Mnohočetná léková rezistence u nádorových onemocnění MASARYKOVA UNIVERZITA

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie Mnohočetná léková rezistence u nádorových onemocnění Brno, 2008 Kamila Kýrová

Poděkování: Ráda bych touto cestou poděkovala vedoucí bakalářské práce Mgr. Jarmile Navrátilové, PhD. za cenné rady, které mi při zpracování daného tématu udělila, a za čas, který mi věnovala. 2

OBSAH 1. Úvod...5 2. Obecný úvod k MDR...6 3. Typická a atypická MDR...6 3.1. Typická MDR...6 3.2. Atypická MDR...7 4. Geny a proteiny ovlivňující MDR...7 4.1. Nádorově supresorový gen p53...7 4.2. PKC...8 4.3. Gen WT1...9 4.4. Rodina ABC transportních proteinů...9 4.4.1. Pgp...10 4.4.2. MRP...11 4.5. LRP...12 4.6. Protein Bcl-2...14 4.7. HSP...14 5. Mechanizmy vniku MDR...15 5.1. Mechanizmy vniku rezistence nádorových buněk na protinádorovou léčbu...15 5.2. Konkrétní příklady mechanizmů způsobujících MDR...16 5.2.1. Bodová mutace v genu bcr-abl...16 5.2.2. Změny intracelulárního a extracelulárního ph u MDR buněk...16 5.2.3. GST, GSH...17 5.2.4. Topoizomerázová aktivita...17 5.2.5. Pozměněná regulace apoptózy...18 6. Protinádorová terapie...19 6.1. Chemoterapie...19 6.2. Imunoterapie...21 6.2.1. Monoklonální protilátky...22 6.2.2. Modifikátory imunitní odpovědi...22 6.2.3. Vakcíny proti nádorům...23 7. MDR a její ovlivnění...24 7.1. Inhibitory kalciového kanálu...24 7.2. Vliv pohlaví na MDR...25 7.3. Oligosacharidy hyaluronanu...25 3

8. Možnosti potlačení MDR...26 8.1. si-rna...26 9. Závěr...28 Seznam zkratek...30 Použitá literatura...32 4

1. Úvod Chemoterapie patří, společně s chirurgií a radioterapií, k nejstarším léčebným metodám nádorových onemocnění. V současnosti se objevují nové léčebné metody jako genová terapie či imunoterapie, jejichž využití v praxi by v budoucnosti mohlo zvýšit úspěšnost nádorové terapie a omezit její dosavadní nežádoucí účinky. Žádné z nových metod se prozatím nepodařilo nahradit chemoterapii, která tak patří k nejdůležitějším terapeutickým strategiím. Rozvoj současné chemoterapie je zaměřen na vývoj nových typů cytostatik s nižší toxicitou zabraňujících vzniku rezistence, která je častým důvodem selhání protinádorové léčby. Kromě rezistence na jednotlivá cytostatika se setkáváme i s mnohočetnou lékovou rezistencí (MDR, multidrug resistance), která způsobuje selhání alternativní léčby, při které byly podány takové druhy cytostatik, které nebyly použity v předešlé léčbě (před dosažením remise). Právě MDR věnuji ve své práci největší pozornost. Se vznikem MDR je spojena řada genů a jejich produktů, které různými mechanizmy zajišťují odolnost buněk vůči chemoterapii. Ať už se jedná o změny transportních proteinů, změny v drahách programované buněčné smrti nebo o změny v signálních drahách, většinou se na vzniku MDR podílí více faktorů. Cílem této práce je mechanizmy vzniku MDR charakterizovat a uvést konkrétní příklady genů a proteinů, které značnou měrou přispívají ke vzniku MDR. V druhé části práce se budu věnovat léčbě nádorových onemocnění pomocí chemoterapie a imunoterapie. A na závěr uvádím možnosti potlačení MDR, a to nejen pomocí farmakologických přípravků, ale i využitím molekulárně biologických přístupů. 5

2. Obecný úvod k MDR Na přelomu 60. a 70. let získala chemoterapie stejné postavení jako chirurgie a radioterapie (Nosková a kol., 2000a). Přes tento nesporný pokrok nebyl vyřešen problém odhadu účinnosti cytostatické léčby a míry její toxicity pro pacienta. Okolností, které ovlivňují cytostatickou léčbu a způsobují různorodou odpověď onkologických pacientů na ni, je několik. Teoreticky je můžeme rozdělit do dvou skupin: a) závislé od pacienta (věk, pohlaví, renální a jaterní funkce, vazebná kapacita plazmatických proteinů, souběžná léčba jinými medikamenty, ) b) závislé od nádoru (typ, lokalizace, rozsah, agresivita, metastatická aktivita, předchozí léčba, ) Nejčastější příčinou komplikací a selhání protinádorové léčby je schopnost nádorových buněk odolávat účinkům cytostatických látek (= rezistence). Pokud nádorové buňky odolávají účinkům cytostatické léčby již při první léčbě, jedná se o rezistenci primární (přirozenou). Sekundární (získaná) rezistence vzniká až v průběhu léčby, kdy se původně citlivé buňky stávají k dané cytotoxické látce rezistentní, a tím se účinnost léčby snižuje (Nosková a kol., 2000a). Citlivost k jiným cytostatikům však může zůstat zachována. Pokud při vzniku rezistence na jedno cytostatikum vzniká rezistence i na jiné (často strukturálně příbuzné) cytostatikum, jedná se o rezistenci zkříženou. Bohužel se vyskytují i případy zkřížené rezistence mezi látkami, které nejsou strukturálně podobné a mohou mít dokonce jiný mechanizmus účinku. V těchto případech mluvíme o tzv. MDR. 3. Typická a atypická MDR 3.1. Typická MDR Typickou MDR způsobuje membránový P-glykoprotein (Pgp), který je produktem genu mdr1. Pgp je ATP dependentní membránová pumpa, která exportuje toxické látky z buňky a 6

způsobuje tak sníženou intracelulární koncentraci léčiv. V nádorové terapii je možné typickou MDR obejít pomocí chemosenzitorů, tzv. modulátorů (Nosková a kol., 2000a). Modulátory MDR jsou látky obnovující citlivost nádorových buněk k chemoterapeutikům (např. verapamil, tamoxifen, cyklosporin A, PSC-833, ). Bylo popsáno, že modulátory kromě přímé vazby na Pgp mají společný i zásah do metabolismu lipidů. V MDR buňkách zpomalují přeměnu ceramidů na glykosylceramidy. Ceramidy plní funkci signalizačních poslů v indukci apoptózy. Glykosylceramidy jsou prekurzory přibližně 200 známých glykosfingolipidů, které hrají roli v regulaci buněčné proliferace a neregulují apoptózu. Je pravděpodobné, že přeměna toxických ceramidů na netoxické glykosylceramidy chrání rezistentní nádorové buňky před apoptózou. 3.2. Atypická MDR Atypická MDR zahrnuje všechny mechanizmy MDR, na kterých se nepodílí Pgp (Nosková a kol., 2000b). Způsobit ji může změna subcelulární distribuce léčiva, změna farmakologicky účinné struktury léčiva, rozdílná kapacita DNA opravných procesů nebo změna v detoxifikačních metabolických drahách buňky. Atypická MDR je asociována často s MRP (multidrug resistance associated protein), LRP (lung resistance protein) a také s p-izoformou enzymu gluthathion-s-transferázy (GST-p). Navíc na rozdíl od typické MDR nezahrnuje rezistenci na vinca alkaloidy. 4. Geny a proteiny ovlivňující MDR Změna exprese prote;inů nebo enzymů, zejména těch zasahujících do buněčného cyklu, reparace DNA a apoptózy, může přispět k lékové rezistenci. Mezi klinicky významné se řadí proteiny Pgp, MRP, LRP, HSP, Bcl-2 a nádorově supresorové geny p53 a WT1. Jejich nadměrná exprese je asociována s MDR. 4.1. Nádorově supresorový gen p53 Nejčastěji mutovaným genem v lidských nádorech je gen kódující protein p53. Jeho nádorově supresorová aktivita je těmito mutacemi nebo jinými genetickými změnami 7

