MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA DIPLOMOVÁ PRÁCE BRNO 2010 MICHAELA PAVELKOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Analýza polymorfizmů v genu EEF1A2 u prasat Diplomová práce Vedoucí práce: Prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph.D. Vypracovala: Bc. Michaela Pavelková Brno 2010 1

ZADÁNÍ 2

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Analýza polymorfizmů v genu EEF1A2 u prasat vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. podpis diplomanta. 3

Poděkování Děkuji vedoucímu své práce, prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za projevenou ochotu a odborné vedení při zpracování mé diplomové práce. Dále bych ráda poděkovala Ing. Kateřině Svobodové za pomoc v laboratoři a při psaní práce a v neposlední řadě také doc. Ing. Tomáši Urbanovi, Ph.D. za pomoc při zpracování výsledků. 4

Abstrakt Cílem této práce bylo vyhodnotit asociační analýzu jednonukleotidového polymorfizmu v genu EEF1A2 s parametry masné užitkovosti u prasat (výška hřbetního tuku, průměrný denní přírůstek a podíl libové svaloviny). Polymorfizmus v genu byl zjišťován u 69 prasniček plemene české bílé ušlechtilé. Pro detekci genotypů byly použity metody PCR a RFLP, s využitím restrikční endonukleázy Hin6I. Ze získaných dat byly vypočteny frekvence genotypů a alel a následně byla pomocí software SAS 9.1.4 provedena asociační analýza mezi genotypy a jednotlivými užitkovými vlastnostmi. Frekvence zjištěných genotypů byly: 26,09 % GC a 73,91 % CC. Genotyp GG nebyl u studovaných zvířat zaznamenán. Byla tudíž zjištěna nízká frekvence alely G (0,1304) a vysoká frekvence alely C (0,8696). V asociační analýze mezi jednotlivými genotypy (GC a CC) a parametry masné užitkovosti nebyla zjištěna statistická průkaznost (p 0,05) ani statistický rozdíl blížící se průkaznosti (p 0,1). Klíčová slova: EEF1A2, polymorfizmus, masná užitkovost, české bílé ušlechtilé 5

Abstract The aim of this study was to evaluate association analysis of EEF1A2 gene polymorphism on pig meat performance characteristics (backfat thickness, average daily gain and lean meat percentage). The polymorphism was analysed in a population of 69 Czech Large White pigs. Individual genotypes were detected using PCR and RFLP methods with use of restriction endonuclease Hin6I. Frequencies of genotypes and alleles were counted and than the association analysis between genotypes and individual performance characteristics using the SAS 9.1.4 software was carried out. The genotype frequencies were 26.09% GC and 73.91% CC. No GG genotype was observed, so a low frequency of allele G (0.1304) and a high frequency of allele C (0.8696) were find out. There were found no significant difference (p 0.05) and no traits approached to significant level (p 0.1) in the association analysis between individual genotypes (GC and CC) and meat performance characteristics. Key words: EEF1A2, polymorphism, meat performance, Czech Large White 6

OBSAH 1 ÚVOD... 9 2 CÍL PRÁCE... 10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 11 3.1 Plemeno české bílé ušlechtilé... 11 3.2 Masná produkce... 12 3.2.1 Definice masa... 12 3.2.2 Maso ve výživě člověka... 12 3.2.3 Vepřové maso... 12 3.2.4 Produkce masa... 13 3.2.5 Šlechtění prasat pro produkci libového masa... 13 3.3 Karyotyp a genom prasat... 14 3.3.1 Karyotyp prasete... 14 3.3.2 Genom prasat... 14 3.4 Genetické markery a QTL... 15 3.4.1 QTL... 15 3.4.2 Genetický marker... 15 3.5 Metoda kandidátních genů... 16 3.6 Gen EEF1A2... 17 3.6.1 Elongační faktor EEF1A... 17 3.6.2 Lokalizace genů EEF1A1 a EEF1A2... 18 3.6.3 Struktura EEF1A2... 18 3.6.4 Geny pro EEF1A u eukaryot... 19 3.6.5 Exprese EEF1A1 a EEF1A2... 20 3.6.6 Rozdílné funkce a vlastnosti EEF1A2 a EEF1A1... 21 3.6.7 Vliv EEF1A2 na degeneraci neuronů... 22 3.6.8 Onkogenní charakter EEF1A1 a EEF1A2... 22 3.6.9 EEF1A jako biomarker poškození DNA... 24 3.6.10 EEF1A2 a masná užitkovost... 24 3.7 Polymorfizmus... 25 3.8 Metody detekce polymorfizmu DNA... 27 3.8.1 Elektroforéza... 27 7

3.8.2 Polymerázová řetězová reakce... 29 3.8.3 Polymorfizmus délky restrikčních fragmentů... 31 4 MATERIÁL A METODIKA... 33 4.1 Testovaný soubor... 33 4.2 Izolace DNA... 34 4.3 Polymerázová řetězová reakce... 34 4.4 Polymorfizmus délky restrikčních fragmentů... 35 4.5 Výpočty frekvencí genotypů a alel... 37 4.6 Statistické vyhodnocení asociační analýzy... 38 5 VÝSLEDKY... 39 5.1 Frekvence alel a genotypů... 39 5.2 Nalezení polymorfizmu v genu EEF1A2... 40 5.3 Výsledky asociační studie... 41 6 DISKUZE... 42 7 ZÁVĚR... 44 8 POUŽITÁ LITERATURA... 45 9 SEZNAM OBRÁZKŮ A TABULEK... 53 10 SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK... 54 11 PŘÍLOHY... 56 8

1 ÚVOD V České republice je vepřové maso tradiční potravinou a jeho spotřeba je na vysoké úrovni. Pokud si má vepřové maso tuto pozici udržet, není možné spoléhat na dosavadní zvyklosti. Celosvětový trend výroby masa se vedle zvýšení produkce orientuje na zlepšení jeho kvality. Při šlechtitelském zlepšování kvality jatečných prasat nelze usilovat pouze o maximální podíl svaloviny a minimální podíl tukové tkáně, ale zároveň je třeba se zaměřit i na kvalitu masa a tuku. EEF1A2 je v této práci zkoumán jako kandidátní gen ovlivňující parametry masné užitkovosti u prasat. Identifikace genů, které ovlivňují užitkovost hospodářských zvířat, přispívá k rozšíření znalostí o genetické podmíněnosti masné užitkovosti a nabízí perspektivu využití těchto poznatků ve šlechtění. Poznatky molekulární genetiky již přispěly a nadále mohou přispívat významnou měrou k úspěšnému naplnění nových cílů ve šlechtění prasat podle požadavků spotřebitelů a technologů a ke snížení doprovodných nedostatků. 9

2 CÍL PRÁCE Cílem mé diplomové práce bylo provést asociační analýzu jednonukleotidového polymorfizmu v genu EEF1A2 u plemene české bílé ušlechtilé s parametry masné užitkovosti (výškou hřbetního tuku, přírůstkem a podílem libové svaloviny). K tomu bylo v jednotlivých krocích nutné: zpracovat literaturu k tématu určit genotypy jednotlivých zvířat ze souboru pomocí metod PCR a RFLP, za použití agarózové gelové elektroforézy vytvořit databázi jednotlivých genotypů a zpracovat statistické vyhodnocení výsledků zjistit asociace genotypů v genu EEF1A2 vzhledem k parametrům masné užitkovosti 10

