Jiří Schindler. Mikrobiologie. Pro studenty zdravotnických oborů. 2., doplněné a přepracované vydání

Jiří Schindler Mikrobiologie Pro studenty zdravotnických oborů 2., doplněné a přepracované vydání

Jiří Schindler Mikrobiologie Pro studenty zdravotnických oborů 2., doplněné a přepracované vydání GRADA Publishing

Upozornění pro čtenáře a uživatele této knihy Všechna práva vyhrazena. Žádná část této tištěné či elektronické knihy nesmí být reprodukována a šířena v papírové, elektronické či jiné podobě bez předchozího písemného souhlasu nakladatele. Neoprávněné užití této knihy bude trestně stíháno. Prof. MUDr. Jiří Schindler, DrSc. MIKROBIOLOGIE Pro studenty zdravotnických oborů 2., doplněné a přepracované vydání TIRÁŽ TIŠTĚNÉ PUBLIKACE: Grada Publishing, a.s., 2014 Zdroje obrázků uvedeny v kapitole Poděkování Ostatní obrázky z archivu autora Technická kvalita některých obrázků je snížena vzhledem k množství a různé kvalitě zdrojů. Cover Photo fotobanka allphoto, 2014 Vydala Grada Publishing, a.s. U Průhonu 22, Praha 7 jako svou 5548. publikaci Odpovědná redaktorka Mgr. Ivana Podmolíková Sazba a zlom Karel Mikula Počet stran 224 + 24 stran barevné přílohy 2. vydání, Praha 2014 Vytiskly Tiskárny Havlíčkův Brod, a. s. Názvy produktů, firem apod. použité v knize mohou být ochrannými známkami nebo registrovanými ochrannými známkami příslušných vlastníků, což není zvláštním způsobem vyznačeno. Postupy a příklady v této knize, rovněž tak informace o lécích, jejich formách, dávkování a aplikaci jsou sestaveny s nejlepším vědomím autorů. Z jejich praktického uplatnění ale nevyplývají pro autory ani pro nakladatelství žádné právní důsledky. ISBN 978-80-247-4771-2 TIRÁŽ ELEKTRONICKÉ PUBLIKACE: ISBN 978-80-247-9275-0 ve formátu PDF ISBN 978-80-247-9276-7 ve formátu EPUB

Obsah Úvod..................................... 11 1 Lékařská mikrobiologie......................... 13 2 Bakteriální buňka............................ 15 2.1 Morfologie............................ 15 2.2 Cytologie............................. 17 2.3 Růst a množení bakterií.................... 23 2.3.1 Růst v tekuté půdě.................... 23 2.3.2 Růst na pevné půdě................... 25 2.4 Biofilm.............................. 27 2.4.1 Vznik a složení biofilmu................ 27 2.4.2 Biofilm a medicína................... 29 2.4.3 Rezistence buněk biofilmu k antibiotikům...... 31 2.5 Genetika bakterií........................ 31 2.6 Nástroje patogenity a patogeneze bakteriálních infekcí... 34 2.6.1 Adherence, kolonizace................. 35 2.6.2 Tvorba toxinů, toxiny.................. 37 2.6.3 Patogenní ostrovy v genomu.............. 39 2.6.4 Perzistoři......................... 41 2.7 Usmrcení bakterií........................ 42 2.7.1 Fyzikální vlivy...................... 44 2.7.2 Chemické vlivy..................... 44 2.8 Klasifikace bakterií....................... 45 3 Antibiotika................................ 47 3.1 Charakteristika antibiotik................... 47 3.2 Vyšetření citlivosti bakterií k antibiotikům......... 50 3.3 Mechanizmus účinku antibiotik................ 52 3.4 Rezistence bakterií k antibiotikům.............. 54 3.4.1 Přirozená rezistence bakterií.............. 54 3.4.2 Rozložení rezistence v populaci bakterií....... 54 3.4.3 Přenos rezistence.................... 55 3.4.4 Rezistence změnou cílové struktury mutací..... 56 3.4.5 Enzymatická inaktivace antibiotik.......... 57 3.5 Multirezistence.......................... 58 5

3.6 Problémové druhy bakterií z hlediska rezistence...... 59 3.6.1 Dynamika rezistence.................. 59 3.6.2 Surveillance a monitorování rezistence........ 61 3.7 Budoucnost antimikrobní terapie............... 62 3.7.1 Nové látky........................ 63 3.7.2 Nové cílové struktury.................. 63 3.8 Omezování rezistence, racionální antibiotická politika... 63 4 Speciální bakteriologie.......................... 65 4.1 Pyogenní koky.......................... 66 4.1.1 Staphylococcus aureus.................. 66 4.1.2 Staphylococcus epidermidis............... 69 4.1.3 Streptokoky........................ 69 4.1.4 Streptococcus pyogenes................. 70 4.1.5 Streptococcus agalactiae................ 71 4.1.6 Streptococcus pneumoniae............... 71 4.1.7 Ostatní streptokoky a viridující streptokoky... 73 4.1.8 Enterokoky........................ 74 4.1.9 Neisserie......................... 74 4.2 Enterobacteriaceae........................ 75 4.2.1 Escherichia coli...................... 77 4.2.2 Klebsiella pneumoniae................. 78 4.2.3 Enterobacter cloacae.................. 79 4.2.4 Serratia marcescens................... 79 4.2.5 Proteus.......................... 79 4.2.6 Yersinia enterocolitica.................. 80 4.2.7 Salmonely........................ 80 4.2.8 Shigelly.......................... 81 4.2.9 Vibria........................... 82 4.3 Hemofily a bordetely...................... 83 4.3.1 Haemophilus influenzae................ 83 4.3.2 Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis.... 84 4.4 Legionella pneumophila..................... 84 4.5 Gramnegativní nefermentující aerobní tyčky........ 85 4.5.1 Pseudomonas aeruginosa................ 85 4.5.2 Burkholderia cepacia a Stenotrophomonas maltophilia........................ 86 4.6 Mikroaerofilní pohyblivé prohnuté tyčky.......... 86 4.6.1 Campylobacter jejuni.................. 86 6

4.6.2 Helicobacter pylori.................... 88 4.7 Spirochety............................ 89 4.7.1 Treponema pallidum.................. 89 4.7.2 Borrelia burgdorferi................... 90 4.7.3 Leptospira interrogans................. 91 4.8 Rickettsia prowazekii a Coxiella burneti........... 92 4.9 Chlamydie............................ 92 4.9.1 Chlamydia trachomatis................. 92 4.9.2 Chlamydia psittaci.................... 93 4.9.3 Chlamydia pneumoniae................. 93 4.10 Anaerobní bakterie....................... 94 4.10.1 Anaerobní koky..................... 95 4.10.2 Gramnegativní anaerobní tyčky............ 95 4.10.3 Grampozitivní anaerobní tyčky............ 96 4.10.4 Actinomyces israeli................... 96 4.10.5 Klostridia......................... 97 4.10.6 Clostridium tetani.................... 97 4.10.7 Clostridium botulinum................. 99 4.10.8 Clostridium perfringens................. 99 4.10.9 Clostridium difficile.................. 100 4.11 Grampozitivní tyčky...................... 100 4.11.1 Corynebacterium diphtheriae............. 101 4.11.2 Corynebacterium jeikeium.............. 102 4.11.3 Listeria monocytogenes................ 103 4.11.4 Nocardia asteroides.................. 104 4.11.5 Bacillus anthracis.................... 104 4.12 Mykobakterie.......................... 106 4.12.1 Mycobacterium tuberculosis............. 107 4.12.2 Mycobacterium avium complex............ 110 4.12.3 Mycobacterium kansasii................ 110 4.13 Bakterie bez buněčné stěny, mykoplazmata......... 110 4.13.1 Mycoplasma pneumoniae............... 112 5 Normální flóra.............................. 113 5.1 Význam mikrobní flóry.................... 113 5.2 Kolonizace povrchu těla a sliznic............... 114 6 Biologie virů............................... 116 6.1 Klasifikace virů......................... 117 6.2 Struktura virů......................... 118 7