inaktivována (Bush and Li, 2002). Fosfoprotein p53 je v malém množství produkován i v normálních buňkách. Jeho množství vzrůstá při různých stresových situacích (např. poškození DNA, zástava syntézy DNA i RNA, ionizující záření, UV-záření, aplikace léčiv poškozujících DNA). Důsledkem těchto dějů je zástava buněčného cyklu, aktivace mechanizmů reparace DNA nebo indukce apoptózy. Obecně je známo, že mutace v genu p53 zhoršují prognózu pacientů a zvyšují riziko vytvoření rezistence k chemoterapii a radiačnímu záření (Taubert a kol., 1996). Předpokládá se, že v buňkách s mutací v genu p53 (mut p53), které jsou vystavené genotoxickým vlivům, nedochází k expresi pro-apoptického genu bax a současně buňky ztrácejí kontrolu nad přechodem z G1 do S fáze buněčného cyklu v důsledku nízké hladiny proteinu p21 WAF1 v buňce. Tomu odpovídají poznatky, že MDR fenotypem se vyznačují ty buňky nádorů měkkých tkání (např. karcinom prsu, varlat, vaječníků), které exprimují mut p53 (Zhan a kol., 2005). Obnovení exprese WT p53 (wild type p53) u těchto buněk zvýšilo jejich citlivost k chemoterapii. Existují dva mechanizmy, kterými WT p53 potlačí MDR fenotyp. Prvním je přímé snížení exprese mdr1 a druhým je potlačení exprese genu kódujícího PKC (proteinkináza C), která se také podílí na vzniku a rozvoji MDR. Bylo prokázáno, že WT p53 inhibuje aktivitu promotoru genu PKC. I když na promotoru PKC nebyla nalezena konzervativní sekvence vázající protein p53, je možné, že důležitou roli v inhibici transkripce PKC hraje některý cis (nebo trans) element vázající transkripční faktor potlačující transkripci PKC a regulovaný prostřednictvím WT p53. (Zhan a kol., 2005). Z těchto poznatků vyplývá, že terapie založená na využití molekulárních mechanizmů zasahujících mut p53 a PKC, by mohla znamenat novou účinnou strategii potlačení MDR fenotypu a kontroly průběhu onemocnění. 4.2. PKC U některých nádorů byla odhalena zvýšená aktivita PKC ve srovnání s její aktivitou v okolních tkáních (Zhan a kol., 2005). PKC patří do geneticky příbuzné rodiny proteinkináz, která sestává z Ser/Thr kináz a které jsou aktivovány extracelulárními signály. Konvenční PKC izoformy (α, βi, βii, γ) jsou aktivovány 1,2-diacylglycerolem a fosfatidylserinem mechanizmem závislým na přítomnosti vápenatých iontů. PKC jsou v inaktivním stavu lokalizovány převážně v cytosolu a po stimulaci jsou jako aktivní kinázy transportovány na určité místo buňky (cytoplazmatická membrána, membránové vezikuly, cytoskelet, mitochondrie, jádro). PKC mají důležitou roli v invazi a migraci nádoru, dále při zvýšené sekreci vaskulárně-endoteliálních 8

růstových faktorů a v rozvoji MDR fenotypu. Zvýšená exprese genů kódujících PKC byla pozorována u mnoha onemocnění, včetně rakoviny, proto se PKC staly hlavním cílem terapeutických zásahů. V terapii se využívá inhibitorů PKC, které dokáží obnovit citlivost rezistentních nádorových buněk k radioterapii a chemoterapii. PKC nejen zvyšují hladinu Pgp v buňce indukcí promotoru genu mdr1, ale i stimulují jeho aktivitu fosforylací klíčových aminokyselin. Tento fakt naznačuje, že PKC se nepřímo podílí na vzniku MDR fenotypu. 4.3. Gen WT1 Jiným genem, jehož výskyt je zachycen u jednotlivých typů leukémií, je gen WT1 (Wilm s tumor 1 gene), který byl původně nalezen u Wilmsova tumoru (Hirose a Kuroda, 1998). Jedná se o nádorově supresorový gen, který reguluje transkripci různých genů. V genomu je lokalizován na 11. chromozómu (11p13). Zvýšená exprese WT1 byla popsána u leukemických pacientů se špatnou prognózou a koreluje také se stupněm lékové rezistence podmíněné mdr1. WT1 by se mohl využívat jako spolehlivý diagnostický marker pro stanovení citlivosti k určitým léčivům a pro určení typu regulačního mechanizmu genu mdr1 během rozvoje MDR. 4.4. Rodina ABC transportních proteinů Toxické látky jsou z buněk odstraňovány pomocí různých mechanizmů. Jedním z těchto mechanizmů je transport toxinů z buňky přes membránu pomocí transportních proteinů (Nosková a kol., 2000a). Mezi tyto proteiny řadíme i ABC-transportní proteiny se širokou substrátovou specifitou a obsahující ATP-vazebnou kazetu (z angl. ATP-binding cassette). ABCtransportní proteiny tvoří superrodinu, která zahrnuje přes 50 proteinů, které vykazují rozsáhlou sekvenční homologii funkčních domén. Navíc všechny využívají k exportu toxinů z buňky energii fosfátových vazeb a bývají produkovány v normálních i nádorových buňkách (Leonard a kol., 2003). Zajišťují transport mnoha látek včetně exkrece toxinů z jater, ledvin, gastrointestinálního traktu a omezují průnik toxinů do důležitých orgánů (mozek, placenta, varlata). Mutace v genech, které kódují transportní proteiny, mohou indukovat řadu defektů, které se projeví v autozomálně recesivní sestavě (pozn. mutace v genu CFTR, který kóduje protein patřící také do rodiny ABC-transportních proteinů, je podkladem pro vznik cystické fibrózy). 9

