Zdravotní ústav se sídlem v Ústí nad Labem

Zdravotní ústav se sídlem v Ústí nad Labem Moskevská 15, 400 01, Ústí nad Labem Z Á V Ě R E Č N Á Z P R Á V A o řešení programového projektu s účelovou podporou Interní grantové agentury ministerstva zdravotnictví ČR Název programu: Protektivní a imunomodulační vliv suplementace RNA, srovnání klinického testování a experimentálního modelu Registrační číslo: NJ 6888 3 Doba řešení projektu: 2001 2003 Řešitel projektu: MUDr. Josef Richter Spoluřešitelé: RNDr. Petr Šíma, CSc. MBÚ AV Praha MUDr. Ivan Pfeifer, CSc., Univerzita Karlova Praha Odborná spolupráce: RNDr. Vlastimil Král, CSc., ZÚ se sídlem v Ústí n. Lab. MUDr. Dalibor Jílek, CSc., ZÚ se sídlem v Ústí n. Lab. Ing. Ivana Stiborová, ZÚ se sídlem v Ústí n. Lab. MUDr. Stanislava Richterová, ZÚ se sídlem v Ú. n. Lab. Jitka Pešková, ZÚ se sídlem v Ústí nad Labem MUDr. Dagmar Slížová, Ústav anatomie LFUK HK Mgr. Lucie Dobiášová, ZÚ se sídlem v Ústí n. Lab. Ekonomicko-hospodářské zajištění: Ing. Miroslav Štráchal Ing. Jana Adamcová Martina Škvárová Irena Zemanová 1

Obsah Zdravotní ústav se sídlem v Ústí nad Labem 29.1.2004 Úvod 3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4 1. Cíl experimentální části projektu 4 2. Experimentální model 4 3. Výsledky 5 4. Preventivní programy 13 5. Suplementace školních dětí 15 6. Nové cesty suplementace 17 KLINICKÁ ČÁST 19 1. Přínos speleoterapie s nutričním režimem pro léčbu alergických onemocnění 19 2. Ovlivnění zdravotního stavu u jedinců s klinickými projevy únavového syndromu s definicí EBV infekce 22 3. Suplementace pacientů s inhalační alergií způsobenou roztoči domácího prachu 23 4. Suplementace nukleotidy u zánětlivých onemocnění gastrointestinálního traktu 24 5. Výstup 26 Seznam použité literatury 27 Publikace grantu - seznam 30 2

Úvod Neadekvátní výživa se podílí na narušení zdravotního stavu obyvatelstva nejenom nesprávným způsobem stravování, ale i nevyvážeností základních nutričních složek v potravinách. Obecně je kalkulováno se skutečností, že 15-25% všech úmrtí má souvislost s nesprávnou výživou. Optimální zastoupení vitaminů a stopových prvků ve stravě je stále opakovaným požadavkem podmiňujícím kvalitu zdravotního stavu populace. Jednostranná skladba potravy působí na imunitní systém jedince analogicky jako její nedostatek a to zejména v obou stranách věkového rozpětí člověka, v období růstu (dětství) a v období stárnutí. Z těchto základních předpokladů vycházejí současné koncepce světové zdravotní politiky, které se soustřeďují na preventivní programy se snahou postihnout pokud možno nejširší vrstvy senzitivní populace. Především z těchto důvodů by měl být do naší zdravotní politiky zahrnut výzkum a klinické ověřování různých zdravotních doplňků, u kterých je prokázáno jejich kladné působení na metabolické, fyziologické a imunitní funkce. Tyto aspekty se významně prosazují ve vyspělých zemích, kde je věnována zvýšená pozornost otázkám potravinové suplementace různými mikronutrienty. Jak v Japonsku, USA, tak již i v některých zemích Evropy se sledují otázky tzv. funkční stravy. Řada výše uvedených aspektů je řešena i v materiálech SZO Zdraví pro všechny v 21.století. Cílem našeho projektu bylo ověření možností ovlivnění zdraví a imunitního stavu výživou cestou suplementace dietním přípravkem s vysokým obsahem DNA. Sledovali jsme účinky vysoce čištěné DNA kvasnicového původu na vybrané imunitní parametry a to jak v experimentu tak i v klinických a preventivních studiích. Zjistili jsme, že stejný účinek lze dosáhnout s preparátem Imuregen s vysokým obsahem aminokyselin, polypeptidů, oligo a polynukleotidů. Výhodou tohoto preparátu je vysoká finanční dostupnost (náklady na jeden den aplikace 20x nižší). Stanovili jsme optimální dávku suplementu a to v závislosti na dávkování preventivním i dávkování léčebném. V záměru projektu jsme vycházeli z předpokladu, že imunoregulační účinky exogenní DNA spočívají v její využitelnosti pro syntézu nukleových kyselin při dělení buněk. Dietární nukleotidy jsou z hlediska energetického krytí v této aplikaci daleko výhodnější i proto, že jejich částečné štěpení v GI traktu vede k jejich rychlému využití a tím ke zlepšení reparace buněčných substrátů různých tkání organizmu závislých na přívodu exogenních nukleotidů. V řadě případů lze hovořit o tom, že dietární nukleotidy jsou z tohoto hlediska ve významu výživy esenciální. Absence dietárních nukleotidů v organizmu člověka může vést i k příznakům malnutrice, která je popisována pod názvem NAIDS (Nutritionally Acquire Immune Disfunction Syndromes). Snažili jsme se v naší studii nejenom potvrdit funkčnost suplementace dietárními nukleotidy, ale i jejich příznivý efekt jak v preventivní tak v klinické aplikaci. V rozvržení jednotlivých klinických studií jsme překročili rozsah zadání vzhledem k tomu, že jsme dosáhli významného účinku při podávání dietárních nukleotidů u řady onemocnění. Proto pokračujeme v této studii klinických indikací dále. Za podstatný přínos považujeme možnost rozšíření preparátu ve formě nápoje, který v současné době zkouší společnost Dobrá voda. Vzhledem k tomu, že rozsah studie byl v takové šíři, bude řada dalších výstupů publikována v průběhu roku 2004. České i zahraniční publikace budou postupně zveřejňovány jednak po zpracování dokončených etap, dále pak i po dokončení studií v dostatečném počtu sledovaných jedinců. 3