6.2.1 Symetrie virionu.................... 118 6.3 Replikace virů......................... 120 6.3.1 Adsorpce viru..................... 121 6.3.2 Penetrace viru..................... 121 6.3.3 Odstranění obalu................... 122 6.3.4 Aktivace genomu.................... 122 6.3.5 Syntéza viru a uvolnění................ 124 6.3.6 Efektivita virové replikace.............. 124 6.3.7 Cytopatogenní efekt.................. 125 6.3.8 Výsledek infekce buňky................ 126 6.4 Patogeneze a rozvoj virové infekce.............. 127 6.4.1 Brána vstupu...................... 127 6.4.2 Primární pomnožení................. 127 6.4.3 Šíření k cílové tkáni či orgánu............ 128 6.4.4 Sekundární pomnožení................ 128 6.4.5 Vyloučení........................ 128 6.5 Pomnožování virů v laboratoři................ 128 7 Speciální virologie........................... 130 7.1 Adenoviry............................ 130 7.2 Herpesviry........................... 131 7.2.1 Herpesvirus hominis.................. 131 7.2.2 Varicella zoster virus.................. 132 7.2.3 Virus Epsteina-Barrové................ 133 7.2.4 Cytomegalovirus.................... 134 7.2.5 HHV 6 HHV 7 (Roseolovirus)........... 135 7.3 Poxviry............................. 135 7.3.1 Virus varioly...................... 135 7.3.2 Virus vakcinie..................... 136 7.3.3 Virus Molluscum contagiosum............ 137 7.4 Papovaviry........................... 137 7.4.1 Papilomaviry...................... 137 7.4.2 Polyomaviry...................... 138 7.5 Pikornaviry........................... 139 7.5.1 Enteroviry........................ 139 7.5.2 Poliovirus hominis................... 140 7.5.3 Coxsackie viry (C-viry)................ 141 7.5.4 Echoviry......................... 142 7.5.5 Rinoviry......................... 142 8

7.5.6 Virus hepatitidy A................... 143 7.6 Ortomyxoviry......................... 143 7.6.1 Myxovirus influenzae................. 143 7.7 Paramyxoviry.......................... 148 7.7.1 Viry parainfluenzy................... 149 7.7.2 Respirační syncytiální virus............. 149 7.7.3 Virus spalniček..................... 149 7.7.4 Virus příušnic..................... 149 7.8 Rubivirus............................ 150 7.9 Virus vztekliny......................... 150 7.10 Arboviry............................. 151 7.10.1 Virus klíšťové encefalitidy.............. 152 7.10.2 Virus žluté zimnice.................. 153 7.10.3 Virus západodonilské encefalitidy.......... 153 7.11 Arena viry............................ 153 7.12 Viroví původci zánětu jater.................. 154 7.12.1 Virus hepatitidy B................... 154 7.12.2 Virus hepatitidy C................... 155 7.12.3 Virus hepatitidy D................... 155 7.12.4 Virus hepatitidy E................... 155 7.13 Rotaviry............................. 156 7.14 Caliciviry, astroviry, koronaviry............... 157 7.15 HIV, lidský virus ztráty imunity............... 158 7.16 Infekční jednotky podobné virům.............. 160 7.17 Imunizace proti virovým onemocněním, virové vakcíny 161 7.17.1 Vlastnosti vakcíny................... 161 7.17.2 Inaktivované vakcíny................. 161 7.17.3 Živé vakcíny...................... 162 7.17.4 Rekombinantní vakcíny................ 162 7.17.5 Vakcíny v praxi..................... 163 7.18 Chemoterapie virových infekcí................ 163 8 Houby (Fungi).............................. 166 8.1 Rod Candida.......................... 166 8.2 Cryptococcus neoformans................... 168 8.3 Rod Aspergillus......................... 168 8.4 Pneumocystis jiroveci...................... 169 8.5 Původci systémových endemických mykóz......... 169 8.6 Původci dermatomykóz.................... 170 9

9 Prvoci (Protozoa)............................ 171 9.1 Trichomonas vaginalis..................... 171 9.2 Cryptosporidium parvum................... 172 9.3 Entamoeba histolytica..................... 173 9.4 Giardia lamblia......................... 174 9.5 Jiná parazitická protozoa menšího významu........ 175 10 Klinická mikrobiologie......................... 176 10.1 Infekce horních cest dýchacích................ 177 10.1.1 Pneumonie v komunitě................ 177 10.1.2 Nozokomiální pneumonie.............. 178 10.1.3 Bronchitida....................... 178 10.2 Sepse............................... 179 10.2.1 Zdroj nozokomiální sepse.............. 180 10.2.2 Mikrobiologické vyšetření.............. 181 10.3 Endokarditida......................... 182 10.4 Močové infekce......................... 183 10.4.1 Uretritida........................ 184 10.4.2 Cystitida......................... 184 10.4.3 Pyelonefritida...................... 185 10.4.4 Prostatitida....................... 185 10.4.5 Mikrobiologické vyšetření moči........... 185 10.5 Sexuálně přenosné infekce.................. 186 10.6 Průjmová onemocnění..................... 188 10.7 Infekce ran........................... 190 10.8 Nemocniční infekce...................... 191 11 Principy diagnostiky infekčních chorob................ 193 11.1 Odběr materiálu........................ 196 11.2 Mikroskopické vyšetření vzorku............... 196 11.3 Kultivace............................ 196 11.4 Identifikace bakterií...................... 198 11.5 Testování citlivosti k antimikrobním látkám........ 202 11.6 Sdělení výsledku........................ 202 11.7 Virologické vyšetření..................... 203 12 Nové a obnovené infekční nemoci................... 205 Poděkování................................. 207 Doporučená literatura........................... 208 Rejstřík................................... 209 10

Úvod Úvod Lékařská mikrobiologie je mikrobiologie člověka pojednávající o původcích onemocnění i o nepatogenních mikrobech v těle a v jeho bezprostředním okolí. Tato stručná učebnice lékařské mikrobiologie je zaměřena na studenty zdravotnických oborů, především na studentky a studenty bakalářského oboru všeobecná sestra. Výběr, rozsah a hloubka látky vycházely ze zkušenosti s výukou na tomto stupni a z realisticky pochopených potřeb v praxi. Hlavní snahou je, aby studenti poznali obecné souvislosti existence mikrobů a jejich vztahu k člověku. Cílem není memorování látky, ale její pochopení. Znalosti lékařské mikrobiologie jsou pro zvolený obor studia nástrojem a prostředkem orientace, jejich samostatné používání je však určeno lékařům. Všichni studenti přicházející do prvního studijního kontaktu s lékařskou mikrobiologií si stěžují na obtížnost systematiky a množství jmen mikrobů, jež mají znát. Jejich stesky lze samozřejmě chápat. Z množství mikrobů byly proto v kapitolách speciální mikrobiologie, virologie, mykologie a parazitologie vybrány druhy, s nimiž se v povolání častěji setkají, nebo které znamenají ohrožení života pacienta. To je však vše, čím lze studium lékařské mikrobiologie ulehčit. Některé druhy mikrobů jsou probírány kvůli hrozbě bioterorizmu, jiné pro možnost epidemického šíření. Jména některých druhů mikrobů jsou uváděna pro seznámení a jako připomínka při případném výskytu v praxi. Kaž dopádně je hlavním cílem studia vědět Jak? a Proč?. Problém výuky virologie u studentů zdravotnických oborů spočívá kromě jiného v tom, že viry pouhým okem nebo jednoduchým mikroskopem nejsou vidět. Druhy probíraných virů jsou vybrány podle závažnosti onemocnění, podle praktické potřeby studentů, zejména všeobecných sester, a podle epidemiologické naléhavosti. Objem informací o virech může pro studenty zdravotnických oborů působit někde nepřiměřeně, je však potřebné poukázat na rozmanitost a komplikovanost ustrojení virů, a zdůraznit tak biomedicínský význam virových infekcí. Je na učiteli, aby své požadavky přizpůsobil svému pedagogickému záměru. Vydavatelé se snažili umožnit prezentaci co nejvíce obrazového materiálu z archivu autora, případně elektronoptických snímků autorů 11