Superrodina ABC-transportních proteinů se dělí do dvou podskupin Pgp a MRP. Obě podskupiny využívají jako substrát neutrální molekuly a organické kationty a navíc pro MRP slouží jako substrát i organické anionty (Marbeuf-Gueye a kol., 2000). 4.4.1. Pgp V roce 1976 bylo zjištěno, že zkřížená rezistence je způsobena sníženou akumulací léčiva v buňce (Kartner a kol., 1983). Později se prokázalo, že tento jev souvisí s nadměrnou expresí mrp1 (Pgp). Pgp je glykoprotein plazmatické membrány (P označuje zvýšenou permeabilitu), jehož původní předpokládanou funkcí byla regulace propustnosti buněčné membrány. Pgp je kódován genem mdr1, který je umístěný na 7. chromozómu (Bell a kol., 1987). Molekulová hmotnost kolísá v rozmezí 135-180 kda v závislosti na glykosylaci, standardně se uvádí hodnota 170 kda (Nosková a kol., 2000a). Míra glykosylace nemá vliv na lékovou rezistenci buněčných linií. Molekulu Pgp tvoří 128 aminokyselin. Je tvořena ze dvou homologních polovin, z nichž každá má ABC doménu i transmembránovou (TM) doménu (obr. 1). ABC domény jsou lokalizovány na vnitřní straně membrány (do cytoplazmy buňky). Obě poloviny spojuje vysoce nabitá oblast, která je na několika místech fosforylována PKC. Všechny transmembránové domény vytvářejí vodní porus, který má v průměru přibližně 5 nm. Je nutné, aby spolu obě homologní poloviny spolupracovaly a vytvořily tak jednu funkční transportní bílkovinu. Studie s fotoaktivním analogem ATP ukázaly, že ATP se váže na malý fragment ATP-vazebné domény Pgp. Mutace indukované v této oblasti měly za následek ztrátu funkce Pgp. Také delece na C- a N- konci molekuly Pgp způsobily ztrátu jeho transportní funkce, takže obě koncové oblasti mají zásadní význam pro správnou funkci Pgp (Currier a kol., 1989). Pgp podléhá posttranslačním modifikacím jako je glykosylace, fosforylace a defosforylace. Fosforylace a defosforylace probíhá hned na několika místech (Nosková a kol., 2000a). Na fosforylaci se podílí PKC a camp-dependentní proteinkináza A. Na rozdíl od glykosylace má fosforylace vliv na aktivitu Pgp a tím i na míru lékové rezistence. Přítomnost Pgp v nádorových buňkách je označována jako MDR fenotyp (Leonard a kol., 2003). Pgp je zodpovědný za zkříženou rezistenci na chemoterapeutika hlavně přírodního původu (př. paklitaxel, vinkristin, doxorubicin), ale i na jiná chemoterapeutika (imatinib mesylát - Glivec ), která nemusí mít strukturální podobnost, a jejichž mechanizmus účinku může být zcela odlišný (Lim a kol., 2007). Zvýšená exprese mdr1 byla zjištěna u 19 % pacientů s diagnostikou ALL, AML nebo CML v blastické krizi iniciální fáze nemoci a u 50 % nemocných v relapsu (Nosková a kol., 2000a). Zvýšená exprese genu mdr1 měla nepříznivý vliv na dosažení remise u dospělých s ALL. 10

Exprese mdr1 byla také spojována s celkově nižší úspěšností léčby u starších pacientů s AML (sledována byla skupina pacientů straších 55 let, medián 68 let). V těchto případech byla přítomnost Pgp prokazatelně špatným prognostickým faktorem (Lim a kol., 2007). Obrázek 1: Struktura Pgp a seznam substrátů a inhibitorů Pgp (Leonard a kol., 2003) 4.4.2. MRP (multidrug resistance associated protein, MRP1) MRP, obdobně jako Pgp, způsobuje sníženou akumulaci léčiva uvnitř buňky a pomáhá jeho vyloučení ven z buňky. MRP je lokalizován na cytoplazmatické membráně a na membránách endoplazmatického retikula (Nosková a kol., 2000b). Jedná se o ATP-dependentní membránovou pumpu pro glutathion-s-konjugáty. Podařilo se identifikovat šest MRP (MRP1 - MRP6), ale s MDR je spojován pouze MRP1. Gen pro MRP1 je lokalizován na 16. chromozómu v oblasti p13.1. MRP1 je tvořen 1531 aminokyselinami a jeho molekulová hmotnost činí 190 kda. Protein je tvořen membránovou doménou složenou z pěti transmembránových segmentů (α-helixů), dvou homologních částí (ty jsou složeny ze šesti transmembránových segmentů) a ABC domény. N-konec MRP1 je umístěn extracelulárně, což není pro nadrodinu ABC transportních proteinů typické. 11

MRP1 podléhá (stejně jako Pgp) glykosylaci a fosforylaci (Nosková a kol., 2000b), ale liší se velmi nízkou transportní specifitou pro paklitaxel a kolchicin (protinádorová léčiva, která náleží mezi nejlepší substráty pro Pgp). MRP1 způsobuje sníženou akumulaci léčiva uvnitř buňky a zvyšuje jeho vyloučení ven z buňky. MRP1 transportuje široké spektrum hydrofobních, záporně nabitých substrátů, patřících hlavně do skupiny gluthathion-s-konjugátů (od samotné oxidované formy glutathionu přes kyselinu ethakrynovou), avšak jeho afinita k cysteinyl leukotrienu (LTC4) byla ze všech zkoušených substrátů nejvyšší (LTC4 patří mezi gluthathion-s-konjugáty). Byl prokázán vztah mezi úrovní syntézy GSH (glutathion) a expresí MRP1. U MDR buněčných linií, které produkují nadměrné množství MRP1, vedlo snížení GSH ke zvýšení vnímavosti na některá léčiva (vinkristin, doxorubicin). 4.5. LRP (lung resistance protein) LRP nepatří do rodiny ABC transportních proteinů, ale přísluší k MVP (major vault protein). Jeho molekulová hmotnost činí 110 kda (Meschini a kol., 2002) a nachází se na cytoplazmatické a jaderné membráně (Leonard a kol., 2003). Gen kódující LRP je lokalizován na krátkém raménku 16. chromozómu - 16p11.2 (Izquierdo a kol., 1996) v blízkosti genů kódujících MRP a PKC-β (Silva a kol., 2007). LRP tvoří komplexy ribonukleoproteinových částic - vaults, které obsahují nejméně tři menší proteiny a malé molekuly RNA (Izquierdo a kol., 1996). Vaults jsou buněčné organely neznámé funkce (Leonard a kol., 2003). Zdá se, že mohou transportovat léčiva z jader nádorových buněk do lysozómů či exocytotických váčků (Nosková a kol., 2000a), a tak snižovat koncentraci léčiva v buňce (obr. 2). Je také možné, že LRP je pouze indikátorem rezistence, který způsobuje sníženou regulaci jiných proteinů, a jeho hlavní funkcí není transport léčiv (Izquierdo a kol., 1996). Zvýšená hladina LRP byla detekována u buněk střevního a plicního epitelu, v makrofázích a také v dendritických buňkách (všechny tyto buňky jsou vystaveny účinkům xenobiotik, což by mohlo znamenat, že vaults mají podíl na obraně tkání proti škodlivinám). Také látky poškozující DNA (např. UV záření) indukují zvýšení produkce LRP, což značí, že vaults se podílejí na reparaci DNA. Nejasnosti o funkci vaults byly podkladem pro vznik řady teorií, které se snaží jejich funkci vysvětlit. Mnohé z nich vychází z faktu, že většina vaults je přítomna v cytoplazmě a jen několik jich je lokalizováno na jaderné membráně poblíž komplexů tvořících jaderné póry. Vzhledem k této lokalizaci by mohly zprostředkovávat vazbu chemoterapeutik nebo proteinů (které chemoterapeutika váží) a podílet se na jejich vyloučení z buňky nebo přesunu na jiné místo 12

v buňce (kde jejich výskyt nemá chemoterapeutický účinek). Vaults by také mohly regulovat funkci jiných proteinů, které nepřímo souvisejí s rezistencí (např. PTEN). Obrázek 2 : LRP/vaults by mohly zprostředkovávat nukleocytoplazmatický a vezikulární transport léčiv. Léčivo by mohlo být vyloučeno z buňky prostřednictvím exocytotických vezikulů (Izquierdo a kol., 1996). PTEN (z angl. phosphatase and tensin homolog) je protein s nádorově supresorovou a fosfatázovou aktivitou a sekvenční homologií s některými cytoskeletárními proteiny (Silva a kol., 2007). Jeho funkcí je defosforylace fosfatidylinositol-3,4,5-trifosfátu (Masopust, 2007), která způsobí inhibici fosfatidylinositol-3-kinázové dráhy (PI3K dráhy). Naopak aktivace PI3K dráhy indukuje přežívání buněk, jejich migraci a angiogenezi. Tyto procesy podporují maligní transformaci buněk a vznik rezistence. Nejvyšší koncentrace PTEN je během G 0 a G 1 fáze buněčného cyklu a k poklesu dochází během S fáze (Silva a kol., 2007). Význam přemisťování PTEN mezi jádrem a cytoplazmou v závislosti na fázi buněčného cyklu zůstává nejasný. Probíhající výzkum v této oblasti naznačuje, že PTEN v jádře snižuje hladinu cyklinu D1 a tím zpomaluje průběh buněčného cyklu. Naopak cytoplazmatický PTEN je vyžadován pro indukci apoptózy. Navíc se prokázalo, že interakce s MVP je nezbytná pro transport PTEN z cytoplazmy do jádra, kde PTEN zastavuje buněčný cyklus a inhibuje apoptózu. Vzhledem k tomu, že cytotoxická léčiva a radiace většinou působí na rychle se dělící buňky, prodloužení buněčného cyklu poskytuje dostatek času na aktivaci 13

