MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY:

- 1 - MODERNÍ BIOFYZIKÁLNÍ METODY: POKROČILÉ PRAKTICKÉ VZDĚLÁVÁNÍ V EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGII Operační program Vzdělávání pro konkurenceschopnost Číslo projektu: CZ.1.07/2.3.00/09.0046 Praktický kurz základních metod experimentální biologie konaný na Katedře biologie a ekologie Přírodovědecké fakulty Ostravské univerzity v Ostravě v termínu 28. 5. 1. 6. 2012

- 2 - Program praktického kurzu 28. 5. 1. 6. 2012 Pondělí 28. 5 Úterý 29. 5. Středa 30. 5. Čtvrtek 31. 5. Pátek 1. 6. 9-10 Přednáška - mikrobiologie Přednáška transformace bakterií plasmidovou DNA. Přednáška elektrochemie nukleových kyselin Přednáška restrikční štěpení Přednáška + praktické ukázky zásady správného pipetování dopoledne Mikrobiologie: Disimilační aktivita mikrooorganismů. Specifické metody barvení mikroorganismů. Mikrobiologie: vyhodnocení výsledků.. Elektroaktivita a povrchová aktivita NK, vliv struktury NK; denaturace DNA v roztoku a na povrchu elektrody, předdenaturační přechody. Analýza poškození DNA pomocí elektrochemických metod. Restrikční štěpení plasmidové DNA, elektroforéza restrikčních fragmentů. Imunodetekce proteinů na membránách. odpoledne Izolace DNA pomocí kolonek. Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty. Transformace buněk plasmidovou DNA. Selekce buněk s rekombinantním plasmidem. Detekce poškození DNA. Polyakrylamidová gelová elektroforéza proteinů Barvení gelu Elektroforetický přenos proteinů z gelu na membránu. Vyhodnocení výsledků, hodnocení kurzu účastníky.

- 3 - Téma: Disimilační aktivita mikroorganismů Metabolismus (látková přeměna) představuje soubor vzájemně na sebe navazujících oxidoredukčních reakcí, které probíhají v určitém prostoru buňky a v konkrétním čase. Termín metabolismus byl prvně uveden v roce 1839 německým přírodovědcem Theodorem Schwannem (1810-1882). Metabolismus mikroorganismů se podobně jako u všech ostatních živých jedinců rozděluje na dvě základní větve: anabolismus (zahrnující procesy biosyntézy za spotřeby energie) a katabolismus (rozkládání, degradace složitějších sloučenin v buňce na látky jednodušší za tvorby energie ). Metabolická dráha představuje řetězec enzymaticky katalyzovaných chemických reakcí, ve kterých buď dochází k výstavbě složitějších molekul z jednodušších látek, nebo naopak k jejich rozkládání. Následující experimentální úlohy jsou zaměřeny na praktické osvojení si některých základních biochemických testů, jimiž je zjišťována schopnost mikroorganismů syntetizovat určité enzymy. Úkol č. 1: Fermentace sacharidů Princip: Fermentací sacharidů testovaným mikroorganismem vznikají různé organické látky. Důsledkem metabolické činnosti dochází k hromadění kyselin v kultivačním médiu, což se projeví posunem hodnoty ph do kyselé oblasti a dojde ke změně barvy indikátoru přidaného do média. Rozklad cukrů může probíhat za tvorby plynu nebo bez tvorby plynu. Tvorba plynu se obvykle prokazuje přidáním malých plynovek (Durhamovy zkumavky) do tekutého média, v nichž se během kultivace shromažďují bublinky CO 2. Materiál a pomůcky: A. Mikroorganismy: Escherichia coli, Alcaligenes faecalis, Enterobacter aerogenes, Proteus vulgaris B. Média a chemikálie: tekutá živná média pro fermentaci sacharidů (s glukózou, sacharózou, fruktózou, laktózou a manózou, indikátor bromthymolová modř) C. Laboratorní vybavení: Pipety, očkovací klička, plynovky, zkumavky, stojany na zkumavky, termostat, kahan Obr. Fermentace sacharidů (fenolová červeň jako indikátor) (převzato z Harley-Prescott 2002). Pozn. V našem testu bude jako barevný indikátor použita bromthymolova modř a změna zbarvení bude z modré na žlutou

- 4 - Postup: 1. Fermentační zkumavky s tekutým médiem a plynovkami zaočkujte pomocí kličky čistou 24 hod. kulturou testovaného mikroorganismu. Jednu zkumavku ponechte nezaočkovanou. 2. Naočkované zkumavky kultivujte 24 hodin při 35 C. 3. Po kultivaci zhodnoťte růst kultur, změnu zbarvení média a tvorbu plynu. Naočkované zkumavky porovnejte s nezaočkovanou fermentační zkumavkou. 4. V případě pozitivního výsledku dojde ke změně modrozeleného zbarvení média na žluté. U negativních výsledků nedochází ke změně zbarvení média. Hodnocení výsledků: 1. Všechny zkumavky vyhodnoťte a na základě zjištěných výsledků doplňte Mikroorganismus Escherichia coli Enterobacter aerogenes Alcaligenes faecalis Proteus vulgaris následující tabulku. 24 hod. 48 hod. 24 hod. 48 hod. 24 hod. 48 hod. 24 hod. 48 hod. Zbarvení nezaočkovaného média: Sacharidy Glukóza Laktóza Sacharóza Růst Barva Kys. Plyn Růst Barva Kys. Plyn Růst Barva Kys. Plyn

- 5 - Úkol č. 2: Test tvorby sirovodíku (TSI TEST) Princip: Mikroorganismy mohou tvořit sirovodík z různých zdrojů. Mohou to být aminokyseliny (cystein) i anorganické látky obsahující síru (sulfáty, thiosulfáty, sulfity). Reakce na H 2 S z organických látek je většinou málo průkazná, neboť běžné komponenty kultivačních médií jsou na síru chudé a proto vzniká i málo H 2 S. Proto se používají pro diferenciaci mikroorganismů kultivační média obsahující sirné anorganické látky. Bylo prokázáno, že mechanismus tvorby H 2 S z organických látek je zcela odlišný od procesu tvorby H 2 S z anorganických komponent, je proto důležité výsledky testů srovnávat pouze za podmínky použití stejného kultivačního média. Jako kultivační médium se používá médium TSI (tvorba sirovodíku je indikována železnatými solemi, které vytvářejí po reakci se sirovodíkem černé sulfidy železa). Obr. TSI test (převzato z Harley-Prescott 2002) a-nezaočkovaná zkumavka, b-žluté zbarvení povrchu i agaru živného média (tvorba kyselin), tvorba plynu, absence tvorby sirovodíku, c-červené zbarvení povrchu i agaru média (alkalické prostředí), tvorba sirovodíku, absence plynu, d- červené zbarvení povrchu média (alkalické prostředí), žluté zbarvení média (tvorba kyselin), tvorba sirovodíku, absence plynu Materiál a pomůcky: A. Mikroorganismy: Escherichia coli, Alcaligenes faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris B. Média a chemikálie: Triple-Sugar-Iron agar (TSI) C. Laboratorní vybavení: Očkovací klička, zkumavky, stojany na zkumavky, termostat, kahan Postup: 1. Čistá kultura testovaného mikroorganismu se naočkuje na připravený šikmý agar (vpichem podél stěny zkumavky, nátěrem na šikmý agar). Jednu nezaočkovanou zkumavku se šikmým agarem použijte jako kontrolu.