Mikrobiologie z významných světových pracovišť. Z technických a ekonomických důvodů však všechny kapitoly nemohly být názorně doplněny dostatečným počtem obrázků, a proto i počet barevných verzí obrázků byl omezen. Je opět na pedagogovi, který je hlavním mediátorem výuky, aby v přednáškách a praktických cvičeních potřebné doplnil. 12

Lékařská mikrobiologie 1 1 Lékařská mikrobiologie Mikroorganizmy, které žijí v lidském těle, nejsou výhradně škodlivé. Člověk je s některými (převážně bakteriemi) ve vzájemném pozitivním vztahu. Člověk hostitel zajišťuje prostředí, z něhož bakterie těží živiny, a jejich metabolity jsou mu prospěšné. Příkladem je Escherichia coli v tlustém střevě, která obstarává menachinon vitamin K, jenž je zpracováván v játrech při syntéze protrombinu, který má význam pro srážlivost krve. Určité druhy bakterií, virů, hub i prvoků jsou přítomny na sliznicích a na kůži, aniž by vyvolávaly onemocnění. Jsou to organizmy nepatogenní. Vztah člověka jako hostitele a mikrobů je vztahem dynamickým, při němž se mění kvalita i kvantita mikrobů a současně s nimi i reakce organizmu hostitele. Lékařská mikrobiologie se zabývá jak mikroby, které jsou vysloveně patogenní, tak i takovými, které vyvolávají onemocnění jen za určitých podmínek, nejčastěji při snížení imunity hostitele. Zabývá se i mikroby v bezprostředním okolí člověka, které se na člověka přenášejí, a mikroby, které se na člověka přenášejí ze zvířat. Prvotními a nejdůležitějšími objekty jsou však mikroby patogenní. Čtyři skupiny mikrobů se vztahem k člověku jsou od sebe více či méně biologicky vzdáleny. Jejich spektrum jde od nebuněčných virů, přes jednobuněčné bakterie schopné již samostatné existence, houby složitější organizmy s bohatou morfologií s organelami až po parazitické jednobuněčné prvoky již podobné buňkám vyšších živočichů. Kromě popisu vlastností těchto mikroorganizmů se lékařská mikrobiologie zabývá způsobem zneškodňování původců onemocnění fyzikálními i chemickými vlivy, zejména antimikrobními látkami antibiotiky a antivirovými látkami. Lékařská mikrobiologie se také zabývá teorií očkovacích látek a jejich přípravy. Klinická mikrobiologie se zabývá infekčními onemocněními a podmínkami výskytu nemocničních infekcí u pacientů oslabených základním onemocněním a zároveň vystavených infekci z prostředí. Do tohoto oboru patří i epidemiologie používaná jako nástroj zkoumání šíření infekčních onemocnění v nemocnicích i v komunitě mimo ně. V neposlední řadě k lékařské mikrobiologii patří i zájem o nová a znovu se vyskytující infekční onemocnění. Nejjednodušší organizmy schopné reprodukce jsou viry. Jsou živé v tom smyslu, že se replikují, nejsou však schopny samostatné existence 13

1 Mikrobiologie (života), protože jsou závislé na hostitelské buňce. Jsou nejmenšími infekčními agens s jedním druhem nukleové kyseliny. K replikaci používají v různé míře aparát hostitelské buňky, kterou pak většinou ničí. Jsou tedy parazity na molekulární úrovni, protože využívají makromolekuly, zejména enzymy, pro svou reprodukci. Míra tohoto využívání, tedy míra relativní autonomie, je různá. Jejich původ je předmětem teorií. Podle regresivní teorie viry vznikly únikem z hostitelské buňky. Podle teorie progresivní je základem plazmid nebo transpozon, jehož DNA byla obalena bílkovinou a získala schopnost vniknutí do buňky. RNA viry mají původ v mrna buňky. Byly by tedy vývojově mladší než bakterie. Koevoluční teorie praví, že se viry jako biologické struktury vyvíjely nezávisle a jsou na počátku vývojové řady organizmů schopných množení. O žádné z těchto teorií nejsou důkazy a vývoj virů je zřejmě provždy tajemstvím. Bakterie jsou nejstarší organizmy na Zemi. Existuje jich něco mezi 300 000 a jedním milionem druhů, z nichž bylo nalezeno a popsáno na tři tisíce. Bakterie jsou jednobuněčné organizmy, které si mohou obstarat energii a výživu z anorganických zdrojů. Evolucí se však tato vysoká nezávislost na prostředí změnila, některé bakterie se přizpůsobovaly prostředí, ztrácely schopnost stavby těla z anorganických zdrojů, potřebovaly doplnit výživu aminokyselinami, cukry i bílkovinami, a adaptovaly se dokonce na určitého hostitele, ačkoliv mohou růst i na relativně bohaté umělé půdě. Například Streptococcus pyogenes se vyskytuje jen u člověka. Některé bakterie ztratily schopnost růstu mimo buňku a jsou obligatorními intracelulárními parazity. Jejich strategií je množit se s co nejmenším vynaložením energie, což je vedlo k parazitizmu. Paradoxně však působí skutečnost, že činnost patogenu vede k smrti hostitele, čímž však je ohrožen sám patogen, protože logicky ztrácí možnost další existence. Houby jsou mikroorganizmy s rozvětvenými vlákny myceliem, která mají průchodné přepážky, jsou mnohojaderná a cytoplazma či nukleové kyseliny jimi procházejí. Nepravé houby jsou kvasinkovité organizmy, buď jednobuněčné, nebo tvoří mnohobuněčná vláknitá pseudomycelia. Protozoa jsou jednobuněčné eukaryotické (mají jádro) organizmy s organelami. Některé mají bičíky, jiné se pohybují pomocí pseudopodií jako améby. 14

Bakteriální buňka 2 2 Bakteriální buňka V průběhu evoluce trvající miliony let se bakterie rozrůznily jak ve způsobu života, tak svým tvarem a velikostí. Jejich velikost je od 0,2 µ až po 0,75 mm, některé druhy rostou při 0 C a jiné při 113 C, při ph 0,06 a ph 12, při tlaku více než 1000 atm, nebo v 32% nasyceném roztoku NaCl. Vlastnosti bakterií v okolí člověka jsou dány charakterem jeho životního prostředí a vlastnostmi hostitele. 2.1 Morfologie Morfologie bakterií se studuje mikroskopickými metodami. V diagnostice se běžně používá pozorování obarvených usmrcených bakterií, v praxi kombinované Gramovo barvení. To kromě znázornění tvaru bakterií vypovídá o jejich charakteru bakterie grampozitivní se od bakterií gramnegativních liší strukturou a jinými vlastnostmi, včetně mechanizmu infekce. Velikost nejmenšího objektu, který lze spatřit (při dané vlnové délce světla) světelným mikroskopem, je dána jeho rozlišovací schopností. Je to nejmenší vzdálenost dvou bodů (objektů), které lze jako dva body rozlišit. Užitečné zvětšení mikroskopu je takové zvětšení, jež umožní pozorovat objekt nejmenší rozlišitelné velikosti. Celkové zvětšení mikroskopu je dáno součinem zvětšení objektivu (např. 100 ) a okuláru, kterým se zvětšený obraz pozoruje (např. 10 ) (obr. 2.1). Konfokální mikroskop umožňuje ostře pozorovat objekt v rovině zaostření a překrýt obraz v rovinách nad a pod rovinou zaostření. Procházením rovin lze získat trojrozměrný obraz objektu. Obraz se zpracovává elektronicky pomocí vestavěného počítače. Jako zdroj světla se používá laserový paprsek, rozlišovací schopnost tohoto typu mikroskopu je proto větší než obyčejného světelného mikroskopu. Elektronový mikroskop pracuje s elektrony, které mají menší vlnovou délku, má větší rozlišovací schopnost a umožňuje vyšší zvětšení. Paprsek elektronů buď objektem (např. ultratenkým řezem bakterie) prochází, nebo se od objektu (celé bakterie) odráží. Transmisivní elektronová mikroskopie pracuje s paprskem elektronů podobně jako světelný mikroskop se světelným paprskem. Procházející elektrony se zachycují, obraz se zvětší a fotografuje. Metoda umožňuje pozorovat 15