reparačních mechanizmů buňky, což podporuje vznik rezistence. Takže PTEN, ač nádorový supresor, může zastavením buněčného cyklu podpořit vznik nádorové rezistence 4.6. Protein Bcl-2 (z angl. B-cell lymphoma 2) Bcl-2 je anti-apoptický protein. Jeho exprese se vztahuje k MDR u některých typů nádorových onemocnění (Fernandes a kol., 2006). Známou úlohou proteinové rodiny Bcl-2 je regulace mitochondriální cesty apoptózy. Tuto cestu aktivuje otevření mitochondriálních permeabilních převodních pórů (PTP - permeability transition pore), snížení transmembránového potenciálu a uvolnění apoptogenních faktorů z vnitřní membrány mitochondrií. Tak např. uvolnění cytochromu c do cytosolu spouští řadu pochodů, které vedou k apoptóze. Předpokládá se, že proteiny Bcl-2 mohou regulovat některé zásadní události vedoucí k apoptóze, zejména otevírání PTP a snížení transmembránového potenciálu. Bcl-2 chrání buňky před škodlivými vlivy, které stimulují apoptózu (UV-záření, záření gamma, TNF, látky indukující produkci volných kyslíkových radikálů). Anti-apoptické proteiny z rodiny Bcl-2 (Bcl-2, Bcl-xL) inhibují buněčnou smrt formováním komplexů s pro-apoptickými činiteli (Bax, Bad). Ukázalo se, že snížená exprese bcl-2 stimulovala nádorové buňky k apoptóze. Naopak zvýšená exprese bcl-2 snížila apoptózu indukovanou některými chemoterapeutiky používanými v klinické léčbě a vedla tak k chemorezistenci (shrnuto v Krishna and Mayer, 2000). 4.7. HSP (heat shock proteins) HSP náleží do skupiny intracelulárních proteinů exprimovaných konstitutivně anebo po vystavení nějakému fyzikálnímu či biologickému stresu (Thomas a kol., 2005). HSP byly detekovány v nádorových i normálních buňkách a mohou zastávat funkci tzv. chaperonů (což jsou proteiny, které napomáhají sbalování polypeptidového řetězce do vyšších struktur a skládání proteinových podjednotek do nadmolekulárních celků). HSP mohou být také zapojeny do regulace apoptózy a získané údaje nasvědčují tomu, že se podílejí na lékové rezistenci. Častěji než v normálních buňkách jsou HSP exprimovány v nezralých buňkách (blastech) u AML. Jednotlivé subtypy AML (podle FAB klasifikace) nemají vliv na zvýšenou expresi HSP, i když HSP 90 a HSP 110 byly exprimovány hlavně u subtypu M5. Zvýšená exprese HSP se vyskytla u pacientů s průměrným nebo nepříznivým karyotypem a je spojována s nižší kompletní remisí a kratší dobou přežívání pacientů (studie zahrnovala všechny zkoumané HSP HSP 27, 14

HSP 60, HSP 70, HSP 90, HSP 110). Tyto výsledky naznačují, že by syntéza HSP mohla doprovázet lékovou rezistenci. 5. Mechanizmy vniku MDR 1996) 5.1. Mechanizmy vzniku rezistence nádorových buněk na protinádorovou léčbu (Klener, a) Změny farmakokinetiky - snížená resorpce cytostatika - urychlení biotransformace - rychlejší inaktivace cytostatika - urychlené vylučování cytostatika b) Změny cytokinetiky Růst nádoru je doprovázen přechodem většiny nádorových buněk do klidového stavu G 0, ve kterém je citlivost k chemoterapii omezená. Zástava buněčného dělení je tedy jedním z mechanizmů navození rezistence u nádorových buněk. Dalším mechanizmem navození rezistence může být selekce buněk s výhodnější mutací. S přibývajícím počtem nádorových buněk se zvyšuje počet spontánních mutací a zvyšuje se heterogenita buněčné populace, která způsobuje odlišnou citlivost k léčbě. Postupně dochází k selekci a pomnožení rezistentní populace. c) Strukturální a funkční změny buňky Jedná se o nejčastější způsob vzniku rezistence zapříčiněný sníženou/zvýšenou expresí nebo aktivitou enzymů, porušením intracelulární distribuce cytostatika (např. vazbou na lysozóm), ovlivněním transportu cytostatik buněčnou membránou a zvýšenou intenzitou oprav DNA. 15

5.2. Konkrétní příklady mechanizmů způsobujících MDR 5.2.1. Bodová mutace v genu bcr-abl Bodová mutace v genu bcr-abl může souviset s rezistencí na imatinib (Leonard a kol. 2003). Tento chimérický fúzní gen vzniká reciprokou translokací t(9;22), kdy dochází ke vzniku tzv. Philadelphského chromozómu (Ph-chromozóm), jehož výskyt je typický pro CML (Lee a kol., 2006). Při vzniku Ph-chromozómu je gen bcr-abl lokalizován na 22. chromozómu. V některých případech se vytváří fúzní gen abl-bcr, který je lokalizován na derivovaném chromozómu 9. Fúzní gen abl-bcr se vyskytuje asi u 60 % pacientů s Ph-chromozómem a zatím nebyla prokázána souvislost mezi úspěšností léčby CML a expresí genu abl-bcr. Prokazatelný vliv na léčbu mají však bodové mutace v genu abl-bcr. Ty způsobí záměnu esenciální aminokyseliny, která váže chemoterapeutikum (imatinib mesylát) ke kinázové doméně, což vede k selhání léčby. Stejně tak rozsáhlejší mutace (např. delece) vedou k selhání léčby. Pravděpodobně při nich dochází ke ztrátě genů asociovaných s nádorovou aktivitou. 5.2.2. Změny intracelulárního a extracelulárního ph u MDR buněk U MDR buněk pozorujeme nejen fyziologické změny (ovlivňující strukturu plazmatické membrány, cytoplazmatické ph, zvýšení vakuolizace buněk, změny struktury a funkce lysozómů, ), ale i změny v expresi a aktivitě některých buněčných proteinů a také sníženou schopnost MDR buněk akumulovat cytotoxická léčiva. Změna vnitrobuněčného ph (phi) je jednou z fyziologických změn spojených se vznikem a rozvojem MDR (Martínez-Zaquilán a kol., 1999). U rezistentních buněk je phi zásaditější než u buněk citlivých k chemoterapeutikům. Nicméně bylo prokázáno, že transportní mechanismus Pgp a MRP1 není ovlivněn hodnotou intracelulárního ani extracelulárního ph. V případě MRP1 by závislost lékové rezistence na phi mohla být vysvětlena pomocí enzymů zasahujících do metabolismu GSH a citlivých na změny phi. Jak již bylo zdůrazněno výše, GSH je nutný pro export antracyklinů, např. hydroxydoxorubicinu (OH-DOX), proteinem MDR1. Změna aktivity enzymů metabolizujících GSH by proto v konečném důsledku mohla vysvětlit vliv phi na export chemoterapeutik z buňky. 16