Experimentální část 1.Cíl experimentální části projektu V rámci cíle projektu, kterým je ověření možnosti pozitivního ovlivnění imunitního systému výživou prostřednictvím suplementace potravinovými přípravky s vysokým obsahem dietárních nukleotidů (dnt) a tím celkového zdravotního stavu populace, bylo nutné doplnit klinické studie výsledky na experimentálním zvířecím modelu, které nelze získat v klinických studiích z praktických nebo etických důvodů u lidí, a které jsou významné pro objasnění mechanismů imunoregulačního působení dnt. 1.1. Výchozí premisy: Přesný mechanismus ovlivnění imunitních procesů dnt není zcela jasný. Předpokládá se, že dnt v organismu působí na mnoha úrovních, zejména zvyšují zásobu endogenních nukleotidů, které jsou využívány proliferujícími a diferencujícími se imunokompetentními buňkami. Intenzivní nástup tvorby nukleotidů po aktivaci imunokompetentních buněk antigenem je vysvětlován vysokými požadavky na přípravu energetického metabolismu potřebného pro syntézu nukleových kyselin a také tím, že lymfoidní buňky mají omezenou schopnost syntézy a endogenní reutilizace zejména pyrimidinových nukleotidů. Bylo prokázáno, že omezení dnt ve stravě se odrazí ve snížení imunologické pohotovosti organismu, zvláště reakcí buněčné (T-složky) imunity (odhojení aloštěpu a snížení proliferace lymfoidních buněk po alogenní indukci, snížení produkce interleukinu-2 a nižší exprese receptoru pro IL-2) a humorální (B-složky), která je efektivní v antiinfekční imunitě. Naopak suplementace dnt podporuje nejen normální fyziologické funkce, ale stává se nezbytnou pro zajištění regeneračních pochodů. Řada údajů naznačuje, že antigenem stimulované imunocyty a buňky aktivně metabolicky se účastnící imunitních funkcí (makrofágy, granulocyty aj.) mají zvýšené požadavky na přísun dnt. Proliferačně diferenciační procesy antigenem aktivovaných lymfocytů vyžadují další zvýšený přísun nukleotidů (ať už zajištěný endogenní syntézou, nebo reutilizací z exogenního zdroje - nutrice), které jsou využívány v energetickém metabolismu a později při syntéze nukleových kyselin při klonální expanzi v průběhu imunitní odpovědi. 2.Experimentální model Pro stanovení základních parametrů antiinfekční a protinádorové imunity byla jako experimentální zvířata použity myši definovaného inbredního kmene Balb/c (MBÚ AV ČR, Praha) a myši definovaného inbredního kmene C57Bl/6 (AnLab, Praha) ve stáří 3 měsíců a hmotnosti cca 20g chované za standardních podmínek (teplota, osvit, unifikovaná základní dieta ad libitum); kontrolní a testovací skupiny byly po 16 myších. C57Bl/6 myši byly s.c. inokulovány melanomovými buňkami B16F10 (Weizmann Inst., Rehovot, Israel). Všechny pokusy byly prováděny ve dvou paralelních liniích a třikrát opakovány. Jako zdroje dnt bylo použito standardní vysoce čištěné kvasinkové RNA (Ribonucleic acidcore Torula sp. Type II-C, Sigma-Aldrich Chemie, Gmbh, Steinheim Germany) a přípravku Imuregen (Uniregen s.r.o., Náchod) v preventivním časovém protokolu (4 týdny) pitného (krmného) programu ad libitum a dávkování (100 mg/l (kg) dnt) stanovených podle programů doporučovaných literárními údaji. 4

Vycházejíce z výše uvedených předpokladů, stanovovali jsme základní parametry antiinfekční a protinádorové imunity po aplikaci dnt podle zadaného harmonogramu projektu u myšího experimentálního modelu ve srovnání s kontrolními (dnt neovlivněnými) zvířaty. 3. Výsledky 3.1. Ovlivnění produkce IL-2, IL-4, IL-12, TNF-α a IFN-γ 3.1.1. Kritéria výběru cytokinů: IL-2 je markerem aktivace Th1 lymfocytů antigenem. Je růstovým faktorem pro T i B buněčnou populaci a také Tc a NK buněk. V Th buňkách stimuluje tvorbu IL-4 a IFN-a. Stimuluje proliferaci a diferenciaci CTL a NK buněk a zvyšuje jejich cytotoxickou aktivitu. Rovněž zvyšuje proliferaci a diferenciaci B buněk. Zvýšení produkce IL-2 znamená zvýšení T složky imunity a IL-2 je terapeuticky využíván v onkologii. IL-4 je produkován Th2 lymfocyty a stimuluje diferenciaci B buněk ke tvorbě IgM a IgG protilátek. Rovněž podporuje diferenciaci CTL a granulocytů, snižuje produkci prozánětlivých cytokinů (např. TNF- α). IL-12 je produkován buňkami monocytárního-makrofágového systému a podporuje aktivaci a cytotoxicitu NK buněk a jejich přeměnu do účinnějších LAK buněk podobně jako IL-2. Dále je klíčovým stimulátorem tvorby IFN-γ v Th1 buňkách. Je aplikován při léčbě nádorů a parazitárních onemocnění. TNF-α (kachektin) má cytostatické a cytotoxické účinky na nádorové buňky. Jako prozánětlivý faktor (endogenní pyrogen) indukuje zánět (přes stimulaci tvorby hlavně IL-1 a GM- CFS) a podporuje toxické účinky endotoxinu G- baktérií. Produkce TNF-α je inhibována jinými cytokiny a také IL-4. IFN-γ má pleiotropní regulační účinky v imunitním systému. Mimo jiné podporuje diferenciaci B a T buněk a stimuluje expresi HLA-1, čímž usnadňuje protinádorový zásah CTL. Je aktivátorem makrofágů a endoteliálních buněk. Rekombinovaný IFN-γ je používán pro prevenci i terapii virových onemocnění (Actimun). 3.1.2. Uspořádání experimentu: Preventivní aplikace dnt (Torula) 30 dnů myším kmene C57Bl/6 inokulovaným nádorovými melanomovými buňkami. Koncentrace cytokinů byly identifikovány metodou ELISA (viz Obr. 1). Obr. 1. Srovnání koncentrací vyšetřovaných cytokinů oproti kontrolám 5

Srovnání koncentrací vyšetřovaných cytokinů oproti kontrolám pg/ml 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 IL-2 IL-4 IL-12 TNF-a IFN-gama cytokiny kontrola Torula 3.1.3. Závěry: Preventivní 30 denní aplikace dnt u nádorových myší se oproti neovlivněným kontrolám projevila významným zvýšením IL-2, IL-4, IL-12 a nejvíce IFN-γ, zatímco produkce TNF-α nebyla ovlivněna a jeho koncentrace zůstaly na úrovni kontrol. Lze konstatovat, že preventivní aplikace dnt podporuje produkci regulačně významných cytokinů, zejména těch, které jsou důležité pro rozvoj protinádorové složky imunity, tj. přímo stimulují diferenciaci a aktivitu CTL a buněk NK (IL-2, IL-4, IL-12, IFN-γ), a z nichž některé jsou již terapeuticky používány (IL-2, IL-12, IFN-γ), anebo jsou důležité pro rozvoj komplexní imunity, tozn. také B-složky, na níž spočívá antiinfekční imunita (IL-2, IL-4) a buněk monocytárněmakrofágového systému důležitých při zpracování a prezentaci antigenu při T a B buněčných kooperacích (IFN-γ). Naopak preventivní aplikace dnt nezpůsobila zvýšení TNF-α, který je významným prozánětlivým faktorem a lze nepřímo usuzovat, že by tak mohlo být v důsledku zvýšení produkce IL-4, který TNF-α inhibuje (viz výše). Lze uzavřít, že účinky dnt aplikovaných formou preventivního dlouhodobého pitného režimu mají v prostředí experimentálně navozeného nádorového procesu (myš-melanom) prokazatelně podpůrný vliv na produkci cytokinů pozitivně ovlivňujících přípravu a rozvoj protinádorové složky imunity. Naopak, nepůsobí na výši produkce TNF-α, který přes svoje cytostaticko-cytotoxické účinky je především silným prozánětlivým faktorem. 3.2. Kvantifikace buněk tvořících hemolytické protilátky IgM a IgG 3.2.1. Kritéria stanovení počtů IgM a IgG: IgM představuje hlavní třídu protilátek při nástupu primární imunitní reakce. Výkonná humorální imunita v pozdějších fázích imunitní odpovědi spočívá především na protilátkách třídy IgG. Kvantifikací buněk tvořících hemolytické protilátky IgM a IgG lze získat informaci, do jaké míry jsou preventivní aplikací dnt ovlivněny nejen diferenciace prekurzorových imunokompetentních buněk pro obě třídy imunoglobulinů, ale také dynamika molekulárního přesmyku IgM v IgG v průběhu primární imunitní reakce. 6