2 Mikrobiologie Obr. 2.1 Mikroskop starého typu dnes nepoužívaný (vlevo) a současný jednoduchý laboratorní mikroskop (vpravo). Hlavní části: A) objektiv (vpravo binokulární), B) sada objektivů na otočném měniči, C) kondenzor světla, D) zdroj světla (vlevo světlo z lampy odráží vzhůru zrcátko), E) zaostřovací šroub, F) stolek pro pozorovaný objekt detaily buňky a virových částic. Ke kontrastnímu znázornění zvýraznění struktur se používá negativní barvení solemi těžkých kovů, které nepropouštějí elektrony (jedná se např. o uranyl acetát nebo molybdenan amonný). Rastrovací elektronová mikroskopie znázorňuje povrch objektu (bakterie, viru, leukocytu) tence potažený paprskem iontů kovu, např. platiny. Protože se pokovuje pod ostrým úhlem v místech, kam se kovové ionty nedostanou, vznikají stíny. Výsledkem je plastický trojrozměrný obraz. Tvar a velikost bakterií Velikost bakterií významných pro medicínu se pohybuje v řádu tisícin milimetru (μ). Stafylokoky a streptokoky jsou kulovité bakterie o průměru přibližně 1 μ. Kulovité bakterie jsou koky, tyčky různé délky buď pravidelného, nebo nepravidelného tvaru. Tyčky mohou mít tvar kyjovitý s rozšířením na jednom pólu (korynebakteria), rohlíčkovitý (vibrio), obloučkovitě nebo esovitě zprohýbaný (kampylobakter), spirálový či spíše vývrtkový (treponema), některé s nepravidelným 16

Bakteriální buňka 2 Obr. 2.2 Základní morfologické tvary bakterií stoupáním závitu (borrelie) (obr. 2.2). Některé tyčky se za podmínek prostředí prodlužují do vláken (např. Escherichia coli v moči, legionely). Bakterie mohou být vyduté sporou uvnitř cytoplazmy, uprostřed (centrálně), nebo na konci těla (subterminálně, terminálně). Aerobní sporulující bakterie jsou bacily, anaerobní klostridia (vypadají jako vřeteno closter). 2.2 Cytologie Navenek je bakterie ohraničena cytoplazmatickou membránou, tuhou a pevnou buněčnou stěnou, u grampozitivních bakterií silnější, u gramnegativních tenčí, které ještě mají na sobě složitou vnější membránu. S okolním prostředím se bakterie stýkají strukturami důležitými pro přilnutí buňky hostitele, pro pohyb, pro přenos genetické informace na jiné bakterie i jako čidla stavu vnějšího prostředí. Bakteriální chromozom je tvořen jedinou molekulou dvouvláknové DNA, která je do sebe uzavřena. Vzhledem k délce buňky je velmi dlouhá, u E. coli měří 1 mm (obr. P1). Dvoušroubovice DNA 17

2 Mikrobiologie * je dalším stočením zavinuta do nepravidelné struktury a pak svinuta do klubka. Aby klubko drželo pohromadě, je zpevňováno třemi bílkovinami. (Tento útvar se nazývá nukleoid, protože neobsahuje jen DNA, ale v malém množství i RNA a podobně jako jádro eukaryot i bílkovinu [přípona -oid naznačuje, že jde o podobnost jádru]) Chromozom nese geny a jejich soubor se označuje jako genom. Nejmenší bakteriální chromozom se skládá z 600 kilobází (kb), největší má 10 000 kb. Chromozom E. coli má asi 4500 kb a obsahuje na 4405 genů. Chromozom E. coli je dlouhý asi 1400 µ a při šetrném lyzování buňky je dobře patrna rozvinutá struktura. DNA určuje přímo transkripci přepis či okopírování určitého úseku DNA na mrna. Na ribozomech probíhá podle kódu na mrna translace, což je řetězení aminokyselin do peptidového (bílkovinného) řetězce. Aminokyseliny přivádí na ribozom, kde je již navázána mrna, přenosová či transferová molekula ribonukleové kyseliny trna. Každá trna je pro danou aminokyselinu specifická a přináší jenom ji. Výběr se řídí podle kódu, který na aktuálním úseku mrna přečte. Tak geny řídí syntézu bílkoviny, kterou určují. Cytoplazma nemá endoplazmatické retikulum. Obsahuje ribozomy, jež jsou nástrojem proteosyntézy (obr. 2.3). Skládají se ze dvou podjednotek, jsou asi 10 20 nm velké, v buňce jich je několik tisíc. Při sestavování molekul bílkovin jsou jakoby navlečeny na mrna, jež obsahuje informaci, kterou aminokyselinu má právě trna napojit na polypeptidový řetěz. Některé druhy bakterií mají v cytoplazmě inkluze, z nichž jsou nejvýznamnější volutinová granula charakterizující Corynebacterium diphtheriae. Slouží jako zásoba energie. Obr. 2.3 Ribozom prokaryotických buněk složený ze dvou částí značených podle hmotnosti 50 S a 30 S (CDC ATB) 18

Bakteriální buňka 2 Obr. 2.4 Ohraničení bakteriální buňky proti prostředí (CDC ATB) Cytoplazmu ohraničuje dvouvrstvá fosfolipidová cytoplazmatická membrána. Má jemnou strukturu, její povrch se elekronopticky ozřejmí speciální technikou odlomení. Obsahuje enzymy permeázy, které selektivně transportují látky, tj. živiny dovnitř, katabolity ven z buňky. Jsou na ní též enzymy, které syntetizují buněčnou stěnu. Cytoplazmatická membrána naléhá na tuhou buněčnou stěnu, která určuje tvar bakteriální buňky a chrání ji mechanicky zvnějšku. Zevnitř odolává osmotickému tlaku (obr. 2.4). Když se buňka zbaví stěny, praskne. Pokud na buňku grampozitivní bakterie působí enzymem lysozymem, musí se vyrovnat vnější osmotický tlak sacharózou a z buňky se stane kulovitý protoplast. Buněčná stěna je pevná, silná kolem 20 nm, propouští molekuly menší než 1 nm. Je složena z řetězových makromolekul peptidoglykanu (murein nebo glykopeptid) síťovitě pospojovaných oligopeptidy. Tato struktura způsobuje její pevnost, tuhost a určitou omezenou elasticitu. Je silnější u grampozitivů, které obsahují ještě významnou kyselinu teichoovou. Buněčnou stěnu syntetizují enzymy transpeptidázy, které mohou také na sebe vázat penicilin (PBP penicillin binding proteins) a tím být inaktivovány. Gramnegativní buňky mají ještě vnější membránu. Je hlavní permeabilní bariérou. Její strukturu lze z náhledu vidět elektronovým mikroskopem. Propouští pasivně vodu a selektivně některé látky s malou molekulou. V membráně jsou bílkoviny poriny, jež propouštějí látky s malou molekulou. Dvě molekuly porinů k sobě přiléhají, mezi nimi 19

