5,2 nm a vlnové délce fluorescenčního emisního maxima 500 až 750 nm. V prezentaci budou ukázány charakteristické parametry: excitační a emisní fluorescenční spektra, doba života fluorescence, kvantový výtěžek fluorescence, separace pomocí kapilární elektroforézy s detekcí laserem indukované fluorescence, snímky z transmisní elektronové mikroskopie a velikosti nanočástic změřené ve formě aerosolu. Možnosti konjugace nanočástic s funkčními biomolekulami např. protilátkami nebo proteiny a makrocyklickými ligandy budou demonstrovány na imunofluorescenčních analýzách a Försterově rezonančním přenosu energie. Dále jsme zkoumali možnosti konjugace nanočástic zlata s protilátkami. Takto značené protilátky mohou nalézt uplatnění v medicíně při léčbě nádorů. Protilátka se selektivně naváže na nádorové buňky a následně se tkáň ozáří světlem, které absorbují zlaté nanočástice mnohonásobně více než okolní tkáň. Tímto způsobem může dojít k tepelnému zničení označené tkáně. Na površích nanočástic prvků podskupiny IB (Cu, Ag, Au) dochází také k mnohonásobnému zvýšení signálu Ramanova rozptylu adsorbovaných molekul. Tato metoda se nazývá spektrometrie povrchem zesíleného Ramanova rozptylu (SERS). V tomto příspěvku budou ukázána Ramanova spektra karotenu zesílená na povrchu koloidní suspenze stříbrných nanočástic. Abstract Nanoparticles are structures with sizes from one to hundreds nanometers. The mostly investigated ones are magnetic nanoparticles, metal nanoparticles (e.g. Au, Ag, Ni) and semiconductor nanocrystals so called quantum dots. Quantum dots are used as luminescent labels in analytical chemistry, molecular biology and medicine. They consist of semiconductor core which should be stabilized by a shell (e.g. CdS, ZnS). Their surface is modified by covalently bonded polar molecules to increase hydrophilicity. A set of CdTe nanoparticles with sizes from 2.5 to 5.2 nm and fluorescence emission wavelength maximum between 500 and 750 nm was prepared. Characteristic parameters as an excitation and emission fluorescence spectra, fluorescence lifetime, fluorescence quantum yield, separation using capillary electrophoresis with laser induced fluorescence detection, nanoparticle size determination using
transmission electron microscopy and free mobility particle sizer will be shown. The possibility of nanoparticle conjugation with functional biomolecules will be demonstrated on immunofluorescence analyses and Förster resonance energy transfer. The possibilities of conjugation of gold nanoparticles with antibodies were studied as well. These conjugates should find applications in medicine in tumor treatment. Antibody is selectively bonded to the tumor cells and, consequently, they are irradiated by visible light, which is absorbed by gold nanoparticles. The tumor cells are thermally destroyed by this process. Extensive enhancement of Raman scattering signal of adsorbed molecules occur on the surface of the nanoparticles Cu, Ag, Au. This signal enhancement utilizes surface enhanced Raman scattering spectrometry. The Raman spectra of carotene enhanced on colloid silver nanoparticle surface was measured. 