3.2.2. Uspořádání pokusu: Absolutní počty slezinných lymfoidních buněk tvořících hemolytické protilátky tříd IgM a IgG po i.p. imunizaci T-závislým antigenem (0,5 ml 4% ovčích erytrocytů) 5. den primární imunitní odpovědi byly zjišťovány modifikovanou Jerneho plakovou metodou, kdy jsou buňky secernující protilátky identifikovány vazbou morčecího komplementu a tvorbou hemolytických zón (plaků). Byly srovnávány myši Balb/c po 30. denní aplikaci preventivního pitného režimu dnt (Torula a Imuregen). Hodnoty jsou uvedeny jako průměry absolutních počtů buněk tvořících hemolytické protilátky stanovených u jednotlivých pokusných zvířat a přepočteny na 10 8 lymfoidních buněk. Průměrné hodnoty paralelních pokusů, které byly třikrát opakovány jsou uvedeny v Tab.1. a Obr. 2. Tab. 1. Průměrné absolutní počty buněk tvořících hemolytické protilátky IgM a IgG v přepočtu na 10 8 slezinných buněk IgM SD IgG SD Kontrola 5837 236 33281 3563 Torula 15889 770 115945 1599 Imuregen 14674 269 105170 3344 Obr. 2. Průměrné absolutní počty buněk tvořících hemolytické protilátky IgM a IgG v přepočtu na 10 8 slezinných buněk 140000 120000 Průměrné absolutní počty buněk tvořících hemolytické protilátky IgM a IgG počet buněk 100000 80000 60000 40000 kontrola Torula Imuregen 20000 0 IgM IgG 3.2.3. Závěry: Po 30 denní preventivní aplikaci dnt ve formě pitného režimu u obou testovaných přípravků Torula a Imuregen významně zvýšily absolutní počty buněk tvořících hemolytické protilátky IgM a IgG ve slezině imunizovaných zvířat oproti kontrolním dnt nesuplementovaným zvířatům. Rozdíly mezi oběma testovanými přípravky nebyly významné. Zvýšení absolutních počtů buněk však není exhaustivní (přesahuje pouze 1 řád). Lze očekávat, že po dlouhodobém přísunu dnt ve formě preventivního pitného režimu s testovanými vzorky Torula a Imuregen se vytváří tendence k neexhaustivní stimulaci diferenciace imunokompetentních buněk k tvorbě humorálních ochranných protilátek a tím k vyšší 7

pohotovosti B buněčné složky imunitního systému, na jejíž buněčné kapacitě přímo závisí účinnost antiinfekční imunity. 3.3. Ovlivnění cytotoxicity efektorových buněk (přirozených zabíječů NK) 3.3.1. Kritéria určení cytotoxické kapacity NK buněk: Stanovení cytotoxické aktivity lymfoidních buněk umožňuje získat informaci o působení dnt na diferenciaci NK buněk. 3.3.2. Uspořádání pokusu: Buněčná cytotoxicita je kvantifikována měřením množství 51 Cr, který je uvolňován ze značených cílových (nádorových) buněk (T), které jsou zabíjeny efektorovými NK z buněk (E) testovaného zvířete. Jako cytotoxický testovací systém byly použity cílové buňky myší nádorové linie YAC-1 (American Type Culture Collection). Byly srovnávány myši Balb/c po 30. denní aplikaci preventivního pitného režimu dnt přípravků Torula a Imuregen. Hodnoty jsou uvedeny jako průměrná procenta cytotoxické aktivity splenocytů po 3,5 a 18 hodinové inkubaci efektorových buněk s cílovými buňkami YAC1 značenými 51 Cr v poměrech E : T: 200 : 1; 100 : 1; 50 : 1; 25 : 1. Hodnoty cytotoxické aktivity byly vypočítány podle vztahu: % cytotoxicity = (cpm exp - cpm spont : cpm max - cpm spont ) x 100 z maximálních výtěžků cytotoxicity a jsou vyjádřeny jako průměry procent cytotoxických aktivit stanovených u jednotlivých pokusných zvířat a 3 x opakovaných pokusů (Obr. 3). Obr. 3. Průměrná cytotoxická aktivita lymfoidních efektorových buněk sleziny (NK) po preventivní aplikaci pitného režimu dnt; srovnání přípravků Torula a Imuregen 8

Cytotoxický test proti cílovým buňkám Yac 60 % cytotoxicity 50 40 30 20 10 kontrola dnt 0 Torula 3,5h Torula 18h Imuregen 3,5h Imuregen 18h 3.3.3. Závěry: 30 denní preventivní aplikace dnt ve formě pitného režimu u obou testovaných přípravků Torula a Imuregen nevýznamně zvýšila cytotoxickou aktivitu efektorových cytotoxických splenocytů (NK buněk) zaměřených na nádorové cílové buňky YAC1 v in vitro modelovém buněčném systému. Lze usuzovat, že dlouhodobý přísun dnt podávaných v přípravcích Torula a Imuregen formou preventivního pitného režimu bude mít tendenci pozitivně stimulovat některou součást protinádorové složky imunity. Tyto výsledky odpovídají nálezům při testování proliferační aktivity kostimulované mitogenem ConA, který stimuluje hlavně T-buněčnou subpopulaci (viz níže odst. 3.4.3). 3.4. Stanovení proliferačních aktivit lymfoidních buněk 3.4.1. Kritéria stanovení proliferačních aktivit: Imunokompetentní buňky po setkání s antigenem procházejí proliferačními procesy, v jejichž průběhu se diferencují do terminálního stádia efektorových buněk. Proto je stanovení proliferační aktivity lymfoidních buněk základní informací o stavu imunitního potenicálu organismu. Kostimulace T-závislým mitogenem ConA určuje vliv zkoušené látky na T buněčnou složku, kostimulace LPS dává obraz o vlivu na B buněčnou složku. 3.4.2. Uspořádání pokusu: Buněčná proliferace v proliferačním testu ex vivo je kvantifikována měřením množství 3 H- thymidinu, který se v S fázi buněčného cyklu inkorporuje do jaderné DNA. 9

Byly srovnávány myši Balb/c po 30. denní aplikaci preventivního pitného režimu dnt přípravků Torula a Imuregen. Byla měřena celková bazální ( klidová ) proliferace splenocytů neovlivněných mitogeny a porovnávána s proliferací po kostimulaci ConA a LPS. Průměrné hodnoty proliferačních aktivit jsou uvedeny jako proliferační indexy udávající intenzitu buněčného dělení (viz Obr. 4). Obr.4. Bazální a kostimulované proliferační aktivity proliferační index 14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 Indexy bazální a stimulované proliferace ConA a LPS u lymfoidních slezinných buněk kontrola bazální ConA LPS Imuregen Torula 3.4.3. Závěry: Celková bazální proliferace lymfoidních slezinných buněk není po 30 denní preventivní aplikaci dnt ve formě pitného režimu u obou testovaných přípravků (Torula a Imuregen) významně ovlivněna. Oproti proliferačním aktivitám kontrol (neovlivněných dnt) jsou významně zvýšeny proliferační aktivity kostimulovaných lymfoidních buněk dnt ovlivněných myší (Torula a Imuregen), zejména však ConA indukovaná T buněčná subpopulace (srv. výše odst. 3.3.3.). Aplikace dnt podávaných v přípravcích Torula a Imuregen formou dlouhodobého preventivního pitného režimu významně stimuluje proliferující lymfoidní buňky indukované T i B mitogeny. Lze očekávat, že přísun dnt pozitivně ovlivní více T buněčnou složku imunity. 3.5. Průtoková cytometrie Průtokovou cytometrií byly identifikovány specifické povrchové markery IgM a IgG, CD4 a CD8, CD11b, CD14, CD45 a Dx5 na splenocytech experimentálních myší obou kmenů, kterým byly aplikovány dnt (Torula a Imuregen) a kontrolních myší (bez ovlivnění dnt). Aplikace dnt v preventivním 30 denním pitném režimu neovlivnila expresi žádného ze sledovaných markerů oproti kontrolám. Z tohoto důvodu nejsou uvedeny výsledné hodnoty. 3.5.1. Závěr U experimentálního modelu (myši Balb/c; nádor nesoucí myši C57Bl/6) neměla preventivní aplikace dnt (zdroj Torula a Imuregen) podávaných po 30 dní formou pitného režimu obecně toxické účinky na organizmus. 1