2 Mikrobiologie je pór, otvor, kterým molekuly procházejí do periplazmového prostoru a poté cytoplazmatickou membránou do nitra buňky (obr. 2.5). Vnější membrána chrání peptidoglykan před účinkem lysozymu a je na ní vázán lipopolysacharid s výrazným biologickým účinkem. Mezi ní a buněčnou stěnou je periplazmový prostor, v němž jsou enzymy, které mají rozličnou funkci: transport, štěpení a pohyb. Jsou tu i β-laktamázy, enzymy inaktivující penicilin a jemu příbuzné β-laktamy. Grampozitivní bakterie tento prostor nemají a enzymy vylučují do prostředí, kde štěpí makromolekulární látky, např. bílkoviny. Štěpy o menší molekule se pak snadněji dostanou do buňky. Na povrchu některých bakterií je dobře patrné pouzdro až 1 µ silné, které do určité míry chrání buňku před nepříznivými vlivy prostředí a zabraňuje fagocytóze pohlcení leukocyty. Je většinou polysacharidové povahy (Streptococcus pneumoniae), někdy polypeptidové (Bacillus anthracis) či velmi tenké z kyseliny hyaluronové (Streptococcus pyogenes). Pouzdro, např. u pneumokoků, má specifickou antigenicitu, takže protilátky proti pneumokoku jednoho antigenního typu nechrání před infekcí jinými typy. Očkovací látka proti pneumokokovým infekcím proto musí obsahovat směs antigenních typů nejčastěji vyvolávajících infekce. Pneumokokové kmeny se typizují pomocí antisér proti jednotlivým typům. Specifické antisérum způsobí zbobtnání pouzdra, jež se pozoruje v mikroskopu. Polymerní hmota na povrchu bakterie je glykokalyx, produkovaná za určitých podmínek. Může to být pouzdro nebo neorganizovaná hlenová vrstva. Je nástrojem tvorby biofilmu, protože zajišťuje přilnutí na pevný povrch na sliznici, Obr. 2.5 Stavební součásti buněčné stěny a vnější membrány (CDC ATB) 20

Bakteriální buňka 2 Obr. 2.6 Dlouhé bičíky E. coli neporušené preparací zubní sklovinu, implantát. Oba pojmy, pouzdro a glykokalyx, se proto významově oddělují. Bičíky jsou silné kolem 20 nm, tedy asi padesátkrát tenčí než šířka bakterie. Jsou křehké a snadno se odlamují (obr. 2.6). Běžným barvením nejsou vidět. V optickém mikroskopu je lze spatřit až po speciálním barvení, např. po impregnaci stříbrem. Bičík může být na pólu buňky jen jeden, nebo jich je více uspořádaných jako koňský ohon. Bičíky mohou pokrývat celé tělo bakterie (u salmonel, Escherichia coli nebo některých bacilů). Elektronová mikroskopie umožnila poznat strukturu bičíku a mechaniku pohonu buňky. Bičík je složen z bílkovinných stavebních jednotek šroubovitě na sebe naskládaných. Vlákno bičíku se nehýbe jako bič, ale pohybuje se šroubovitou rotací po celé délce, je poháněno složitou bílkovinnou turbínou, již do pohybu uvádí proud protonů. Vnější vláknitá část bičíku je vsazena do duté ohnuté spojky, která může převádět rotační pohyb ve své ose. Spojka sedí na vnější membráně buňky a spojuje vlákno bičíku s motorem, který bičíkem pohybuje (obr. P2). Motor je složen ze šesti částí. Je pevně usazen v periplazmovém prostoru. Funguje podobně jako elektromotor, ale rotor roztáčí proud protonů nebo iontů sodíku procházejících do buňky. Točivý moment se přenáší na hřídel a přes ohebnou spojku na vlastní bičík. 21

2 Mikrobiologie Obr. 2.7 Elektronoptický snímek E. coli s dlouhými bičíky a krátkými fimbriemi, získaný speciální řádkovací technikou Bičíky E. coli rotují ve svazku rychlostí asi 18 000 otáček za minutu a posunují bakterií o 30 µ za vteřinu. Urazí tak desetinásobek své délky stejně jako automobil jedoucí rychlostí 100 km/hod. Bičíky se točí doleva a chvílemi se směr rotace obrátí. Pohyb chemotaxí směřuje ke zdroji živin nebo od toxických látek. Bakterie, které nemají bičíky, se mohou pohybovat jinými způsoby, např. klouzáním a trhavými pohyby těla. Povrch buněk některých bakterií je pokryt kartáčkovitými výběžky fimbriemi, jež vypadají jako chloupky, a proto se označují termínem pili (obr. 2.7). Jsou také složeny z bílkovin ve šroubovicovém uspořádání. Mají několikerou funkci: adherují na povrch sliznice, zakládají biofilm i na pevné neživé podložce. Fimbrií je několik typů. Fimbrie typu 1 na povrchu enterobakterií se vážou na glykoproteinové receptory buněk sliznice. Fimbrie typu 4 adherují i na bakterie, jsou relativně dlouhé, mohou smrštit a přitáhnout si buňku, na kterou se navázaly. Jsou to fimbrie sex-specifické, přítomné jen na samčích buňkách enterobakterií, a jsou nástrojem konjugace a přenosu DNA na jinou buňku. Spory jsou klidové formy, které tvoří některé vegetativní bakterie při nepříznivých podmínkách, jako je vysušení, hladovění, vysoká teplota. Sporami si buňka zachovává život i při těchto podmínkách, ačkoliv má všechny životní funkce zastavené (obr. 2.8, 2.9). Spory jsou rezistentní k vysoké teplotě (100 C), organickým rozpouštědlům a dezinfekčním látkám, iradiaci, kyselinám. Ačkoliv mají zastavený metabolizmus, reagují na restituci podmínek, které umožňují život původní vegetativní buňce, a klíčí germinují. Mají složitou strukturu, uvnitř 22

Bakteriální buňka 2 Obr. 2.8 Umístění spor uvnitř tyčinkovitých buněk Bacillus cereus Obr. 2.9 Spory uvnitř buňky. Elektronoptický snímek řezu buňkami Bacillus anthracis je dřeň obklopená vnitřní membránou, kůrou, obalem a vnějším exosporiem. Spory tvoří aerobní grampozitivní bakterie rodu Bacillus (Bacillus anthracis) a anaerobní rodu Clostridium (Clostridium tetani). Tělo buňky se většinou sporami vydouvá. Ničí se autoklavací vystavení teplotě 120 C po dobu 20 minut. 2.3 Růst a množení bakterií Růst jedné individuální bakteriální buňky, to znamená zvětšování jejího objemu, syntézu makromolekul a vedlejších metabolitů až do momentu, kdy je růst dokončen, nelze sledovat (a pro praxi nemá velký význam). Před ukončením růstu se bakterie rozdělí, obě buňky, teoreticky rovnocenné, pokračují v růstu a cyklus se opakuje. 2.3.1 Růst v tekuté půdě Velikost populace bakterií živých i mrtvých lze sledovat: přímo počítáním buněk v určitém (malém) objemu mikroskopem, měřením zákalu, který např. v jednotkovém objemu kultivační půdy způsobí nejméně statisíce buněk, vážením sušiny buněk odebraných z kultivační půdy. 23