5.2.3. GST (glutathion-s-transferáza), GSH GST je součástí enzymatického systému, jenž se podílí na detoxifikaci léčiv a jiných xenobiotik. Chrání buňky před reaktivními epoxidy a před poškozením volnými radikály. GST katalyzuje konjugaci chemoterapeutik s GSH, výsledkem tohoto biotransformačního procesu jsou molekuly léčiv ve formě svých polárních derivátů, které jsou snadno exportovatelné ven z buňky (shrnuto v Krishna and Mayer, 2000). Tyto metabolické procesy zbavují buňky toxických látek a potlačují tak účinek chemoterapeutik, což vysvětluje zvýšenou hladinu GST u rezistentních nádorových buněk. GSH se také podílí na detoxifikaci a reparaci poškození buněk způsobené chemoterapeutiky (např. doxorubicinem) a alkylačními činidly (shrnuto v Krishna and Mayer, 2000). V této souvislosti není překvapující produkce většího množství GSH u rezistentních nádorových buněk. Pokud by se podařilo redukovat hladinu intracelulárního GSH, citlivost rezistentních nádorových buněk k léčbě by mohla být zvýšena. Jednou z látek, která prokazatelně snižuje hladinu GSH, je buthionin sulfoxim (BSO). 5.2.4. Topoizomerázová aktivita Ve všech eukaryotických buňkách najdeme dva typy topoizomeráz topoizomerázu I a topoizomerázu II (shrnuto v Krishna and Mayer, 2000). Topoizomeráza I je monomerický protein o molekulové hmotnosti 110 kda měnící topologii DNA tvorbou jednořetězcových zlomů (SSB), zatímco topoizomeráza II indukuje vznik dvouřetězcových zlomů. Existují dva subtypy topoizomerázy II topoizomeráza IIα jejíž molekulová hmotnost činí 170 kda a topoizomeráza IIβ o molekulové hmotnosti 180 kda. Všechny topoizomerázy jsou zapojeny do replikace DNA a představují terapeutický cíl chemoterapeutik v rychle se dělících nádorových buňkách. Působením chemoterapeutik (např.antracyklinů) dochází ke stabilizaci přechodného kovalentního komplexu mezi DNA a topoizomerázou IIα. Tím je blokováno znovuspojení DNA řetězců. Výsledný stabilní komplex enzym-dna a dvouřetězcové zlomy DNA působí jako induktory apoptózy. Buňky, které získaly rezistenci k inhibitorům topoizomeráz II (doxorubicin, etoposid), vykazují snížení exprese genu pro topoizomerázu II, které může být důsledkem hypermetylace jejího promotoru, stejně jako potlačení aktivity tohoto enzymu. 17

5.2.5. Pozměněná regulace apoptózy K programované buněčné smrti často vedou látky s protinádorovým účinkem (shrnuto v Krishna and Mayer, 2000). Apoptóza je charakterizována kondenzací buněčného jádra, což vede k fragmentaci DNA endolytickým štěpením genomové DNA. Za to, zda buňka bude pokračovat v buněčném cyklu anebo zanikne, zodpovídá spolupráce genů a proteinů (Bcl-2, Bax, NFκB, ), jejichž funkcí je regulace buněčných pochodů. Jak bylo uvedeno výše Bcl-2 a Bax jsou důležitými proteiny v regulaci buněčného cyklu. Zda v buňce indukují nebo inhibují apoptózu záleží především na jejich poměrném zastoupení, nikoliv na jejich koncentraci uvnitř buňky (Gürsoy a kol., 2008). Proteiny Bcl-2 a Bax mohou tvořit homodimery nebo heterodimery. Tvorbou heterodimerů s Bax ztrácí Bcl-2 své antiapoptické vlastnosti. Pokud je ovšem Bcl-2 v buňce zastoupen v nadbytku, apoptóza je v buňce inhibována. V opačném případě (Bax je v nadbytku) nebo v případě, že mají homodimery Bax dominantní postavení, dochází k iniciaci apoptózy. Významnou úlohu v řízení buněčného cyklu a apoptózy má i transkripční faktor NF-κB, který ve většině případů působí jako anti-apoptotický faktor a indukuje buněčnou proliferaci. Typickou a nejvíce zastoupenou formu NF-κB představuje heterodimerický komplex. Skládá se ze dvou podjednotek velkých 50 kda (p50) a 65 kda (p65 nebo RelA), které jsou v cytoplazmě v inaktivním stavu vázané k proteinovému inhibitoru IκB (Garcia a kol., 2005). Apoptické signály (např. oxidativní stres, chemoterapeutika, poškozená DNA, TNF-α) aktivují IκB kinázy (IKK), které způsobují fosforylaci a ubiquitinaci IκB. Následuje degradace IκB v proteazomu. Tyto změny umožní NF-κB přejít do jádra, kde se váže jako dimer na DNA a zahájí expresi cílových genů, mezi které v nádorových buňkách patří i gen mdr1. Zvýšení aktivity NF-κB vede k rezistenci na chemoterapeutika indukující apoptózu. Tato rezistence by mohla být potlačena inhibicí fosforylace IκB nebo blokací přesunu aktivního NF-κB do jádra. Jednou z látek, které inhibují funkci NF-κB, je BAY 11-7082 irreverzibilní inhibitor fosforylace IκB-α, který zabraňuje jeho degradaci. Aplikace BAY 11-7082 přispívá k indukci apoptózy u rezistentních buněčných linií, které vykazují zvýšenou aktivitu NF-κB oproti citlivým buňkám. Inhibice signální dráhy NF-κB by mohla být novou strategií v léčbě MDR u leukémií. 18

6. Protinádorová terapie Původně byla chemoterapie pouze doplňkovou léčbou k chirurgické terapii (tzn. nádor může být chirurgicky odstraněn, pokud neprorůstá do životně důležitých struktur) a léčbě ozářením (ozářením lze např. do jisté míry eliminovat reziduální tumory). Pro chirurgii a záření je limitujícím faktorem rozsah a diseminace nádoru, pro chemoterapii celkový počet nádorových buněk (Klener, 1996). V uplynulých desetiletích prodělala chemoterapie bouřlivý rozvoj a navíc se začaly uplatňovat regulátory biologické odpovědi a hledají se možnosti ovlivnění genomu (genová terapie). Pro některé typy nádorových onemocnění by mohla být perspektivní metodou imunoterapie. Volba určitého terapeutického přístupu závisí především na stádiu pokročilosti a typu nádorového onemocnění. 6.1. Chemoterapie V onkologii se pod pojmem chemoterapie rozumí podávání léků s cytotoxickým účinkem, ať jsou původu syntetického, či jde o deriváty látek získaných z rostlin nebo plísní (Adam a Vorlíček, 2004). Cytostatika mají odlišný mechanizmus účinku a zasahují specificky v různých fázích buněčného cyklu (alkylace nukleových kyselin, interkalace léčiva do DNA, blokáda reparačního mechanizmu nukleových kyselin, blokáda topoizomerázy, zástava tvorby buněčných mikrotubulů, inhibice klíčových enzymů, indukce apoptózy). Přehled některých chemoterapeutik a jejich mechanizmů účinku je uveden v tab. 1. Přes velký pokrok v léčbě nádorových onemocnění cytostatiky nejsou možnosti protinádorové terapie zcela uspokojivé (Klener, 1996). Použití chemoterapie jako hlavní léčebné metody je omezeno řadou faktorů (citlivost nádoru k chemoterapii, toxicita, rezistence). U některých cytostatik se při jejich podávání vyvíjí MDR (jejich přehled je uveden v tab. 2). 19

