IZOLACE BIOMAKROMOLEKUL

Transkript

1 IZOLACE BIOMAKROMOLEKUL Rozsah: 2/1 Zk/Z Vyučujíí: Ing. Petra Lipovová, PhD. Předmět navazuje na: Biohemie, Enzymologie Doporučená literatura: Dr. Ing. K. Bílková, Prof. Ing. B. Králová, CS.: Izolae biomakromolekul, Vydavatelství VŠCHT, Obsah předmětu: Úvod - zdroje enzymů, dezintegrae, membránové proesy (prednaska1.pdf 1.21MB) Srážení, extrake a entrifugae (prednaska2.pdf 742 KB) Základní rozdělení a instrumentae (prednaska3.pdf 793 KB) Gelová permeační hromatografie (prednaska4.pdf 978 KB) Ionexová hromatografie (prednaska5.pdf 1,51 MB) Hydrofobní hromatografie a hromatografie na reversní fázi (prednaska6.pdf 670 KB) Afinitní hromatogrefie (prednaska7.pdf 1,21MB) Tenkovrstvá hromatografie, sledování průběhu hromatografie a stanovení konentrae bílkovin (prednaska8.pdf 228 KB) Úvod do elektroforetikýh metod (prednaska9_10.pdf 3,07MB) Typy elektroforetikýh metod (prednaska9_10.pdf 3,07MB) Cvičení navržení postupu přípravy rekombinantního proteinu, Cvičení práe s programem protnlab Imobilizae enzymu a buněk (prednaska pdf)

2 Úvod zdroje enzymů, dezintegrae, membránové proesy

3 Základní izolační kroky 1. výběr vhodného produenta 2. homogenizae a separae buněk 3. dezintegrae buněk 4. odstranění buněčnýh zbytků + konentrování 5. purifikae

4 Zdroje enzymů Mikroorganismy, živočišné tkáně, rostlinná pletiva, tělní tekutiny Seleke optimálníh produentů maximální produke enzymu optimální vlastnosti enzymu snadné získání produenta snadnost purifikačního postupu...

5 Výhody: Mikroorganismy Bakterie, kvasinky, plísně, řasy lze je snadno získat v dostatečném množství (kultivae ve fermentoru...) seleke mutantů s požadovanými vlastnostmi genetiké inženýrství thermofilní organismy (produke enzymů s vyšší teplotní stabilitou) psyhrofilní organismy

6 Živočišné zdroje Laboratorní zvířata myši, krysy, králíi Jateční zvířata orgány, krev Člověk tělní tekutiny (krev plasmin, thrombin ; moč urokinasa...) Bezobratlí - hmyz, plži, mlži málo se využívají Rostlinné tkáně Špenát, řepa, hráh, Arabidopsis thaliana, tabák Nevýhoda: problematiký růst za definovanýh podmínek

7 Kde získat informae o možnýh zdrojíh? ATCC (Amerian Type Culture Colletion) CCM (Czeh Colletion of Miroorganisms) FDA (Food and Drug Administration) (2001), Partial list of miroorganisms and mirobial-derived ingredients that are used in foods. AMFEP (The Assoiation of Manufaturers and Formulators of Enzyme Produts)

8 Vaším úkolem je isolovat ureasu z Heliobater pylori Ureasa (EC ) (NH 2 ) 2 CO + H 2 O CO 2 + 2NH 3 Heliobater Pylori Urease drawn from PDB 1E9Z

9 ATCC (Amerian Type Culture Colletion)

10

11 Plant Seed ATCC Number: Prie: ; Organism: Designations: Depositors: Arabidopsis thaliana Heinhold S8-1-2A D Dennis, Y Poirier, CR Somerville Biosafety Level: 1 Shipped: dried, pakage of 25 seeds eah order Permits/Forms: In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purhasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits. Please lik here for information regarding the speifi requirements for shipment to your loation

12 Optimalizae kultivae Teplota Složení media Aktivátor Aerae

13 Optimalizae kultivae

14 Homogenizae a solubilizae materiálu Mehaniky: mletí (kulový mlýnek, masový strojek), mixování (výkonný mixer), krájení, třeí miska s pískem Separae buněk odstřeďování (6000 g, 10 min, 4 C) filtrae

