IZOLACE BIOMAKROMOLEKUL Rozsah: 2/1 Zk/Z Vyučující: Ing. Petra Lipovová, PhD. Předmět navazuje na: Biochemie, Enzymologie Doporučená literatura: Dr. Ing. K. Bílková, Prof. Ing. B. Králová, CSc.: Izolace biomakromolekul, Vydavatelství VŠCHT, 1997 http://biomikro.vscht.cz/vyuka/?predmet=ib Obsah předmětu: Úvod - zdroje enzymů, dezintegrace, membránové procesy Srážení, extrakce a centrifugace Biosenzory (2 x přednáška doc. Bílka) Základní rozdělení a instrumentace Gelová permeační chromatografie, Ionexová chromatografie Hydrofobní chromatografie a chromatografie na reversní Afinitní chromatogrefie Tenkovrstvá chromatografie, sledování průběhu chromatografie a stanovení koncentrace bílkovin Úvod do elektroforetických metod Typy elektroforetických metod Cvičení navržení postupu přípravy rekombinantního proteinu, Cvičení práce s programem protnlab Imobilizace enzymu a buněk
Úvod zdroje enzymů, dezintegrace, membránové procesy
Základní izolační kroky 1. výběr vhodného producenta 2. homogenizace a separace buněk 3. dezintegrace buněk 4. odstranění buněčných zbytků + koncentrování 5. purifikace
Zdroje enzymů Mikroorganismy, živočišné tkáně, rostlinná pletiva, tělní tekutiny Selekce optimálních producentů maximální produkce enzymu optimální vlastnosti enzymu snadné získání producenta snadnost purifikačního postupu...
Výhody: Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy lze je snadno získat v dostatečném množství (kultivace ve fermentoru...) selekce mutantů s požadovanými vlastnostmi thermofilní organismy (produkce enzymů s vyšší teplotní stabilitou), psychrofilní organismy genetické inženýrství
Živočišné zdroje Laboratorní zvířata myši, krysy, králíci Jateční zvířata orgány, krev Člověk tělní tekutiny (krev plasmin, thrombin ; moč urokinasa...) Bezobratlí - hmyz, plži, mlži Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hrách, Arabidopsis thaliana, tabák Nevýhoda: problematický růst za definovaných podmínek
Kde získat informace o možných zdrojích? ATCC (American Type Culture Collection) http://www.lgcpromochem-atcc.com/ CCM (Czech Collection of Microorganisms) www.sci.muni.cz/ccm/ FDA (Food and Drug Administration) (2001), Partial list of microorganisms and microbial-derived ingredients that are used in foods. www.cfsan.fda.gov/~dms/opa-micr.html AMFEP (The Association of Manufacturers and Formulators of Enzyme Products) www.amfep.org
Vaším úkolem je isolovat ureasu z Helicobacter pylori Ureasa (EC 3.5.1.5) (NH 2 ) 2 CO + H 2 O CO 2 + 2NH 3 Helicobacter Pylori Urease drawn from PDB 1E9Z http://www.madrimasd.org/blogs/microbiologia/wpcontent/blogs.dir/110/files/1431/o_helicobacter.jpg
ATCC (American Type Culture Collection) http://www.lgcpromochem-atcc.com/
Semínka Arabidopsis thaliana Plant Seed ATCC Number: Organism: Designation s: Depositors: Biosafety Le vel: Permits/For ms: 75043 Price: 190.00; 285.00 Arabidopsis thaliana Heinhold S8-1-2A D Dennis, Y Poirier, CR Somerville 1 Shipp ed: dried, package of 25 seeds each order In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the specific requirements for shipment to your location
Lidská hexokinasa brain/cns neuroblastoma cell line lung, small cell carcinoma leukocyte
Optimalizace kultivace Teplota Složení media Aktivátor Aerace
Optimalizace kultivace
Homogenizace a solubilizace materiálu Mechanicky: mletí (kulový mlýnek, masový strojek), mixování (výkonný mixer), krájení, třecí miska s pískem Separace buněk odstřeďování (6000 g, 10 min, 4 C) filtrace