Tabulka 1: Hlavní skupiny léků s protinádorovým účinkem (Adam a Vorlíček, 2004) Skupina chemoterapeutik Mechanizmus účinku Nejčastěji používaná chemoterapeutika Alkylační cytostatika Alkylace DNA, RNA a proteinů Chlorambucil, melfalan, cyklofosfamid, busulfan Antimetabolity Blokují syntézu základu purinových bází nebo blokují činnost enzymů tvořících aktivní formy nukleotidtrifosfátů Metotrexát, 6-merkaptopurin, tioguanin, 5-fluorouracil, gemcitabin Protinádorová antibiotika Rostlinné alkaloidy Cytostatika nezařazená do uvedených skupin Další protinádorové léky Nemají společný cytotoxický mechanizmus, ale většinou se shodují v cíli svého cytotoxického působení, kterým jsou nukleové kyseliny Inhibují tvorbu mitotického vřeténka (vinca alkaloidy, taxány) nebo inhibují topoizomerázu I, II Různý mechanizmus účinku (všechny nějakým způsobem poškozují nukleové kyseliny) Cíleně působí na určité patologicky změněné či nadměrně exprimované proteiny (enzymy) v buňkách Antracykliny ( doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin), mitoxantron, bleomycin, mitomycin C, daktinomycin Vinca alkaloidy (vinkristin, vinblastin, vindesin), taxány (paklitaxel, docetaxel), podofylotoxinová cytostatika (etopozid VP-16, tenipozid), kamptotecinová analoga (topotekan) Platinová cytostatika (cisplatina, karboplatina), L- asparagináza, amsakrin Induktory diferenciace (tretinoin, kyselina all-trans retinová), imatinib mesylát, anagrelid hydrochlorid Tabulka 2: Výskyt MDR u jednotlivých cytostatik (Klener, 1996). MDR - častá Aktinomycin D Daunomycin Doxorubicin Etopozid (VP-16) Mitoxantron Taxol Tenipozid (VM26) Trimetrexát Vinblastin Vinkristin Vindezin MDR - vzácná Bleomycin Karmustin Chlorambucil Cisplatina Cyklofosfamid Cytosin arabinosid 5-fluorouracil Ifosfamid 6-merkaptapurin Melfalan Metotrexát 20

Používání chemoterapeutik by se mělo řídit určitými zásadami, které by měly zabránit vzniku lékové rezistence (Klener, 1996). Zejména je nutné zajistit účinnou koncentraci cytostatika v cílové tkáni, zahájit léčbu co nejdříve, dodržovat intervaly podávání chemoterapeutika tak, aby léčba neposkytla prostor pro vznik mutací a podávat současně různá cytostatika s rozdílným mechanizmem účinku. Byla vyvinuta řada přípravků, které pomáhají překonat lékovou rezistenci nádorových buněk. Jejich přehled je uveden v tab. 3. Tabulka 3: Přípravky používané k překonání lékové rezistence (Klener, 1996). Látky omezující Předpokládaný mechanizmus účinku Prokázaná účinnost rezistenci verapamil, nifedipin, nitrendipin, prenylamin, kompetice se substrátem Pgp a omezení MDR vinkristin, vinblastin, doxorubicin, podofylotoxin trifluoroperazin, dexniguldipin, cyklosporin A, PSC-833 Buthionin sulfoxim inhibice syntézy GSH melfalan, cisplatina Afidicolin, β-lapachol inhibice DNA-polymerázy, inhibice ligáz (= inhibice opravy DNA) Cisplatina, alkylační látky Amfotericin B nejasný snad vliv na permeabilitu Daktinomycin membrán tamoxifen, reserpin nejasný antracykliny 6.2. Imunoterapie Buňky imunitního systému mohou být využity v léčbě nádorů díky imunogenní povaze nádorových buněk (Adam a kol., 2003). Imunitní systém pacienta je schopen nádorové buňky rozpoznat a v konečném důsledku zničit. Cílem imunoterapie je tedy posílit pacientův imunitní systém v průběhu onemocnění tak, aby došlo ke zničení všech nádorových buněk nebo alespoň k jejich redukci. Po objevení řady antigenů asociovaných s nádory dosáhla imunoterapie velkého rozvoje. Různé typy antigenů asociovaných s nádory byly popsány jako cíl CD8+ T-lymfocytů (cytotoxické T-lymfocyty, CTL) in vitro a in vivo. Patří k nim např. antigeny nadměrně 21

exprimované v nádorových tkáních, antigeny diferencujících melanocytů a virové antigeny. Pro ilustraci uvádím konkrétní příklady antigenů uplatňujících se při léčbě melanomů - p21/ras, CDK4, β-katenin, MAGE, GAGE, při léčbě CML - proteinkináza 3 a při léčbě leukémií - WT1 (De Magistris and Marshall, 2006). Imunoterapii můžeme rozdělit na pasivní a aktivní (Adam a kol., 2003). O pasivní imunoterapii hovoříme v případě, kdy jsou molekuly nebo substance protilátek vpraveny do těla dříve, než si tělo vytvoří vlastní protilátky. O aktivní imunoterapii pak mluvíme v případě, že si tělo tvoří vlastní protilátky na základě stimulace imunitního systému (vakcíny). Imunoterapie využívá k léčbě monoklonálních protilátek, modifikátorů imunitní odpovědi a vakcín. 6.2.1. Monoklonální protilátky V polovině 70. let 20. století se zrodila technologie využívající monoklonálních protilátek (MP). Ovšem až v posledních letech získala tato technika na významu a byla zavedena do klinické praxe (Adam a kol., 2003). MP jsou produktem jediného klonu B lymfocytů, jsou naprosto homogenní a přísně specifické k jedinému epitopu a mohou zasahovat specifické nádorové antigeny. To z nich činí vhodný nástroj přesné diagnostiky a léčby chorob. MP byly vyzkoušeny např. při léčbě rakoviny prsu (trastuzumab) a nehodgkinského lymfomu (rituximab). Hojně jsou využívány k charakterizaci, léčbě a ke sledování recidivy u dříve léčených nádorů. 6.2.2. Modifikátory imunitní odpovědi Jedná se o molekuly exogenního nebo endogenního původu, které vyvolávají imunitní odpověď. Skupina exogenních modifikátorů je nazývána imunitními potenciátory a zahrnuje mikroorganismy nebo jejich produkty (např. endotoxin) způsobující imunitní odezvu. Tato imunitní odpověď může, za určitých podmínek, podmínit regresi nádoru a nebo zpomalit růst nádorových buněk (Adam a kol., 2003). Endogenní skupina modifikátorů, nazvaná modifikátory biologické odpovědi, je tvořena cytokiny (interleukiny, interferony, TNF, růstovými faktory B- lymfocytů, hematopoetickými růstovými faktory, faktory stimulujícími kolonie a dalšími). Cytokiny plní funkci signálních poslů v imunitním systému (IS). Jedná se o látky proteinové nebo glykoproteinové povahy, které jsou produkovány buňkami IS. Cytokiny ovlivňují imunitní odpověď na různých úrovních a v nádorové terapii jsou používány k posílení imunity. Např. použití hematopoetického růstového faktoru je často kombinováno s radioterapií či chemoterapií a podílí se na obnovení funkce kostní dřeně. Velká pozornost byla věnována TNF, ale protože se 22