15 Distribue enzymů Intraelulární V periplasmatikém prostoru Extraelulární extraelulární ytoplasma periplasma BUŇKA

16 Membránově vázané bílkoviny Membránové bílkoviny interagujíí integrální elektrostatiky hydrofobně zanořené transmembránové

17 Dezintegrae buněk Způsoby fyzikální hemiké enzymové

18 Živočišné buňky nemají buněčnou stěnu jsou velmi křehké kultivované živočišné buňky jsou velké několik mikronů sfériké nebo elipsoidní

19 Rostlinné buňky Rostlinné a živočišné buňky rostlinné buňky mohou být větší rostlinné buňky mají silnější a robusnější buněčnou stěnu tvořenou hlavně elulosou rostlinné buňky se obtížně rozbíjejí kultivované rostlinné buňky jsou méně robustní než buňky isolované z živýh rostlin

20 Bakterie Mikroorganismy G - G +

21 Kvasinky

22 Fyzikální způsoby dezintegrae Třeí miska + balotina, křemenný písek... Střídavé zmrazování a rozmrazování X-press (protlačování zmražené suspenze malým otvorem pod velkým tlakem) zarážky píst štěrbina X-press

23 Dounerův homogenizátor Mini-BeatBeater pomoí balotin různé rozměry

24 Frenh press - protlačování tekuté suspenze malým otvorem pod velkým tlakem (136 MPa) Ultrazvuk - intezita - nad 50 W/m 2 kavitae G - bakterie k3

25 Snímek 24 k3 UZ - působením uz vln na kapaliny vzniká jev KAVITACE. V kapalině se tvoří oblasti stlačení a zředění. V místeh zředění vznikají dutiny určitýh velikostí, které v oblasti stlačení opět zaniknou. Zánik dutin je pak doprovázen tlakovou vlno, která se považuje za destrukční prvek využívaný u této metody. Kavitae je množina jevů spojená se vznikem, výskytem a působením dutin ( bublin ) v kapalině. Jestliže má ultrazvukové vlnění dostetečnou intezitu - nad 50 W/m2 dohází ke vzniku kavitae, to jest ke vzniku a zániku množství malýh bublinek v kapalině s frekvení ultrazvukového vlnění. Tvorba a zánik těhto bublinek, způsobené rázy ultrazvukovýh vln jsou vlastní příčinou dějů v mnohýh známýh proeseh jako je např. čištění povhů, dispergae, eroze povrhů a pod. V nejbližším okolí těhto bublinek dohází k pozoruhodnému uvolnění energie, lokální růst teploty spojený s tímto dejem se odhaduje až na 3000 C a tlaky v oblasteh stovek MPa v nanosekundovýh časovýh úseíh. Kavitae je vlastně studeným varem v kapalině. Průvodním dějem akustikýh kavitačníh dějů je sonoluminisene. V důsledku kavitae dohází také ke kavitačnímu narušení konů vlnovodů a tím k jejih opotřebení a k postupnému snižování přeneseného výkonu. Dále je pro srovnání uvedeno kavitační narušení kone sonifikátoru z duralu a titanu a snímek tohoto narušení z elektronového sanovaího mikroskopu karasovp;

26 Chemiké způsoby dezintegrae aetonová sušina -homogenizae buněk ve vyhlazeném aetonu osmotiká lyse (erythroyty)-suspenze v hypotonikém prostředí změna tlaku plynu přídavek org. rozpouštědla - toluen, diethyleter, hloroform - (toluen extrahuje při o C fosfolipidy buněčné stěny osmotiký šok + enzymová autolýza způsobí uvolnění buněčného obsahu) Wikipedia

27 přídavek kyseliny či zásady přídavkem detergentů neionogení ionogenní anioniké kationiké amfoterní CMC kritiká mielární konentrae C konentrae detergentu Y-PER Reagent signifiantly disrupts yeast ell wall and plasma membrane. Cells of Saharomyes erevisiae stain DY150 after lysis with Y-PER Yeast Protein Extration Reagent. Arrows indiate disruption of ell wall, resulting in ell lysis.