1. ÚVOD Nanočástice jsou struktury, které mají alespoň jeden rozměr v řádu jednotek až stovek nanometrů, a jsou dostatečně malé, aby se v nich mohly uplatňovat kvantové jevy. Nanostruktury lze dělit podle chemického složení na kovové (např. Au, Ag, Ni, Fe 2 O 3 ), polovodičové kvantové tečky (např. CdTe, CdSe) a nekovové (např. uhlíkové nanotrubky). Další možností je dělení podle struktury na částice, tyčinky, trubky, atd. 2. KVANTOVÉ TEČKY Kvantové tečky jsou polovodičové nanočástice skládající se z polovodičového jádra, které může být stabilizováno obalem z anorganických solí, nejčastěji CdS a ZnS [1]. Rozpustnost ve vodě je zajištěna nabitými organickými molekulami, které jsou kovaletně vázány na povrch kvantové tečky pomocí thiolových skupin [2]. Tyto molekuly mohou sloužit pro navázání dalších funkčích ligandů nebo biomolekul [3, 4]. Kvantové tečky nacházejí použití jako fluorescenční značky v analytické chemii, molekulární biologii a medicíně díky svým výborným optickým vlastnostem. Vyznačují se úzkými a symetrickými emisními spektry, širokými excitačními spektry, dobrou chemickou i foto- stabilitou [5] a vlnová délka emise je závislá na velikosti částice [2]. 2.1 Příprava a fyzikálně-chemické vlastnosti CdTe kvantové tečky rozpustné ve vodě byly připraveny reakcí chloridu kademnatého s hydrogenteluridem sodným v přítomnosti kyseliny 3-merkaptopropionové (MPA) v poměru 2:1:4,8 [6]. Nejprve byl připraven hydrogentelurid sodný reakcí 85 mg boritanu sodného se 127 mg práškového teluru v 2 ml deionizované vody. Reakce probíhala při 0 ºC přibližně 4 hodiny. Potom byly 2 ml tmavě fialového roztoku NaHTe přidány k roztoku 370 mg CdCl 2 s 420 l MPA v 80 ml deionizované vody probublávaném 30 minut N 2. ph roztoku bylo nastaveno na 7 pomocí NaOH a MPA. Reakční směs potom byla zahřívána pod zpětným chladičem. Velikost kvantových teček a maximum jejich emise závisí na době varu reakční směsi. Takto byly během jediné syntézy připraveny částice o velikostech od 2,5 nm (10 minut varu) až po 5,2 nm (44 hodin varu) s maximem vlnových délek emise od 500 do 750 nm a pološířkou emisního pásu od 45 do 100 nm Obr. 1. Excitační spektra všech připravených nanočástic byla skoro stejná a široká od 300 do 500 nm.
Obr.1 Luminiscenční emisní spektra kvantových teček s různou dobou varu reakční směsi, spektra byla normallizována Doba života a kvantový výtěžek luminiscence, veličiny používané v analytické chemii pro charakterizaci fluoroforů, byly změřeny pomocí časově rozlišené fluorescenční spektroskopie a fluorescenční spektroskopie. Bylo zjištěno, že doba života fluorescence roste s velikostí částice od 3,05 do 20,5 ns. Doba života fluorescence nejmenších měřených kvantových teček (3,05 ns) je srovnatelná s dobou života nízkomolekulárních fluoroforů, např. fluoresceinu (3,8 ns). Pro měření kvantového výtěžku byla použita srovnávací metoda [7] a jako referenční fluorofor byl použit fluorescein rozpuštěný v etanolu s kvantovým výtěžkem 0,91. Kvantový výtětžek připravených částic byl v rozmezí 0,01 až 0,25. Úzká emisní a široká excitační spektra jsou výhodou pro paralelní stanovení několika různých analytů značených kvantovými tečkami o různé velikosti. Výhodou je možnost použití jediného excitačního zdroje pro všechny fluorofory místo několika světelných zdrojů pro každou fluorescenční značku zvlášť. Odolnost proti fotodegradaci umožňuje sběr signálu po dlouhou dobu a opakovaná měření jednoho vzorku bez ztráty intenzity signálu. Obr. 2 HRTEM snímek CdTe kvantových teček s maximem vlnové délky emise 610 nm a velikosti 3,5 n
Velikost syntetizovaných nanočástic byla ověřena dvěma nezávislými metodami a to vysoce rozlišující transmisní elektronovou mikroskopií (HRTEM) Obr.2. a přístrojem pro určování velikosti částic v aerosolu (Scanning Mobility Particle Sizer Spectrometr SMPS). Oběma metodami byly potvrzeny vypočtené velikosti nanočástic odvozené od vlnové délky maxima emise [2]. HRTEM byla stanovena krystalová mřížka F 43m s velikostí jedné buňky a = 6,48 Å, což se shoduje s údaji uvedenými v literatuře pro makroskopický CdTe [8]. 