- 6-2. Zkumavky se kultivují při teplotě 35 C 18-24 hodin (případně až 48 hodin pro tvorbu sirovodíku). 3. V případě pozitivního výsledku dojde jednak k tvorbě černého sirovodíku (tvoří se kolem vpichu, případně u dna zkumavky), jednak ke změně barvy živného média na žlutou. Také je sledována tvorba plynu. 4. U negativního výsledku nedojde u kultivačního média po kultivaci k žádným změnám. Hodnocení výsledků: 1. Zkumavky vyhodnoťte a na základě zjištěných výsledků doplňte následující tabulku. Při pozorování zkumavek si všimněte zbarvení agaru, přítomnosti či absence černého zbarvení kultivačního média, přítomnosti či nepřítomnosti tvorby plynu. Mikroorganismus Escherichia coli Alcaligenes faecalis Pseudomonas aeruginosa Proteus vulgaris Zbarvení nezaočkovaného média: Fermentace cukrů Tvorba plynu Produkce sirovodíku Zbarvení agaru (+/-) Zbarvení (+/-) Poznámka: Zežloutnutí média pouze kolem vpichu bývá s největší pravděpodobností způsobeno štěpením glukózy. Vzhledem k jejímu malému obsahu v médiu jsou kyseliny, vznikající štěpením glukózy u povrchu média, dále vlivem vzdušného kyslíku odbourávány, takže zde nemůže dojít ke změně hodnoty ph. V případě, že je organismus schopen štěpit i laktózu, které je v médiu 10x více, nestačí se kyseliny u povrchu média odbourávat a proto dojde k poklesu hodnoty ph i u povrchu média. Výsledkem je zežloutnutí média i zde.

- 7 - Úkol č. 3: Hydrolýza škrobu Princip: Amylolytické bakterie vytvářejí amylolytické extracelulární enzymy amylázy, kterými ve vnějším prostředí katalyzují hydrolýzu škrobu a substrátů s vyšším obsahem škrobu. Škroby jsou významnými polysacharidy. Skládají se obvykle asi z 20 % amylózy a 80 % amylopektinu. Amylolytické bakterie stanovujeme na tzv. škrobovém agaru. Po naočkování a příslušné inkubaci se miska přelije roztokem Lugolova činidla z jodu a jodidu draselného. Kolem kolonií produkujících amylázy se vytváří bezbarvá průhledná zóna. Amylázy tvoří zejména zástupci rodů Bacillus a Clostridium a rovněž některé plísně. Materiál a pomůcky: A. Mikroorganismy: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Proteus vulgaris B. Média a chemikálie: Škrobový agar Lugolův roztok C: Laboratorní vybavení: Petriho misky, pipety, očkovací klička, zkumavky, stojany na zkumavky, termostat, kahan Postup: 1. Na Petriho misku se škrobovým agarem si na spodní straně fixem vyznačte tři vodorovné čáry. 2. Každou část misky zaočkujte rovnou čárkou testovanou bakteriální kulturu. 3. Misku inkubujte 24 až 48 hodin při 35 C. 4. Po inkubaci zakapejte povrch živné půdy s narostlou kulturou Lugolovým roztokem. 5. Pozorujte, zda dochází k hydrolýze škrobu, což se projeví vznikem nezbarvených zón kolem rostoucí kultury test je pozitivní. Půda s nerozloženým škrobem se zbarví modře test je negativní. 6. Pozor: Modré zbarvení škrobu po určité době mizí, proto výsledky odečítejte okamžitě. Hodnocení výsledků: 1. Petriho misku vyhodnoťte a na základě zjištěných výsledků doplňte následující tabulku. Mikroorganismus Bacillus subtilis Proteus vulgaris Růst Zbarvení média okolo kolonií po přidání Lugolova roztoku Hydrolýza škrobu (+/-)

- 8 - Escherichia coli Téma: Mikroskopování kvasinek Úkol č. 1: Test vitality Princip: Test využívá semipermeability cytoplazmatické membrány. Živé buňky mají zbarvenu pouze buněčnou stěnu, proto se jeví jako světle modré. Mrtvé buňky jsou zbarveny intenzívně modře, neboť jejich membránový systém je narušen. Pro kontrolu vybarvení mrtvých buněk připravujeme vedle vitálně barveného preparátu také preparát barvený po fixaci plamenem. Materiál: Podložní a krycí sklo, methylenová modř, klička, pipety, filtrační papír, mikroskop. Kultury: Saccharomyces cerevisiae Postup: 1. Z pekařských kvasnic připravíme ve zkumavce se sterilní destilovanou vodou řídkou suspenzi. 2. Pipetou přeneseme kapku methylenové modři na podložní sklíčko. 3. Kápneme malou kapku kultury. 4. Ihned přikryjeme krycím sklem. Pokud se nám zdá preparát málo zbarven, lze k hraně krycího skla přikapávat barvivo, přičemž z druhé strany jej odsáváme proužkem filtračního papíru. 5. V 10 zorných polích spočítáme počet živých a mrtvých buněk. POZOR! Pracujte rychle, celková doba barvení by měla trvat jen 3 minuty. Přesáhne-li 5 minut, barvivo působí toxicky a všechny buňky budou sytě modré. 6. Připravíme ze suspenze kvasinek ještě jeden preparát. Mikroorganismy v nátěru fixujeme v plameni poněkud déle, aby došlo k úhynu buněk (pozitivní kontrola). 7. Barvíme a mikroskopujeme stejně jako v předchozím případě. Hodnocení výsledků: Zakreslete obraz pozorovaný v jednom zorném poli. Vypočítejte % mrtvých kvasinek.

- 9 - Úkol č. 2: Měření velikosti buněk kvasinek Princip: Velikost mikroorganismů, tj. šířka a délka buněk, fruktifikačních orgánů, spór a některých buněčných organel, patří k diagnostickým znakům mikroorganismů. Jestliže za stejných podmínek zjistíme, že velikost buněk téže kultury kolísá, stanovíme maximální a minimální hodnoty a jako výsledek uvedeme variační rozpětí (např. 0,4 1,2 µm x 3,0 6,5 µm). K přesnému zhodnocení velikosti bychom museli proměřit 100 až 200 buněk příslušné kultury. Materiál: Mikroskop, objektivový a okulárový mikrometr, podložní a krycí sklo, methylenová modř, klička, filtrační papír. Kultury: kultura Saccharomyces cerevisiae Postup: 1. Připravíme preparát dle úlohy č. 1. 2. Měření provádíme pomocí objektivového a okulárového mikrometru. Postupujeme tak, že před vlastním měřením seřídíme stupnice objektivového a okulárového mikrometru tak, aby obě stupnice ležely v zorném poli rovnoběžně a jejich počátky se ztotožnily. Pak zjistíme, kolik dílků objektivového mikrometru odpovídá dílkům okulárového mikrometru. Odpovídající dílky se musí přesně krýt. Okulárový mikrometr Objektivový mikrometr 3. Vypočteme hodnotu okulárového dílku (H) pro dané zvětšení podle vzorce: H = dílky objektivové x 10 dílky okulárové

- 10-4. Při vlastním měření se objektivový mikrometr nepoužívá. Tzn., že ho musíme vyjmout a místo něj umístíme připravený preparát. Pozor! S mikrometrem manipulujte velmi opatrně, ihned jej řádně uložte, aby se nepodřel, neztratil nebo nerozbil! 5. Jednotlivé buňky umístíme do středu zorného pole a natočíme na ně okulárový mikrometr tak, aby bylo možné odečíst délku v dílcích (desetiny dílku odhadujeme). 6. Otáčením okuláru o 90 lze pak stejným způsobem odečíst šířku buňky. 7. Proměříme větší počet buněk a průměrné hodnoty v dílcích se pronásobí zjištěnou hodnotou dílku (H) pro určité zvětšení a výsledky se převedou na µm. Hodnocení výsledků: Proveďte měření velikosti buněk kvasinek. Změřte 10 buněk v daném preparátu. Hodnoty zapisujte do tabulky. Dílky přepočtěte na µm. Buňka Délka buňky (µm) Šířka buňky (µm) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Variační rozpětí V závěru se zkuste zamyslet nad příčinami možných rozdílů ve velikosti buněk jedné kultury. Uveďte, čím mohou být způsobeny. Úkol č. 3: Barvení glykogenu a bílkovin Princip: Glykogen je důležitá rezervní látka v buňkách mikroorganismů. Buňky v optimálních podmínkách růstu mohou obsahovat až 20 % glykogenu. Rychlost tvorby glykogenu je závislá na podmínkách prostředí a jeho obsah v buňce je v určitém poměru k bílkovinám. Množství glykogenu je nepřímo úměrné množství bílkovin v buňce. Podle množství glykogenu posuzujeme fyziologický stav kultury. Materiál: Mikroskop, podložní a krycí sklo, Lugolův roztok, pipety, filtrační papír. Kultury: třídenní kultura Saccharomyces cerevisiae