28 Detergent CMC MMW konentrae odstranění aplikae mm Da ANIOGENNÍ SDS(dodeylsulfát sodný) 8,3 288,4 > 10 mg/mg prot. denaturae proteinů, použití pro DNA, PAGE DOC(deoxyholát sodný) ,6 0,1-10 mg membr. lipidů solubilizae membránovýh proteinů N-lauroylsarkosin ,1-1,5 % KATIOGENNÍ solubilizae membr. prot., příprava antigenů CTAB (hexadeyltrimethyl amonium bromide) ,1 1 %??? rozpouští membrány, tvoří komplex s DNA, odstranění polysaharidů NEIONOGENNÍ Triton X-100 [otylphenolpoly(ethylenglyo lether) n ] 0,2 647 n= mm solubilizae proteinů Tween 20 [poly(oxyethylene) n sorbitanmonolaurate] 0,06 > 10 mg/mg membr. lipid; imunobloty, ELISA AMFOTERNÍ CHAPS (3-[(3- holamidopropyl)dimethylam monio]-1-propanesulfonate) 4 614,9 6,5-13 mm solubilizae membránovýh proteinů

29 Extrake membránovýh proteinů sonikae helátová činidla alkaliké podmínky (ph 8 11) plus nízká iontová síla neionogenní detergenty (Triton X-114) částečně vodoumísitelná organiká rozpouštědla (n-butanol) vysoká iontová síla (1M NaCl) fosfolipasy

30 Phase separation of hromaffin-granule membrane proteins Proteins from the Triton X-1 14 phase-separation proedure were analysed under reduing onditions on an 8-15% -polyarylamide gel. Trak 1, standard proteins. Trak 2, omplete hromaffin-granule membranes. Trak 3, phospholipid-rih phase. Trak 4, detergent-rih phase. Trak 5, aqueous phase.

31 Odstranění detergentů vliv: fyzikální vlastnosti detergentu harakter proteinu (hydrofobní/hydrofilní) složení pufru ionogenní močovina, ionex gelová hromatografie Sephadex G-25 naředění vzorku dialýza neionogenní gelová hromatografie Sephadex G-200 afinitní hromatografie

32 Enzymové způsoby dezintegrae Bakterie Lysozym nejčastěji z vaječnýh bílků, T4 fága hydrolysa 1,4-β-glykosidiké vazby mezi NAG a NAM u G - v kombinai s helatačním činidlem např. EDTA nebo polykationty, Tris ph 6,7-8,6 (4-10) Kvasinky zymolyasa, lytikasa β-1,3-glukanasová aktivita Rostlinné buňky ellulasa, pektinasa

33 Jak vybrat správný postup dezintegrae? typ organismu předpokládaná stabilita proteinu lokalizae proteinu dostupné vybavení ena čas objem vzorku sledování úspěšnosti dezintegrae

34 Inhibitory proteas

35 Solubilizae proteinovýh agregátů 1. lyse buněk 2. isolae inkluzníh tělísek 3. solubilizae proteinů z inkluzí (Guanidin-HCl 5-8 M, močovina 6-8 M) 4. renaturae proteinu dialysa

36 Stabilizae proteinů soli stabilizují proteiny v roztoku Hofmeisterova řada (CH 3 ) 4 N + > NH 4+ > K + > Na + > Mg 2+ > Ca 2+ > Ba 2+ SO 4 2- > Cl - > Br - > NO 3- > ClO 4- > SCN - proteiny např.bsa redukční činidla β-merkaptoethanol (5-20 mm), DTT (0,5-1 mm) osmolyty polyalkoholy, mono- a polysaharidy, neutrální polymery % aminokyseliny nenabité (Gly, Ala) mm polymery (PEG) 1-15 % zvyšuje viskozitu a tak zabraňuje agregai

37 Membránové proesy - filtrae rozdělení molekul z roztoku na základě jejih velikosti, definovaná velikost pórů = ut off (µm, Da), gravitae, inertní plyn retentát permeát mikroporesní anizotropní

