PŘÍBALOVÁ INFORMACE GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit IDNA050 IDNA250 In vitro diagnostický zdravotnický prostředek Souprava je vyrobena v souladu s evropskou Směrnicí Rady 98/79/ES jako in vitro diagnostický zdravotnický prostředek a je určena pro profesionální použití ve specializovaných klinických a výzkumných laboratořích. GeneProof a.s. Vídeňská 119 / CZ-619 00 Brno / +420 543 211 679 / info@geneproof.com VERZE: IDNA_004_15_02 Platnost od: 14.09.2015 1/20 www.geneproof.com
2.1. PRINCIP METODY... 4 2.2. SPECIFIKACE SOUPRAVY... 4 2.3. UCHOVÁVÁNÍ VZORKŮ... 5 2.4. ELUCE... 5 GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit 2/20 www.geneproof.com
1. Obsah soupravy GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit 50 reakcí 250 reakcí Pufr B3 15 ml 60 ml Pufr B5 (koncentrát)* 12 ml 50 ml Pufr BW 30 ml 150 ml Pufr BE 13 ml 60 ml Proteináza K (lyofylizovaná)* 30 mg 2 x 75 mg Proteinázový Pufr 1,8 ml 8 ml DNA kolonky (plus centrifugační zkumavky) 50 250 2 ml centrifugační zkumavky 3 x 50 3 x 250 * Příprava pracovních roztoků a podmínky skladování viz sekce 3 Příbalová informace 3/20 www.geneproof.com
2. Popis soupravy 2.1. Princip metody Genomovou DNA lze pomocí soupravy GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit izolovat z plné krve, kultivovaných buněk, plasmy nebo ostatních tělních tekutin. Lyze vzorku je dosaženo inkubací v roztoku s vysokým obsahem chaotropních iontů za přítomnosti proteinázy K. Ideálních podmínek k navázání DNA na silikagelovou membránu kolonky je dosaženo přidáním ethanolu k lyzátu. Vazebný proces je reverzibilní a specifický pro nukleové kyseliny. Promývací kroky efektivně odstraňují možnou kontaminaci. Čistá genomová DNA je eluována za nízké koncentrace iontů v mírně alkalickém elučním pufru. 2.2. Specifikace soupravy GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit je navržen pro rychlou izolaci genomové DNA z plné krve, plasmy a ostatních tělních tekutin. Umožňuje také izolaci virové a bakteriální DNA z klinických vzorků. Vzhledem k tomu, že se virová DNA izoluje společně s buněčnou DNA, doporučujeme pro přípravu čisté virové DNA použít vzorky neobsahující buňky (plasma, sérum). Je možné použít krev ošetřenou EDTA, citrátem i heparinem. Pokud se zpracovávají materiály bohaté na leukocyty jako např. buffy coat, aplikujte na kolonku menší objemy vzorku a vzorky nařeďte sterilním PBS. Rozpustit 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4 a 0.24 g KH2PO4 v 800 ml H2O. ph upravit na 7.4 pomocí HCl. Doplnit H2O do 1 litru. DNA izolovaná pomocí této soupravy vykazuje poměr A260/280 mezi 1,60 a 1,90 a průměrnou koncentraci 40 60 ng/µl. Izolovaná DNA je vhodná pro použití v kombinaci s GeneProof PCR Kity. Parametr Objem vzorku GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit až 200 µl tělních tekutin Průměrný výtěžek 4-6 µg Eluční objem 100 µl Vazebná kapacita 60 µg Čas/reakce 30 min GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit 4/20 www.geneproof.com
2.3. Uchovávání vzorků Vzorky pro izolaci s použitím GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit mohou být uchovávány při teplotě 2 až 8 C po dobu několika dnů. Výtěžek DNA ovšem s prodlužující se dobou uchovávání klesá. Pro lepší výtěžnost DNA při dlouhodobém skladování doporučujeme vzorky zamrazit na -85 až -10 C. 2.4. Eluce Proces eluce a objem elučního pufru je možné přizpůsobit podle požadavků na následné zpracování izolované DNA. Standardní metoda dosahuje procentuálního výtěžku 70-90 % a je možno ji modifikovat několika dalšími postupy. Pro následující kroky použijte eluční pufr předehřátý na 70 C. Vysoký výtěžek: Proveďte dva eluční kroky po sobě v objemu pufru daném v protokolu. Takto lze získat 90 100 % navázané DNA. Vysoká koncentrace: Proveďte