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Plemeno české bílé ušlechtilé Prasata plemene české bílé ušlechtilé mají velmi dobré reprodukční vlastnosti, vynikající růstovou schopnost při velmi dobré konverzi živin a velmi dobrou masnou užitkovost, přičemž však v převažující míře zachovávají užitkový typ odpovídající mateřským liniím. Kvalita masa je dobrá. Vyznačují se větším až velkým tělesným rámcem, lehčí hlavou se vzpřímeným uchem, jemnější ale pevnou kostrou, pevnou konstitucí s vysokým stupněm odolnosti vůči stresům. Barva kůže i štětin je bílá (Pulkrábek et al., 2005). Plemeno vzniklo z původního klapouchého prasete ( český štětináč ) křížením s dovezenými plemeny z Anglie a Německa. Roku 1927 byla zahájena tvorba bílého ušlechtilého plemene převodným křížením s německým ušlechtilým plemenem, využívalo se též velké bílé anglické plemeno. Již v meziválečném období se přešlo k čistokrevné plemenitbě, kontrole užitkovosti, k výběru a licentaci kanců. V poválečném období byl rozvoj plemene spíše kvantitativní, později byly snahy o zlepšení vlastností využitím importu landrase. Od 70. let 20. století bylo plemeno zapojeno do hybridizačního programu, ve kterém se uplatňuje v mateřské pozici. Intenzivní šlechtění masného typu dalo vznik otcovským liniím, které vytvořily samostatné plemeno bílé otcovské (Sambraus, 2006). Prasata otcovská linie jsou bílé barvy, uši mají vzpřímené, tělesný rámec střední až větší, kostra je pevná, o něco mohutnější než u mateřských linií. Užitkový typ požaduje výrazné vyjádření masného užitkového typu s mediální rýhou na hřbetě. Růstová schopnost je velmi dobrá při výborné konverzi živin. Používá se v čistokrevné formě, případně při produkci speciálních otcovských linií pro C pozici (Žižlavský et al., 2005). 11

3.2 Masná produkce 3.2.1 Definice masa Jako maso jsou často definovány všechny části těl živočichů v čerstvém nebo upraveném stavu, které jsou vhodné k lidské výživě. Vzhledem k nesmírné rozmanitosti konzumačních zvyklostí různých národů a etnických skupin můžeme v našich podmínkách pojem maso zúžit pouze na příčně pruhovanou svalovinu z těl teplokrevných jatečných zvířat, včetně nedílných součástí svalových partií jako jsou vazivové součásti svalů, povrchový a intramuskulární tuk, cévy, mízní uzliny, nervy, kosti a v některých případech i opařená kůže (Steinhauser et al., 2000). 3.2.2 Maso ve výživě člověka Maso je součástí výživy člověka nejméně dva miliony let. Jedná se o velmi bohatý a univerzální zdroj živin. Primární význam masa z hlediska výživy spočívá zejména v obsahu proteinů. Aminokyseliny jsou využívány pro růst a obnovu buněk těla. Maso je ale i poměrně koncentrovaný zdroj esenciálních mikronutrientů. Mastné kyseliny, vitaminy, minerálie, energie, voda jsou zahrnuty v syntéze proteinů, tuků, buněčných membrán aj. Některé látky obsažené v mase mohou hrát roli při podpoře zdraví. Mezi tyto látky můžeme zařadit např. kyselina lipoovou, což je antioxidant prospěšný při diabetu, karnosin dipeptid s antioxidačním, protizánětlivým a protinádorovým účinkem, glutathion tripeptid zesilující absorpci nehemového železa, cholin prekurzor acetylcholinu nebo karnitin, který se skládá z lyzinu a methioninu, přenáší mastné kyseliny s dlouhým řetězcem do mitochondrií a má vliv na oxidativní získávání energie (Simeonová et al., 2003). 3.2.3 Vepřové maso Je u nás i v dalších evropských státech nejrozšířenějším druhem masa pro výživu lidí. Vepřové maso z mladých prasat je jemně vláknité, růžově-červené a poměrně měkké. Maso je v různém rozsahu obrostlé a prorostlé tukem. Starší prasata poskytují maso tmavěji červené, hruběji vláknité a pevnější textury. Vařené vepřové maso je bledě šedé barvy. Vepřové maso má typické aroma a slabě nasládlou chuť (Simeonová et al., 2003). 12

3.2.4 Produkce masa Produkce masa je úzce spojena s růstem zvířat, dynamickým procesem, jenž probíhá během celého života. Jedná se o složitý znak masné užitkovosti, propojený se všemi životními pochody. Biologické dispozice pro produkci masa zvířat se vytváří již v jednotlivých růstových fázích ontogeneze. Růst je souhrn interakcí genetického založení organismu, podmínek prostředí a výživy (Steinhauser et al., 2000). Ke sledování a hodnocení růstových dějů je v současnosti využíváno několik základních metod. Podkladem pro používání jednotlivých metod hodnocení růstu je zjišťování jednoho nebo více znaků na zvířeti v pravidelných časových intervalech. Základním ukazatelem růstu je přírůstek hmotnosti měřený za časovou jednotku. Tou bývá nejčastěji krmný den. Kvalita masa a tuku může být hodnocena velkým počtem ukazatelů. Při analýzách kvality jsou obvykle sledována kritéria náležející do souborů charakterizovaných požadavky zpracovatelů a konzumentů masa (Steinhauser et al., 2000). Kvalita masa se dá definovat jako součet nutričních, senzorických, hygienicko-toxických a technologických vlastností (Bečková et Václavková, 2009). 3.2.5 Šlechtění prasat pro produkci libového masa Dobrá zdravotní pověst masa se zhroutila v 80. letech minulého století. Výzkum potvrdil negativní vliv tuku na kardiovaskulární onemocnění. Pozornost byla věnována především tuku z červeného masa, protože je obvykle největším zdrojem nasycených mastných kyselin v naší dietě. I když je od 90. let známý multifaktoriální původ kardiovaskulárních onemocnění, negativní asociace se škodlivostí červeného masa přetrvává (Simeonová et al., 2003). Snahou o zvýšení podílu svaloviny došlo u prasat k podstatnému snížení podílu tukové tkáně i k poklesu obsahu intramuskulárního tuku, který silně ovlivňuje senzorické vlastnosti masa. Maso chudé na tuk je chuťově nevýrazné, tuhé a suché. Na základě degustačních testů se doporučuje podíl intramuskulárního tuku ve výši 2,5 %, většina plemen a finálních hybridů však již této hodnoty nedosahuje (Bečková et Václavková, 2009). V odborné literatuře se objevuje varování před dalším snižováním podílu tuku a zvyšováním zmasilosti prasat, které je příčinou zvyšování věku prasniček při dosažení pohlavní dospělosti. Vychází se z poznatku, že cholesterol je 13

prekurzorem steroidních pohlavních hormonů a spolu s leptinem tvořícím se v tukové tkáni zasahují do řízení pohlavních funkcí prasat (Steinhauser et al., 2000). Z uvedených informací vyplývá, že při šlechtitelském zlepšování kvality jatečných prasat nelze usilovat pouze o maximální podíl svaloviny a minimální podíl tukové tkáně, ale zároveň je třeba se zaměřit i na kvalitu masa a tuku (Bečková et Václavková, 2009). 3.3 Karyotyp a genom prasat 3.3.1 Karyotyp prasete Prase domácí (Sus scrofa domestica) díky relativně malému počtu chromozomů patří po stránce cytogenetické k nejlépe prostudovaným druhům (Knoll, 2003). Má diploidní počet chromozomů, 2n = 38 (18 párů autozomů, X a Y). Obr. 1: Karyotyp prasete (www.animalgenome.org/edu/gene/kary.html) 3.3.2 Genom prasat Genom je definován jako celková suma genetické informace v konkrétní buňce nebo organizmu. Genomy mikroorganizmů a eukaryot dosahují rozpětí od 700 000 bp u jednobuněčného mikrobiálního chromozomu až po více než 3 miliardy bp (3 Gb), v rozmezí od 5 do 96 chromozomů u různých savců. Haploidní genom člověka 14