Imunologické testy zaměřené na základní projevy přirozené i specifické humorální a protinádorové imunity neprokázaly inhibiční účinky v žádném z experimentálních uspořádání. Preventivní aplikace dnt průkazně podporuje buněčnou i humorální složku imunity a tak i celkovou imunitní pohotovost organismu. Experimentální testování naznačilo, že dnt by se mohly stát vhodným suplementem nutrice doporučované v preventivních zdravotnických programech. 3.6. Regenerace sliznice ilea dietou obohacenou nukleotidy Epitel gastrointestinálního traktu hraje důležitou roli nejen při trávení a vstřebávání živin, ale i při předávání antigenních a patogenních signálů ke střevní lymfatické tkáni. Nejčastější příčinou selhání imunitního systému jsou různé stupně a formy malnutrice. Vědecké práce, zabývající se v posledních letech problematikou dietárních nukleotidů docházejí k závěru, že oligo- a polynukleotidy, které jsou přítomny v potravě, představují nejdůležitější složky výživy vzhledem k jejich významu pro celou řadu metabolických a energetických pochodů v organizmu. Nukleotidy jsou základem pro syntézu nukleových kyselin při regeneraci tkání. Exogenní nukleotidy jsou nezbytným stavebním kamenem pro některé buněčné systémy, neschopné využít endogenních zdrojů, například buňky červené krevní řady, bílé krevní řady, centrální nervové soustavy i částečně buněčný substrát jaterní tkáně. Většina dosud publikovaných prací udává příznivý vliv dietárních nukleotidů na růst a zrání střevního epitelu. Již dříve jsme publikovali výsledky zvířecího modelu s podáváním extraktů živočišného původu s výrazným dopadem na zvýšení imunitní odpovědi. 3.6.1 Materiál a metodika V této studii byly tříměsíční samice myší kmene Balb/c krmeny jednak standardní dietou ( 1 ), dietou obohacenou o suplement ( 2 ) a dále pak dietou a vodou obohacenou suplementem v dávce 100mm/l. Ve všech případech byl podáván preparát Imuregen firmy Uniregen s.r.o., Náchod, ČR. Doba podávání suplementu byla ve všech případech čtyři týdny. Vzorky terminálního ilea ze všech tří skupin byly odebrány pro histologické vyšetření a pro pozorování v rastrovacím elektronovém mikroskopu. Tkáň pro histologické vyšetření byla fixována, zalita do parafinu a barvena hematoxilinem eozinem a metodou na průkaz kyselých mukopolysacharidů podle Hale-Mullera a studována ve světelném mikroskopu. Délka klků střevní sliznice byla hodnocena morfometricky. Vzorky pro rastrovací elektronový mikroskop byly vysušeny hexametyldisylazanem, pozlaceny a prohlíženy v rastrovacím elektronovém mikroskopu TESLA BS 301. 3.6.2.Výsledky V žádné sledované skupině nebyly zjištěny patologické změny střevních klků. Nejvyšší nárůst klků byl zjištěn ve skupině č.3, které byla podávána standardní dieta s vodou suplementovanou Imuregenem. Vyhodnocení morfometrických údajů prokázalo statisticky výzanmný rozdíl v délce klků jednotlivých experimentálních skupin ( graf l.) Morfologie jednotlivých vybraných nálezů ze skupiny 1 3 je znázorněna na obrázcích 1, 2 a 3. 1

Obr.1. Obr.2. Obr.3. 1

3.6.3. Statistické zhodnocení Rozptyly naměřených hodnot výšky klků kontrolní a obou pokusných skupin byly porovnána Snedeckovým F testem. K ověření platnosti nulové hypotézy o rozdílu průměrů naměřených hodnot byl použit Studentův t-test. Rozdíly v průměrných hodnotách výšky klků byly považovány za statisticky významné, pokud hodnota testovací charakteristiky byla větší než příslušný kvantil Studentova rozdělení na 5% hladině významnosti. 3.6.4. Závěry V experimentu byl nalezen statisticky významný nárůst průměrné délky klků terminálního ilea u myších samic kmene Balb/c po 4 týdnech podávání směsi oligo- a polynukleotidů v dietetickém přípravku Imuregen oproti kontrolní skupině. K výraznějšímu nárůstu došlo v případě podávání Imuregenu v pití ( p<0,0005 )než v případě obohacení krmiva tímtéž přípravkem ( p< 0,025 ). V experimentálních skupinách zvířat nebyly nalezeny žádné patologické změny střevních klků. Při daném pokusném uspořádání byl tudíž prokázán pozitivní vliv směsi nukleotidů v dietetickém imunostimulačním přípravku Imuregen na regeneraci a růst epitelu terminálního ilea. 1

4. Preventivní programy 4.1. Nutriční kompenzace u dětí předškolního věku Je stále více důkazů o tom, že i ve společnosti s vysokým standardem životní úrovně dochází k nerovnoměrnému přísunu složek výživy, což si vynucuje řešení kompenzačními nutričními opatřeními. V posledních letech dochází ke snahám o zlepšení kvality suplementace. K vitamínům a minerálům přistupují další mikronutrienty, jako například flavonoidy, DNA a nukleotidy. Podnětem pro tuto část práce byla snaha ověřit účinek preparátu s vysokým obsahem oligo a polynukleotidů u rostoucí dětské populace. 4.1.1. Soubor a metodika Soubor dětí mateřských škol byl rozdělen do dvou skupin. První skupina dostávala suplementovanou stravu, druhá skupina dostávala stravu s placebem. Kurz suplementace je znázorněn na obrázku 1. Program projektu suplementace Supleme ntace 29.11.o dběry 14. 3. 20. 6. 4.1 0. prosinec listopad břez en dub en květ en červ en červe nec srp en zá ří říj en Suplementace probíhala v rozmezí 3 měsíců na jaře a stejnou dobu na podzim. V průběhu studie byly provedeny odběry slin a to vždy před suplementací a po ní v jarním i podzimním období. Ve slinách byla sledována koncentrace lyzozymu, SIgA a albuminu metodou jednoduché radiální imunodifuze. Z hodnot SIgA a albuminu byl kalkulován sekreční index. Byla sledována nemocnost dětí v průběhu suplementace a to jednak z hlediska frekvence onemocnění, dále pak z hlediska délky onemocnění. Výsledky byly statisticky zhodnoceny s použitím příslušenství Microsoft Excel a s použitím programu dostupných v InStat 3. Dvojice vzorků jednotlivých dětí byly zhodnoceny s pomocí dvoustranného párového T-testu. 4.1.2. Výsledky Z výsledků je patrné, že největší změny při porovnání hodnot suplementovaného a kontrolního souboru jsme nalezli u hodnot albuminu. Zatímco u suplementovaných došlo vždy po 1