Distribuce enzymů Intracelulární V periplasmatickém prostoru Extracelulární extracelulární cytoplasma periplasma BUŇKA
Membránově vázané bílkoviny Membránové bílkoviny interagující integrální elektrostaticky hydrofobně zanořené transmembránové
Rostlinné buňky Rostlinné a živočišné buňky rostlinné buňky mohou být větší rostlinné buňky mají silnější a robusnější buněčnou stěnu tvořenou hlavně celulosou rostlinné buňky se obtížně rozbíjejí kultivované rostlinné buňky jsou méně robustní než buňky isolované z živých rostlin
Živočišné buňky nemají buněčnou stěnu jsou velmi křehké kultivované živočišné buňky jsou velké několik mikronů sférické nebo elipsoidní
Bakterie Mikroorganismy G - G +
Kvasinky
Dezintegrace buněk Způsoby fyzikální chemické enzymové
Fyzikální způsoby dezintegrace Třecí miska + balotina, křemenný písek... Střídavé zmrazování a rozmrazování X-press (protlačování zmražené suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) zarážky píst štěrbina X-press
Douncerův homogenizátor Mini-BeatBeater pomocí balotin různé rozměry
French press - protlačování tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem (136 MPa) Ultrazvuk - intezita - nad 50 W/cm 2 kavitace G - bakterie k3
Snímek 27 k3 UZ - působením uz vln na kapaliny vzniká jev KAVITACE. V kapalině se tvoří oblasti stlačení a zředění. V místech zředění vznikají dutiny určitých velikostí, které v oblasti stlačení opět zaniknou. Zánik dutin je pak doprovázen tlakovou vlno, která se považuje za destrukční prvek využívaný u této metody. Kavitace je množina jevů spojená se vznikem, výskytem a působením dutin ( bublin ) v kapalině. Jestliže má ultrazvukové vlnění dostetečnou intezitu - nad 50 W/cm2 dochází ke vzniku kavitace, to jest ke vzniku a zániku množství malých bublinek v kapalině s frekvencí ultrazvukového vlnění. Tvorba a zánik těchto bublinek, způsobené rázy ultrazvukových vln jsou vlastní příčinou dějů v mnohých známých procesech jako je např. čištění povchů, dispergace, eroze povrchů a pod. V nejbližším okolí těchto bublinek dochází k pozoruhodnému uvolnění energie, lokální růst teploty spojený s tímto dejem se odhaduje až na 3000 C a tlaky v oblastech stovek MPa v nanosekundových časových úsecích. Kavitace je vlastně studeným varem v kapalině. Průvodním dějem akustických kavitačních dějů je sonoluminiscence. V důsledku kavitace dochází také ke kavitačnímu narušení konců vlnovodů a tím k jejich opotřebení a k postupnému snižování přeneseného výkonu. Dále je pro srovnání uvedeno kavitační narušení konce sonifikátoru z duralu a titanu a snímek tohoto narušení z elektronového scanovacího mikroskopu karasovp; 19.7.2005
Chemické způsoby dezintegrace acetonová sušina -homogenizace buněk ve vychlazeném acetonu osmotická lyse (erythrocyty)-suspenze v hypotonickém prostředí změna tlaku plynu přídavek org. rozpouštědla - toluen, diethyleter, chloroform - (toluen extrahuje při 35 40 o C fosfolipidy buněčné stěny osmotický šok + enzymová autolýza způsobí uvolnění buněčného obsahu) Wikipedia
přídavek kyseliny či zásady přídavkem detergentů CMC kritická micelární koncentrace C koncentrace detergentu
detergenty neionogení ionogení aniogenní katiogenní These images show a Streptococcus pyogenes cell experiencing lysis after exposure to the enzyme PlyC. (Credit: Daniel Nelson/UMD) amfoterní Y-PER Reagent significantly disrupts yeast cell wall and plasma membrane. Cells of Saccharomyces cerevisiae stain DY150 after lysis with Y-PER Yeast Protein Extraction Reagent. Arrows indicate disruption of cell wall, resulting in cell lysis.