obsahuje přibližně 3 miliardy nukleotidů rozmístěných na 23 chromozomech, v kterých je asi 25 000 genů. Podobnou velikost genomu mají i významné druhy hospodářských zvířat (Urban, 2008). Předpokládaná velikost genomu prasete je přibližně 2,7 Gb, přičemž průměrný výskyt SNP je odhadován na jeden v 336 bp (Kerstens et al., 2009). Srovnání genomu prasete a člověka ukazuje velké množství strukturálních podobností, více než například při srovnání člověka a myši (Fadista et al., 2008). 3.4 Genetické markery a QTL 3.4.1 QTL Poloha genu na chromozomu se nazývá lokus. Lokus pro gen, který ovlivňuje kvantitativní znak, se nazývá lokus pro kvantitativní znak (quantitative trait loci), ve zkratce QTL (Snustad et Simmons, 2009). QTL mají vesměs polygenní charakter a jejich vztah k užitkovosti se vyjadřuje nepřímo prostřednictvím genetických markerů polymorfních úseků DNA s rozličnou funkcí či bez funkce, ale se známou identifikovatelnou pozicí (Urban, 2008). Konečným ukazatelem úrovně masné užitkovosti je ekonomický efekt, proto se i v genetice zaměřené na produkci masa nejvíce pozornosti věnuje QTL pro ekonomicky významné kvantitativní znaky (economic trait loci), ve zkratce ETL (Steinhauser et al., 2000). 3.4.2 Genetický marker Genetický marker je vysoce polymorfní znak vykazující mendelistickou kodominantní dědičnost, který je snadno a jednoznačně detekovatelný (Knoll et Vykoukalová, 2002). Podle využití při mapování genomu můžeme markery rozdělit na: I. typ: kódující exprimované geny, které mohou být kandidátními geny pro QTL. Mají nízkou hladinu polymorfizmu, jsou tedy málo použitelné pro studie diverzity populací a rodin, avšak využívají se v komparativním mapování. 15

II. typ: vysoce variabilní sekvence DNA. Z těch se využívají především mikro a minisatelity. Vzhledem k vysokému stupni polymorfizmu jsou mikrosatelity vysoce informativní v populačních studiích a při určování rodičovství a tvoří základ pro vazbové mapování genů. Tyto markery přímo neovlivňují variabilitu znaku, avšak mohou být ve vazbě s QTL. III. typ: jednonukleotidové polymorfizmy (SNP), které se mohou vyskytovat uvnitř kódujících genů, ale častěji v nekódujících intronech nebo intergenových oblastech. Jsou využitelné pro populační a rodinné studie. V genomu se objevují přibližně každých 500 1000 bp. Jejich význam souvisí s rozvojem automatických metod screeningu (microarrays) (Knoll et Vykoukalová, 2002). Dle způsobu detekce můžeme markery rozdělit na: a) polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP restriction fragment lenght polymorphism) b) polymorfizmus v délce sekvence (SSLP simple sequence lenght polymorphism) c) polymorfizmus jednotlivých nukleotidů (SNP single nucleotide polymorphism) (Knoll et Vykoukalová, 2002). Metody detekce polymorfizmů a markerů mohou být: a) elektroforetické (podle velikosti či podle konformace) b) enzymatické c) hybridizační d) hybridizace při polymerázové řetězové reakci (fluorescenční výměny) e) hmotnostní spektrofotometrie 3.5 Metoda kandidátních genů Pro detekci genů pro kvantitativní znaky se využívají dva přístupy: asociační testy kandidátních genů a intervalové (vazbové) mapování (Knoll, 2003). Metoda kandidátních genů vychází z předpokladu, že známe působení kandidátního genu na genetické a fyziologické úrovni. Musí být známy geny a jejich sekvence DNA. Výběr správného genu by měl být prováděn na základě dobré znalosti 16

jeho pozice v metabolických drahách. Aditivní efekty pro různé alely těchto kandidátních genů se pak porovnávají navzájem, aby se prokázaly substituční efekty alely. Používají se rozdílné techniky na úrovni populací nebo rodin. Tato strategie sestává ze studia různých genů, které jsou potenciální pro ovlivňování fyziologických procesů, a pro každý gen pak z určení alely, která má za následek žádoucí fenotyp. To vyžaduje znalost genetické kontroly studovaného fyziologického procesu. Identifikace polymorfních míst a vyhodnocení rozdílů alel kandidátních genů mezi zvířaty různých fenotypových hodnot nabízí potenciální možnost identifikace markerového genu asociovaného s fenotypovou hodnotou (Urban, 2008). Použití kandidátních genů může být velmi účinné a může detekovat i lokusy s malým efektem. Nevýhodou je, že se často vyskytuje pro danou vlastnost nebo znak příliš mnoho kandidátních genů a jejich studium tak je časově náročnější, než intervalové mapování celého genomu. Interpretace výsledků kandidátních genů musí být opatrná, protože mohou být získány falešné pozitivní výsledky buď kvůli vazbové nerovnováze s příčinnými geny (pozitivní nebo negativní vazba) a nebo špatně nastavenému prahu statistické významnosti (Knoll, 2003). Pro využití v selekci musí mít kandidátní gen aspoň dvě různé alely. K účinné selekci je důležité i zastoupení těchto alel a z nich tvořených genotypů v populaci zvířat (Steinhauser et al., 2000). 3.6 Gen EEF1A2 3.6.1 Elongační faktor EEF1A Eukaryotický elongační faktor 1A (EEF1A, dříve známý jako EF1α) je klíčový faktor pro syntézu proteinů v eukaryotických buňkách (Bischoff et al., 2000). Jedná se o druhý nejrozšířenější protein v buňkách po aktinu, tvoří asi 1 3 % z celkového obsahu proteinů v buňkách (Lee et Surh, 2009). U savců byly objeveny dvě izoformy EEF1A: EEF1A1 a EEF1A2. Tyto izoformy jsou z 96 % identické na úrovni aminokyselin (Knudsen et al., 1993) a ukazují stejnou aktivitu v in vitro translační analýze (Kahns et al., 1998). 17

3.6.2 Lokalizace genů EEF1A1 a EEF1A2 Gen EEF1A1 byl u člověka popsán na šestém chromozomu, v oblasti 6q14, zatímco EEF1A2 byl zmapován v oblasti 20q13.3 (Lund et al., 1996). U myší byl gen pro izoformu EEF1A1 identifikován na devátém chromozomu a pro EEF1A2 na druhém chromozomu (Chambers et al., 1998). U prasete byl gen EEF1A1 pomocí radiačního hybridního mapování nalezen na osmém chromozomu, oblast 8q11 (Karnuah et al., 2001), avšak dle novější studie (Svobodová et al., dosud nepublikováno) tento gen leží na prvním chromozomu. Gen EEF1A2 byl u prasat dle nedávného výzkumu lokalizován na chromozomu 17 (Svobodová et al., dosud nepublikováno). Obr.2: Prasečí chromozom 17 ( INRA) 3.6.3 Struktura EEF1A2 Studium překrývajících se klonů odhalilo, že lidský gen EEF1A2 má rozpětí asi 10 kb a skládá se z osmi exonů. Gen izoformy EEF1A2 je rozsáhlejší než gen EEF1A1, což způsobují introny. Mezi kódujícími regiony lidského EEF1A1 a EEF1A2 jsou pozorovány homologie, zatímco introny a netranslatované oblasti jsou vysoce rozdílné. Další rozdíl mezi geny těchto dvou izoforem je ten, že v oblasti kódující EEF1A1 je obsažen TATA-box, zatímco v oblasti kódující EEF1A2 není (Bischoff et al., 2000). Strukturu lidského genu EEF1A2 znázorňuje obrázek 3. 18