kursu suplementace k poklesu hodnot albuminu (snížená zánětlivá reakce), u kontrolního souboru docházelo v obou obdobích k vzestupu (obr.2). 4 Obr. 2: Hodnoty salivárního albuminu u suplementovaných a kontrol odběr č. 3 2 1 Nukleotidy Kontrola 0 20 40 60 80 100 120 albumin mg / L slin Méně jsou výrazné změny hodnot lysozymu, kde jak u kontrol, tak u suplementovaných byly změny výrazněji ovlivněny sezónní a cirkadiánní rytmicitou (obr. 3). Pouze po jarní suplementaci došlo k výraznějšímu vzestupu hodnot lyzozymu ve skupině suplementovaných. Obr. 3.: Hodnoty lyzozymu u kontrolních a suplementovaných dětí lysozym mg/l 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 p=0,045 Suplementovaní Kontrolní soubor 1 2 3 4 odběr č. Stejné nálezy jsme zjistili v hodnotách SIgA, kde rovněž došlo k významné změně u suplementovaných pouze v jarním odběru po suplementaci. Hodnoty SIgA u kontrolních a suplementovaných dětí (log. průměry) SIgA mg / L 1,9 1,85 1,8 1,75 1,7 1,65 1,6 NS Suplementovaní Kontrolní soubor p=0,0015 NS 1 2 odběr č. 3 4 NS 1

Jak je patrné z grafu 4, jsou nálezy sekrečního indexu (poměr albumin / SIgA) statisticky vysoce významné, což je ovlivněno především poklesem zánětlivé iritace ve skupině suplementovaných. Poměr SIgA / Albumin u suplementovaných a kontrol ( log. průměry) 1,3 1,2 1,1 1 0,9 p=0,0005 1 2 3 4 Odběr č. Suplementovaní Kontrolní soubor Za podstatný přínos suplementace považujeme výrazné ovlivnění nemocnosti ve sledovaném souboru suplementovaných dětí. V ovlivňované skupině byl snížen výskyt onemocnění o 50% a statisticky významně zkrácen počet prostonaných dní u dětí se suplementačním režimem. Tyto nálezy považujeme za přínosné i z toho hlediska, že potvrzují význam racionální suplementace a dokumentují náš názor, že ústup od suplementační politiky dětské populace není příliš šťastným řešením. Uvědomujeme si to především v kontextu se vstupem do Evropské unie, kde je suplementace především mléčnými produkty běžnou normou. 5. Suplementace školních dětí 5.1. rómská populace Jako vstupní studii pro projekt SZO-RHN jsme provedli komplexní sledování dětské populace základních škol v Ústí nad Labem. V rámci této studie byla sledována nejenom ekonomická a sociální kritéria, ale i aspekty zdravotní. Vycházeli jsme z literárních podkladů uvádějících predispozici pro řadu onemocnění, například zvýšenou prevalenci poruch štítné žlázy. Přistoupili jsme k modelu suplementace, ve kterém jsme použili humanizované mléko (přídavek nukleotidů) spolu s navážkou 150ug jodidu draselného denně. Přesnídávky pro tuto studii připravila firma Nutricia Opočno. Suplement byl podáván po dobu 2 měsíců. 5.1.1. Soubor a metoda U souboru 120 rómských dětí jsme provedli odběry slin před a po nutriční intervenci. Z celkového počtu 120 dětí jsme získali dvojice vzorků slin od 77 dětí, to je 64,2%. 33 dětí dostávalo mléko se suplementem 34 bez suplementu, denně v množství 200 ml mléka. Odebrané sliny byly vyšetřeny metodou jednoduché radiální imunodifuse a byly sledovány hodnoty SIgA, albuminu a lysozymu. Opět bylo využito poměru SIgA a albuminu pro výpočet sekrečního indexu. Statistické zhodnocení bylo provedeno s použitím programu Microsoft Excel a InSTAT 3. 1

Graf 1.: Salivární albumin před a po suplementaci (log hodnoty) albumin mg /L (log) 2,1 2,05 2 1,95 1,9 1,85 1,8 p<0,0356 suplementovaní nesuplementovaní albumin mg / L slin 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Graf 2.: Albumin ve slinách u kontrolního souboru 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 dvojice č. 21 23 25 27 29 31 33 600 Graf 3.: Albumin ve slinách u suplementovaných dětí albumin mg / L slin 500 400 300 200 100 0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 dvojice č. 1

5.1.2.Výsledky a diskuse Graf 4.: Sekreční index před a po suplementaci (log hodnoty ) index 1,05 1 0,95 0,9 0,85 suplementovaní před po nesuplementovaní V grafu 1 jsou znázorněny hodnoty salivárního albuminu u suplementovaných a nesuplementovaných dětí před a po nutričním ovlivnění. Je patrné, že u suplementovaných došlo k výraznému poklesu hodnot albuminu z průměrné hodnoty 117 mg/l slin na hodnotu 79 mg/l slin. Zatímco u nesuplementovaných se hodnoty nesignifikantně, avšak přesto zvýšily z hodnoty 95 mg/l slin na 105 mg/l slin. Vyšší hodnoty u kontrolního souboru ukazují na setrvávající zánětlivou iritaci, která může být i ve vztahu k úrovni hygieny ústní dutiny. Překvapující jsou nálezy jednotlivých dvojic albuminu před a po suplementaci u kontrolního souboru a u suplementovaného souboru. Zatímco u kontrolního souboru došlo v několika případech ke zvýšení i ke snížení hodnot (graf 2.), je v grafu 3 patrný velice významný pokles hodnot albuminu u suplementovaných dětí, především ve vzorcích s extrémně vysokými hladinami albuminu. Tento pokles je natolik významný, že po suplementaci se v hodnotách signalizujících zánět (nad 100 mg/l slin) nacházelo pouze 7 jedinců z původních 14 extrémně zvýšených nálezů. Tyto nálezy dokumentují výrazné protizánětlivé působení nukleotidů, pravděpodobně na bázi aktivace imunitních funkcí celého imunitního systému GALT. Jak jsme ve zvířecích modelech prokázali, výrazné zvýšení a reparace střevních klků vede pravděpodobně nejenom ke zvýšení imunitních funkcí, ale i aktivací alfa a beta defenzinů k celkovému zlepšení homeostázy imunitních funkcí. V grafu 4. se ukazuje, že lokální produkce IgA je u suplementovaných dětí daleko výraznější než u dětí nesuplementovaných. Na tomto místě je nezbytné podotknout, že vybraná skupina sledované populace byla často v nutričním deficitu a jak jsme zjistili z dotazníkové akce, byla námi podávaná svačinka u většiny druhým jídlem celodenní spotřeby. 5.1.3. Závěry Nutriční suplementace mlékem obohaceným nukleotidy a polypeptidy významně ovlivnila parametry sekreční imunity. Účinek je výraznější ve skupině rómských dětí především z důvodů krytí nezbytných základních energetických požadavků. Prokázali jsme v kontextu s názory jiných autorů význam ekoimunonutričních zásahů v regulaci a udržování homeostázy imunitních mechanizmů sliznic. 6. Nové cesty suplementace 6.1. Seniorské populace Existuje řada složek potravy, u kterých již dnes vykazují epidemiologické studie významný přínos v prevenci nádorových, srdečně cévních i autoimunních onemocnění. I když tyto látky mají mnohem větší význam především v ranném věku, nelze podceňovat jejich účinek pro zdraví i v období časného a pozdního seniorského věku. 1