38 Produkt polyvinylidenfluorid PVDF polyethersulfon PES estery ellulosy MCE polykarbonáty nylon a síťovina skleněná a křemenná vlákna teflon použití nízká vazba proteinů ryhlý průtok a nízká vazba proteinů filtrae pufrů a části hladký povrh široká hemiká kompatibilita, rozsahu 3-10 ph hrubá filtrae, roztoky s vysokým počtem části hydrofobní,org.rozpouštědla, hemiky agresivní roztoky PVDF 0,1-5 µm estery ellulosy skleněná a křemenná vlákna 0,025-8 µm 0,7 3 µm nylon 0, µm

39 harakteristika membrán dělíí rozsah NMWL, MWCO, NCO průtočnost membrány rozsah povolenýh praovníh teplot, tlaků a ph odolnost membrán životnost Membrane: Durapore Membrane Filters - PVDF (Polyvinylidene fluoride) Features: Low Protein Binding Speifiations: Pore sizes: 0.1, 0.22, 0.45, 0.65, 5 µm Color: Surfae: Wettability: White Plain Hydrophili, hydrophobi Thikness: 125 µm Sterilization: Operating temperature: by autolave (121 C at 1 bar), EO or gamma 85 C max. Gravimetri extratables: <0.5% Protein binding apaity: 4 µg/m²

40 Mikrofiltrae separae koloidníh a nerozpustnýh části ( bakterie, barevné pigmenty, kvasinky) 0,05-10 µm hnaí silou - rozdíl tlaku potřebný tlak - nízký

41

42 Ultrafiltrae separae např. bílkovin, virů frakionae bílkovin velikost pórů přibližně 3 nm do 0,1 µm hnaí sílou rozdíl tlaků tlak > 10 bar (145 psi, 1 MPa) N 2 pojistný ventil míhadlo membrána retentát permeát

43 Nanofiltrae separae nízkomolekulárníh látek velikost pórů přibližně 1 nm do 10 nm g/mol hnaí sílou rozdíl tlaků Použití odsolování potravin odsolování syrovátky zakonentrovávání

44 Reverzní osmóza separae nízkomolekulárníh látek menší než 200 g/mol hnaí sílou rozdíl tlaků

45 Mikrofiltrae Ultrafiltrae Nanofiltrae Reverzní osmóza

46

47 zygota - Cryptosporidium

48 Jaký osmotiký tlak vykazuje jednomolární roztok saharosy při 25 C? (R=8,314 J K -1 mol -1 ) π = RT i π = RT= 1. 8, ,15 = 2478,8??? kpa J / dm 3 = N.m /dm 3 = 10 3 N/m 2 = Pa

49 * Roztok obsahujíí 0,5 g ribonukleasy v 0,1 dm 3 0,2 M NaCl má při 298 K osmotiký tlak 0,0097 atmosfér. Membrána je propustná pro všehny částie kromě bílkoviny; osmotiky tlak byl měřen proti 0,2 M NaCI Určete molární hmotnost ribonukleasy (R = 0,082 dm 3. atm. mol -1. K -1 ). π = RT i

50 Dialýza - difuze nízkomolekulárníh látek polopropustnou membránou

51 dialysa 100 ml 5 M NaCl proti 1 litru

52 Příklady: 2 1 Na Na M ln F RT = ϕ 1 2 Cl Cl M ln F RT = ϕ Na + Cl Cl Cl Na Na ln F RT ln F RT = Cl Na Cl Na =

53 * Do jednoho prostoru dialysační nádoby je umístěn roztok albuminu o konentrai 0,1 mmol/l, který při ph 7 nese volný náboj -7; je tedy ve formě soli, v našem případě např. sodné. Do druhého prostoru o stejném objemu je umístěn roztok NaCl o konentrai 10 mmol/l. Jaké bude rozložení iontů po ustanovení rovnováhy? = Na1 Cl1 Na2 Cl2 ( 0, x ).x = ( 10 x) 0, 7x + x 2 = x + 20, 7x = 100 x = 4, 83mmol/l Na1 Cl1 Na2 Cl 2 = 5,53mmol / l = 4,83mmol / l = 5,17 mmol / l = 5,17 mmol / l 2 x 2