Obr.3: Genomická struktura lidského genu EEF1A2 (Bischoff et al., 2000) Osm exonů je představováno černými obdelníčky. Introny jsou reprezentovány čárami mezi exony. Subfragmenty, které byly izolovány a sekvenovány, jsou ve spodní části schématu. Ukázalo se, že struktury EEF1A2 u lidí a potkanů jsou velmi podobné. Kódující a netranslatované regiony ukazují vysoký stupeň podobnosti, rozdíly jsou pozorovatelné v intronech (Bischoff et al., 2000). 3.6.4 Geny pro EEF1A u eukaryot U eukaryot byla pozorována variabilita v genech pro EEF1A. Větší množství těchto genů bylo identifikováno u rostlin, například 10 15 genů u kukuřice (Carnerio et al., 1999) a 9 genů u bavlny (Xu et al., 2007). Méně jich bylo objeveno u hub, kvasinka Saccharomyces cerevisiae obsahuje dva geny pro EEF1A (Nagashima et al., 1986) a Mucor racemosus tři (Linz et al., 1986). Ovocná muška Drosophila melanogaster má tyto geny dva, z nichž jeden je vždy exprimován v určitých stádiích vývoje (Hovermann et al., 1988). U žáby Xenopus laevis byly pozorovány tři tyto geny, které jsou také exprimovány v různých vývojových stádiích (Abdallah et al., 1991). V savčím genomu existuje mnoho lokusů podobných EEF1A, většina z nich se však jeví jako pseudogeny (Lund et al., 1996). Pouze dvě z těchto sekvencí (EEF1A1 a EEF1A2) jsou v současnosti známé jako aktivně exprimované u lidí (Kundsen et al., 1993), myší (Lee et al., 1994), potkanů (Lee et al., 1993) a králíků (Kahns et al., 1998). 19

3.6.5 Exprese EEF1A1 a EEF1A2 Expresní analýzy EEF1A1 a EEF1A2 jsou obecně komplikovány nedostatkem protilátek, které specificky rozpoznají obě tyto izoformy. Proto je třeba pro analýzy vytvářet panel protilátek, které na rozdíl od komerčně dostupných protilátek specificky rozeznávají varianty EEF1A1 a EEF1A2 (Newbery et al., 2007). EEF1A1 a EEF1A2 jsou různě exprimovány. Izoforma EEF1A1 je exprimována ve všech známých tkáních kromě kosterního svalu, zatímco exprese EEF1A2 je omezena na kosterní svalstvo, srdce, mozek a aortu (Kahns et al, 1998; Knudsen et al., 1993). V těchto tkáních je exprese EEF1A2 zvýšena během terminálního diferenciačního procesu (Lee et al., 1995). Zvýšení exprese EEF1A2 se objevuje současně s snížením exprese EEF1A1, což naznačuje, že EEF1A2 přebírá tkáňově specificky funkci EEF1A1 v syntéze proteinů (Bischoff et al., 2000). Vysvětlením vývojového přepnutí mezi EEF1A1 a EEF1A2 v terminálně diferencovaných buňkách svalu by mohla být protiapoptická funkce EEF1A2 (Ruest et al., 2002), avšak tato problematika není dosud zcela objasněna. Bylo usouzeno, že exprese EEF1A2 je spojena s terminální diferenciací (Lee et al.,1995), jsou zde však další typy buněk (např. keratinocyty), které jsou terminálně diferencovány, ale které neexprimují EEF1A2 (Newbery et al., 2007). Buňky v těle spadají do tří kategorií: ty, které exprimují jenom EEF1A1 (většina typů buněk), ty, které exprimují pouze EEF1A2, a ty, které koexprimují obě formy (zejména v nádorech). Jelikož je koexprese EEF1A1 a EEF1A2 jen málokdy pozorována v normálních buňkách, bude přínosné dále studovat, jak koexprese souvisí s tvorbou nádorů (Newbery et al., 2007). Buněčné typy, které vypínají expresi EEF1A1, mají tendenci mít silnou, stabilní organizaci cytoskeletu, jako jsou neurony a svalové buňky. Je proto lákavá hypotéza, že toto vypnutí souvisí s ochranou těchto buněk před funkcemi EEF1A1 spojenými s modifikací cytoskeletu, a že tyto buňky používají EEF1A2, jelikož si potřebují udržet syntézu proteinů (Abbott et al., 2009). Stojí však za zmínku, že například svalové buňky znovu zapínají expresi EEF1A1 jako odezvu na toxické poškození a po zotavení se opět vrací k vysokým hodnotám EEF1A2 (Khalyfa et al., 2003). 20

3.6.6 Rozdílné funkce a vlastnosti EEF1A2 a EEF1A1 Z mnoha zjištění vyplývá, že vlastnosti obou izoforem se mohou mírně odlišovat. Pokud se týče jejich funkce v translaci, bylo zjištěno, že ačkoliv izoformy EEF1A1 i EEF1A2 vykazují stejnou aktivitu v in vitro translační analýze, EEF1A1 váže GTP silněji než GDP, zatímco u EEF1A2 je tomu naopak (Kahns et al., 1998). U obou izoforem byly kromě jejich role v translaci objeveny další funkce. Při studiu myotubulů bylo například prokázáno, že zatímco EEF1A1 je proapoptický, EEF1A2 se vyznačuje antiapoptickou aktivitou (Ruest et al., 2002). U EEF1A1 byly navíc zjištěny funkce ovlivňující mimo jiné například modifikace cytoskeletu (Condeelis, 1995). Také má roli v proteozomy zprostředkované degradaci poškozených proteinů (Chuang et al., 2005) nebo responsi na teplotní šok (Shamovsky et al., 2006). EEF1A2 nebyl zatím dostatečně prostudován na biochemické úrovni, aby bylo jasné, které z těchto funkcí platí i pro něj (Soares et al., 2009). Pro prozkoumání strukturálních základů funkčních rozdílů byl vytvořen srovnávací trojrozměrný model lidského EEF1A1 a EEF1A2 (obrázky 4 a 5). Pozorování vedlo k hypotéze, která byla nakonec potvrzena: že chemické rozdíly a funkční odlišnosti jsou způsobeny různou fosforylací těchto dvou variant (Soares et al., 2009). Obr.4: Modely lidského proteinu EEF1A1 a EEF1A2 (Soares et al., 2009). Modrý 3-D model EEF1A1 a červený EEF1A2 ukazují lokaci rozdílných bočních řetězců, zbarvených zeleně. 21

Obr.5: Lokalizace variací aminokyselin zmapovaných na povrchu EEF1A1 a EEF1A2 (Soares et al., 2009). Rozdíly jsou zbarveny zeleně a označeny u modelu lidského EEF1A2. 3.6.7 Vliv EEF1A2 na degeneraci neuronů Při studiu myší bylo prokázáno, že pokud je znemožněna exprese EEF1A2, dochází k degeneraci neuronů (MND motor neuron degeneration). Tato porucha je dána delecí o rozsahu 15 kb, která zasahuje promotor prvního exonu kódujícího EEF1A2 a narušuje tak jeho expresi (Newbery et al, 2007). Tato delece nezasahuje žádný jiný gen. Vliv EEF1A2 na vadný fenotyp byl potvrzen také další studií (Abbott et al., 2009). 3.6.8 Onkogenní charakter EEF1A1 a EEF1A2 EEF1A2 byl již v mnoha pracích studován jako pravděpodobný onkogen, dosavadní studie byly zaměřeny především na karcinom prsu a vaječníků. První zpráva spojující lidský proteinový translační faktor EEF1A1 s rakovinou identifikovala jeho expresi u primárního karcinomu prostaty, ale ne v normální tkáni prostaty (Shen et al., 1995). První specifický důkaz o roli EEF1A2 v tumorogenezi pochází z roku 2002, kdy bylo zveřejněno, že EEF1A2 byl v pokusech zvýšeně exprimován u 30 % nádorů vaječníků, ale nebyl exprimován u normální tkáně vaječníků (Anand et al., 2002). Stejný výsledek potvrdila i další studie (Lee, 2003). 22