Po zkušenostech našich pracovišť s aplikací nukleotidů, o jejichž významu v reparaci řady fyziologických funkcí bylo ve světové literatuře předloženo mnoho důkazů, jsme přistoupili ke studiu účinku nukleotidů v komplexu preparátu ve složení: 1 mg Imuregenu 5 mg dihydroquercetinu 50 mg vitamínu C 20 mg Zn laktátu Preparát byl podáván ve skupinách seniorské populace v různých zařízeních Ústeckého kraje. 6.1.1. Soubor a metoda 3-měsíční podávání preparátu 30 seniorům bylo kontrolováno souborem 15 jedinců, kterým byl poskytován placebo preparát. Pro sledování účinku jsme využili odběrů provedených v rámci pravidelné komplexní prověrky zdravotního stavu. Kromě série 17 parametrů humorální imunity jsme sledovali i kvalitu psychického stavu jedince a jeho pohody. Hodnocení bylo provedeno ze vstupního vyšetření a vyšetření po skončení programu. 6.1.2. Výsledky a diskuse Hodnocení výsledků u jednotlivých sledovaných osob jak se suplementem tak bez suplementu bylo velmi obtížné především z důvodu věkové heterogenity skupiny a mnohdy výrazných změn při vstupním vyšetření, signalizující často vážné onemocnění. Přesto jsme zaznamenali významné ovlivnění v ukazatelích zánětu, kde jsme prokázali pokles hodnot C- reaktivního proteinu ze 75 na 43 mg/l (P=0,01). V souvislosti s tím jsme zjistili zlepšení hodnot složek komplementu - především C3, kde došlo ke zvýšení z 96 na 123 mg (p=0,001). Významný je rovněž vzestup hodnoty prealbuminu z 0,221 mg/l na 233 mg/l a to především z důvodu jeho poklesu v kontrolní skupině 0,219 na 0,174 mg/l (p=0,047). To ukazuje na výrazné zlepšení nutričního stavu. Velmi překvapující jsou pro nás nálezy změn hodnot revmatoidního faktoru, kde oproti kontrolní skupině jsme po tříměsíční suplementaci zjistili významný pokles (p=0,0039) (graf 1.). Tomu odpovídá i významný pokles hodnot cirkulujících imunitních komplexů, zatímco u kontroly došlo k jejich zvýšení. Zkvalitnění imunitní odpovědi již po této krátkodobé suplementaci je dokumentováno vzestupem průměrných hodnot přirozených protilátek (xenoaglutininů), které u kontrolní skupiny nevykázali žádnou změnu. 140 120 100 Graf 1.: Revmatoidní faktor před a po suplementaci seniorů ředění 80 60 40 20 0 CH Staff DD CH DEM OHS LT S LT K před po 1

6.1.3. Souhrn a závěr Opakovaně jsme prokázali význam suplementace seniorské populace s použitím suplementu s obsahem nukleotidů. Bereme v úvahu i zřejmý aditivní účinek kladného vlivu psychického ovlivnění tohoto populačního vzorku. Soudíme, že nutriční ovlivnění má význam i v populaci seniorské, především z důvodu ovlivnění zdraví i psychické pohody. V souhlase s literaturou považujeme za nezbytné věnovat pozornost této problematice mimo jiné i proto, že seniorská populace bude vykazovat v následujících letech neustálý vzestup. Hodnoty LFT u suplem entované a kontrolní seniorské populace (před a po s uplem entaci) LFT (ředění séra) 300 250 200 150 100 50 0 249 150 p=0,039 39 52 p=0,096 s uplem entovaní nes uplem entovaní KLINICKÁ ČÁST 1. Přínos speleoterapie s nutričním režimem pro léčbu alergických onemocnění Nápadný růst alergických onemocnění v celé naší dětské populaci vede k hledání dalších možných léčebných zásahů, které by přispěly ke zlepšování zdravotního stavu postižených dětí. Jednou z možných cest je odstranění dítěte z expozice škodlivin jak domácího (bytového) prostředí tak prostředí exteriérů. U alergických dětí pak jsou v naší republice již dlouhodobě využívány kapacity různých zařízení s vhodným klimatem pro přídatnou léčbu alergiků. Jsou to například pobyty s režimem speleoterapie, při kterých jsou využívány další možné přístupy včetně nutričního zásahu. V rámci řešení výzkumu jsme sledovali vliv speleoterapie na zdravotní stav alergiků. 1.1. Soubor a metoda V první etapě jsme porovnávali zdravé jedince bez výjezdu s alergickými jedinci rovněž bez výjezdu a alergiky, kteří absolvovali režim speleoterapie. V první skupině zdravých jedinců jsme sledovali 23 dětí ve věku 8-12 let, ve druhé skupině alergiků bez výjezdu 21 dětí se stejným věkovým průměrem a ve třetí skupině 31 dětí, které absolvovali 3 týdenní pobyt v léčebně ve Zlatých horách s režimem speleoterapie (bez nutričního zásahu). U všech sledovaných jedinců byly provedeny odběry před zahájením studie, dále po absolvování režimu za tři týdny a poslední vzorek za tři měsíce. Ve slinách byly vyšetřeny hodnoty IgG, SIgA, IgM, lysozymu a albuminu. Výsledky byly statisticky zpracovány s použitím programu Microsoft Excel a InSTAT 3. 2

1.2. Výsledky a diskuse Z grafu 1 je patrné, že hodnoty albuminu u zdravých dětí byly statisticky významně nižší oproti alergickým dětem s výjezdem i bez výjezdu. Tyto hodnoty se v průběhu celého sledování u kontrolních zdravých dětí prakticky nezměnily. Rovněž tak hodnoty salivárního albuminu u alergických dětí bez výjezdu nevykazovaly statisticky významné změny v průběhu celého sledování. U dětí s režimem speleoterapie jsme však zjistili významný pokles hodnot albuminu po absolvování režimu speleoterapie, avšak za tříměsíční epizodu došlo k pozvolnému vzestupu těchto hodnot. Přesto tyto hodnoty byly významně nižší než u alergiků bez režimu speleoterapie a nelišily se od nálezů zdravých dětí. Graf 1: Salivární albumin u alergických dětí a kontrol (průměrné hodnoty a SD) 150 albumin mg / l slin 100 50 0 1 2 3 zdraví 54,8 52,2 58,8 alergici bez výjezdu 88,2 86,3 91,2 speleoterapie 95,1 26,8 65,5 odběry Z grafu 2 vyplývá, že hodnoty SIgA jsou u alergiků statisticky významně vyšší než u kontrolní skupiny dětí. Je to způsobeno částečně i kontaminací slin sérovým IgA. U alergiků, kteří absolvovali režim speleoterapie jsme zjistili významný pokles hodnot SIgA, který setrvával v posledním odběru. Graf 2: SIgA sledovaných souborů dětí (průměrné hodnoty a SD) SIgA mg / l slin 100 80 60 40 20 0 1 2 3 zdraví 46,1 46,1 27 alergici bez výjezdu 81,2 83,1 85,2 speleoterapie 77,4 64,6 53 2