jeden eluční krok se 60 % objemu pufru daném v protokolu. Koncentrace DNA bude vyšší než při standardní eluci (asi 130 %). Maximální výtěžek DNA je kolem 80 % Vysoký výtěžek a vysoká koncentrace: Aplikujte na membránu polovinu objemu elučního pufru udaného v protokolu, nechte inkubovat 3 min a centrifugujte. Aplikujte druhou polovinu elučního pufru a opět inkubujte 3 min. a centrifugujte. Takto obdržíte asi 85-100 % vázané DNA ve standardním objemu elučního pufru ve vysoké koncentraci. Zjednodušená eluce: Pro usnadnění procesu eluce lze použít eluční pufr o laboratorní teplotě. Výtěžek DNA bude asi o 20 % menší než při použití předehřátého pufru. Eluci lze také provádět s použitím Tris-EDTA pufru (TE) o ph 8. Tento postup zvyšuje stabilitu DNA během dlouhodobého skladování při teplotě 2 až 8 C tím, že inhibuje činnost všudypřítomných DNáz. EDTA obsažená v TE pufru nicméně interferuje v závislosti na finální koncentraci s některými následnými aplikacemi. Pro optimální využití izolované DNA při následných aplikacích doporučujeme používat dodávaný eluční pufr a uchovávat DNA při -85 až -10 C zvláště při dlouhodobém skladování. Opakované zamražení a rozmražení nebude znehodnocovat následné aplikace. Kvalita provedení long-range PCR (> 10 kb) nebo sensitivita detekce stopových množství DNA může být několikanásobným zamražováním a rozmražováním nebo dlouhým skladováním izolované DNA při teplotě 2 až 8 C snížena díky rozpadu DNA nebo adsorpci na povrchy. Příbalová informace 5/20 www.geneproof.com
3. Skladování a příprava pracovních roztoků Upozornění: Pufry B3 a BW obsahují guanidin hydrochlorid! Noste ochranné brýle a rukavice! Všechny součásti soupravy mohou být uchovávány při laboratorní teplotě (15 až 25 C) a jsou stabilní po dobu jednoho roku. Před začátkem GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit protokolu si připravte následující: Před prvním použitím soupravy přidejte udané množství Proteináze Buffer k lyofilizované proteináze K a rozpusťte ji. Takto připravený roztok je stabilní při 2-8 C po dobu 6 měsíců. Pokud připravený roztok nespotřebujete do té doby, doporučujeme roztok zamrazit na -85 až -10 C. Pufr B5: Přidejte udané množství ethanolu (96 100 %) ke koncentrátu pufru B5. Takto připravený pufr lze skladovat při laboratorní teplotě (15 až 25 C) po dobu jednoho roku. Během skladování, zvláště při nižších teplotách se může v pufrech B3 tvořit bílý precipitát. Precipitát rozpustíte zahřátím láhve na 70 C před použitím pufrů. GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit Složka 50 reakcí 250 reakcí Pufr B5 (koncentrát) 12 ml přidat 48 ml ethanolu 50 ml přidat 200 ml ethanolu Proteináza K (lyofilizovaná) 30 mg přidat 1,35 ml Proteináze Buffer 2 x 75 mg do každé lahvičky přidat 3,35 ml Proteináze Buffer GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit 6/20 www.geneproof.com
4. Bezpečnostní informace H a P věty Následující komponenty GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit obsahují nebezpečné látky. Vždy noste rukavice a ochranné brýle a dbejte bezpečnostních pokynů v této sekci. Složka Nebezpečný obsah GHS symboly H-věty P-věty B3 Guanidine hydrochlorid 36-50 % Varování 302, 319 280, 301+312, 305+351+338, 330-337, 313 BW Guanidine hydrochlorid 36-50 % + isopropanol 20-50 % Varování 226, 302, 319 210-233-280-301+312-305+351+338, 330, 337+313, 403+235 Proteináza K Proteináza K, lyofilizovaná Nebezpečí 334 261, 304+340, 342+311 H-věty H 226 Hořlavá kapalina a páry. H 302 Zdraví škodlivý při požití. H 319 Způsobuje vážné podráždění očí. H 334 Při vdechování může vyvolat příznaky alergie nebo astmatu nebo dýchací potíže. Příbalová informace 7/20 www.geneproof.com