- 11 - Postup: 1. Na čisté a suché podložní sklíčko přeneseme malou kapku suspenze kvasinek. 2. Přikápneme kapku Lugolova roztoku, promícháme a přikryjeme krycím sklíčkem. 3. Mikroskopujeme za použití imerze. Hodnocení výsledků: Obraz preparátu zakreslete: Zhodnoťte množství glykogenu v kultuře: Žlutě zbarvené části plazmy dokazují přítomnost bílkovin, hnědé a hnědočervené zbarvení nasvědčuje přítomnosti glykogenu. Všimněte si pučících buněk, v pupenech se glykogen nevyskytuje - starší buňky obsahují poměrně velké množství glykogenu. Proveďte důkaz rozpustnosti glykogenu: Podložní sklíčko se zbarveným preparátem zahřejte nad plamenem hnědé zbarvení zmizí, po opětovném zchlazení se znovu objeví (je potřeba pracovat co nejrychleji po zahřátí sklíčka ihned pozorovat s imerzí).

- 12 - Téma: Barvení buněčných organel a struktur Úkol č. 1: Barvení pouzder Materiál: Podložní sklo, klička, pipety, mikroskop, pinzety, filtrační papír, Kongo červeň, roztok Maneval s. Kultury: 24 hod. kultury Enterobacter aerogenes, E. coli, Proteus vulgaris Postup práce: 1. Na konec podložního sklíčka umístíme kapku Kongo červeně. 2. Kličkou přeneseme inokulum a rozmícháme. 3. Hranou dalšího podložního skla rozetřeme kapku do tenkého filmu po celé ploše podložního skla. 4. Nátěr necháme zaschnout na vzduchu (nefixujeme teplem). 5. Nátěr převrstvíme Maneval s roztokem, necháme působit 1 min. 6. Opláchneme tekoucí vodou a osušíme. 7. Mikroskopujeme za použití imerze. Hodnocení výsledků: Vegetativní buňky jsou zbarveny modře (červeně) Pouzdra vytvářejí bílé prstence kolem buněk. Zakreslete pozorovaná pouzdra. Srovnejte vzájemně všechny kmeny.

- 13 - Úkol č.2: Barvení spor Bakteriální spory se vyznačují velmi špatnou barvitelností. K jejich obarvení je proto nutné použít metod agresivního barvení založeného na barvení koncentrovanými barvivy za horka. Materiál: Podložní sklo, klička, pipety, mikroskop, pinzety, filtrační papír, malachitová zeleň, mafranin. Kultury: 24 hod. a 1 týdenní kultury Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus cereus. Postup: 1. Připravíme si nátěry z 24 hod. a z 1 týdenní kultury a bez fixace je usušíme. 2. Na nátěr umístíme filtrační papír a nakapeme na něj roztok malachitové zeleně. 3. Sklíčko opatrně zahříváme 10 minut až do odpařování barviva, ale barvivo nesmí vřít, přitom však barvivo průběžně doplňujeme. 4. Po skončení barvení filtrační papír odstraníme a preparát opláchneme tekoucí vodou. 5. Převrstvíme vodným roztokem safraninu a barvíme 30 sekund. 6. Znovu opláchneme a po zaschnutí pozorujeme imerzním objektivem. Hodnocení výsledků: Spory pozorujeme zbarvené zeleně, vegetativní buňky červeně. Zakreslete mikroskopický obraz. Stanovte typ pozorovaných spor. Stanovte % sporulujících buněk v 10 zorných polích.

- 14 - Rozlišení jedno a dvouřetězcové DNA pomocí AC voltametrie, detekce hybridizace oligonukleotidů na uhlíkové elektrodě Princip metody AC voltametrie (ACV) patří mezi voltametrické metody se střídavou složkou potenciálu. U této metody se na elektrodu vkládá lineárně se měnící potenciálová rampa. Na ni je superponováno střídavé napětí sinusového průběhu o malé amplitudě (10 mv) a nízké frekvenci (desítky až stovky Hz). Měří se závislost střídavého proudu procházejícího elektrodou na jejím potenciálu. DNA poskytuje v ACV řadu signálů. Některé z nich jsou citlivé ke změnám struktury DNA. Dvouřetězcová (ds) a jednořetězcová (ss) DNA poskytují pík 1, který je způsoben adsorpcí/desorpcí cukrfosfátové kostry. Ds DNA dále poskytuje pík 2 v důsledku adsorpce/desorpce zdeformovaných ds úseků. Ss DNA poskytuje pík 3, který je způsoben adsorpcí/desorpcí zbytků bází v jednořetězcových úsecích. Rozdílů v ACV záznamech lze využít pro rychlé rozlišení ss a ds DNA. Adsorptivní rozpouštěcí voltametrie je založena na užití adsorptivního nahromadění analytu z roztoku na povrchu pracovní elektrody. Naadsorbovaný analyt je pak v dalším kroku voltametrickém scanu rozpuštěn zpět do roztoku základního elektrolytu. Tím se o několik řádů zvýší detekční limit. Při adsorptivní přenosové rozpouštěcí voltametrii je analyt nahromaděn na povrchu elektrody (analyt se musí adsorbovat ireverzibilně) z malé kapky vzorku (3-5 l), poté je elektroda s naadsorbovanou vrstvou omyta a přenesena do roztoku základního elektrolytu. Zde pak probíhá samotné elektrochemické měření. Díky aplikaci této metody se sníží potřebný objem vzorku o tři řády (jednotky ml jednotky l). Navíc lze tímto způsobem analyzovat vzorky DNA obsahující nízkomolekulární látky, které by mohly rušit elektrochemické měření. Další možností pro posouzení stavu DNA je možnost využít oxidačních signálů bazí. K oxidaci adeninu a guaninu dochází v místech (na atomech), které se účastní párování bazí vodíkovými můstky. V dvouřtězcovém stavu jsou tedy báze od elektrody stéricky izolovány a svůj oxidační signál poskytují jen v jednořetězcovém stavu. Tohoto lze využít například při detekci hybridizace. Pracovní postup A: nativní a denaturovaná DNA - Denaturace DNA. DNA rozpuštěná ve vodě o koncentraci maximálně 150 g/ml se zahřeje na 6 minut na 99 o C a poté se rychle ochladí v nádobě s ledem. - Připravená denaturovaná DNA i původní nativní DNA se naředí 0,2 M NaCl na koncentraci 30 g/ml (připravovaný objem 30 l) - Měření AC voltametrie do měřící nádobky nalijeme 3 5 ml základního elektrolytu (roztok 0,3 M NaCl a 50 mm Na 2 HPO 4 ze zásobních roztoků 3M NaCl a 0,5 M Na 2 HPO 4 ). Provedeme voltametrické měření v potenciálovám rozsahu -0,6 až -1,6 V. Jako pracovní elektrodu používáme visící rtuťovou kapku. Měříme nejdříve základní elektrolyt a potom postupně oba vzorky DNA. Měření DNA probíhá pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí voltametrie (AdTSV).