Detergent CMC MMW koncentrace Odstranění aplikace mm Da dialýzou ANIOGENNÍ SDS(dodecylsulfát sodný) 8,3 288,4 > 10 mg/mg prot. DOC(deoxycholát sodný) 1-4 416,6 0,1-10 mg membr. lipidů N-lauroylsarkosin 7 488 0,1-1,5 % KATIOGENNÍ denaturace proteinů, použití pro DNA, PAGE solubilizace membránových proteinů solubilizace membr. prot., příprava antigenů CTAB (hexadecyltrimethyl amonium bromide) 4-5 337 0,1 1 %??? rozpouští membrány, tvoří komplex s DNA, odstranění polysacharidů NEIONOGENNÍ Triton X-100 [octylphenolpoly(ethylenglycoleth er) n ] 0,2 647 n=10 1 5 mm solubilizace proteinů Tween 20 [poly(oxyethylene) n sorbitan-monolaurate] 0,06 > 10 mg/mg membr. lipid; imunobloty, ELISA AMFOTERNÍ CHAPS (3-[(3- cholamidopropyl)dimethylammon io]-1-propanesulfonate) 4 614,9 6,5-13 mm solubilizace membránových proteinů
Extrakce membránových proteinů sonikace chelátová činidla alkalické podmínky (ph 8 11) plus nízká iontová síla neionogenní detergenty (Triton X-114) částečně vodoumísitelná organická rozpouštědla (n-butanol) vysoká iontová síla (1M NaCl) fosfolipasy
Phase separation of chromaffin-granule membrane proteins Proteins from the Triton X-1 14 phase-separation procedure were analysed under reducing conditions on an 8-15% -polyacrylamide gel. Track 1, standard proteins. Track 2, complete chromaffin-granule membranes. Track 3, phospholipid-rich phase. Track 4, detergent-rich phase. Track 5, aqueous phase.
Odstranění detergentů vliv: fyzikální vlastnosti detergentu charakter proteinu (hydrofobní/hydrofilní) složení pufru ionogenní močovina, ionex gelová chromatografie Sephadex G-25 naředění vzorku dialýza neionogenní gelová chromatografie Sephadex G-200 afinitní chromatografie
Enzymové způsoby dezintegrace Bakterie Lysozym nejčastěji z vaječných bílků, T4 fága hydrolysa 1,4-β-glykosidické vazby mezi NAG a NAM u G - v kombinaci s chelatačním činidlem např. EDTA nebo polykationty, Tris ph 6,7-8,6 (4-10) Kvasinky zymolyasa, lytikasa β-1,3-glukanasová aktivita Rostlinné buňky cellulasa, pektinasa
Jak vybrat správný postup dezintegrace? typ organismu předpokládaná stabilita proteinu lokalizace proteinu dostupné vybavení cena čas objem vzorku sledování úspěšnosti dezintegrace
Inhibitory proteas
Inkluzní tělíska Kopito R.: Trends in Cell Biology (10), 524-530, 2000
Dva modely tvorby inkluzních tělísek Kopito R.: Trends in Cell Biology (10), 524-530, 2000
inkluzní tělíska (agregovaný protein) Solubilizace Solubilizované, ale špatně sbalené proteiny změna prostědí Misfolded Refolded & native Re-aggregated
Izolace inklusních tělísek resuspendace buněčné pelety v pufru s inhibitorem proteas, DTT (5mM) a lysozymem přidat detergent (Triton X-100, DOC) + sonikace přidat DNasu I centrifugace 30 000 x g 30 min 4 C opláchnout peletu pufrem s detergentem rozpustit peletu (inkluzní tělíska) v pufru s 6M guanidin-hcl a 25 mm DTT centrifugace 100 000 x g 10 min důležitý krok změřit koncentraci proteinů v supernatant
Stabilizace proteinů soli stabilizují proteiny v roztoku Hofmeisterova řada (CH 3 ) 4 N + > NH 4+ > K + > Na + > Mg 2+ > Ca 2+ > Ba 2+ SO 4 2- > Cl - > Br - > NO 3- > ClO 4- > SCN - proteiny např.bsa redukční činidla β-merkaptoethanol (5-20 mm), DTT (0,5-1 mm) osmolyty polyalkoholy, mono- a polysacharidy, neutrální polymery 10 40 % aminokyseliny nenabité (Gly, Ala) 20-500 mm polymery (PEG) 1-15 % zvyšuje viskozitu a tak zabraňuje agregaci