P-věty P 210 P 233 P 261 P 280 P 301 + 312 P 304+340 P 305+351+338 P 330 P 337+313 P 342+311 P 403+235 Chraňte před teplem, horkými povrchy, jiskrami, otevřeným ohněm a jinými zdroji zapálení. Zákaz kouření. Uchovávejte obal těsně uzavřený. Zamezte vdechování prachu/dýmu/plynu/mlhy/par/aerosolů. Používejte ochranné rukavice/ochranný oděv/ochranné brýle/obličejový štít. PŘI POŽITÍ: Necítíte-li se dobře, volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře/... PŘI VDECHNUTÍ: Přeneste osobu na čerstvý vzduch a ponechte ji v poloze usnadňující dýchání. PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně vyplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. Vypláchněte ústa. Přetrvává-li podráždění očí: Vyhledejte lékařskou pomoc/ošetření. Při dýchacích potížích: Volejte TOXIKOLOGICKÉ INFORMAČNÍ STŘEDISKO/lékaře/... Skladujte na dobře větraném místě. Uchovávejte v chladu. GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit 8/20 www.geneproof.com
5. Protokol pro izolaci z tělních tekutin Před začátkem protokolu nastavte inkubátor nebo vodní lázeň na 70 C. Předehřejte eluční pufr BE na 70 C. Připravte pufry B3 a B5 a roztok proteinázy K (sekce 3). 1 Lyze vzorku Napipetujte 25 µl proteinázy K a 200 µl vzorku do 1,5 ml zkumavky. Nutnost dodržet pořadí pipetování, jinak by mohlo dojít ke znehodnocení proteinázy. U menšího objemu vzorku přidejte ke vzorku PBS do objemu 200 µl. Při izolaci DNA virů doporučujeme použít 200 µl plasmy Buněčné kultury resuspendujte v koncentraci až 5 10 6 buněk ve finálním objemu 200 µl PBS. Přidejte 200 µl lyzačního pufru B3 ke vzorkům a důkladně vortexujte (10-20 s). Inkubujte vzorky při 70 C po dobu 30 min. U krevních vzorků by měl lyzát v průběhu inkubace s B3 zhnědnout. Pokud zpracováváte starší nebo viskozní či sražené vzorky, prodlužte dobu inkubace až na 1 hodinu a průběžně vortexujte. Krátce centrifugovat. 25 µl proteinázy K + 200 µl vzorku + 200 µl B3 zamíchat 70 C; 30 min 2 Upravení podmínek navázání na membránu Přidejte 210 µl ethanolu (96-100 %) ke každému vzorku a vortexujte. Krátce centrifugovat. + 210 µl ethanol zamíchat 3 Vázání DNA Pro každý vzorek použijte jednu DNA kolonku umístěnou v 2ml centrifugační zkumavce a naneste vzorek tak, aby se nesmočil okraj zkumavky. nanesení lyzátu na kolonku Maximální objem pro jednu kolonku je 650 µl. Centrifugujte 1 min 11 000 g. Pokud celý vzorek neprošel přes membránku, centrifugujte při vyšších g (< 15 000 g) nebo prodlužte dobu centrifugace. Vyhoďte zkumavku s filtrátem do odpadu. 1 min 11 000 g Příbalová informace 9/20 www.geneproof.com
4 Promývání membrány 1. Promytí Umístěte kolonku do nové 2ml centrifugační zkumavky a přidejte 500 µl pufru BW. Centrifugujte 1 min při 11 000 x g. + 500 µl BW 1 min 11 000 x g Vyhoďte zkumavku s filtrátem do odpadu. 2. Promytí Umístěte kolonku do nové 2ml centrifugační zkumavky a přidejte 600 µl pufru B5. + 600 µl B5 1 min 11 000 x g Centrifugujte 1 min při 11 000 x g. Vyhoďte zkumavku s filtrátem do odpadu. 5 Vysušení membrány Umístěte kolonku do nové 2 ml centrifugační zkumavky. Centrifugujte 1 min při 11 000 x g Při tomto kroku se odstraní zbytkový ethanol z membránky. 1 min 11 000 x g 6 Eluce čisté DNA Umístěte kolonku do 1.5ml centrifugační zkumavky a přidejte 50 µl předehřátého elučního pufru BE (70 C). Pufr pipetujte přímo na membránu kolonky, ale nedotýkejte se jí špičkou. Inkubujte 1 minutu při pokojové teplotě. Centrifugujte 1 min při 11,000 x g. Přidejte dalších 50 µl předehřátého elučního pufru BE (70 C). Pufr pipetujte přímo na membránu kolonky, ale nedotýkejte se jí špičkou. Inkubujte 1 minutu při pokojové teplotě. + 50 µl BE (70 C) RT 1 min 1 min 11 000 x g Centrifugujte 1 min při 11,000 x g. Výsledný objem je 100 µl. Pro další možnosti eluce viz sekce 2.4. GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit 10/20 www.geneproof.com