- 15 - Pracovní postup B: Signály bazí DNA na uhlíkové elektrodě - Hybridizace oligonukleotidů do mikrozkumavky 1 smíchejte k sobě komplementární oligonukleotidy a doplňte 0.2M NaCl tak, aby výsledná koncentrace nukleotidů byla cca 30µg/ml, ve výsledném objemu 20µl. - Zkumavky zahřejte na 99ºC a nechte pomalu chladnout. - Na uhlíkové elektrodě v SWV módu změřte signály bází za podmínek: základní elektrolyt 0.2M acetát sodný, počáteční potenciál -0.1V, koncový 1.5V, frekvence 200Hz, amplituda 50mV - Mezi jednotlivými měřeními je potřeba povrch elektrody obnovit nastavte na 30s potenciál 1.8V (condition potential) a pak obnovte povrch elektrody pomocí lepící pásky Materiál a pomůcky - potenciostat (Autolab) - elektrodový systém (663 VA-stand) - tlaková láhev s argonem - základní elektrolyty, 0,2M acetát sodný, 0,3 M NaCl, 50 mm Na 2 HPO 4 - roztok 0,2 M NaCl - DNA

- 16 - Analýza nukleotidových sekvencí pomocí magnetických kuliček a hybridizace se sondou značenou enzymem Princip úlohy: Přítomnost určité sekvence nukleotidů v cílové DNA lze dokázat pomocí vhodně navržené sondy - krátkého úseku DNA, která s hledanou sekvencí hybridizuje, tj. vytvoří duplex DNA. Vznik duplexu detekujeme. V této práci bude cílová DNA s (da) 30 -koncem nejprve navázána na magnetické kuličky modifikované (dt) 25 řetězci. Bude-li v této DNA úsek komplementární k navržené sondě nesoucí biotin, dojde k hybridizaci. Na biotin bude poté navázán konjugát streptavidinu s enzymem, alkalickou fosfatázou, která přemění elektroneaktivní substrát 1-naftylfosfát na 1- naftol, jehož oxidace bude detekována pomocí lineární voltametrie. Postup: 1) napipetujeme 40 μl kuliček DB-(dT) 25 do eppendorfky, pomocí magnetu odebereme skladovací pufr a 3x promyjeme 100 μl 0,3M NaCl/ 10mM TRIS (tj. resuspendujeme na vortexu a pomocí magnetu odebereme promývací roztok a přidáme čistý) 2) před posledním odebráním promývacího pufru kuličky rozdělíme do 2 eppendorfek po 50 μl 3) do jedné eppendorfky napipetujeme 20 μl cílové DNA I (5 μg/ml) v roztoku 0,3M NaCl, do druhé totéž ale s cílovou DNA II 4) necháme inkubovat v termomixeru 12 min, 20 C, 900 rpm 5) 3x promyjeme 100 μl 0,3M NaCl/ 10mM TRIS 6) do obou eppendorfek napipetujeme 20 μl biotinylované sondy (5 μg/ml) 7) viz 4) 8) viz 5) 9) přidáme 50 μl mléka (2,5 g sušeného mléka + 50 ml PBS) - necháme inkubovat 10 min, 20 C, 900 rpm

- 17-10) po odebrání mléka přidáme 50 μl konjugátu streptavidinu s alkalickou fosfatázou 100x ředěného v mléce 11) viz 4) 12) promyjeme - 3x 100 μl PBST (fosfátový pufr + 0,2 % TWEEN) a 3x 100 μl 0,3M NaCl/ 10mM TRIS 13) přidáme 50 μl 100mM 1-naftylfosfátu v uhličitanovém pufru 14) viz 4) 15) odebereme roztok od kuliček a přeneseme ho do 1 ml uhličitanového pufru Elektrochemická detekce: metoda: LSV - lineární voltametrie pracovní elektroda: PGE - elektroda z pyrolytického grafitu roztok připravený v bodě 15) přeneseme do elektrochemické měřící nádobky, vložíme do ní elektrody, spustíme měření, vyhodnotíme

- 18 - Značení DNA komplexy oxidu osmičelého Komplexy oxidu osmičelého s bidentátními dusíkatými ligandy poskytují s pyrimidinovými zbytky bází v DNA kovalentní adukty. Thymin je asi 10x reaktivnější než cytosin. Pokud je jako ligand použit 2,2 -bipyridin (Os,bipy) je tato reakce specifická pouze pro jednořetězcovou DNA. Tato vlastnost byla použita pro detekci některých sekundárních struktur DNA. Tyto adukty jsou elektroaktivní a na rtuťových a uhlíkových elektrodách poskytují celou řadu elektrochemických signálů. Na rtuťových a uhlíkových elektrodách jsou to faradaické signály způsobené postupnou redukcí nebo oxidací atomu osmia v molekule aduktu. Pouze na rtuťových elektrodách pak lze získat signál katalytického vylučování vodíku v důsledku přítomnosti aduktu na povrchu pracovní elektrody. Tento katalytický signál může sloužit pro velmi citlivé stanovení modifikované DNA. Naproti tomu elektrodu z pyrolytického grafitu lze použít pro přímou analýzu reakční směsi, kdy je nezreagovaný komplex separován z povrchu pracovní elektrody extrakcí organickým rozpouštědlem (chloroform, isopropylalkohol). Pracovní postup: 1) Odpipetujte 20 μl CT-DNA (120 μg/ml) a nechte 10 min inkubovat při 95 stupních, prudce zchlaďte v ledové lázni 2) Připravte si 10 μl komplexu OsO 4 s bipyridinem (20 mm ekvimolární) 3) Napipetujte: a) 2 μl komplexu, 5 μl ssdna, 2 μl Tris-Cl ph 8, 11 μl H 2 0 b) 2 μl komplexu, 5 μl dsdna, 2 μl Tris-Cl ph 8, 11 μl H 2 0 4) Obě zkumavky nechte inkubovat 30 min při 37 C, sledujte čas 5) Připravte si analogickým způsobem dvě zkumavky s nemodifikovanou DNA (ss a ds) o koncentraci 30 μg/ml 6) Připravte si základní elektrolyt 200 mm acetát sodný ph 5 7) Na uhlíkové elektrodě změřte signál ssdna a dsdna 8) Na uhlíkové elektrodě změřte signál DNA modifikované osmiem Elektrochemické měření: Do měřící nádobky napipetujeme 2 ml základního elektrolytu (0,2 M acetátový pufr, ph 5) provedeme záznam SWV s počátečním potenciálem -1, konečným potenciálem +1,5 V, frekvence 200 Hz amplituda 50 mv. Poté obnovíme povrch pracovní elektrody lepící páskou, naneseme vzorek (7 l) a 60 s akumulujeme. Pak elektrodu opláchneme v destilované vodě, ethanolu a isopropylalkoholu (60 s). Po omytí provedeme měření. Po naměření provedeme elektrochemickou úpravu povrchu elektrody (30 s 1,8 V) a opět obnovíme povrch lepící páskou. Seznam potřebného vybavení a chemikálií: potenciostat (PalmSens) elektrodový systém (663 VA-stand), pracovní elektroda: PGE, referentní elektroda: Ag/AgCl/3M KCl, pomocná elektroda: platinový drát termomixér 0,2 M acetátový pufr, ph 5 roztok OsO 4 roztok 2,2 -bipyridinu isopropylalkohol, ethanol

- 19 - Izolace plasmidové DNA Izolace plasmidové DNA pomocí kolonek od firmy QIAGEN Princip: V současné době je izolace plasmidové DNA velice usnadněna díky dostupnosti komerčních kitů, které umožňují zkrátit dobu nutnou pro izolaci, vyhnout se práci s některými chemikáliemi (fenol, chloroform) a získat plasmidovou DNA v požadované kvalitě. Na našem trhu jsou k dispozici izolační kity od několika firem (Qiagen, Macherey-Nagel, Sigma), které fungují na podobném principu a liší se pouze v detailech. K dostání jsou kolony o různé kapacitě, kolony, kterými nanesený lyzát protéká pouze za pomoci gravitační síly nebo kolony, u nichž je průtok lyzátu urychlen centrifugací. Posledně jmenované kolony zkracují čas potřebný pro izolaci, používají se hlavně při přípravě malých množství DNA, protože jejich kapacita je omezená. Poslední novinkou na trhu jsou kolony vybavené speciálním filtrem, které umožňují oddělit rozpustnou frakci lyzátu od nerozpustné bez použití centrifugace. A B Obr. 5.1: (A) Znázornění kolony od firmy Qiagen a její upevnění ve zkumavce. (B) Aniontové výměnné kolony firmy Qiagen o kapacitě 20-10 000 g. Podstatou izolace DNA je alkalická lýze a oddělení nerozpustné buněčné frakce s chromozomální DNA od vodné frakce, ve které je rozpuštěna plasmidová DNA. Vodná