2 Mikrobiologie (U obou posledních metod je ovšem nutné zákal, respektive hmotnost bakterií kalibrovat na počet buněk.) Odběry a měření se mohou dít opakovaně ve zvolených časových intervalech a podle toho lze poznat průběh růstu populace bakterií, která se za laboratorních podmínek pěstování označuje jako kultura bakterií. Předpokládejme, že se jedna bakterie dostane do tekutého živného prostředí. To lze provést experimentálně v laboratoři za optimálních podmínek. Tato jedna bakterie se za určitý čas rozdělí na dvě. Ony dvě buňky se rozdělí a v médiu jsou již čtyři, ze čtyř je pak osm atd. Evidentně lze předvídat, kolik by na konec teoreticky mohlo být v dané půdě bakterií, neboť konečný počet buněk B by byl 1 2 n. Tedy: 24 B = B 0 2 n, kdy B 0 je počet bakterií na počátku a n počet generací. Generací se rozumí zdvojení počtu buněk. Buňky se rozdělují v určitém čase, což je tzv. generační doba. Čím je generační doba kratší, tím roste populace rychleji. Platí, že za optimálních podmínek je generační doba E. coli 20 minut, generační doba Mycobacterium tuberculosis je při kultivaci v laboratoři 36 hodin. Rychlost množení c je dána počtem generací za jednotku časovou t, např. za hodinu: c = n/t Zaznamenáváme-li počet buněk po naočkování do tekuté půdy v čase, získáme typickou růstovou křivku, z níž jsou zřejmé fáze množení. Po naočkování se buňky adaptují na nové podmínky a metabolizmus se z klidové fáze přepíná na aktivní. Tato fáze, kdy buněk nepřibývá, je lag fáze. Pomalu a nesynchronně se buňky začínají dělit, křivka se ohýbá a přechází do fáze vyrovnaného růstu s konstantní maximální rychlostí množení, kdy se všechny buňky dělí stejným tempem a bílkoviny i nukleové kyseliny se syntetizují stejnou rychlostí. Počet buněk roste exponenciálně, proto se tento interval označuje jako exponenciální fáze (obr. 2.10). Lineární průběh je zřejmý po vynesení logaritmu počtu buněk v čase (odtud někdy používané označení logaritmická fáze). Rychlost množení se pozvolna snižuje a po fázi zpomalení se populace dostává do stacionární fáze, kdy buněk nepřibývá, ani

Bakteriální buňka 2 Obr. 2.10 Základní fáze růstové křivky bakterií neubývá. Po další době začne živých buněk ubývat a populace je ve fázi hynutí. Proč kultura přechází do stacionární fáze, když prokazatelně nejsou vyčerpány živiny, není zcela vysvětleno (jistě mohou být vyčerpány limitní živiny a nahromaďují se toxické metabolity). V optimální tekuté půdě (živném bujonu) se za 18 hodin namnoží modelová bakterie E. coli při teplotě 35 C do koncentrace 10 9 buněk/ml. Při pohledu je původně čirá kultivační půda ve zkumavce mléčně zakalená, je slabě průsvitná a neprůhledná. Takto rostou nepříliš náročné střevní bakterie, pseudomonády, stafylokoky. 2.3.2 Růst na pevné půdě Bakterie se pěstují na živných půdách v kulatých skleněných nebo plastových miskách. Rostou v kupkách, kterým se výstižně říká kolonie, neboť osídlují určité území. Zpočátku se bakterie pěstovaly v přirozených tekutých půdách i v těch umělých, jako je masový bujon, ovšem nebylo možno od sebe oddělit bakterie různých druhů. To umožnily až agarové půdy. 25

2 Mikrobiologie Jednotlivé druhy bakterií rostou v oddělených koloniích, a lze je tak získat v čisté kultuře. Kolonie bakterií mají rozmanitou velikost, tvar, konzistenci, zbarvení, mají lesklý nebo hrubý povrch, různě se ohraničují od podložky, na níž rostou. Kolonie některých bakterií jsou typicky zbarveny pigmentem, u jiných barvivo difunduje také do půdy a zabarvuje ji, některé fluoreskují nebo svítí (obr. P3, P4). Bakterie z domény lékařské mikrobiologie vyrůstají převážnou většinou za 18 až 48 hodin v koloniích. Mladé kolonie jsou konvexní útvary, hladkého či drsného povrchu, většinou pravidelného tvaru. Kolonie aktinomycet, klostridií a bacilů tvoří bizarní rozvětvené útvary složené ze sektorů nepravidelné struktury s laločnatými okraji (obr. 2.11). Tak dorůstají i kolonie, které za 24 hodin byly zcela pravidelné. Kolonie modelové bakterie Escherichia coli jsou po 24 hodinách za optimálních laboratorních podmínek pravidelné, okraj je tvořen různě dlouhými buňkami, často v tenkých provazcích (obr. P5). Po několikadenní kultivaci, také vlivem lokálního vyčerpání živin, mají i kolonie Escherichia coli a ostatních gramnegativních tyček rozsochatou strukturu, jako je pravidlem u bacilů. Pravidelný okrouhlý tvar kolonie je více méně artefaktem krátké kultivace v nadbytku živin, který se bakteriím nabízí v laboratoři (obr. 2.12, P6). Obr. 2.11 Stromovitá struktura vyvinuté kolonie Bacillus pumilus po 7 dnech Obr. 2.12 Kolonie Streptococcus mitis, která má na okraji dceřiné kolonie, z nichž se pak šíří do okolí opět pomocí dceřiných kolonií. Tento způsob není běžný 26

Bakteriální buňka 2 Růst kolonie Množením buněk se populace prostorově zhušťuje a buňky na okraji se vytlačují do volné plochy. Pohyblivé bakterie putují po agarové půdě z periferie a plazivým růstem se šíří koncentricky ve vlnách. Například bakterie rodu Proteus přerůstají všechny bakterie izolované ze vzorku od pacienta, a proto je nutno jeho šíření po agaru zabránit. Dociluje se toho jednoduše použitím kultivační půdy s vyšším obsahem agaru. Taková půda je tužší a ostatní bakterie lze pak dobře izolovat. 2.4 Biofilm Biofilm je společenství mikrobiálních buněk nevratně přichycených k podložce nebo k okolním buňkám, usazeným v polymerní mimobuněčné hmotě, kterou samy produkují, jež mají změněný fenotyp (růstové vlastnosti). Biofilmem není povlak bakterií nebo plochá kolonie, pokud nemají tyto bakterie změněný fenotyp. 2.4.1 Vznik a složení biofilmu Volně plovoucí planktonické buňky se přichycují na pevný povrch pomocí adhezinů. Po přichycení změní své chování a fenotyp. Produkují velké množství lepivého polysacharidu podobného škrobu (obr. P7). Vytváří se z něj hlenová matrice, která drží buňky pohromadě a funguje jako voštinové lešení (obr. 2.13), v němž se buňky množí, tvoří se mikrokolonie a spleť kanálků (obr. 2.14, 2.15). Z biofilmu se ale na určitý impulz také buňky odlučují, přecházejí do planktonického stavu, odplouvají a kolonizují další části povrchu. Obr. 2.13 Systém kanálků v biofilmu 27

2 Mikrobiologie Obr. 2.14 Mikroskopický řez biofilmem. Kanálkem v hmotě biofilmu proudí tekutina s rozpuštěnými živinami Obr. 2.15 Voštinová struktura polymerní matrice bio filmu nesoucí uvnitř stafylokoky. Tenká vlákna polysacharidu glykokalyxu lepí buňky k sobě navzájem a ke stěnám voštinového lešení Biofilm lze zobrazovat konfokálním laserovým mikroskopem v optických řezech a z nich složit prostorovou strukturu. Lze pořídit i animovaný záznam dějů v biofilmu. Podle dostupnosti živin kolísá tloušťka biofilmu od několika µ do stovky µ. Biofilm není homogenní, skládá se ze shluků buněk a četných dutin propojených kanálky. Bakterie v něm rostou v mikrokoloniích. 28