2.2 Neselektivní značení buněk kvantovými tečkami Bylo studováno neselektivní značení buněk kvantovými tečkami. Pro používání kvantových teček konjugovaných s funkčními biomolekulami pro specifické a selektivní značení analytů v buňkách je nezbytné znát dobu pronikání nanočástic do buněk. Jako modelové buňky regující na změny v jejich okolí byly vybrány lidské lymfocyty a kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Buňky byly smíchány s kvantovými tečkami a průnik do buněk byl sledován pomocí dvou technik: epifluorescenční mikroskopie a TIRF mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence). TIRF mikroskopie umožňuje, podobně jako konfokální mikroskopie, pozorování tenké vrstvy preparátu v řádu stovek nanometrů. Tímto dochází k výraznému zvyšení kontrastu získaných snímků Obr. 3. Pronikání nanočástic do buněk bylo patrné po 3 hodinách v případě kvasinek a po 30 minutách u lidských lymfocytů Obr. 4. Obr. 3 Lidský lymfocyt neselektivně značený QD pozorovaný TIRF technikou Obr. 4 Pronikání nekonjugovaných kvantových teček do lidských lymfocytů (A) a kvasinek Saccharomyces cerevisiae (B) 2.3 Konjugace kvantových teček s protilátkami a makrocyklickými ligandy Kvantové tečky pokryté MPA byly konjugovány s molekulami obsahujícími primární aminoskupinu pomocí reakce s hydrochloridem 1-ethyl-3-(3-dimethyl-3-aminopropyl) karbodiimidu (EDC) a N-
hydroxysulfosukcinimidem (NHS) za vzniku peptidické vazby mezi karboxylovou skupinou a primární amino skupinou [9]. NHS bylo přidáváno pro zvýšení stability aktivního intermediátu v ph 5 až 7. Nejprve bylo 100 ml kvantových teček o koncentraci 2,6 mg.ml -1 rozpuštěných ve fosfátovém pufru ph = 7,4 smícháno se 3 mg EDC a 0,5 mg NHS. Potom byla přidána protilátka nebo ligand a reakční směs byla ponechána 60 minut při laboratorní teplotě. Byly optimalizovány poměry kvantových teček a ligandů. Konjugace byla kontrolována pomocí kapilární elektroforézy s laserem indukovanou fluorescenční detekcí (CE-LIF). Pro měření byla použita nepokrytá kapilára o průměru 75 m, efektivní délce 12 cm a celkové délce 20 cm, separační pufr 100 mm TRIS/TAPS o ph = 8,3 a napětí 6 kv. Makrocyklické ligandy se vyznačují tvorbou velmi termodynamicky stabilních a kineticky inertních komplexů s ionty kovů. Skládají se z cykloalkanového kruhu se čtyřmi atomy dusíku, přes které jsou vázány ramena s různými funkčními skupinami. Tato ramena, spolu s velikostí kruhu, určují selektivitu daného ligandu k iontu kovu a zároveň mohou sloužit k navázání fluorescenční značky nebo funkční biomolekuly. Konjugát makrocyklického ligandu s kvantovou tečkou bude použit jako fluorescenční sonda pro měření Försterova rezonančního energetického posunu (FRET). S kvantovými tečkami byl konjugován makrocyklický ligand MPI (1,4,7-triacetyl-10-aminopentyl-1,4,7,10-tetraazacyklododekan). Konjugace byla ověřena metodou CE- LIF Obr.5. Obr. 5 CE-LIF CdTe kvantových teček a konjugátu kvantových teček s MPI Na testování možnosti využití kvantových teček jako luminiscenčních značek v imunoanalýze byla vybrána protilátka membránovému proteinu CD3 (anti-cd3). Tento protein je specifický pro lidské T-lymfocyty. B- lymfocyty tento protein neobsahují. Protilátka anti-cd3 byla konjugována jak s kvantovými tečkami, tak pro kontrolu, s fluoresceinem. Tyto konjugáty byly přidány do směsi T- a B-lymfocytů a sledováno jejich značení pomocí epifluorescenčního mikroskopu. V případě T-lymfocytů bylo pozorováno značení bezprostředně po smíchání Obr.6 A a B, zatímco v případě B-lymfocytů žádné značení pozorovatené nebylo Obr.6 C. Fluorescence pozadí na Obr.6 C je dána dlouhou dobou expozice (10 100x delší než v případě Obr.6 A a B) a je zachycena fluorescence kvantových teček v roztoku.