- 20 - frakce je nanesena na kolonu, jejíž náplň je tvořena chemicky upravenou pryskyřicí a při ph 7 obsahuje kladně nabité konce tvořené dietylaminoetanolem (DEAE). Kladné náboje interagují se záporně nabitými nukleovými kyselinami (obr. 5.2A) a zadrží je na koloně. Z kolony jsou nežádoucí biomakromolekuly vymyty pufrem, který obsahuje dostatečnou koncentraci solí pro uvolnění krátkých oligomerů, trna, rrna a ssdna, zatímco plasmidová DNA zůstane navázána. Eluce DNA je provedena pufrem o vyšší iontové síle než je promývací pufr (obr. 5.2B) A Obr. 5.2: (A) Interakce DEAE se záporně nabitými fosfátovými skupinami DNA. (B) Separace jednotlivých druhů nukleových kyselin při neutrálním ph na aniontové výměnné koloně Pro úspěšnou izolaci čisté plasmidové DNA je kritickým krokem lýze buněk. Pokud lýzi buněk provedeme příliš drasticky, ať už prodloužením času nebo příliš intenzivním protřepáním směsi po přidání lyzačního pufru, fragmenty chromozomální DNA se uvolní do rozpustné frakce a v dalších krocích se při izolaci chová jako plasmidová DNA. Přečištění takto znehodnocené DNA je možné pouze za použití centrifugace v gradientu chloridu cesného, nicméně musíme počítat s nižším výtěžkem, protože chromozomální DNA na koloně kompetuje o vazebná místa s plasmidovou DNA. B Pracovní postup: Tab.: Objemy bakteriální kultury a pufrů pro izolaci plasmidové DNA na aniontových výměnných kolonách Qiagen podle kapacity použité kolony. Kapacita kolony ( g) Objem kultury (l) Objem pufru P1 (ml) Objem pufru P2 (ml) Objem pufru P3 (ml) Objem pufru QBT (ml) Objem pufru QC (ml) Objem pufru QF (ml) Objem isopropanolu (ml) Objem etanolu (ml) Mini (20) 0,003 0,3 0,3 0,3 1 2 x 2 0,8 0,56 1 Midi (100) 0,025 (0,1) 4 4 4 4 2 x 10 5 3,5 2 Maxi (500) 0,1 (0,5) 10 10 10 10 2 x 30 15 10,5 5 Mega (2 500) 0,5 (2,5 ) 50 50 50 35 2 x 100 35 24,5 7 Giga (10 000) 2,5 (5 ) 125 125 125 75 2 x 300 75 52,5 10 Pozn. : Optimální objem kultury pro jednotlivé izolace je uveden pro plasmidy, které v bakteriálních buňkách vytvářejí velký počet kopií (řádově stovky až tisíce) nebo pro plasmidy nízkým počtem kopií (10-20) jejichž počet byl zvýšen amplifikací v důsledku kultivace v přítomnosti chloramfenikolu. V závorce je uveden objem bakteriální kultury pro plasmidy s nízkým počtem kopií, které nebyly amplifikovány.

- 21-1. Dobře rostlou a centrifugovanou bakteriální kulturu suspendujeme v pufru P1 tak, aby bakterie byly kompletně rozsuspendovány a nevytvářely žádné shluky. 2. Přidáme pufr P2, jemně ale důkladně zamícháme několikanásobným (4-6 x) obrácením zkumavky dnem vzhůru a inkubujeme 5 minut při pokojové teplotě. 3. Přidáme vychlazený pufr P3, jemně zamícháme (bod 2) a necháme inkubovat 15 minut v ledové lázni. 4. Centrifugujeme 30 minut při 4 C a RCF minimálně 20 000 x g. Supernatant, obsahující plasmidovou DNA, slejeme přes složenou gázu do připravené zkumavky. Odebereme 250 l vyčištěného lyzátového supernatantu a uchováme pro nanesení na analytický gel (kontrolní vzorek 1). 5. Během centrifugace ekvilibrujeme kolonu QIAGEN-tip ekvilibračním pufrem QBT. Necháme kolonu vyprázdnit působením gravitace. 6. Na ekvilibrovanou kolonu naneseme supernatant (krok 4) a počkáme, než se kolona působením gravitace vyprázdní. Odebereme 250 l vzorku prošlého kolonou a uchováme pro nanesení na analytický gel (kontrolní vzorek 2). 7. Promyjeme kolonu promývacím pufrem QC. Tímto krokem se zbavíme všech nečistot, jejichž vazba vůči kationtům v náplni kolony je slabší než vazba dsdna (proteiny, RNA, ssdna) Odebereme po 500 l z promývacích frakcí a uchováme pro nanesení na analytický gel (kontrolní vzorky 3 a 4). 8. Eluujeme DNA elučním pufrem QF. Odebereme 100 l eluátu a uchováme pro nanesení na analytický gel (kontrolní vzorek 5). 9. Získanou plasmidovou DNA vysrážíme přidáním isopropanolu (0,7 objemu). Zamícháme a okamžitě centrifugujeme 30 minut při 15 000 x g a teplotě 4 C. Opatrně slijeme supernatant. 10. Vysráženou DNA promyjeme 70% etanolem a centrifugujeme 10 minut při 15 000 x g a teplotě 4 C. Opatrně slijeme supernatant, abychom neporušili pelet. 11. Pelet vysušíme při sníženém tlaku po dobu 5-10 minut a DNA rozpustíme v TE pufru, ph 8.0. 12. Kontrolní vzorky 1-5 přesrážíme přidáním 0.7 objemu isopropanolu, centrifugujeme, promyjeme 80% etanolem a vysušíme. Rozpustíme v 50 l TE pufru, ph 8.0. Na gel nanášíme po 10 l přesrážených kontrolních vzorků. Tento krok provádíme souběžně se srážením izolované DNA. Během srážení si také připravíme 1% agarosový gel (krok 14). 13. Stanovení výtěžku a čistoty DNA provedeme UV spektrofotometrií při 260 a 280 nm a kvantitativní analýzou na agarosovém gelu. 14. Do Erlenmayerovy baňky navážíme 1 g agarosy, přidáme 100 ml 1 x TAE pufru, zamícháme a v mikrovlnné troubě vaříme 3 minuty při 500 W. Protože během varu dochází k odpaření vody, poznačíme si původní úroveň hladiny. Destilovanou vodou doplníme úbytek vody. Pod tekoucí vodou zchladíme agarosu na cca 60 C a naléváme na připravený nosič. Po ztuhnutí agarosy zalijeme gel 1 x TAE pufrem (400-500 ml), ke vzorkům (10 l ) přidáme 2 l 6 x koncentrovaného nanášecího pufru a vzorky naneseme na gel. 15. Elektroforézu provádíme při 80 V po dobu 60 minut. Gel vyjmeme z aparatury, vložíme do roztoku ethidiumbromidu (1 g/ml) necháme 15 minut barvit. Poté gel vyjmeme a zobrazíme pod UV světlem. POZOR!!! S roztokem ethidiumbromidu a gely, které jsou jím obarveny manipulujeme zásadně v rukavicích!!! 16. Z intenzity zbarvení standardů a izolované DNA stanovíme výtěžek izolace. 17. Změřením absorbance při 260 nm a 280 nm provedeme nezávislé stanovení výtěžku DNA a její čistoty. Dvoušroubovicová DNA o koncentraci 50 g/ml dává v kyvetě o

- 22 - tloušťce 1 cm hodnotu absorbance při 260 nm 1. Poměr absorbancí při 260 a 280 nm by měl činit minimálně 1.8. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Obr. 5.3: Kontroly izolace plasmidů pbsk- (dráhy 1,5,9,13), ppgm1 (2,6,10,14), ppgm2 (3,7,11,15) a ppgm3 (4,8,12,16). V drahách 1-4 jsou kontroly buněčného lyzátu před nanesením na aniontovou výměnnou kolonu (kontroly 1), dráhy 5-8 představují kontroly 2 lyzát prošlý kolonou, dráhy 9-12 představují spojené frakce kontrolních vzorků 3 a 4 promývací frakce, v drahách 13-16 jsou vzorky eluované z kolony.