Membránové procesy - filtrace rozdělení molekul z roztoku na základě jejich velikosti, definovaná velikost pórů = cut off (µm, Da), gravitace, inertní plyn retentát permeát mikroporesní anizotropní
Produkt polyvinylidenfluorid PVDF polyethersulfon PES estery cellulosy MCE polykarbonáty nylon a síťovina skleněná a křemenná vlákna teflon použití nízká vazba proteinů rychlý průtok a nízká vazba proteinů filtrace pufrů a částic hladký povrch široká chemická kompatibilita, rozsahu 3-10 ph hrubá filtrace, roztoky s vysokým počtem částic hydrofobní,org.rozpouštědla, chemicky agresivní roztoky PVDF 0,1-5 µm estery cellulosy skleněná a křemenná vlákna 0,025-8 µm 0,7 3 µm nylon 0,22-180 µm
charakteristika membrán dělící rozsah NMWL, MWCO, NCO průtočnost membrány rozsah povolených pracovních teplot, tlaků a ph odolnost membrán životnost Membrane: Durapore Membrane Filters - PVDF (Polyvinylidene fluoride) Features: Low Protein Binding Specifications: Pore sizes: 0.1, 0.22, 0.45, 0.65, 5 µm Color: Surface: Wettability: White Plain Hydrophilic, hydrophobic Thickness: 125 µm Sterilization: Operating temperature: by autoclave (121 C at 1 bar), EO or gamma 85 C max. Gravimetric extractables: <0.5% Protein binding capacity: 4 µg/cm²
Mikrofiltrace separace koloidních a nerozpustných částic ( bakterie, barevné pigmenty, kvasinky) 0,05-10 µm hnací silou - rozdíl tlaku potřebný tlak - nízký
Ultrafiltrace separace např. bílkovin, virů frakcionace bílkovin velikost pórů přibližně 3 nm do 0,1 µm hnací sílou rozdíl tlaků tlak > 10 bar (145 psi, 1 MPa) N 2 pojistný ventil míchadlo membrána retentát permeát
Nanofiltrace separace nízkomolekulárních látek velikost pórů přibližně 1 nm do 10 nm 200 15000 g/mol hnací sílou rozdíl tlaků Použití odsolování potravin odsolování syrovátky zakoncentrovávání
Reverzní osmóza separace nízkomolekulárních látek menší než 200 g/mol hnací sílou rozdíl tlaků
Mikrofiltrace Ultrafiltrace Nanofiltrace Reverzní osmóza
zygota - Cryptosporidium
Jaký osmotický tlak vykazuje jednomolární roztok sacharosy při 25 C? (R=8,314 J K -1 mol -1 ) π = RT c i π = crt= 1. 8,314. 298,15 = 2478,8??? kpa J / dm 3 = N.m /dm 3 = 10 3 N/m 2 = Pa
* Roztok obsahující 0,5 g ribonukleasy v 0,1 dm 3 0,2 M NaCl má při 298 K osmotický tlak 0,0097 atmosfér. Membrána je propustná pro všechny částice kromě bílkoviny; osmoticky tlak byl měřen proti 0,2 M NaCI Určete molární hmotnost ribonukleasy (R = 0,082 dm 3. atm. mol -1. K -1 ). π = RT c i
Dialýza - difuze nízkomolekulárních látek polopropustnou membránou
dialysa 100 ml 5 M NaCl proti 1 litru
Princip hemodialysy http://www.inmed.cz/index.php?page=princip_dialyzy
Elektrodialysa vzorek anionaktivní iontově selektivní membrána kationaktivní iontově selektivní membrána
odsolování syrovátky odsolování mořské vody odstraňování nitrátů z pitné vody odstraňování kyselin z organických produktů odstranění kyselosti džusu
další způsoby odsolování a zahušťování: gelová chromatodrafie - Sephadex G-25, BioGel P-30 vakuové odpařování použití polyethylenglykolu lyofilizace precipitace chromatografie na reversní fázi (C4) ionexová chromatografie