Dynamika změn IgA a albuminu se projevila u hodnot sekrečního indexu (graf 3), kde jsme nalezli významný vzestup ve druhém odběru sledovaným poklesem do stejných hodnot jako u jedinců bez výjezdu do režimu speleoterapie. Graf 3: Poměr SIgA/albumin (sekreční index) (průměrné hodnoty a SD) sekreční index 600 400 200 0 1 2 3 zdraví 156,1 155,6 83,6 alergici bez výjezdu 178,5 177,2 185,2 speleoterapie 167,5 324,9 190,4 odběr Souhrn V této první části jsme prokázali příznivý vliv léčebného pobytu s režimem speleoterapie u dětí s alergickým onemocněním. Považujeme za významné sledovat tento efekt opakovaně s využitím delšího režimu léčby a se zajištěním dalších postupů, které by příznivě ovlivnily zdravotní stav alergické populace. Z tohoto důvodu jsme přistoupili k režimu speleoterapie v kombinaci s nutričním ovlivněním dětské populace. Graf 1.: Salivární albumin u dětí s astma bronchiale a recidivujícími infekcemi HCD před a po speleoterapii (skupina a + c = suplementovaní) albumin mg /L slin 200,00 150,00 100,00 50,00 0,00 a b c d Řada1 175,33 141,06 145,99 137,90 Řada2 98,86 128,67 107,53 128,21 Skupiny: A: astma bronchiale + suplement B: dtto bez suplementu C: recidivující infekce HCD + suplement D: dtto bez suplementu 2

V pokračování studie jsme zařadili celkem 45 dětí s astma bronchiale a 43 dětí s onemocněním recidivujících infekcí horních cest dýchacích. Jak je patrné z grafu 1, došlo k výraznému zlepšení nálezů především u dětí s nutričním režimem (suplement s poly a oligonuklotidy), skupina A a C. Hodnoty albuminu u jedinců s astma bronchiale statisticky významně poklesly a stejně tak i u dětí s onemocněním recidivujících infekcí HCD. Zlepšení u dětí bez suplementu bylo méně výrazné avšak prokazatelné. Tyto nálezy jsou v souladu s literárními údaji, které uvádějí, že již krátká suplementace odpovídající dávkou nutričního suplementu může vést k rychlé úpravě imunitních parametrů. V této studii pokračujeme s hodnocením odběrů, které jsou prováděny po 6-ti měsících po absolvovaném léčebném režimu. 2. Ovlivnění zdravotního stavu u jedinců s klinickými projevy únavového syndromu s definicí EBV infekce Klinické projevy únavy jsou doprovodným jevem řady chronických infekcí, nutričních incuficiencí (deficit železa) a dalších dodnes dobře nespecifikovaných onemocnění. Ukazuje se, že klinika únavového syndromu je vyjádřením neschopnosti medicíny definovat blíže a specificky řadu onemocnění. Aspekty chronické EBV infekce, respektive polyherpetického syndromu japonských autorů, jsou neustálým předmětem sledování ve světové literatuře. Všichni postižení touto klinickou jednotkou vykazují spolu s klinickými projevy únavy i vysoké skóre Holmesových kritérií. V rámci komplexního sledování a léčby této jednotky jsme kromě léčby přenosovým faktorem využili i možnosti nutriční suplementace sledovaných jedinců jednak minerály a pro tuto studii i přípravkem Imuregen s vysokým obsahem polypeptidů, oligo a polynukleotidů. 2.1. Soubor a metoda Do souboru jsme zařadili celkem 26 pacientů, polovina s placebo preparátem, druhá polovina s preparátem Imuregen v dávkování 2x2 tablety denně po dobu 3 měsíců. Před a po nutriční suplementaci bylo provedeno komplexní imunologické vyšetření, sledující parametry humorální imunity, protilátkovou odpověď proti herpetickým virům (HSV1, HSV2, HSV6) a proti CMV a EBV. Buněčná imunita byla vyšetřena imunofenotypizací metodou průtokové cytometrie. Na základě nálezů zvířecího modelu jsme věnovali pozornost především sledování populace buněk spontánní cytotoxicity (NK). 2.2. Výsledky Výsledky jsou patrné v grafu 1. Zatímco v souboru placebo nedošlo k významným změnám této lymfocytární subpopulace, v souboru s podáváním nukleotidů došlo ke zvýšení počtu buněk z průměrné hodnoty 257 na 354 buněk na mikrolitr séra (p=0,000913). NK lymfocyty u EBV infekce po nutričním zásahu ( N = suplementovaní - P = placebo) 400 CD16+56+/ bb/uml 350 300 250 200 p=0,0009 150 100 p1 p2 n1 n2 2

Společně se zlepšením nálezu buněčných lymfocytárních subpopulací došlo i ke zlepšení parametrů Holmesova kritéria, významné úpravě klinických projevů a ke zlepšení funkčních jaterních testů. 2.3. Závěr Nutriční suplementace pacientů s únavovým syndromem na bázi aktivované EBV infekce jsme dosáhli nutriční suplementací významné úpravy laboratorních parametrů i klinických projevů onemocnění. 3.Suplementace pacientů s inhalační alergií způsobenou roztoči domácího prachu Neustálý vzestup projevů inhalační alergie v celém světě i v naší republice je vážným zdravotnickým problémem. V současné době zjišťujeme v epidemiologických studiích provedených v okrese Ústeckého kraje již více než 50% respondentů s pozitivitou buď celkového IgE nebo specifických protilátek IgE proti inhalačním alergenům, potravinovým alergenům a alergenům latexu. V tomto populačním vzorku s pozitivní odpovídavostí nacházíme více než 30% jedinců s jasnými klinickými projevy inhalační alergie. Kromě klasické léčby alergických onemocnění je ve světě stále častěji používáno nutričních zásahů nejenom s preventivním záměrem (těhotné ženy), ale i se snahou akcelerovat odpovídající základní léčbu. 3.1. Soubor a metoda Do souboru zařazujeme postupně inhalační alergiky definované klinickými projevy onemocnění spolu s aktivitou specifických protilátek IgE proti alergenu d1 (Dermatophagoides pteronyssin). U všech jedinců bylo vyšetřováno celé základní spektrum inhalačních alergenů s použitím diagnostických souprav firmy Phadiatop. Dále byly sledovány hodnoty celkového IgE, hodnoty ECP, hodnoty základních proteinů a hodnoty eosinofilů. Na tomto místě referujeme o prvních výsledcích studie, ve které jsme podávali kromě základní léčby i suplement nukleotidů odpovídající dávce dvou tablet denně a individuální vakcínu proti roztočům domácího prachu. Celkem bylo suplementováno 12 jedinců, placebo dostávalo 8 jedinců. 3.2. Výsledky a diskuse Výsledky suplementovaných pacientů s respirační alergií léčených standardní léčbou, vakcinací se suplementací a bez suplementace (placebo preparát ve stejném balení) jsou znázorněny na grafu 1. Vliv suplementace nukleotidy na desenzibilizaci s alergenem d1 d1 ku/l séra 20 18 16 14 12 10 8 NUKLEOTIDY PLACEBO 6 4 2 0 1 2 3 odběr 2