- 23 - Izolace plasmidové DNA pomocí centrifugačních kolonek Princip: Pro izolaci plasmidové DNA je možné použít nejen kolonky, u kterých je k přečištění a uvolnění zachycené plasmidové DNA využíváno přirozené gravitační pole. Na trhu jsou k dispozici izolační kity, které využívají odstředivou sílu vznikají při centrifugami. Princip izolace je obdobný jako v případě gravitačních kolonek. Použití vyššího přetížení nám však umožňuje zkrátit čas potřebný pro izolaci na 20-30min. Na druhé straně centrifugační kolonky mají nižší kapacitu, izolací proto získáme menší množství DNA. Pracovní postup: 1. V centrifuze stočíme 1-5 ml bakteriální kultury kultivované v LB médiu. Centrifugami provádíme 30 sekund při 11 000 x g. Odstraníme supernatant, pokud možno kompletně. 2. Přidáme 250 l pufru A1. Resuspendujeme buněčný pelet na vortexu. Pro účinnou izolaci je nutné, aby v suspenzi nezůstaly viditelné shluky buněk. Přidáme 250 l pufru A2. Promícháme přvrácením zkumavky dnem vzhůru a zpět 6-8x. Nevortexujeme! Inkubujeme při pokojové teplotě 5 min. Přidáme 300 ml pufru A3. Opět jemně zamícháme převrácením zkumavky (6-8x). Nevortexujeme! 3. Centrifugujeme 5 10 min při 11 000 x g při pokojové teplotě. 4. Vložíme NucleoSpin Plasmid kolonu do 2 ml sběrné zkumavky a naneseme supernatant z bodu 3 na kolonu. Centrifugujeme 1 min při 11 000 x g. Odstraníme proteklý roztok. 5. Vložíme NucleoSpin Plasmid kolonu zpět do sběrné zkumavky a přidáme 600 l pufru A4. Centrifugujeme 1 min při 11 000 x g. Roztok prošlý kolonou odstraníme. 6. Abychom dostatečně vysušili membránu, na které je plasmidová DNA navázána, vložíme NucleoSpin Plasmid kolonu zpět do prázdné sběrné zkumavky a centrifugujeme další 2 min při 11 000 x g. Tento krok zabezpečí odstranění zbytků etanolu, který je součástí promývacího pufru A4. Etanol může inhibovat enzymatické reakce, ke kterým může být izolovaná DNA použita. 7. Vložíme NucleoSpin Plasmid kolonu do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky a přidáme 50 l pufru AE. Inkubujeme 1 min při pokojové teplotě. Centrifugujeme 1 min při 11 000 x g. Opakováním tohoto kroku můžeme dosáhnout zvýšení výtěžku o 15-20%. Eluce může být prováděna destilovanou vodou nebo TE pufrem.

- 24 -

- 25 - Kontrola čistoty a koncentrace izolované DNA Po izolaci DNA (plasmidové, chromozomální) je nutné zjistit její koncentraci a čistotu. Pro další aplikace izolovaných DNA je naprosto nezbytné zajistit, aby do reakcí (sekvenování, PCR apod.) bylo bráno alespoň přibližně stejné množství DNA. Rovněž izolované vzorky nesmějí být kontaminovány jinými molekulami, např. proteiny nebo látkami typu fenolů. Ke stanovení čistoty a druhu nukleové kyseliny ve vzorku se používá výpočet poměru hodnot absorbancí při 260 a 280nm. Nukleové kyseliny mají absorpční maximum při 260 nm, absorpční maximum proteinů a aromatických látek je kolem 280 nm. Pro přesné stanovení čistoty a koncentrace je třeba vzít v úvahu možný vliv pufrů s vysokou absorbancí, zákal vzorku, či použití kyvet se zúženou štěrbinou. Protože ani nukleové kyseliny ani proteiny neabsorbují při 320 nm, používá se tato vlnová délka pro kompenzaci vlivu absorbance pozadí. Index čistoty DNA je dán poměrem absorbancí při 260 a 280 nm, sníženým o rozptyl světla při 320 nm. Čistá DNA má tento poměr minimálně 1,8; čistá RNA 2,0. Hodnoty významně nižší signalizují přítomnost nečistot ve vzorku a nutnost dalšího přečištění. Také zvýšená absorbance při 230 nm může být způsobena nečistotami. Vlnová délka 230 nm je blízká absorpčnímu maximu peptidových vazeb, také Tris, EDTA a jiné pufry absorbují při této vlnové délce. Absorbance 260nm se používá pro kvantifikaci čistých nukleových kyselin: roztok s absorbancí 1,0 v kyvetě s optickou dráhou 10 mm odpovídá koncentraci 50 g/ml u dvouřetězcové DNA, 40 g/ml u ssdna a RNA, a 33 g/ml u oligonukleotidů (může se měnit v zavislosti na složení bází). U vzorků s příměsí proteinů lze přibližnou koncentraci vypočítat dle Warburgovy-Christianovy rovnice: C protein = (1552,0 *A 280 ) (757,3*A 260 ) C nukleová kys. = (62,9 *A 260 ) (36,0*A 280 )

- 26 - Příprava kompetentních buněk a transformace plasmidové DNA do bakterií Princip: V laboratoři často nastává situace, kdy je třeba rekombinantní DNA (většinou plasmid s ligovaným úsekem DNA) vpravit do bakteriálních buněk, kde se pomnoží. Bylo vypracováno několik technik, které se liší použitými pufry, způsobem přenosu DNA do buněk a v neposlední řadě i účinností. Nejčastěji používanou technikou je transformace. Ta vyžaduje tzv. kompetentní buňky (schopné přijmout cizorodou DNA), které se připravují inkubací bakteriálních buněk v přítomnosti např. vápenatých iontů při 0 C. Při tomto procesu se podstatně zvýší prostupnost buněčné stěny pro molekuly plasmidu. Po krátkém zahřátí na 42 C plasmidová DNA vstupuje do bakterií. Další metodou je elektroporace, při které je roztok, v němž jsou bakterie spolu s plasmidovou DNA, vystaven krátkému elektrickému impulsu o vysokém napětí. Impuls vytvoří v bakteriální stěně póry, kterými se DNA dostane dovnitř buněk. Materiál: - agarová plotna s narostlými koloniemi bakteriálního kmene, který chceme použít k transformaci - plasmidová DNA - 0,1 M CaCl 2 - MgCl 2 -CaCl 2 (80 mm MgCl 2, 20 mm CaCl 2 ) - LB médium (případně SOB) - SOC médium - agarové plotny s SOB médiem, 20 mm MgSO 4, selekčním antibiotikem - centrifuga - sterilní polypropylenové kyvety 50 ml - sterilní mikrozkumavky - vodní lázeň 42 C - termostat 37 C - pipety - rukavice - sterilní špičky Pracovní postup: a) příprava kompetentních buněk kalciovou metodou 1) Z agarové plotny setřeme oddělenou, dobře narostlou kolonii a přeneseme ji do 100 ml LB média. Inkubujeme kulturu při 37 C do dobu 2-3 hodin za intenzivního třepání. Nádoba, ve které kultivace probíhá, má mít objem minimálně 5 x větší než je objem média. 2) Přelijeme bakteriální kulturu do sterilních vychlazených 50 ml polypropylenových zkumavek. Uložením kultury do ledové lázně na 10 minut ji vychladíme na 0 C. 3) Centrifugací při 4000 rpm při 4 C po dobu 10 minut shromáždíme bakteriální buňky na dně centrifugační kyvety. 4) Opatrně slijeme supernatant. Postavíme kyvety dnem vzhůru na filtrační papír nebo buničinu a necháme je v této poloze 1 minutu, abychom se zbavili posledních zbytků kultivačního média.