zjistilo, že při systémovém užití způsobuje hypotenzi, jeho význam pro léčbu je minimální. Skupina interleukinů je tvořena více jak dvaceti členy, avšak pro nádorovou terapii se ukázaly být významné IL-2, IL-12. Kromě nich se v imunoterapii uplatňují hlavně cytokiny IFN-α a faktor stimulující kolonie (GM-CSF). U některých dalších interleukinů byla prokázána protinádorová aktivita (IL-6, IL-4). Ovšem zjistilo se, že IL-4 je toxický a IL-6 působí jako růstový faktor pro myelomy. 6.2.3. Vakcíny proti nádorům Myšlenka léčit rakovinu vakcínami se zrodila současně se vznikem imunologie. Ale až pokrok v buněčné a molekulární imunologii dovolil porozumět složitým vztahům mezi IS a nádorovými buňkami. Tyto interakce vykazují značnou protinádorovou imunitní odpověď a nebo toleranci k antigenům asociovaným s nádory (Adam a kol., 2003). Získávání nových poznatků v oblasti biologie umožňuje lépe porozumět mechanizmům IS (zejména rozpoznání nádorových antigenů, aktivaci T-lymfocytů, imunitní odpovědi) a napomáhá konstrukci nových účinnějších vakcín. Preklinickému testování byly podrobeny různé typy vakcín, které využívaly autologní i alogenní nádorové buňky, proteiny, peptidy, virové vektory, DNA a dendritické buňky. Při vývoji vakcín je snahou pozměnit nádorové buňky tak, aby byly více imunogenní. Nádorové buňky mohou být infikovány různými typy virů tak, aby na povrchu exprimovaly virové proteiny, nebo do nich mohou být vneseny geny, které kódují cytokiny jako např. IL-2, GM-CSF nebo molekuly HLA. Po aktivaci IS jsou antigeny zachyceny dendritickými buňkami a prezentovány T-lymfocytům. Kromě antigenů je k ovlivnění IS využíváno celých nádorových buněk, které podněcují protinádorovou imunitu. Nádorové buňky však disponují různými mechanizmy, jak IS pacienta unikat. Proto zůstává otázkou, jak zlepšit imunitní odpověď tak, aby tělo nádorové buňky zahubilo. Celé nádorové buňky se používají v imunoterapii k přípravě vakcín vyrobených z autologních nádorových buněk (které byly izolovány z primárního nádoru), vakcín vyrobených z alogenních nádorových buněčných linií a pro účely imunoterapie in situ. Velká pozornost je věnována vývoji vakcín proti mnoha typům nádorových onemocnění, zejména však proti rakovině konečníku, rakovině prsu a melanomu. Současná snaha vyvinout široké spektrum účinných vakcín by mohla v budoucnosti znamenat velký přínos pro profylaktickou léčbu nádorových onemocnění. 23

7. MDR a její ovlivnění MDR mohou částečně upravovat některé inhibitory kalciového kanálu (verapamil, dexverapamil, mefedipin, dexnigulpidin, ), antagonisté kalmodulinu (trifluoroperazin), steroidní hormony a antihormony (progesteron, tamoxifen, toremifen) a další látky (ceftriaxon, reserpin, ). Příznivé účinky byly prokázány i u cyklosporinu a jeho neimunosupresivního derivátu PSC-833, který omezuje rezistenci mnohonásobně účinněji než cyklosporin A (Klener, 1996). Novější poznatky kladou důraz na složku extracelulární matrix hyaluronan, jehož menší fragmenty (oligosacharidy hyaluronanu) mohou potlačit MDR (Cordo Russo a kol., 2008). 7.1. Inhibitory kalciového kanálu Jednou z možných strategií, jak zvrátit MDR, je inhibovat funkci Pgp využitím specifických inhibitorů Pgp (Pechandová a kol., 2006). Ty by zamezily nežádoucímu poklesu intracelulární koncentrace léčiv, která je způsobena jejich rychlým vyloučením ven z buňky. Mezi látky s takovými vlastnostmi patří např. inhibitory kalciového kanálu. K první generaci těchto inhibitorů patří verapamil, cyklosporin A, amiodaron nebo tamoxifen. Jejich účinnost je bohužel tak nízká, že by k dosažení dostatečné inhibice Pgp bylo nutné podávat vysoké dávky. A to není výhodné vzhledem k toxicitě inhibitorů Pgp první generace. Další nevýhodou je, že inhibitory blokují funkci Pgp nejen v nádorových tkáních, kde Pgp napomáhá eliminaci protinádorových léčiv, ale i v játrech a ledvinách. Druhá generace inhibitorů Pgp vyvinutá za účelem překonání MDR je více účinná a méně toxická než generace první (Pechandová a kol., 2006). Mezi významné zástupce patří PSC-833 (valspodar), VX-710 (biricodar). PSC-833 ovšem snižuje vylučování žlučových solí, protože blokuje ABCB11 (protein příbuzný Pgp), který je exportuje. Kvůli nežádoucím účinkům inhibitorů byla snaha vytvořit látky, které nejsou nespecificky toxické. Vyvinuta byla třetí generace inhibitorů (OC144-093, pyronaridin), které jsou specifické k Pgp, mají dobrou biologickou dostupnost a dlouhodobý účinek. Současný výzkum je zaměřen na čtvrtou generaci inhibitorů Pgp (Cordo Russo a kol., 2008). Testovány jsou dlouhodobě používané léky, které ovlivňují Pgp in vitro a mohly by být v bezpečných dávkách použity i pro účely in vivo. K těmto preparátům patří např. disulfiram používaný již mnoho let k léčbě alkoholismu. Mechanizmus zvratu MDR není zcela jasný. Je ale známo, že inhibitory jsou silně hydrofobní látky, které soutěží se substráty Pgp o vazebná místa na Pgp, a tak dochází 24

k nahromadění chemoterapeutik uvnitř buněk. Další možností, jak zabránit vzniku MDR, je předejít dozrání Pgp po jeho biosyntéze (Pechandová a kol., 2006). Nezralý Pgp nedosáhne buněčného povrchu a nepodléhá konformačním změnám indukovaným ATP. Pgp pravděpodobně není po syntéze zcela funkční, a proto je pozornost směrována na vývoj nových sloučenin, které by inhibovaly dozrávání Pgp. 7.2. Vliv pohlaví na MDR Vliv pohlaví na aktivitu transportních mechanizmů léčiv, např. Pgp., také není zanedbatelný (Fröhlich a kol., 2004). Přesto současné poznatky o vlivu pohlaví, endogenních pohlavních hormonů nebo hormonální terapie na Pgp nejsou přílliš rozsáhlé. Proto uvádím pouze jeden příklad interakci progestinu (hormon žlutého tělíska) s Pgp. Je možné, že rozdílná úroveň pohlavních steroidů přispívá k tomu, že u žen s B-typem CML byla detekována nižší aktivita Pgp ve srovnání s nemocnými muži. Ženské pohlavní steroidní hormony mohly být jednou z příčin celkově lepší prognózy u takto nemocných. Míra inhibice Pgp podáním progestinu byla srovnatelná s potenciálním inhibitorem Pgp quinidinem a nepatrně nižší než při podání verapamilu. Tamoxifen je antiestrogen hojně používaný v léčbě nádorových onemocnění (zejména u rakoviny prsu), protože inhibuje růstovou aktivitu nádorových buněk, které mají estrogenový receptor. Tamoxifen soutěží s estrogenem o vazebné místo na receptoru a zabraňuje buněčnému růstu závislému na estrogenu (Fröhlich a kol., 2004). Antiestrogeny však inhibují i růst některých nádorových buněk, které estrogenový receptor nemají. Proto se předpokládá, že antiestrogeny mohou sloužit i jako antagonisté kalmodulinu při aktivaci c-amp-fosfodiesterázy. Tamoxifen váže také některé proteiny, které jsou obsaženy převážně v mikrosomálních membránách většiny tkání. Tyto proteiny podporují vytváření receptorů pro histamin. Předpokládá se, že interakce tamoxifenu s histaminovým receptorem by mohla zamezit proliferaci buněk. Tato zjištění vysvětlují antiproliferační aktivitu tamoxifenu u buněk, které nenesou estrogenový receptor. 7.3. Oligosacharidy hyaluronanu Hyaluronan (HA) je velký, lineární glykosaminoglykan jehož molekulová hmotnost činí 10 5-10 7 kda (Cordo Russo a kol., 2008). Je jednou z hlavních složek extracelulární matrix savců (ECM), která má vliv na hydrataci a fyzikální vlastnosti tkání. Interakcí s buněčnými receptory 25