Z grafu je patrné, že průběh desenzibilizace od vstupního vyšetření je v průběhu jednoho roku aplikace nukleotidů spolu s vakcínou významně účinnější. Dochází ke statisticky významnému poklesu protilátek proti d1 ve srovnání se skupinou placebo, avšak i v této skupině je patrný významný efekt vakcinace. Toto zlepšení je pravděpodobně způsobeno reparačními pochody obnovujícími střevní sliznici s indukcí dalších mediátorů, které ovlivňují rozpoznání podávané vakcíny a její účinek. V neposlední řadě kalkulujeme rovněž s možností indukce dalších regulačních mechanizmů jak na buněčné úrovni tak na úrovni imunitních procesů sliznice střevního traktu (betalyziny, muciny atd.). Této problematice se hodláme nadále věnovat. Rychlá reparace klinických projevů u suplementovaných jedinců s respirační alergií nás vede ke snahám o stejný postup u alergických projevů s potravinovou alergií a atopiků. 4. Suplementace nukleotidy u zánětlivých onemocnění gastrointestinálního traktu Chronické nespecifické záněty střevního traktu jsou provázeny velice často extrémními ztrátami nejenom energetickými, ale i ztrátami mikronutrientů. Obecně jsou studovány změny u nemocných touto klinickou jednotkou jak v imunitní odpovědi specifické tak i nespecifické a neustále přetrvává snaha o detailní definici patogeneze onemocnění. Tradiční pozornost tomu věnovalo ústecké pracoviště pod vedením doc. Bittra na počátku sedmdesátých let. S tímto pracovištěm spolupracujeme s různým časovým odstupem. V souvislosti s našimi předchozími nálezy se snažíme nivelizovat dopady chronického zánětu na parametry imunitní odpovědi jak u nemocných ulcerózní kolitidou tak i Crohnovou chorobou. V této studii jsme se věnovali otázkám energetické suplementace s použitím jak DNA tak nukleotidů u souboru 30 nemocných ulcerózní kolitidou. 4.1. Soubor a metoda Pro studii jsme si vybrali 30 pacientů s onemocněním ulcerózní kolitidou, s definovaným klinickým průběhem, potvrzeným histologicky. Sledujeme celkem 17 žen ve průměrném věku 63,5 let (v rozmezí 44 90 let) a 13 mužů s průměrným věkem 65,7 let ( rozmezí 38 79 let). Všichni sledovaní pacienti byli suplementováni přípravkem Imuregen s vysokým obsahem oligo a polynukleotidů a byli imunologicky sledováni po dobu 2 měsíců suplementace v dávce 2 6 tablet denně (dle hmotnosti). Kontrolní odběry byly provedeny po 6 měsících od začátku suplementace. V této části studie jsme se zaměřili na sledování parametrů humorální imunity a to především indikátorů zánětu a indikátoru nutričního stavu. 4.2. Výsledky a diskuse V grafu 1 jsou znázorněny hodnoty prealbuminu při vstupním vyšetření, po aplikaci a ve třetím vzorku za 6 měsíců po aplikaci preparátu. Nalezli jsme statisticky významné zvýšení hodnoty prealbuminu mezi prvním a druhým a prvním a třetím odběrem, což dokumentuje nejenom zlepšení nutričního stavu, ale i zlepšení imunitního potenciálu sledovaných jedinců. Vyšší hodnota prealbuminu dokumentuje vyšší úroveň imunoregulačních funkcí orgasmu. Je známo, že prealbumin má strukturu velice blízkou k thymickým působkům (Thymosin), působícím jako modulátor T- buněčné imunitní odpovědi. Stejně tak jsme zjistili významnou reakci u parametrů sledované složky komplementu C3 (graf 2). 2

Graf 1: Prealbumin s souboru Colitis ulcerosa suplementace Imuregenem Prealbumin mg/l séra 320 310 300 290 280 270 260 p=0,001 1 2 3 Odběr č. Nalezli jsme statisticky významný pokles hodnot C3 prakticky u všech sledovaných, což dokumentuje na jedné straně snížení reakce chronického zánětu, na druhé straně pak i významně sníženou spotřebu složky C3 (graf 2). Tomu odpovídá i dynamika změn hodnot imunoglobulinů třídy M, kde po prvním zvýšení v odběru po suplementaci dochází k normalizaci hodnot, která dokumentuje významně nižší zánětlivou alteraci a pravděpodobně zvýšenou schopnost sekreční imunita nivelizovat antigenní impulsy cestou GI traktu (graf 3). To nasvědčuje tomu, že nukleotidy přispívají stejně jako v modelových pokusech k urychlené reparaci sliznice GI traktu, zvýšené produkci mucinu a dalších složek nespecifické imunity jako například lysozymu a betadefenzinu. Společně s touto úpravou konstatujeme i významný pocit spokojenosti pacientů s léčbou. Vzhledem k tomu, že soubor evidovaných pacientů Masarykovy nemocnice v Ústí nad Labem je dostatečně široký a dobře klinicky definovaný, považujeme za účelné dále sledovat tyto jedince nejenom z hlediska nutričního ovlivnění, ale i z hlediska jejich bližší imunogenetické klasifikace. V rámci studie jsme zjistili, že onemocnění ulcerózní kolitidou postihuje daleko častěji pacienty s poruchou serpinů (nález ZZ deficitu alfa 1 antitrypsinu), která je u těchto postižených 40x častější než u normální populace. Graf 3.: Vliv suplemenatce Imuregenem na parametry složky komplementu C3 C3 mg / séra 160 140 120 100 80 60 40 20 0 p = 0,001 p = 0,001 1 2 3 odběr č. 2

Hodnoty IgM po suplementaci Imuregenem u nemocných ulcerózní kolitídou IgM mg / l séra 140 120 100 80 60 40 20 0 p = 0,05 p = 0,05 1 2 3 odběr č. 4.3. Závěr Naše výsledky ukazují, že suplementace dietárnímu nukleotidy přispívá významnou měrou pro reparaci imunitních funkcí nemocných postižených onemocněním ulcerózní kolitidou. 5. Výstup V rámci projektu jsme zvažovali možnost uplatnění preparátu české provenience, vhodného pro aplikaci v nutriční suplementaci, jak v preventivní tak v klinické medicíně. V porovnání s preparáty DNA jsme zjistili, že prakticky stejný účinek jako ekonomicky náročné preparáty DNA, připravené z kvasinek (firma SIGMA) mají preparáty naší provenience na bázi oligo a polynukleotidů. Dokumentujeme to při aplikacích jak preventivních, u dětí mateřských i základních škol, u seniorské populace. Účinek dokumentujeme i v řadě klinických onemocnění, což odpovídá experimentálním studiím provedených v rámci tohoto projektu. Dobré zkušenosti s preparátem včetně jeho finanční nenáročnosti nás vedly k úvaze o možném rozšíření preparátu v aplikaci v pitné formě v prvé řadě pro populaci významně exponovanou zvýšeným rizikům profesionální expozice chemickým a fyzikálním škodlivinám. Doporučili jsme na základě našich zjištění využít formuli preparátu oligo a polynukleotidů (Imuregen) spolu s navážkou flavonoidů (Grape seed oil) a s vitamínem C spolu s nízkou dávkou zinku. V pilotní studii jsme testovali účinek preparátu tohoto složení v malé krátkodobé sérii u pracovníků firmy Glaverbel, kde jsme měli možnost počítačovým systémem definovat jak spotřebu nápoje s uvedeným preparátem tak i výsledný efekt podávání. Zjistili jsme, že aplikace preparátu vedla v kritickém období chřipkové epidemie 2003/2004 k významné redukci nemocnosti. Na základě těchto údajů jsme ve spolupráci s Ústavem pracovního lékařství / SZÚ (Prof. Cikrt) doporučili rozšíření aplikace na další rizikové provozy. V současné době je nápoj výše uvedeného složení programován a schválen útvarem hlavního hygienika MZČR. 2