Bakteriální buňka 2 Polymerní matrice vytváří voštinovou strukturu, v níž jsou buňky přichyceny. Zhruba šestistěnné komůrky voštiny mají stěnu tlustou 150 nm. 2.4.2 Biofilm a medicína Tvorba biofilmu a zejména změna vlastností buněk má pro patogenezi některých infekčních onemocnění rozhodující význam. Nejdéle známý biofilm v lidském těle je povlak na zubní sklovině zubní plak. Je fyziologický, vzniká přirozeně. Lze ho sice odstranit, ale vždy se tvoří znovu. Biofilmem kolonizují sliznice nepatogenní i patogenní bakterie. Biofilm hraje významnou roli v infekcích, kdy se patogenní bakterie usadí na sliznici nebo uvnitř tkáně. Typickým případem je bakteriální endokarditida, srdeční zánět. Na chlopních se vytváří biofilm a za účasti fibrinu vzniknou vegetace. Endokarditida je způsobena převážně koky streptokoky různého druhu, nebo stafylokoky. Toto onemocnění se velmi těžko léčí. Respirační choroba cystická fibróza je genetické onemocnění, při němž jsou pozměněny poměry v dolních cestách dýchacích. K primárním respiračním infekcím se přidávají chronické nebo opakující se infekce. Mají za následek ucpávání průdušek a trvalé poškození jejich epitelu. Na poškozeném terénu se později biofilmem usadí Pseudomonas aeruginosa a jemu podobné druhy. Biofilm se vyskytuje i při chronickém zánětu prostaty. Bakterie pronikají do prostaty proti proudu moči, z akutní prostatitidy se vyvine chronická, kterou biofilm zprvu jen komplikuje, později je i její příčinou. Častá jsou infekční onemocnění v dutině ústní. Při periodontitidě vzniká v kapsách pod dásní polymikrobní biofilm, do něhož neproniká kyslík. Nahromaděná bakteriální hmota, odumřelé buňky tkáně a hnisavé buňky situaci zhoršují, neboť redukující prostředí napomáhá pomnožení anaerobních bakterií. Biofilm se vytváří také na špatně vyživované kůži a podkoží při bércových vředech a účastní se tak bludného kruhu chabého krevního zásobení, nekrózy a působení bakterií. Biofilm se vytváří i na povrchu popálených ploch. Systematické chirurgické ošetřování eliminuje nebezpečí z tvorby biofilmu a ohrožení života jen kvůli infekci popálenin je minimalizováno. Cizí tělesa cévky, náhrady Bakterie mají tendenci vytvořit biofilm na pomůckách zavedených do tělních dutin a tkání (obr. 2.16, 2.17). Při asistovaném dýchání se 29

2 Mikrobiologie Obr. 2.16 Adherující stafylokoky vytvářejí na povrchu katétru bohatou slizovou hmotu Obr. 2.17 Stafylokoky adherují navzájem na povrch katétru biofilm tvoří na stěně trubic. Při nedostatečném dohledu a ošetřování mohou bakterie proniknout i do průdušek a do plic. Na kontaktních čočkách se při nesprávném používání usazuje většinou Pseudomonas aeruginosa. V močových katétrech se rychle usazují bakterie z dolní části močové trubice. Usazují se také v delší dobu zavedených žilních a arteriálních katétrech. Mají endogenní i exogenní původ a závisí také na kvalitě katétru. Koky se mohou usadit také na protézách srdeční chlopně a mohou poškodit stehy, kterými je přichycena. Je-li biofilm objemný, mohou se jeho části utrhnout. Biofilm bakterií i kvasinkovitých mikrobů na nekontrolovaném nitroděložním tělísku byl příčinou 30

Bakteriální buňka 2 mnoha zánětů v dutině pánve a sepsí. Bakterie tvoří biofilm i v místech, kde je cizí těleso od zevního prostředí zcela izolováno, třeba na kovových náhradách kloubů. Biofilm tvoří nejčastěji stafylokoky, pseudomonády, Escherichia coli, někdy streptokoky a aktinomycety. Dosud není známa metoda, kterou by se tvořený nebo vytvořený biofilm odstranil. 2.4.3 Rezistence buněk biofilmu k antibiotikům Buňky v biofilmu jsou vysoce rezistentní k antimikrobním látkám a dezinficienciím. Jsou až tisíckrát více rezistentní než buňky planktonické. V lékařské praxi to znamená, že k léčbě nestačí ani vysoké dávky antibiotik. Odolnost je vyjádřena fenotypově, nejde o rezistenci podmíněnou geneticky. Laboratorní vyšetření citlivosti k antibiotikům, prováděné v kultivační půdě, poskytuje nesprávné výsledky. Bakterie v biofilmu jsou totiž rezistentní, avšak na rozdíl od planktonických bakterií vyšetřovaných v optimálních podmínkách se v laboratoři jeví jako citlivé. Odolné buňky, které antibiotikum tolerují a zůstávají v těle, se označují obecným termínem varianty nebo perzistoři. V biofilmu se mezi buňkami přenášejí geny až tisíckrát úspěšněji než mezi buňkami žijícími planktonicky. To podporuje přenos genů rezistence v populaci. Hlenovou hmotou jsou buňky v biofilmu také fyzicky chráněny před protilátkami. 2.5 Genetika bakterií Takzvaná genetická informace je uložena v bakteriálním chromozomu. Dělení buňky je vázáno na replikaci DNA, jež zajišťuje předání veškeré informace do potomstva. Replikace je semikonzervativní, neboť každý z obou provazců se kopíruje do svého protějšku a vzniknou dvě stejné nové molekuly, z nichž každá obsahuje polovinu té původní. Soubor genů uložených na chromozomu bakterie se označuje jako genom. Gen si lze představit jako lineární soubor nukleotidů určitým způsobem organizovaný, určuje, kóduje funkční bílkovinu nebo různé molekuly RNA. Geny se mohou koordinovaně exprimovat, tj. být aktivní ve skupině, jež se označuje jako operon, a tvořit tak jednu funkční jednotku. 31

2 Mikrobiologie Regulace aktivity genů je v mnohých případech velmi složitá umožňuje buňce přežívání za kritických podmínek. Soubor zděděných vlastností charakterizujících buňku je genotyp. Genotyp se může měnit mutací, která je buď spontánní, bez vnějšího zásahu, nebo indukovaná z vnějšku. Mutace lze indukovat chemicky nebo ultrafialovým či ionizačním zářením. Spontánně vznikají např. chybnou replikací DNA. V každé populaci bakterií jsou v určité (nízké) frekvenci přítomny mutanty každé vlastnosti bakterie, které lze z populace selektovat. Například v populaci bakterií citlivé ke streptomycinu se ve frekvenci 10 8 spontánně vyskytují mutanty rezistentní ke streptomycinu. Geny nejsou jen na bakteriálním chromozomu, ale i na tzv. plazmidech. Plazmid je genetický element, množící se nezávisle na chromozomu. Je to také kruhová molekula DNA menší než chromozom. Plazmidy se vyskytují v buňce v mnoha kopiích. Některé mají schopnost se přenášet z jedné buňky do druhé. Na plazmidech jsou umístěny geny rezistence k antibiotikům, geny určující produkci toxinů, geny určující syntézu adhezinů a takzvané kolonizační faktory, jež trvaleji umožňují osídlení sliznic hostitele a jiné různé geny. Celková dávka genů bakterie a jejich kvalita může být za určitých okolností nedostatečná. Aby se mikrob s novými podmínkami vypořádal, musí je změnit. Bakterie může přežít např. přítomnost antibiotika, jen pokud získá geny rezistence. Přenos genů Geny se přenášejí i za nevynucených podmínek, zdánlivě bez zřetelného účelu. Bakteriální virus bakteriofág si při množení v buňce do své DNA zabuduje část její DNA (s geny) a při infekci ji pak přenese na nového hostitele, na němž se pomnoží. Tento proces se nazývá transdukce. Cizí geny může buňka získat také transformací, přenosem holé DNA z jedné buňky na recipientní. Transformaci se staví překážky: recipientní buňka vždy nemusí DNA přijmout, tj. není kompetentní. V prostředí přenosu může být DNA štěpena všudypřítomnými nukleázami. Přesto ale k transformaci dochází nejen v laboratoři, ale i za přirozených podmínek. 32