Souhlasně bylo zjištěno, že je EEF1A2 zvýšeně exprimován u dvou třetin zkoumaných prsních nádorů, ale ne v normální prsní tkáni. (Tomlinson et al.,2005). EEF1A2 má pravděpodobně také spojitost s rakovinou slinivky. Zatímco v normální lidské tkáni slinivky břišní a v tkáních slinivky s chronickým zánětem byla detekována malá nebo žádná exprese EEF1A2, u 83 % studovaných případů rakoviny slinivky se objevila zvýšená exprese EEF1A2 (Cao et al., 2009). Jiná provedená studie objevila zvýšenou expresi EEF1A2 u pacientů s hepatocelulárním karcinomem (Grassi et al., 2007). EEF1A2 již byl také zmiňován v souvislosti s rakovinou plic (Lam et al., 2006) a žaludku (Yamashita et al., 2006). Zvýšená exprese byla pozorována i u vzorků karcinomu střeva (dokonce u 76 % zkoumaných případů), ledviny nebo rekta (Lee et Surh, 2009). Navzdory mnoha provedeným studiím stále není jasné, proč by EEF1A2 měl mít onkogenní vlastnosti ve tkáních, ve kterých je vysoce příbuzný EEF1A1 exprimován na vysoké úrovni (Tomlinson et al., 2007). Podle některých výsledků (Tomlinson et al., 2007) nebyla vždy pozorována korelace mezi amplifikací lokusu a genovou expresí, což naznačuje, že amplifikace nemůže být výhradní základní mechanismus zvýšené exprese. Obr. 6: Amplifikace EEF1A2 v ovariálních nádorech, detekováno metodou FISH (Anand et al., 2002) 23

Lokus 20q13, jehož amplifikace je často spojena s nádorem vaječníků, je místem několika onkogenů, vedle eukaryotického elongačního faktoru EEF1A2 také transkripčního faktoru ZNF217 (zinc finger 217) (Sun et al., 2008). Výsledky ukazují, že tyto dva onkogeny mohou jednat vzájemně závisle při tvorbě ovariálních nádorů. Závěrem je, že EEF1A2 může zprostředkovávat pro-neoplastické změny způsobené ZNF217 anebo, že ZNF217 může zvýšit pro-neoplastický efekt EEF1A2 zvýšením jeho exprese (Sun et al., 2008). Je však potřeba provádět další studie, aby byla odhalena přesná úloha EEF1A2 při vzniku rakoviny. 3.6.9 EEF1A jako biomarker poškození DNA EEF1A byl také použit jako jeden ze 4 markerových proteinů v nedávno dokončené práci zkoumající akumulaci poškození DNA během stárnutí (von Figura et al., 2009). Podle jejích výsledků se expresní úroveň těchto markerových proteinů v krevní plazmě stárnoucích lidí zvyšuje. Zkoumaní pacienti měli rozdílné diagnózy, včetně např. diabetu, koronární srdeční choroby a mozkové ischemie, což naznačuje, že tyto s věkem spojované choroby korelují s biomarkery stárnutí. Mladší pacienti s nemocemi spojenými s masivním poškozením DNA (cirhóza jater, rakovina) však mohou mít vyšší hodnoty těchto biomarkerů v krvi než zdraví starší lidé. Mechanismus zvýšení exprese markerových proteinů jako odezva na dysfunkci telomer a poškození DNA však prozatím zůstává nerozluštěn (von Figura et al., 2009). 3.6.10 EEF1A2 a masná užitkovost Vliv funkce genu EEF1A2 na parametry masné užitkovosti prasat nebyl doposud studován, avšak jelikož tento gen významně ovlivňuje metabolismus proteinů, jeví se jako vhodný kandidátní gen pro užitkové vlastnosti prasat spojené s produkcí masa. EEF1A2 je u prasat lokalizován na chromozomu 17, na kterém bylo do současnosti detekováno 87 různých QTL. Mezi nimi mimo jiné několik QTL ovlivňujících průměrný denní přírůstek a také QTL s vlivem na výšku hřbetního tuku, procento libové svaloviny, obsah intramuskulárního tuku nebo například věk při porážce (Animalgenome, 2010). 24

Obr 7: QTL na chromozomu 17 ovlivňující průměrný denní přírůstek (http://www.animalgenome.org/cgi-bin/qtldb/ss/draw_chromap) 3.7 Polymorfizmus Slovo polymorfizmus znamená mnohotvárnost; pochází z řeckého polys = mnoho, morfe = tvar (Kuciel et al., 2004). Za geneticky polymorfní je považován znak s nejméně dvěma geneticky podmíněnými variantami v jedné populaci, které se nachází v alespoň 1% frekvenci. Široký pojem genetického polymorfizmu lze podle objektu studia členit na: polymorfizmus DNA, polymorfizmus biochemický, polymorfizmus imunologický a morfologický (Řehout et al., 2003). Nebyla stanovena žádná hranice pro rozlišení vysokého nebo extremního, případně nízkého nebo limitovaného polymorfizmu z hlediska počtu alel jednoho lokusu ani z hlediska jejich distribuce a frekvence v populaci. Existují polymorfní geny, které mají jen dvě až tři formy alel, ale existují také geny s několika desítkami, případně i stovkami alel (Kuciel et al., 2004). Polymorfizmus můžeme rozdělit dle jeho podstaty, kterou může být: a) bodová mutace b) repetitivní sekvence (minisatelitní nebo mikrosatelitní) c) konformační polymorfizmus (SSCP, DGGE, TGGE) (Knoll et Vykoukalová, 2002) 25

Ad a) Bodový polymorfizmus Tento typ je způsoben změnou v sekvenci bazí, nejčastěji bodovou mutací (většinou záměna nukleotidu nebo delece několika bazí) v určitém místě DNA. V praxi je bodový polymorfizmus detekován jako polymorfizmus délky restrikčních fragmentů RFLP (restriction fragment lenght polymorphism). Bodový polymorfizmus bývá označován jako SNP (single nucleotide polymorphism) a je analyzován za použití přístrojové techniky. Takto definované polymorfní místo se chová jako mendelisticky děděný gen s kodominantní dědičností, jednotlivé varianty se vyskytují s určitou frekvencí, která se může v různých populacích lišit (Řehout et al., 2003). Ad b) Repetitivní sekvence Slovo repetitivní označuje sekvence, které se v genomové DNA vyskytují v mnoha kopiích. V posledních letech je intenzívně sledován výskyt satelitů (mini a zejména mikrosatelitů). Satelity přítomné na určitém místě v genomu mohou mít v rámci populace různý počet opakujících se bází, různou délku. Tyto varianty se chovají jako mendelisticky děděné geny (Řehout et al., 2003). Ad c) Konformační polymorfizmus Rozlišujeme polymorfizmus konformace jednořetězců (SSCP) a polymorfizmus konformace dvouřetězců (DSCP). Diagnostická metoda analýzy konformačního polymorfizmu jednořetězců využívá tvorby rozdílné sekvenčně specifické intramolekulární struktury ssdna (jednořetězcové DNA) nebo ssrna ovlivňující mobilitu jednořetězců při nedenaturujících elektroforetických podmínkách. Metoda polymorfizmu konformace dvouřetězců využívá schopnosti denaturovaných produktů polymerázové řetězové reakce vytvářet duplexy DNA, pokud jsou podrobeny pomalé renaturaci. Duplexy, jejichž řetězce se vyznačují úplnou komplementaritou bází (homoduplexy), a hybridní molekuly, jejichž řetězce se vyznačují neúplnou komplementaritou bází (heteroduplexy), mají v nedenaturujících gelech rozdílné elektroforetické pohyblivosti (Šmarda et al., 2008). 26