A B C Obr. 6 Lidské T-lymfocyty značené konjugátem anti-cd3 s kvantovými tečkami (A), s fluoresceinem (B) a lidské B-lymfocyty ve směsi s konjugátem anti-cd3 s kvantovými tečkami (C) 3. KONJUGACE ZLATÝCH NANOČÁSTIC S PROTILÁTKAMI Protilátky značené zlatými nanočásticemi mohou nalézt uplatnění v medicíně při léčbě nádorů, ve fotodynamické terapii. Fotodynamická terapie je diagnostická a léčebná metoda, kdy se do organismu aplikuje fotosenzitivní látka, která se přednostně hromadí v nádorových buňkách. Po osvícení tkáně světlem dochází k jeho absorpci fotosenzitivní látkou a k tepelnému zničení označené tkáně. Jako fotosenzitivní látky jsou používány deriváty hematoporfyrinu, chloriny, ftalocyaniny, bakteriochloriny, purpuriny a další. Au nanočástice konjugovaná s protilátkou je zkoumána jako potenciální fotosenzitivní látka s vysokou selektivitou k buňkám cílové tkáně. Byla testována možnost konjugace protilátek s Au nanočásticemi stejným postupem jako v případě konjugací s kvantovými tečkami. Karboxylová skupina kyseliny 3-merkaptopropionové na povrchu Au nanočástice reagovala s amino skupinou protilátky za vzniku peptidické vazby v přítomnosti konjugačních činidel EDC a NHS. Konjugace byla kontolována konjugací s protilátkou anti-cd51 značenou fluorescenčně pomocí fluorescein thiokyanátu (FITC). Komplex Au nanočástice-anti-cd51-fitc byl centrifugován v kapilární baničce a konjugace byla potvrzena fluorescencí nanočástic usazených ve špičce kapiláry sledovaná pomocí epifluorescenčního mikroskopu Obr.7. A B Obr. 7 Au nanočástice konjugované s protilátkou anti-cd51 fluorescenčně značenou FITC A) bílé světlo, B) fluorescence excitovaná laserem 473 nm 4. VYUŽITÍ STŘÍBRNÝCH NANOČÁSTIC V SERS Povrchově zesílená Ramanova spektroskopie (SERS) využívá zesílení signálu Ramanova rozptylu elektromagnetickým zesílením a chemickým zesílením. K elektromagnetickému zesílení dochází vybuzením
povrchového plazmonu na povrchu kovové nanočástice nebo drsném kovovém povrchu, nejčastěji z Ag, Au, Cu a alkalických kovů. Povrchvý plazmon je hromadná excitace vodivostních elektronů kovových materiálů při vybuzení elektromagnetickým polem o vlnových délkách ve viditelné oblasti spektra. Toto zesílení může dosáhnout až řádu 10 12. SERS je využíván v analytické chemii, kdy zesílení signálu umožňuje měření nízkých koncentrací látek až jednotlivých molekul. Jeho aplikace je limitována pouze schopností vytvořit vhodné nanočástice a umístit analyt do jejich blízkosti. [10, 11] Jako modelový analyt pro měření SERS byl vybrán -karoten. Klasické Ramanovo spektrum nebylo možno na používaném přístroji naměřit, proto bylo pro identifikaci signálů -karotenu použito tabelovaných hodnot. Stříbrné nanočástice byly připraveny podle postupu Lee a Meisela [12], kdy 250 ml 0,25 mm dusičnanu stříbrného bylo přivedeno k varu a za stálého míchání bylo po kapkách přidáno 5 ml 1% citronanu sodného a vařeno dalších 50 minut. Před měřením byl 1 ml částic odstředěn a dekantován. 