CD44 a RHAMM může měnit signální dráhy buňky (např. PI3K/Akt). Navíc bylo zjištěno, že HA aktivuje expresi mdr1 v citlivých buňkách, na rozdíl od fragmentů HA (viz. dále v textu). HA je v buňkách štěpen enzymem hyaluronidázou na menší fragmenty - nízkomolekulární hyaluronany popřípadě oligosacharidy hyaluronanu (oha). Právě oha jsou nadějí pro léčbu nádorových onemocnění a potlačení MDR. Výzkum zabývající se oha (Cordo Russo a kol., 2008) dospěl k závěru, že oha snižují expresi mdr1 u rezistentních buněk, indukují apoptózu (inhibicí PI3K/Akt dráhy), zvyšují citlivost rezistentních buněk k chemoterapeutikům (vinkristinu, doxorubicinu), inhibují fosforylaci Akt, snižují produkci fosfatidylinositol-3,4,5- trifosfátu, snižují úroveň survivinu (proteinu z rodiny inhibitorů apoptózy, který tlumí apoptózu inhibicí kaspáz) a blokují funkci Pgp (pravděpodobně působí jako inhibitory Pgp). Podáním oha s konvenčními chemoterapeutiky by bylo možné překonat MDR a zlepšit léčbu hematologických malignit. 8. Využití principů molekulární biologie k potlačení MDR Molekulární biologie je vědní disciplína, která v posledních letech prochází neustálým vývojem. Metody molekulární biologie jsou rozšiřovány o nové postupy a navíc stále častěji nacházejí uplatnění v klinické praxi. Pro ilustraci uvádím jednu z metod, která by v budoucnu mohla patřit k účinným strategiím boje s nádorovými onemocněními. 8.1. si-rna (small interfering RNA) SiRNA je 21-25 nukleotidů dlouhá dvouvláknová RNA (dsrna), která může v eukaryotických buňkách způsobit degradaci specifické mrna (Nieth a kol., 2003). Tento mechanizmus regulace genů v rostlinných i živočišných buňkách byl nazván RNA interference (RNAi). RNAi je zahájena štěpením dsrna specifickou RNázou III nazvanou Dicer, která štěpí dlouhou dsrna na kratší štěpy sirna. Takto vytvořené sirna interagují s proteinovým komplexem, který rozpozná specifickou mrna a začne ji štěpit. sirna je schopná specifické degradace určité mrna a následně tak může utlumit produkci daného proteinu, aniž by způsobila nespecifickou degradaci jiných mrna (Lim a kol., 2007), což by bylo výhodné pro léčbu leukemických pacientů. 26

Gen mdr1 je lokalizován na chromozómu 7q21 a jeho mrna je dlouhá 4 872 bp (Ambudkar a kol., 2003), a jak bylo uvedeno, podílí se na MDR. Proto by bylo z klinického hlediska přínosné zasáhnout do exprese mdr1 a inhibovat tak produkci Pgp (Lim a kol., 2007). Využití sirna je možné nejen v laboratorním výzkumu MDR, ale také při prevenci a zvratu MDR (Nieth a kol., 2003). S inhibicí Pgp pomocí anti-mdr1 sirna však souvisí problém fyziologické exprese tohoto membránového transportéru v různých epiteliálních a endoteliálních buňkách. Například mrp1 (Pgp) je silně exprimován v luminální membráně endotelia cév nacházejících se v mozku a má tak důležitou funkci v krevně-mozkové bariéře. Je důležitým limitujícím faktorem pro neurotoxicitu způsobenou antikancerogenními léky. V klinické léčbě by bylo nutné, aby aplikace sirna inhibující produkci Pgp byla omezena na kancerogenní buňky exprimující mrp1. Jedním ze slibných řešení, jak této situace dosáhnout, by mohl být vývoj vektorů specifických pro MDR nádorové buňky, jako například mutantní adenovirové vektory, které by se efektivně a selektivně replikovaly v MDR buňkách. 27

9. Závěr Rezistentní nádorové buňky odolávají účinkům cytostatických látek převážně díky změnám na molekulární úrovni, které se projeví odlišnými farmakokinetickými, cytokinetickými, strukturálními a funkčními vlastnostmi buněk. Mechanizmy vzniku MDR uvedené v této práci představují určitý výběr z rozsáhlého spektra dosud prozkoumaných mechanizmů. Nejlépe prozkoumanými proteiny, které mají značný podíl na vzniku MDR jsou Pgp, MRP1 a LRP. Jejich zvýšená exprese je detekována u mnoha nádorových onemocnění a látky, které blokují jejich funkci nebo snižují jejich expresi, v mnoha případech vedou k dosažení remise. Tyto proteiny zajišťují transport látek přes membránu a zabraňují nahromadění léčiv uvnitř buněk. Důsledkem je snížení koncentrace léčiv v buňkách nebo snížení potřebné doby působení léčiv uvnitř buněk. Kvůli tomu dochází k selhání léčby, která je jinak u buněk s normálním zastoupením těchto proteinů účinná. Kromě proteinů, které způsobují strukturální a funkční změny, existuje řada dalších, které zasahují do regulace buněčného cyklu a programované buněčné smrti. Velký důraz je kladen na nádorově supresorové proteiny p53, WT1, antiapoptický protein Bcl-2, proapoptický protein Bax či transkripční faktor NF-κB. Protein p53 je označován jako strážce genomu a s jeho zvýšenou expresí se setkáme u buněk, které byly vystaveny stresovým situacím. Buňky se snaží ochránit zpomalením buněčného cyklu, aktivací reparačních mechanizmů DNA nebo indukcí apoptózy. Prokázalo se, že mutace v genu p53 zhoršují prognózu pacientů a zvyšují riziko vytvoření rezistence k chemoterapii a radiačnímu záření. Protein WT1 reguluje transkripci mnoha genů, čímž se také může nepřímo podílet na vzniku MDR. Spolupráce genů s proteiny Bcl-2, Bax či NF-κB rozhoduje, zda bude buňka pokračovat v buněčném cyklu či podlehne apoptóze. Právě inhibice apoptózy u nádorových buněk vede k jejich rychlému bujení a znesnadňuje terapii. Kromě proteinů zasahujících do transportních mechanizmů buněk, regulace buněčného cyklu a transkripce genů májí na vzniku MDR podíl i fyziologické změny uvnitř buněk (např. změny cytoplazmatického ph nebo struktury plazmatických membrán) a enzymatický systém. Řada enzymů (např. GST, GSH) se podílí na detoxifikaci léčiv a jiných xenobiotik. Při detoxifikaci dochází k modifikaci molekul léčiv na jejich snadno vylučitelné deriváty. Tak dojde ke snížené akumulaci léčiva v buňce, které je doprovázeno selháním nádorové léčby. Protinádorová terapie se snaží zasáhnout hlavně transportní mechanizmy, signální dráhy a regulaci buněčného cyklu buněk. V současné době existuje mnoho cytostatik, která jsou při léčbě nádorů nezastupitelná, nicméně dosud nebyla nalezena látka, která by uspokojivě působila na 28