54 * Do jednoho prostoru dialysační nádoby je umístěn roztok albuminu o konentrai 100 mmol/l, který při ph 7 nese volný náboj -7; je tedy ve formě soli, v našem případě např. sodné. Do druhého prostoru o stejném objemu je umístěn roztok NaCl o konentrai 10 mmol/l. Jaké bude rozložení iontů po ustanovení rovnováhy? = Na1 Cl1 Na2 Cl2 ( x). x = ( 10 x) 700x + x 2 = x + 720x = 100 x = 0,139mmol / l Na1 Cl1 Na2 Cl 2 = 0,139mmol / l = 9,861mmol / l = 9,861mmol / l 2 x = 700,139mmol / l 2

55 * Do jednoho prostoru dialysační nádoby je umístěn roztok albuminu o konentrai 100 mmol/l, který je při ph 7 ve svém isoelektrikém bodu. Do druhého prostoru o stejném objemu je umístěn roztok NaCl o konentrai 10 mmol/l. Jaké bude rozložení iontů po ustanovení rovnováhy? = Na1 Cl1 Na2 Cl2 x 2 x. x = ( 10 x) = x + 20x = 100 x = 5mmol / l Na1 Cl1 Na2 Cl 2 2 x = 5mmol / l = 5mmol / l = 5mmol / l = 5mmol / l 2

56 * Do jednoho prostoru dialysační nádoby je umístěn roztok albuminu o konentrai 100 mmol/l, který při ph 7 nese volný náboj -7; je tedy ve formě soli, v našem případě např. sodné. Do druhého prostoru o stejném objemu je umístěn roztok NaCl o konentrai 10 mmol/l. Jaké bude rozložení iontů po ustanovení rovnováhy? = Na1 Cl1 Na2 Cl2 ( x). x = ( 10 x) 700x + x 2 = x + 720x = 100 x = 0,139mmol / l Na1 Cl1 Na2 Cl 2 = 0,139mmol / l = 9,861mmol / l = 9,861mmol / l 2 x = 700,139mmol / l 2

57 * Zásobní roztok sodné soli albuminu (= mol/l) měl takové ph, že jeho volný náboj činil -5. Roztok dále obsahoval pufr s přídavkem 0,1 M NaCl. Do druhého prostoru o stejném objemu je umístěn pufr, který neobsahuje ani sodné ani hloridové ionty. Jaké bude rozložení hloridovýh a sodnýh iontů po ustanovení rovnováhy? = Na1 Cl1 Na2 Cl2 3 ( ( 0,1 x) ).( 0,1 x) 2 ( 0,115 x).( 0,1 x) = x 0,0115 = 0,215x Na 2 = Cl 2 = 0,05mol / l = x 2 Na1 Cl1 Na2 Cl 2 = 0,065mol / l = 0,05mol / l = 0,05mol / l = 0,05mol / l

58 * Zásobní roztok sodné soli albuminu (= mol/l) měl takové ph, že jeho volný náboj činil -5. Roztok dále obsahoval 0,1 M NaCl. Proti jakému objemu vody je nutno dialyzovat 0,1 l tohoto roztoku, aby po ustanovení rovnováhy klesla konentrae iontu Na + v roztoku bílkoviny na 0,02 mol/l? 0, 02. Na2 = n = 3 ( 0, ) n Cl2 Cl2 n V n Cl2 2 = Cl2 Cl2 = = V 0, 0001 = n V. 2 1 = 0 0 Na1 Cl1 Na2 Cl2 = 0, 1. 0, 1 n 0, , 01 n V. 0, 1. 0, 005 Cl2 Cl2 = Cl1 = 0, 0095mol 1 Na2 Cl1 = 0, 95l. Cl2 = 0, 01mol/l

59 Prinip hemodialysy

60 Elektrodialysa vzorek anionaktivní iontově selektivní membrána kationaktivní iontově selektivní membrána

61 odsolování syrovátky odsolování mořské vody odstraňování nitrátů z pitné vody odstraňování kyselin z organikýh produktů odstranění kyselosti džusu

62 další způsoby odsolování a zahušťování: gelová hromatodrafie - Sephadex G-25, BioGel P-30 vakuové odpařování použití polyethylenglykolu lyofilizae preipitae hromatografie na reversní fázi (C4) ionexová hromatografie