6. Postup izolace ze stěrů anebo výtěrů Odběrový materiál: kartáček nebo tampon Upozornění: Odběry stěrů a výtěrů pro účely izolace nukleových kyselin se musí provádět NASUCHO a nesmí se používat žádné médium! Transport vzorku se provádí v co nejkratším čase a vzorek se uchovává do 24h při 2 až 8 C nebo delší dobu zamražený. 1. Ustříhnout nebo zalomit kartáček/tampon se stěrem tak, aby se část se vzorkem vešla do zavřené 2ml zkumavky. 2. Vložit takto ustřihnutý kartáček/tampon do 2ml zkumavky. 3. Přidat do zkumavky 200 µl sterilní vody (nuclease free a DNA/RNA free). 4. Přidat 200 µl pufru B3. 5. Lehce promíchat (obracením zkumavky nebo krátce vortexovat). 6. Inkubovat 15 min při pokojové teplotě (rozmezí 15-25 C). 7. Krátce vortexovat a následně krátce centrifugovat. 8. Přidat 25 µl Proteinázy K. 9. Lehce promíchat (obracením zkumavky nebo krátce vortexovat). 10. Inkubovat 30 min při 70 C. 11. Krátce vortexovat a následně krátce centrifugovat. 12. Otevřít zkumavku a odebrat kartáček/tampon (vyhodit jako infekční materiál). 13. Do zkumavky přidat 210 µl Ethanolu 96-100 %. 14. Krátce vortexovat a následně krátce centrifugovat. 15. Zkumavku otevřít a nanést obsah na kolonku a pokračovat podle Příbalové informace od bodu (3-Vázání DNA) dále; eluovat do 50 µl BE. Příbalová informace 11/20 www.geneproof.com
7. Postup izolace ze simulovaných stěrů/výtěrů Odběrový materiál: vzorky mohou být dodávány institucemi poskytujícími EHK panely (takové vzorky neobsahují kartáček ani tampon, ale obsahují na spodní stěně zkumavky materiál napodobující stěr) Poznámka: tento postup je totožný s postupem pro izolaci nukleových kyselin ze stěrů a výtěrů, ale neobsahuje manipulaci s kartáčkem nebo tamponem 1. Přidat do zkumavky s umělým stěrem 200 µl sterilní vody (nuclease free a DNA/RNA free). 2. Přidat 200 µl pufru B3. 3. Lehce promíchat (obracením zkumavky nebo krátce vortexovat). 4. Inkubovat 15 min při pokojové teplotě (rozmezí 15-25 C). 5. Krátce vortexovat a následně krátce centrifugovat. 6. Otevřít zkumavku a přidat 25 µl Proteinázy K. 7. Lehce promíchat (obracením zkumavky nebo krátce vortexovat). 8. Inkubovat 30 min při 70 C. 9. Krátce vortexovat a následně krátce centrifugovat. 10. Do zkumavky přidat 210 µl Ethanolu 96-100 %. 11. Krátce vortexovat a následně krátce centrifugovat. 12. Zkumavku otevřít a nanést obsah na kolonku a pokračovat podle Příbalové informace od bodu (3- Vázání DNA) dále; eluovat do 50 µl BE. GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit 12/20 www.geneproof.com
8. Zkrácený protokol Příbalová informace 13/20 www.geneproof.com
9. Řešení problémů Problém Možné příčiny a návrhy řešení Nízká koncentrace leukocytů ve vzorku Připravte buffy coat ze vzorku plné krve: Proveďte centrifugaci vzorku plné krve při laboratorní teplotě a 3 300 g po dobu 10 min. Poté budou ve vzorku patrné tři vrsty materiálu, leukocyty se nacházejí v prostřední vrstvě (= buffy coat). Nedostatečná lýze buněk Vzorek nebyl dostatečně promíchán s lyzačním pufrem nebo proteinázou. Vzorek je třeba intenzivně vortexovat ihned po přidání lyzačního pufru. Žádný nebo nízký výtěžek DNA Nedostatečná účinnost proteinázy K. Nikdy nepřidávejte proteinázu přímo k lyzačnímu pufru. Inkubujte 15 až 20 min při 70 C. Nesprávně připravené reagencie Připravujte pufry a proteinázu K podle návodu (sekce 3). Před aplikací na kolonku přidejte ke vzorku ethanol. Nedostatečná eluce DNA z membrány Předehřejte pufr BE na 70 C před elucí. Pipetujte eluční pufr přímo na střed membrány.. Účinnost eluce dramaticky klesá při použití pufrů o ph < 7.0. Používejte mírně zásadité roztoky jako pufr BE (ph 8.5). Vzorky během inkubace při 70 C důkladně vortexujte, zejména pokud se jedná o vzorky staré či sražené krve. GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit 14/20 www.geneproof.com