Bakteriální buňka 2 Sexuální polarita Někdy před padesáti lety zjistil Joshua Lederberg, později odměněný Nobelovou cenou, že se geny bakterií mohou přenášet kontaktem a že tento přenos je jednosměrný. Buňky, které vlastnosti přenášejí (samčí F + ), nejsou schopny je přijímat, a buňky, které přijímají (samičí F ), je nejsou schopny předávat. Geny se přenášejí do recipientní buňky po fyzickém kontaktu konjugací. Dárcovské samčí buňky donoři mají plazmid F +, který je přítomný v cytoplazmě. Je nezávislý na chromozomu a je za konjugaci a přenos zodpovědný. Sám může nést rozličné geny určující syntézu enzymů, rezistenci k různým látkám, k antibiotikům, anebo geny s jinými funkcemi. Celý přenos probíhá v několika fázích řízených plazmidem (obr. 2.18). Kontakt mezi buňkami obstarávají fimbrie, které jsou jen u buněk samčích. Označují se jako sex-specifické fimbrie (fimbrie IV. typu). Geny pro jejich tvorbu jsou neseny F plazmidem. Svým koncem se dotkne Obr. 2.18 Přenos plazmidu konjugací. Menší kruh znázorňuje plazmidovou DNA dárcovské (samčí) buňky, jež se napojí pomocí sex-specifické fimbrie na recipientní buňku. Plazmidová DNA se přenese, s ní některé geny a původně recipientní buňka se stává dárcovskou 33

2 Mikrobiologie jednoho místa na povrchu recipientní buňky a pak se retrahuje, přitáhne si samičí buňku a obě buňky k sobě přilehnou. Fimbrie jako jehla proděraví všechny obaly recipienta, bílkoviny sekretorického systému aktivně napumpují DNA plazmidu, včetně genů, které případně nese. Je to jeden z hypotetických modelů. V recipientní buňce se dosyntetizuje chybějící řetězec DNA a totéž se stane v buňce donorové. Plazmid F také produkuje toxické bílkoviny zabíjející všechny samičí buňky v okolí. Ty by totiž rychlejším množením v dalších generacích exkonjuganty vytlačily. Plazmid může znamenat pro buňku metabolickou zátěž, a proto mohou být tyto buňky v určité nevýhodě. Někdy se plazmid integruje do chromozomu. Celý chromozom se prakticky nepřenáší, dlouhé vlákno DNA se při přechodu, který trvá několik minut, láme. Protože integrovaný F-faktor určující syntézu nezbytné F-fimbrie je na konci, jakoby postrkává DNA, už na něj nedojde. Recipientní buňka proto zůstává samičí, je F. U grampozitivních bakterií probíhá přenos přes hranice rodů, tedy na buňky málo příbuzné. Hraje tu opět roli plazmid, který determinuje syntézu peptidu, se sex-specifickou funkcí tzv. feromon, který působí na potenciálního donora, nesoucího plazmid. Ten determinuje tvorbu shlukovacích faktorů, které se navážou na povrch recipienta, zafixují ho a umožní fyzický kontakt nutný pro přenos. Enterokoky mají několik druhů specifických feromonů. U stafylokoků a streptokoků může konjugace probíhat bez jejich pomoci. Polarita bakterií je vzhledem k přenosu genů uskutečňovaným fyzickým kontaktem, konjugací, důležitý fenomén. Neslouží ovšem k rozmnožování, ale ke zlepšení genetické výbavy zejména v kritických situacích. 2.6 Nástroje patogenity a patogeneze bakteriálních infekcí Patogenita je obecná schopnost bakterie způsobit infekční onemocnění. Patogenitu určuje virulence, jež je mírou patogenity pro daný živočišný druh. Patogenní bakterie nemusí být aktuálně virulentní. Virulence či její míra se stanovuje obtížně, protože ji lze měřit jen in vivo na zvířatech nebo na buněčných kulturách. Virulence je komplexní vlastnost, spočívá v invazivitě, tedy ve schopnosti proniknout do tkáně a tam se pomnožit, ve schopnosti kolonizace, to znamená osídlit sliznice hostitele, a v adherenci na buňku. Toxigenní bakterie 34

Bakteriální buňka 2 produkují bílkovinné toxiny. Produkují také bílkoviny, jež samy toxicky nepůsobí, ale jejich kooperace hostitelskou buňku poškodí. Mezi klasickými toxiny a těmito toxiny není logický rozdíl. Toto všechno jsou složky determinující patogenitu a její míru virulenci. Všechny faktory, včetně adhezinů, toxinů, bílkovin zasahujících metabolizmus buňky či aktivujících různé geny, se souhrnně označují jako faktory virulence. Faktorů virulence je mnoho, např. schopnost mobilizovat a vázat železo z prostředí, využít je v metabolizmu tvorby toxinů aj. Vztah bakterií a člověka závisí na tom, zda mezi hostitelem a bakterií je vytvořena rovnováha, nebo zda jeden či druhý převáží. Primární patogeny způsobují infekční onemocnění, jakmile se dostanou do styku s osobou jinak zdravou. Podmíněné patogeny nebo oportunní patogeny vyvolávají infekční metabolizmus osob oslabených nějakou základní nemocí, dlouhým pobytem v nemocnici, podvýživou, vysokým věkem. Patogenní bakterie přicházejí z okolního prostředí, z půdy, z vody nebo od hmyzu, zvířat či lidí, přenášejí se vzduchem, kontaminovanými předměty nebo kontaktem. Do těla se dostávají dýchacím traktem, trávicím traktem, spojivkami, kůží bodnutím hmyzem, kousnutím zvířete, při porušení celistvosti kůže poraněními i zcela neviditelnými. 2.6.1 Adherence, kolonizace Patogenní mikrob se musí v organizmu hostitele uchytit. Bakterie přilnou k buňkám sliznice. Adheziny (tab. 2.1) na povrchu bakterie reagují s receptory na povrchu buněk sliznice a bakterie se na ně navážou. Na sliznici soupeří patogenní bakterie s přítomnou kolonizující normální flórou o receptory. Jako adheziny fungují různé fimbrie, zejména fimbrie typu I a typu IV. Lze zmínit také p-fimbrie, jež se vážou na buňky močového epitelu a jsou specifické pro kmeny gramnegativních bakterií, zejména E. coli, vyvolávající močové infekce, zvláště pyelonefritidu. Jsou 1 µ dlouhé a 6,5 nm tlusté, mají závitnicovou strukturu z bílkoviny. Po adhezi fungují jako spirálová pružina a rozvinou se do sedminásobné délky (obr. 2.19). Podle specificity fimbriového adhezinu vyvolávají určité kmeny E. coli buď střevní, nebo močovou infekci. Bílkovina schopná vazby na receptor eukaryotické buňky je lokalizována na špičce fimbrie. U streptokoků funguje jako adhezin kyselina teichoová a lipoteichoová ve stěně grampozitivních bakterií. Nespecificky adheruje také pouzdro nebo glykokalyx. 35

2 Mikrobiologie Obr. 2.19 Adhezivní p-pilus působící jako spirálová pružina, která se rozvine do sedminásobné délky Adheziny se však nevážou na jakoukoliv buňku, jsou specifické pro určitou tkáň a/nebo živočišný druh. Specificita pro tkáň je patrná u kmenů Escherichia coli; některé adherují jen k prasečím buňkám, jiné k buňkám telecím a nikoliv lidským, jiné výhradně k buňkám lidským. Určitý typ Salmonella enterica adheruje k buňkám hovězím, nikoliv k lidským, a proto infikuje jen hovězí dobytek. Streptococcus pyogenes skupiny A, původce angíny, adheruje pouze k buňkám lidským. Lze to považovat za relativní výhodu, protože člověk se pyogenním streptokokem nemůže nakazit od zvířat. Ani Neisseria gonorrhoeae neinfikuje jiný živočišný druh kromě člověka. Jako adhezin zde funguje fimbrie typu IV. U escherichií je např. schopna poznat jednoduchou cukrovou Tab. 2.1 Nejvýznamnější adheziny Mikrob Adhezin Epitel Streptococcus pyogenes teichoová kyselina buňky faryngu Streptococcus salivarius teichoová kyselina buňky ústní sliznice Escherichia coli fimbrie typu I, typu IV, p-fimbrie 36 buňky střevního, močového epitelu Neisseria gonorrhoeae fimbrie typu IV buňky močového epitelu, čípku Bordetella pertussis fimbrie buňky respiračního epitelu Mycoplasma sp. bílkovina buňky respiračního epitelu