20 l částic bylo rozmícháno v 1 ml ethanolu s 4 l nasyceného roztoku NaCl, pro vytvoření klastrů nanočástic. K takto připraveným nanočásticím byl přidán roztok -karotenu v chloroformu o koncentracích 2,5.10-3 až 2,5.10-6 M a změřeno SERS spektrum Obr. 8. Obr. 8 Srovnání SERS spekter -karotenu v Ag nanočásticích 5. ZÁVĚR Byly připaveny nanočástice Au, Ag a CdTe, ověřena možnost jejich konjugace s makrocyklickými ligandy a protilátkami a aplikace v bioanalytické chemii. Byly připraveny velikosti CdTe nanočástic pokrytých MPA od 2,5 nm po 5,2 nm a charakterizovány pomocí fluorescenčních spekter, doby života fluorescence, kvantového výtěžku fluorescence, HRTEM a SMPS. Kvantové tečky s maximem emise 610 nm a Au nanočástice byly konjugovány s protilátkami a makrocyklickým ligandem MPI pomocí činidel EDC a NHS. V případě kvantových teček byla konjugace ověřena separací na CE-LIF a specifickou vazbou v buňkách. V případě zlatých nanočástic konjugací s fluorescenčně značenou protilátkou a následnou centrifugací. Byla potvrzena možnost využití konjugátů kvantových teček s protilátkami jako fluorescenčních značek v bioanalýze. Ag nanočástice byly použity pro vybuzení povrchového plazmonu v SERS a bylo potvrzeno zvýšení intenzity signálu Ramanova rozptylu -karotenu na jejich povrchu.
6. PODĚKOVÁNÍ Autoři děkují Dr. Marianě Klementové z Ústavu anorganické chemie AVČR za snímky struktur kvantových teček pořízené vysoce rozlišovacím elektronovým mikroskopem, Mgr. Petru Táborskému, Ph.D. a doc. Janu Preislerovi, Ph.D. z Ústavu chemie Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity za spolupráci při měření doby života fluorescence a kvantového výtěžku fluorescence, doc. Přemyslu Lubalovi, Ph.D. z Ústavu chemie Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity za poskytnutí makrocyklického ligandu MPI. Tato práce byla podporována Grantovou agenturou Akademie věd České republiky (KAN400310651 a KJB400310709), Grantovou agenturou České republiky (GA203/08/1680), Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy (LC06023) a AV0Z40310501. LITERATURA [1] van Embden, J., aj. Review of the Synthetic Chemistry Involved in the Production of Core/Shell Semiconductor NanocrystalsAustralian Journal of Chemistry 2007, 60, 457-471. [2] Eychmuller, A.; Rogach, A. L. Chemistry and photophysics of thiol-stabilized II-VI semiconductor nanocrystalspure and Applied Chemistry 2000, 72, 179-188. [3] Burda, C., aj. Chemistry and properties of nanocrystals of different shapeschem. Rev. 2005, 105, 1025-1102. [4] Klostranec, J. M.; Chan, W. C. W. Quantum dots in biological and biomedical research: Recent progress and present challengesadvanced Materials 2006, 18, 1953-1964. [5] Ma, J., aj. Photostability of thiol-capped CdTe quantum dots in living cells: the effect of photooxidationnanotechnology 2006, 17, 2083-2089. [6] Li, L., aj. Significant enhancement of the quantum yield of CdTe nanocrystals synthesized in aqueous phase by controlling the ph and concentrations of precursor solutionsjournal of Luminescence 2006, 116, 59-66. [7] Eaton, D. F. Reference Materials for Fluorescence MeasurementPure and Applied Chemistry 1988, 60, 1107-1114. [8] Zachariasen, W. H. Die kristallstruktur der telluride von zink, cadmium und quecksilber.nor. Geol. Tidsskr 1926, 8, 5. [9] Hermanson, G. Bioconjugate techniques1995. [10] Tian, Z. Q. Surface-enhanced Raman spectroscopy: advancements and applicationsjournal of Raman Spectroscopy 2005, 36, 466-470. [11] Sackmann, M.; Materny, A. Surface enhanced Raman scattering (SERS) - a quantitative analytical tool?journal of Raman Spectroscopy 2006, 37, 305-310. [12] Lee, P. C.; Meisel, D. Adsorption and Surface-Enhanced Raman of Dyes on Silver and Gold SolsJournal of Physical Chemistry 1982, 86, 3391-3395.