Praktické možnosti využití polymorfizmu spočívají v: určování paternity ověřování původu fylogenetických a ontogenetických studiích nebo jejich využití jako genetických markerů za předpokladu existence vazby s genem pro hospodářsky významný znak či vlastnost (Urban et al., 2004) 3.8 Metody detekce polymorfizmu DNA Přehled molekulárně-genetických metod pro detekci polymorfizmu DNA použitých v této diplomové práci: 3.8.1 Elektroforéza (ELFO) Elektroforéza patří v molekulární biologii k nejpoužívanějším separačním technikám pro izolaci a analýzu nukleových kyselin a bílkovin. Principem elektroforetické separace je pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. Hlavním nositelem náboje nukleových kyselin jsou negativně nabité fosfátové skupiny, a proto se nukleové kyseliny v elektrickém poli pohybují k opačně nabité elektrodě anodě (Šmarda et al., 2008). Zařízení pro elektroforézu se skládá z elektroforetické vany s anodou, katodou a pufrem, držáku gelu, ve kterém dochází k separaci, a externího zdroje stejnosměrného napětí. Gelový přípravek se nalije do vaničky (u agarózové elektroforézy) nebo mezi skla (u polyakrylamidové elektroforézy) a nechá se ztuhnout (Knoll et Vykoukalová, 2002). Rychlost pohybu molekul DNA v gelu označovaná jako elektroforetická pohyblivost je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. Při posuzování elektroforetické pohyblivosti dané molekuly DNA není třeba brát v úvahu velikost náboje, protože nukleové kyseliny mají náboj rovnoměrně rozložen a jeho velikost je na jednotku délky molekuly stejná. Velikost molekuly DNA nebo jejího fragmentu o neznámé velikosti lze proto stanovit srovnáním jejich elektroforetické pohyblivosti s elektroforetickou pohyblivostí molekul nebo fragmentů DNA o známé velikosti, které se označují jako standardy velikosti nebo hmotnostní standardy (Šmarda et al., 2008). 27

Obecně platí, že molekuly větší velikosti a složitější prostorové struktury prochází gelem pomaleji (zůstávají blíže místu nanesení vzorků). Pro separaci molekul o určité velikosti je potřeba volit správnou koncentraci gelu (Knoll et Vykoukalová, 2002). Elektroforetické gely používané pro separaci nukleových kyselin jsou nejčastěji tvořeny polyakrylamidem nebo agarózou, které vytvářejí složitou síťovou strukturu polymerních molekul s póry, jejichž velikost lze ovlivnit složením roztoku a koncentrací polymeru (Šmarda et al., 2008). Agarózová elektroforéza U agarózové elektroforézy slouží jako prostředí pro dělení gel z agarózy, což je polysacharid izolovaný z mořských řas. Gely se většinou sestavují jako horizontální. Koncentrace agarózy určuje velikost pórů a tím propustnost pro DNA určité velikosti. Homogenita a rozlišovací schopnost je nižší něž u polyakrylamidové elektroforézy, ale špičkové vysoce kvalitní agarózy se vlastnostem polyakrylamidu přibližují. Výhodou je velmi snadná příprava gelů (Knoll et Vykoukalová, 2002). Polyakrylamidová elektroforéza U polyakrylamidové elektroforézy (PAGE polyacrylamide gel electrophoresis) slouží jako prostředí pro dělení gel tvořený polyakrylamidem (PAA). Gely se tvoří polymerací monomerů akrylamidu křížově sesíťovaného pomocí látky bisakrylamid. Koncentrace polyakrylamidu určuje velikosti pórů podobně jako u agarózy. Polyakrylamidové gely mají oproti agarózovým tři velké výhody: jejich dělící schopnost je tak velká, že mohou separovat molekuly DNA, jejichž velikost se liší až 500 krát (tj. od 1 bp do 500 bp), mohou pojmout mnohem větší množství DNA než agarózové gely (až 10 µg DNA), DNA získaná z těchto gelů je extrémně čistá (Knoll et Vykoukalová, 2002). Vizualizace elektroforetických gelů Nejpoužívanější metoda barvení agarózových gelů je pomocí ethidiumbromidu (EtBr). Využívá se schopnosti fluorescenční molekuly EtBr interkalovat do vlákna nukleových kyselin. Detekuje dvouřetězcové i jednořetězcové molekuly, ale citlivost k jednořetězcům je výrazně nižší. EtBr je silný mutagen a toxická látka. Dále se používá např. barvení stříbrem, autoradiografie nebo neradioaktivní značení (Knoll et Vykoukalová, 2002). 28

3.8.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Za základní molekulárně-genetickou metodu lze považovat polymerázovou řetězovou reakci (PCR), která slouží k získání dostatečného množství specifického úseku DNA pro další analýzy a může v některých svých modifikacích sloužit přímo k identifikaci polymorfizmů (Knoll et Vykoukalová, 2002). Metodu vyvinul Kary Mullis, který za tuto práci obdržel v roce 1993 Nobelovu cenu za chemii (Snustad et Simmons, 2009). Princip metody PCR Princip PCR je založen na replikaci nukleových kyselin, která je základním molekulárním procesem všech živých organizmů. Podstatou PCR je cyklicky se opakující enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA ve směru 5 3 prostřednictvím DNA polymerázy (Šmarda et al., 2008). Metoda PCR zahrnuje tři kroky, které se mnohokrát opakují. V prvním kroku je genomová DNA obsahující sekvence, které mají být amplifikovány, denaturována zahřátím na 92 95 ºC. Ve druhém kroku je denaturovaná DNA hybridizována s nadbytkem syntetických oligonukleotidových primerů tak, že se inkubují společně při 50 60 ºC. Ideální teplota pro připojení primerů závisí na tom, z kolika a z jakých bází jsou složeny. Ve třetím kroku je použita DNA polymeráza pro replikaci úseku DNA mezi místy komplementárními k oligonukleotidovým primerům. Primer poskytuje volnou 3 -OH skupinu potřebnou pro kovalentní navázání dalšího nukleotidu a následné prodlužování řetězce. K polymeraci obvykle dochází při teplotě 65 72 ºC. V následujícím cyklu se produkty prvního cyklu replikace denaturují a po připojení primerů replikují DNA polymerázou. Proces se mnohokrát opakuje, dokud není dosaženo požadovaného stupně amplifikace. Po 30 amplifikačních cyklech vznikne více než miliarda kopií sekvence DNA (Snustad et Simmons, 2009). Výsledným produktem PCR jsou amplikony úseky DNA definované délky o velikosti obvykle desítky až tisíce bp, analogické restrikčním fragmentům, jejichž přítomnost se v reakční směsi prokazuje stanovením jejich velikosti elektroforézou v agarózovém nebo polyakrylamidovém gelu nebo kvantitativním měřením množství produktu v reálném čase (Šmarda et al., 2008). 29

Obr.8: Jeden cyklus polymerázové řetězové reakce (Knoll et Vykoukalová, 2002) Účinnost amplifikace Účinnost PCR se odhaduje na 60 až 85 %, ale může být snížena přítomností většího množství templátu. Ta totiž zvyšuje pravděpodobnost hybridizace templátu s komplementárním řetězcem DNA, namísto primeru. Na účinnost amplifikace má vliv také nespecifická hybridizace primerů s jinými sekvencemi na cílové DNA. Při optimálních podmínkách mohou být detekovány PCR amplifikacemi i genomové sekvence o jedné kopii nebo viry (Knoll et Vykoukalová, 2002). Složení reakční směsi Kromě DNA, která bude amplifikována, obsahuje reakční směs pufr pro DNA polymerázu, směs nukleotidů (dntp), dvojice primerů specifických pro cílovou sekvenci, termostabilní DNA polymerázu a různá aditiva zvyšující účinnost či specifitu reakce (Knoll et Vykoukalová, 2002). 30