- 27-5) Bakterie v každé 50 ml kyvetě resuspendujeme jemným třepáním v 30 ml vychlazeného (0 C) roztoku MgCl 2 -CaCl 2. 6) Zkumavky vložíme na 10 minut do ledové lázně. 7) Centrifugujeme při 4000 rpm, 4 C, po dobu 10 minut. 8) Slijeme supernatant z kyvet. Obrátíme zkumavky dnem vzhůru a postavíme je na filtrační papír nebo buničinu. V této poloze je necháme 1 minutu, aby vytekly zbytky supernatantu. 9) Pelet v každé kyvetě resuspendujeme ve 2 ml 0,1 M CaCl 2 vychlazeného v ledové lázni. 10) Bakterie v CaCl 2 rozdělíme po 50-200 l do sterilních mikrozkumavek. Jednotlivé alikvoty můžeme použít přímo k transformaci nebo je můžeme zamrazit na 70 C. Pokud s buňkami nemůžeme pracovat ihned, můžeme je v tomto stadiu 1-2 dny uchovávat při 4 C. Účinnost transformace u těchto buněk během 12-24 hodin vzroste 4-6 x, potom se vrací na svou původní hodnotu. b) transformace bakterií plasmidovou DNA 1) K 200 l kompetentních buněk ve vychlazeném 0,1 M CaCl 2 přidáme DNA (maximálně 50 ng v objemu 10 l nebo menším). Jemně zamícháme a inkubujeme 30 minut v ledu. 2) Přeneseme zkumavky do vodní lázně temperované na 42 C. Ponecháme je v lázni přesně 90 sekund. Pozn.: Teplotní šok je kritický krok celého postupu. Pro účinnou transformaci je třeba dodržet co možná přesně teplotu i čas. Při kratších časech je účinnost transformace snížená, při delších časech nastává odumírání bakterií. 3) Rychle přeneseme zkumavky zpět do ledové lázně na 1-2 minuty. 4) Do každé mikrozkumavky přidáme 800 l SOB média. Vzorky inkubujeme 45 minut při 37 C, abychom bakteriím umožnili se vzpamatovat a obnovit svou bakteriální stěnu. 5) Na agarovou plotnu obsahující SOB médium s 20 mm MgCl 2 a antibiotikem, proti němuž transformované bakterie získaly resistenci, vysejeme 100-200 l buněčné suspenze. Kulturu pomocí sterilní, zahnuté skleněné tyčinky rovnoměrně rozetřeme po celém povrchu plotny. 6) Plotny ponecháme při pokojové teplotě, dokud není veškerá kapalina absorbována. 7) Obrátíme plotny dnem vzhůru a inkubujeme při 37 C. Kolonie transformovaných bakterií se objeví za 12-16 hodin. Pozn.: Jak příprava kompetentních buněk, tak transformace musí probíhat sterilním způsobem, aby nedošlo ke kontaminaci.

- 28 - Štěpení plasmidové DNA restrikčními endonukleázami, sestavení restrikční mapy Princip: Prudký rozvoj metod molekulární biologie přímo souvisí s objevem restrikčních endonukleáz, které umožňují sekvenčně specifickou fragmentaci DNA. Restrikční endonukleázy jsou součástí tzv. restrikčně modifikačních mechanismů bakterií. Tento systém je zajišťován dvěma druhy enzymových aktivit metylační a restrikční. Enzymy s metylační aktivitou specificky modifikují (metylují) vlastní buněčnou DNA, čímž ji chrání před degradací restrikčními enzymy. Restrikční endonukleázy jsou bakteriemi využívány ke štěpení cizorodé DNA, která není v příslušných sekvencích metylována. Pro účely klonování v molekulární biologii se proto zpravidla používají buňky zbavené restrikční aktivity. Restrikční endonukleázy rozpoznávají krátké sekvence dvouřetězcové DNA a štěpí ji ve specifických místech nebo poblíž nich. Jsou známy tři typy restrikčních endonukleáz. Typy I. a III. třídy vykazují zároveň modifikační i ATP dependentní restrikční aktivitu. Enzymy skupiny I. se vážou na specifickou rozpoznávací sekvenci, ale štěpí DNA v nedefinované oblasti mimo rozpoznávanou sekvenci. Enzymy této skupiny nemají praktické využití při genových manipulacích. Uplatnění nenašly ani enzymy III. skupiny, neboť ke štěpení DNA dochází opět mimo rozpoznávací oblast. Nejvhodnější pro využití v molekulární biologii jsou enzymy II. skupiny, které nevyžadují ATP, jsou striktně specifické a rozpoznávají tzv. palindromové sekvence, tj. dvouvláknové úseky DNA, které mají v obou vláknech opačně orientovanou sekvenci bází. Délka těchto rozpoznávacích sekvencí se pohybuje nejčastěji mezi 4 6 páry bází, existují ale restrikční endonukleázy rozpoznávající sekvence o 15 párech bází. Tento parametr je rozhodující pro četnost, se kterou enzym bude štěpit molekulu DNA. Volbou restrikční endonukleázy lze tedy ovlivnit délku vznikajících úseků. Enzymy II. skupiny lze dále rozdělit podle způsobu, jakým DNA štěpí, na tři podskupiny: a/ poskytující jednovláknové úseky na 5 koncích EcoRI 5...GAATTC...3 5...G3 5 AATTC...3 3...CTTAAG...5 3...CTTAA5 3 G...5 b/ poskytující jednovláknové úseky na 3 koncích PvuI 5...CGATCG...3 5...CGAT3 5 CG...3 3...GCTAGC...5 3...GC5 3 TAGC...5

- 29 - c/ poskytující tupé konce StuI 5...AGGCCT...3 5...AGC3 5 CCT...3 3...TCCGGA...5 3...TCC5 3 GGA...5 Materiál a chemikálie: - Plasmidová DNA - Restrikční endonukleázy + pufry - 96% a 80% etanol (-20 C) - 3 M octan sodný ph 5,0 - Hlubokomrazící box 80 C - Stolní centrifuga - Pipety, špičky - Rukavice - Mikrozkumavky 1,5 ml - Vortex - Aparatura pro agarosový gel - Agarosa - Termostat na 37 C - Elektroforetický pufr (TAE, TBE) - Zdroj napětí - Ethidiumbromid (1 g/ml) - Dokumentační systém Pracovní postup: 1) Připravíme si sadu označených mikrozkumavek. Do nich podle pokynů vedoucího cvičení napipetujeme vzorky jedné z variant uvedených v tabulce. Při přípravě vzorků pipetujeme podle následujícího schématu DNA, pufr, destilovanou vodu a restrikční endonukleázu, v případě dvojnásobných štěpení první enzym. DNA (1 g) 4-5 l pufr (10 x koncentrovaný) 2 l restrikční endonukleáza (2-3 U) 1 l destilovaná voda do 20 l Vzorky zamícháme a vložíme do termostatu na 37 C. Necháme inkubovat 30 minut Číslo vzorku 1 2 3 4 5 6 skupina Použité restrikční endonukleázy A EcoRI ScaI BglI EcoRI + ScaI EcoRI + BglI ScaI + BglI B BamHI XmnI PvuII BamHI + XmnI BamHI + PvuII XmnI + PvuII C EcoRI SmaI AvaII EcoRI + SmaI EcoRI + AvaII SmaI + AvaII