Nesprávně připravené reagencie Připravujte pufry a proteinázu K podle návodu (sekce 3). Před aplikací na kolonku přidejte ke vzorku ethanol. Nedostatečná lýze buněk Vzorek nebyl dostatečně promíchán s lyzačním pufrem nebo proteinázou. Vzorek je třeba intenzivně vortexovat ihned po přidání lyzačního pufru. Špatná kvalita DNA Nedostatečná účinnost proteinázy K. Nikdy nepřidávejte proteinázu přímo k lyzačnímu pufru. Inkubujte 30 min při 70 C. RNA ve vzorku Pokud požadujete DNA bez přítomnosti RNA, přidejte 20 µl roztoku RNasy A (20 mg/ml) před přidáním lyzačního pufru. Izolace DNA ze vzorků staré nebo sražené krve Při izolaci DNA ze vzorků staré či sražené krve doporučujeme prodloužit krok inkubace při 70 C na 30 min a v průběhu kroku několikrát vortexovat. Přenos ethanolu Problémy při následném zpracování DNA při enzymatických reakcích Ujistěte se, že byl z kolonky odstraněn veškerý pufr B5 před elucí DNA. Pokud z jakéhokoliv důvodu dosáhla hladina pufru B5 v centrifugační zkumavce spodní části kolonky, umístěte kolonku do nové centrifugační zkumavky a znovu centrifugujte. Kontaminace DNA inhibitory Pokud byl při eluci použit pufr TE, ujistěte se, že EDTA neinterferuje při následném zpracování DNA nebo DNA přečistěte do pufru BE. Při izolaci DNA ze vzorků staré či sražené krve doporučujeme prodloužit krok inkubace při 70 C na 30 min a v průběhu kroku několikrát vortexovat. Pokud je hodnota poměru A260/280 nižší než 1,6, proveďte přečištění. Přidejte 1 objem pufru B3 a 1 objem ethanolu k eluátu, naneste na kolonku a pokračujte krokem 3 v návodu. Příbalová informace 15/20 www.geneproof.com
10. Varianty produktu Název produktu Kat. č. Technologie Balení GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit IDNA050 Izolace 50 izolací GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit IDNA250 Izolace 250 izolací UPOZORNĚNÍ Jediná platná Příbalová informace pro konkrétní soupravu je součástí balení nebo na vyžádání k dané šarži u výrobce. Soupravu je po použití doporučeno likvidovat podle aktuální právní úpravy s ohledem na skutečnost, že souprava neobsahuje žádné nebezpečné, infekční nebo toxické látky, které by podléhaly zvláštním bezpečnostním předpisům, a použité obalové materiály jsou vyrobeny z papíru a z polypropylenu. V případě jakéhokoliv dotazu kontaktujte zákaznický servis. GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit 16/20 www.geneproof.com
11. Zákaznický servis Vážíme si všech našich zákazníků a kromě kvalitních produktů poskytujeme nadstandardní zákaznický servis, který představuje: poskytnutí demonstračních PCR kitů zdarma vč. předvedení v laboratoři zákazníka a zaškolení personálu expresní dodávky rychlé řešení problémů vztahujících se k dodávaným produktům - garance zahájení servisu do 24 hod. od nahlášení pomoc při řešení jakýchkoliv problémů týkajících se molekulární diagnostiky na pracovišti odběratele konzultace k interpretacím technologickým i klinickým Pro zajištění co nejrychlejšího řešení jakéhokoliv problému od uživatelů GeneProof PCR souprav vždy požadujeme: název soupravy popis problému šarži (lot) soupravy uvedeno na obalu soupravy použitý přístroj soubor se záznamem vyšetření z použitého přístroje, pokud je k dispozici 12. Kontakt Zákaznický servis a technická podpora Tel.: +420 543 211 679 Fax: +420 516 770 824 E-mail: support@geneproof.com Objednávky Tel.: +420 543 211 679 Fax: +420 516 770 824 E-mail: sales@geneproof.com GeneProof a.s. Vídeňská 119 / CZ-619 00 Brno / +420 543 211 679 / info@geneproof.com VERZE: IDNA_004_15_02 Platnost od: 14.09.2015 17/20 www.geneproof.com
13. Poznámky GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit 18/20 www.geneproof.com
Příbalová informace 19/20 www.geneproof.com
GeneProof PathogenFree DNA Isolation Kit 20/20 www.geneproof.com