Optimalizace PCR Jako optimalizace je označován proces výběru a testování nejvhodnějších parametrů, které reakci ovlivňují, tzn. složení reakční směsi a teplotní a časový průběh reakce. Optimalizaci je třeba provádět nejen při zavádění metodiky převzaté z literatury, neboť konkrétní podmínky laboratoří se mohou lišit (Knoll et Vykoukalová, 2002). Taq polymeráza K syntéze DNA se používají termostabilní polymerázy izolované z termofilních mikroorganismů, např. Taq DNA polymeráza z bakterie Thermus Aquaticus odolávající teplotám, při nichž se DNA denaturuje. To umožňuje, aby syntéza DNA probíhala opakovaně formou cyklů (Šmarda et al., 2008). Vedle Taq se používají další teplotně rezistentní polymerázy a jiné komerčně modifikované enzymy a jejich směsi, které vykazují nižší procento tvorby chyb (Knoll et Vykoukalová, 2002). 3.8.3 Polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP) Rozdíly v restrikčních mapách u jedinců téhož druhu podmíněné různou délkou a počtem restrikčních fragmentů, které jsou tvořené štěpením genomové DNA nebo její části určitou restrikční endonukleázou, se označují jako polymorfismuz délky restrikčních fragmentů. Jejich podstatou jsou buď mutace, vedoucí k vytvoření nebo ztrátě rozpoznávacích míst pro restrikční endonukleázy, nebo vznikají jako důsledek přítomnosti různého počtu repetitivních sekvencí, delecí, inzercí nebo přestaveb ve specifických oblastech chromozomů. Rozdíly ve velikosti restrikčních fragmentů u různých jedinců lze snadno detekovat gelovou elektroforézou, která může být doplněna Southernovou hybridizací se sondami specifickými pro polymorfní oblasti genomu (Šmarda et al., 2008). Polymorfizmus délky restrikčních fragmentů se ukázal jako neocenitelný nástroj při konstrukci podrobných genetických map pro účely pozičního klonování. RFLP-markery se mapují stejně jako jiné genetické markery při křížení se segregují jako kodominantní alely (Snustad et Simmons, 2009). 31

Restrikční endonukleázy Jejich název pochází z řeckého endón znamenajícího uvnitř ; endonukleázy štěpí uvnitř molekul DNA (Snustad et Simmons, 2009). Restrikční endonukleázy jsou sekvenčně specifické endonukleázy, produkované kmeny většiny bakteriálních druhů. Jejich přirozenou funkcí je degradace cizorodé DNA, která se do bakteriálních buněk dostává např. při infekci bakteriofágem. V současné době je charakterizováno několik typů restrikčních enzymů, z nichž nejvýznamnější jsou restrikční endonukleázy II. typu (Šmarda et al., 2008). Restrikční endonukleázy II. typu štěpí molekuly DNA uvnitř cílové sekvence, takže jejich štěpící účinek je sekvenčně specifický. Pro restrikční endonukleázy I. a III. typu je charakteristické enzymatické štěpení DNA v jisté vzdálenosti od cílové sekvence, která je rozeznávána enzymem (Snustad et Simmons, 2009). Rozpoznávací místo restrikčních endonukleáz je tvořeno krátkou, obvykle 4 až 8 nukleotidovou sekvencí dvouřetězcových molekul DNA, která má velmi často charakter palindromů (sled bází v jednom řetězci je stejný jako v řetězci komplementárním při čtení z opačného konce). K rozštěpení molekuly DNA dochází hydrolýzou fosfodiesterových vazeb obou řetězců v restrikčním místě neboli místě štěpení, které se nachází uvnitř rozpoznávacího místa nebo těsně vedle něho. Produktem štěpení jsou úseky DNA o definované délce označované jako restrikční fragmenty (Šmarda et al., 2008). Užitečnou vlastností mnoha restrikčních endonukleáz je navíc to, že tvoří posunuté zlomy, tj. štěpí dvojici řetězců dvoušroubovice v různých místech. Jiné restrikční endonukleázy pak štěpí oba řetězce ve stejném místě a vytvářejí fragmenty s tupými konci (Snustad et Simmons, 2009). 32

4 MATERIÁL A METODIKA 4.1 Testovaný soubor Zkoumaný soubor tvořily prasnice plemene české bílé ušlechtilé z chovu z východních Čech. Celkový počet prasnic v souboru byl 71, avšak dva ze vzorků ani při opětovně prováděné PCR nebyly úspěšně amplifikovány, zřejmě v důsledku jejich poškození dlouhodobým skladováním. Proto bylo do asociační studie zahrnuto pouze 69 vzorků. Výsledky testování parametrů masné užitkovosti jednotlivých zvířat jsem získala z databáze Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Agronomické fakulty Mendelovy Univerzity v Brně. Průměrné, maximální a minimální dosažené hodnoty sledovaných znaků uvádím v tabulce 1. Testování daného souboru probíhalo metodou polního testu. Byl sledován přírůstek od narození do hmotnosti 90 kg. Případné odchylky hmotnosti byly přepočítávány pomocí regresní křivky. Ve stejném čase byla také in vivo měřena výška hřbetního tuku a zjišťován obsah libové svaloviny pomocí ultrasondy Piglog 105 (SFK, Soborg, DK). Tab.1: Hodnoty sledovaných znaků souboru použitého pro asociační analýzu Proměnná n x s x minimum maximum PRIR (g) 71 596,97 40,78 484,00 667,00 HRTUK (cm) 71 1,00 0,13 0,71 1,33 LS (%) 71 59,25 1,58 54,20 63,00 Kde PRIR je průměrný denní přírůstek, HRTUK je výška hřbetního tuku, LS je podíl libové svaloviny, n je počet zvířat v souboru, x značí aritmetický průměr, s x směrodatnou odchylku a minimum a maximum značí nejnižší a nejvyšší pozorované hodnoty. 33

4.2 Izolace DNA Nebylo nutné provádět nejprve izolaci vzorků DNA jednotlivých zvířat. DNA zkoumaného souboru byla již dříve izolována z krve a byla k dispozici na Ústavu fyziologie, morfologie a genetiky zvířat Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. 4.3 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Metodika PCR i RFLP byla zpracována dle Svobodové et al. (dosud nepublikováno). Polymerázová řetězová reakce byla prováděna v celkovém objemu 25 µl. Složení reakční směsi pro PCR je uvedeno v tabulce 2. Byly použity primery: 11A: CTG AGG TGA AGT GGG TGG AGA TG přímý 11B: CGC TGC CTG GGA AGA CGG zpětný Tab.2: Složení reakční směsi pro PCR o objemu 25 µl Chemikálie Množství (µl) destilovaná H 2 O 9,5 DNA 2 primer A 0,5 primer B 0,5 HotStar mix (Qiagen) 12,5 34

Podmínky pro amplifikaci zkoumaného úseku DNA: Vlastní PCR probíhala v termálním cykleru PTC-200 TM, MJ Research, Inc. (obrázek 9). Teplotní profil PCR byl dodržen přesně dle původní metodiky autorů: počáteční denaturace 95 C / 15 min.; vlastní PCR: 30 cyklů denaturace 95 C / 20s, annealing 64 C / 20 s, elongace 72 C / 10s; závěrečná elongace 72 C / 10 min. Obr.9: Termální cykler PTC-200, MJ Research Po skončení PCR byla provedena kontrola kvality PCR produktu. Na 3% agarózový gel (Serva) s přídavkem ethidiumbromidu (0,1 µg na 1 ml gelu) bylo nanášeno 5 µl PCR produktu smíchaného s nanášecím pufrem (40% sacharóza a bromfenolová modř). PCR produkt byl následně vizualizován prostřednictvím transiluminátoru a fotografován. Byla hodnocena jeho kvalita, výskyt nespecifických fragmentů a množství amplifikované DNA. 4.4 Polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP) PCR produkt byl štěpen v restrikční směsi skládající se z destilované vody, pufru a restrikční endonukleázy. Složení reakční směsi uvádím v tabulce 3. Štěpení probíhalo v termostatu při 37 ºC po dobu 12 hodin. Tab.3: Složení reakční směsi pro RFLP Chemikálie Množství (µl) destilovaná H 2 O 3,3 pufr Y + / Tango TM (Fermentas) 1,5 restrikční endonukleáza Hin6I (Fermentas) 0,2 PCR produkt 10 35