- 30 -. D HindIII ScaI RsaI HindIII + ScaI HindIII + RsaI ScaI + RsaI 2) Ke vzorkům přidáme 2 l 3 M octanu sodného, ph 5.0, zamícháme a přidáme 70 l vychlazeného 96% etanolu. Zamícháme a necháme 10 minut při -80 C. 3) Vzorky centrifugujeme při 14 000 x g po dobu 10 minut. Slijeme supernatant a k peletu DNA přidáme 500 l vychlazeného (-20 C) 80% etanolu. Zamícháme a centrifugujeme 10 minut při 14 000 x g. Odebereme supernatant a zkumavky s vysráženou a promytou plastidovou DNA vložíme do exsikátoru a sušíme 5-10 za sníženého tlaku. 4) Vysušenou DNA rozpustíme v 17 l destilované vody, přidáme pufr pro druhou restriktázu (2 l), restrikční endonukleázu (2-3 U, tj. 1 l) a necháme inkubovat při 37 C po dobu 30 minut. (U vzorků štěpených pouze jedním enzymem rozpustíme DNA ve 20 l TE pufru, ph 8.0. Vzorky necháme při laboratorní teplotě do doby než je společně s ostatními vzorky naneseme na agarosový gel.) 5) Během inkubace si připravíme 100 ml 1% agarosový gel v 1 x TAE pufru (100 ml) a 500 ml 1 x TAE pufru. 6) Ke vzorkům přidáme 4 l 6 x koncentrovaného nanášecího pufru a nanášíme na agarosový gel. 7) Elektroforézu provádíme při 80 V po dobu 60 minut. Gel vyjmeme z aparatury, vložíme do roztoku ethidiumbromidu (1 g/ml) a necháme 15 minut barvit. Poté gel vyjmeme a zobrazíme pod UV světlem. POZOR!!! S roztokem ethidiumbromidu a gely, které jsou jím obarveny manipulujeme zásadně v rukavicích!!! 8) Na gelu porovnáme mobilitu jednotlivých fragmentů s velikostí fragmentů markerové DNA a odhadneme velikost fragmentů získaných restrikčním štěpením. Z počtu získaných fragmentů zjistíme, kolik rozpoznávacích míst pro jednotlivé restrikční endonukleázy plasmidová DNA obsahuje, a pokusíme se určit jejich vzájemnou polohu. Výsledkem je restrikční mapa plasmidové molekuly DNA. 9) Výsledky porovnáme s teoretickými hodnotami, získanými ze známých restrikčních míst v plasmidu pbluescript II SK(-) a jeho délky (2961 pb): a. AvaII 2184, 2406 b. BamHI 719 c. BglI 466, 2160 d. EcoRI 701 e. HindIII 689 f. PvuII 529, 977 g. RsaI 654, 2525 h. ScaI 2526 i. SmaI 713 j. XmnI 2645

- 31 - Současné štěpení DNA dvěma nebo více restriktázami Princip: Při štěpení DNA restrikčními endonukleázami lze v některých případech použít více restriktáz současně. Tento postup šetří čas a také odpadá riziko ztráty DNA při nedokonalém přesrážení vzorku. Při zvažování, zda můžeme štěpit zároveň více restriktázami, je nezbytné porovnat prostředí, v nichž jsou dané restriktázy aktivní. Jako každé enzymy, i restrikční endonukleázy vyžadují pro svou aktivitu optimální ph, přítomnost iontů (obvykle Mg2+) a iontovou sílu. Většina restrikčních endonukleáz má optimální teplotu štěpení 37 C, ale najdou se i takové, u nichž je optimální teplota nižší (30 C) nebo naopak vyšší (50-65 C) Všechny tyto parametry musíme důkladně prozkoumat než se rozhodneme pro současné štěpení. BglI: 50 mm Tris-HCl (ph 7,5 při 37 C), 10 mm MgCl 2, 100 mm NaCl, 0,1 mg/ml BSA; 37 C. EcoRI: 50 mm Tris-HCl (ph 7,5 při 37 C), 10 mm MgCl 2, 100 mm NaCl, 0,02% Triton X- 100, 0,1 mg/ml BSA; 37 C. ScaI: 50 mm Tris-HCl (ph 7,5 při 37 C), 10 mm MgCl 2, 100 mm NaCl, 1 mm DTT; 37 C. Porovnáním reakčních pufrů dospějeme k závěru, že u uvedených enzymmů lze provést současné štěpení. Pro jednotlivé kombinace jsme vybrali: EcoRI + ScaI: pufr pro ScaI ScaI + BglI: pufr pro ScaI BglI + EcoRI: pufr pro BglI Při rozhodování, který z pufrů vybrat hraje roli stabilita enzymu, jeho cena. Užitečným vodítkem při volbě pufru jsou tabulky v katalozích firem dodávajících enzymy. Z tabulek lze vyčíst, které kombinace restriktáz jsou možné a jaký pufr je pro danou kombinaci vhodný.

- 32 -

- 33 -

- 34 - Pracovní postup: 1) Připravíme si sadu označených mikrozkumavek. Do nich podle níže uvedené tabulky napipetujeme DNA, vhodný pufr a uvedenou kombinaci restrikčních endonukleáz. Vzorky zamícháme a vložíme do termostatu na 37 C. Necháme inkubovat 60 minut Číslo vzorku (RE) 1-2 EcoRI 3 ScaI 4 BglI 5 EcoRI + ScaI 6 ScaI + BglI 7 EcoRI + BglI DNA 1 1 1 1 1 1 1 Pufr E 2 2 - - - - - Pufr S - - 2-2 2 - Pufr B - - - 2 - - 2 EcoRI - 5 - - 5-5 ScaI - - 5-5 5 - BglI - - - 5-5 5 H 2 O 17 12 12 12 7 7 7. 2) Během inkubace si připravíme 100 ml 1% agarosový gel v 1 x TAE pufru a 500 ml 1 x TAE pufru 3) Ke vzorkům přidáme 4 l 6 x koncentrovaného nanášecího pufru a nanášíme na agarosový gel. 4) Elektroforézu provádíme při 80 V po dobu 60 minut. Gel vyjmeme z aparatury, vložíme do roztoku ethidiumbromidu (1 g/ml) a necháme 15 minut barvit. Poté gel vyjmeme a zobrazíme pod UV světlem. POZOR!!! S roztokem ethidiumbromidu a gely, které jsou jím obarveny manipulujeme zásadně v rukavicích!!! 5) Na gelu porovnáme mobilitu jednotlivých fragmentů s velikostí fragmentů markerové DNA a odhadneme velikost fragmentů získaných restrikčním štěpením. Z počtu získaných fragmentů zjistíme, kolik rozpoznávacích míst pro jednotlivé restrikční endonukleázy plasmidová DNA obsahuje, a pokusíme se určit jejich vzájemnou polohu. Výsledkem je restrikční mapa plasmidové molekuly DNA. 6) Výsledky porovnáme s teoretickými hodnotami, získanými ze známých restrikčních míst v plasmidu pbluescript II SK(-) a jeho délky (2961 pb): a. BglI 466, 2160 b. EcoRI 701 c. ScaI 2526

- 35 - Obr.: Mapa plasmidu pbluscript II SK(-), který byl použit pro přípravu plasmidů řady ppgm vložením vazebné sekvence pro protein p53 do HindIII místa. 1 2 3 4 5 6 7 8 Obr.: Výsledek štěpení plasmidu pb II SK (-) restrikčními endonukleázami. 1. scdna; 2961 pb 2. pbs/ecori; lin. 2961 3. pbs/scai; lin. 2961 4. pbs/bgli; lin. 1267 a 1694 pb (2160 466 = 1694; 2961 1694 = 1267) 5. pbs/(ecori + ScaI); lin. 1136 a 1825 pb (2526 701 = 1825; 2961 1825 = 1136) 6. pbs/(bgli + ScaI); lin. 366, 901 a 1694 pb (2526 2160 = 366; 2160 466 = 1694; 2961 1694 366 = 901) 7. pbs/(bgli + EcoRI); lin. 235, 1267 a 1459 pb (701 466 = 235; 2160 701 = 1459; 2961 235 1459 = 1267) 8. Standardy: (odspodu nahoru) 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 pb.