Následně byla provedena elektroforéza na 4% agarózovém gelu obsahujícím barvivo GelStar Nucleic Acid Gel Stain (FMC Corporation, Philadelphia), které se ukázalo být pro vizualizaci vhodnější než ethidiumbromid. Výsledek štěpení byl vizualizován pod UV světlem a fotografován. Po vizualizaci pod UV světlem byly odečteny jednotlivé genotypy. Obr.10: Sekvence PCR produktu použitého pro testování polymorfizmu v genu EEF1A2 (FM992107:g.6609C>G) s vyznačeným restrikčním místem (Svobodová et al., dosud nepublikováno). Odečítání genotypů v polymorfním místě bylo prováděno dle následujícího klíče: 212 bp dlouhý PCR produkt je štěpen na fragmenty 173 bp a 39 bp (alela C) či zůstává neštěpen (alela G) Elektroforéza pro ověření výsledku PCR i RFLP probíhala v TBE pufru při napětí 100 V po dobu 30 až 40 minut. Pro ověření velikosti fragmentů byl použit marker M100 (GeneRuler TM 100 bp DNA Ladder). 36

4.5 Výpočty frekvencí genotypů a alel Vzorce pro výpočet frekvence genotypů a alel (vzorce zpracovány dle Bednář et al.,2006): Tab.4: Vzorce pro výpočet frekvencí genotypů Genotypy Frekvence absolutní Frekvence relativní AA D d=d/n Aa H h= H/N aa R r= R/N Σ D+H+R= N d + h + r = 1 Tab.5: Vzorce pro výpočet frekvencí alel Alely Frekvence absolutní Frekvence relativní A P= 2D+H p= (2D+H)/2N= d+ ½ h a Q= 2R+H q= (2R+H)/2N= r+ ½ h Σ P+Q= 2N p+ q = 1 Kde: D,H, R jsou absolutní frekvence genotypů d, h, r jsou frekvence genotypů relativní P a Q jsou absolutní frekvence alel p, q jsou relativní frekvence alel N je součet absolutních frekvencí všech jedinců Hodnocení genetické rovnováhy dle Hardy-Weinbergova zákona Určení, zda je populace v genetické rovnováze, bylo provedeno na základě porovnání pozorované a očekávané distribuce genotypů pomocí statistického testu χ 2, podle vzorce: χ 2 n-1= Σ (P-O) 2, kde P je pozorovaná a O očekávaná frekvence. O 37

4.6 Statistické vyhodnocení asociační analýzy Pro statistické vyhodnocení asociace mezi jednotlivými genotypy a masnou užitkovostí byl použit program SAS pro Windows 9.1.4. Byla hodnocena asociace mezi genotypy a jednotlivými ukazateli masné užitkovosti, mezi něž byl zahrnut přírůstek, výška hřbetního tuku a procento libové svaloviny. Pomocí programu SAS pro Windows 9.1.4. byl vypočítán průměr nejmenších čtverců (least squares means) a střední chyba odhadu (standard error) pro jednotlivé parametry masné užitkovosti a genotypy. Byla použita metoda odhadu REML (restringovaná metoda maximální věrohodnosti). Pro výpočet byla použitá smíšená rovnice: y ijkl = µ+ G i + O j + M k + e ijkl; Kde: y ijkl jsou pozorované úrovně znaků µ je průměrná hodnota u sledovaného znaku G i je pevný efekt, genotyp zvířete v genu EEF1A2 O j je náhodný efekt j-tého otce M k náhodný efekt k-té matky e ijkl jsou náhodné reziduální efekty 38

5 VÝSLEDKY 5.1 Frekvence alel a genotypů V souboru 69 prasnic byl genotyp GC zastoupen u 18 zvířat, genotyp CC u 51 zvířat, genotyp GG nebyl pozorován. Na základě těchto absolutních frekvencí genotypů byly vypočítány relativní frekvence genotypů a absolutní a relativní frekvence alel, které jsou uvedeny v tabulkách 6 a 7. Grafy 1 a 2 znázorňují absolutní frekvence genotypů a relativní frekvence alel. Tab.6: Frekvence genotypů Genotyp Frekvence absolutní Frekvence relativní GG 0 0 GC 18 0,2609 CC 51 0,7391 Σ 69 1 Tab.7: Četnosti alel Alela Frekvence absolutní Frekvence relativní G 18 0,1304 C 120 0,8696 Σ 138 1 60 50 40 30 20 10 0 GG GC CC 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 G C Graf 1: Absolutní frekvence genotypů Graf 2: Relativní frekvence alel 39

V tabulce 8 jsou uvedeny pozorované a očekávané distribuce genotypů a hodnota χ 2, vyjadřující rozdíl mezi skutečnými a očekávanými frekvencemi genotypů. Tabulková hodnota χ 2 pro 0,05 při jednom stupni volnosti je 3,84. Studovaná populace se nachází v Hardyho-Weinbergově rovnováze, neboť vypočítaná hodnota χ 2 je nižší než tabulková hodnota. Tab.8: Absolutní pozorované a očekávané frekvence genotypů Genotyp Frekvence pozorované Frekvence očekávané χ 2 GG 0 1,17 GC 18 15,65 1,55 CC 51 52,12 5.2 Nalezení polymorfizmu v genu EEF1A2 PCR fragmenty byly nejprve amplifikovány za uvedených reakčních podmínek. Vyhodnocení amplifikovaných produktů na agarózovém gelu je zachyceno na obrázku 11. Obr. 11: Amplifikované PCR produkty o velikosti 212 bp M100 (GeneRuler TM 100 bp DNA Ladder) 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 Po štěpení restrikční endonukleázou Hin6I byla detekována alela G, která se něštěpí (212 bp), a alela C obsahující štěpné místo (173 a 39 bp), viz. obrázek 12. 40

Obr.12: Genotypy genu EEF1A2 po štěpení 212 bp PCR produktu restrikční endonukleázou Hin6I M100(GeneRuler TM 100 bp DNA Ladder) 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, PCRp- neštěpený PCR produkt 5.3 Výsledky asociační studie V testu byly sledovány asociace genotypů v genu EEF1A2 s následujícími parametry masné užitkovosti prasat: výška hřbetního tuku, průměrný denní přírůstek a podíl libové svaloviny. K tomu byl využit software SAS, metoda odhadu REML. Výsledky asociační analýzy jsou shrnuty v tabulce 9. V asociační analýze mezi genotypy zjištěnými ve studovaném souboru (GC a CC) a parametry masné užitkovosti nebyla zjištěna statistická průkaznost (p 0,05) ani statistický rozdíl blížící se průkaznosti (p 0,1). Tab.9: Asociace genotypů genu EEF1A2 s parametry masné užitkovosti Znak Genotyp GC (n = 18) LMS±SE Genotyp CC (n = 51) LMS±SE Průkaznost GC-CC PRIR (g) 593,35±15,08 594,66±13,54 0,8863 HRTUK (cm) 0,99±0,04 1,01± 0,03 0,6714 LS (%) 59,37±0,48 59,01±0,37 0,4130 Kde PRIR je průměrný denní přírůstek, HRTUK je výška hřbetního tuku, LS je podíl libové svaloviny, n je počet zvířat, LMS±SE je průměr nejmenších čtverců (least squares means) ± střední chyba (standard error). 41