MALDI-TOF MS typizace γ-proteobakterií Matrix-assisted assisted laser desorption/ionization time of flight MS (Karas a Hillenkamp, 1987) Andrea Vávrová, 4roč. Oddělení mikrobiologie MU Vedoucí DP: RNDr. Ludmila Tvrzová, PhD. Školitel: RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr. Analýza: Mgr. Ondrej Šedo, Ph.D. Tomáškovy dny mladých mikrobiologů, 7-9. června 2006
Pracoviště (1) Oddělení mikrobiologie, Přírodovědecká fakulta Masarykovy, Brno, Česká republika (2)Oddělení funkční genomiky a proteomiky, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno, Česká republika (3) Oddělení informačních technologií, Fakulta informatiky Masarykovy univerzity, Brno, Česká republika (4) Česká sbírka mikroorganismů, Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity, Brno, Česká republika
Hmotnostní spektrometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice Ionizační metoda tvoří ionty v plynné fázi Aplikace: Detekce a analýza MML biologického původu Identifikace proteinů, struktury, protein.interakcí Podmínka: látky musí tvořit ionty v plynné fázi Rychlá chemotaxonomie založená na detekci biomarkerů
Význam metody pro taxonomii Potřeba jasných a rychlých výsledků identifikace neznámých vzorků zařazení do rodů, druhů a kmenů Výhoda při rozlišení dvou chemotaxonomicky a genotypicky podobných druhů (Př: B.anthracis a B.cereus) Rod Pseudomonas : častý izolát klinického materiálu etiologické agens (NI, SI) geochemické cykly, biodegradace heterogenita a genetická proměnlivost v rámci rodu
1. Vzorek pro analýzu Příprava vzorku 2. Uchovávání glycerolové konzervy Sterilita Optimalizace metodiky (konstantní media) Přesné časové intervaly
MALDI destička nerezová ocel
Vzorky: ~ buňky Analýza MALDI - prostředí, klinika, potraviny a) celobuněčné preparáty b) lyzáty buněk ~jednotlivé izolované MML - NK, lipidy, peptidy Matrice acetonitril rozpouští proteiny Okyselení NMK (trifluoroctová k.) Standard (lysozym) Destička, N laser 337nm excitace UV
Matrice V nadbytku vzhledem ke vzorku neměly by spolu reagovat, velké proteiny potřebují více matrice Rozpustná ve stejném rozpouštědle jako vzorek důležité pro krystalizaci vzorku Musí absorbovat vlnovou délku záření laseru Musí být fotostabilní
Matrice : je výhodné užít této jednoduché složky se známou absorbcí světla jako primární cíl pro laser než přizpůsobovat vlnovou délku pro analyt - vzorek krystalizuje v její mřížce - brání štěpení vzorku, oddělí mlk - převádí ionizační energii laseru na molekuly vzorku (rozkladem na ionty ionizuje vzorek - *ionty v plynné fázi) = Deriváty kys.benzoové:(typy dle Mr analytu) CHCA α-cyano-4-hydroxyskořicová (do Mr 10tis Da) SA sinapinová SDHB gentisová (pro VML) okyselení vyladí šum, potlačení salinity
Nanášení a analýza vzorku Matrice (SDHB, voda:acetonitril 1:1) + vzorek, standard Zaschnutí na vzduchu Technika charakterizuje biomarker poměrem Mm/Q částice, měření délky letu - ionty putují oblastí bez pole 1-3 metry (menší dorazí dříve) Měří se výskyt a intenzita signálu Pozitivní a negativní iontová analýza ( + a mod) Kombinovatelná technika Schéma metody MALDI TOF
Princip metody Energie laseru je aborbována organickou matricí Ionizace molekul Výsledky mnohonásobných laserových pulsů (až 150) jsou sbírány a převedeny z TOF měření na Mr/Q hodnoty Zobrazení jako spektrum ionizovatelných částic bakteriálních povrchů
Výstupní spektrum význam píků = hmotnostní spektrum = záznam četnosti iontů (3 jamky, 7 spotů, 100-150150 výstřelů) 90% signálů 500 Da - 10tis Da,, 1 pík = ± 5Da Výška píku = intenzita proteinu v místě odtřelu (relativní hustota proteinu, proto ne kvantitativ. metoda) Závisí na ionizačním chování vzorku struktura, výskyt konjugovaných systémů (protonové pasti)
Vliv experimentálních podmínek na analýzu Kultivační media a stáří kultury Vliv matrice, kyselin a rozpouštědel Koncentrace analytu vnitřní kontrola Obsah kovů, solí, látek s konjugovaným systémem vazeb
Optimalizace A testy reprodukovatelnosti u sbírkových kultur: V rámci jedné kultivace: Hustota vzorku Test konzervačních vlastností acetonitrilu alikvoty: vliv délky zamražení, nezamražení Test typu použité matrice výsledky dle Mr proteinů Test okyselení matrice Test náhodnosti různé umístění na desce Test oživení vzorku V rámci více kultivací reprodukovatelnost spekter Cíl: Zisk reprodukovatelných spekter s dostatečnou citlivostí detekce metoda odliší skupiny (groups) a druhy.
Cíle Ověřit diferenciační hodnotu MALDI pro bakterie rodu Pseudomonas Pomocí optimalizace metody na sbírkových kulturách rodu (typové a další izoláty) Výsledky : reprodukovatelná spektra -z různých kultivací za stejných podmínek --- stejná spektra charakteristické píky rodu pro skupiny (groups) a druhy odlišnosti mezi kmeny autentizace identifikace
Pseudomonas groups
Srovnání v rámci rodu Pseudomonas a.i. 1600 1400 P. chlororaphis CCM 1975 T 1200 1000 P. fragi CCM 1974 800 P.aeruginosa CCM 1960 T 600 400 P. fluorescens CCM 2115 T 200 0 P. putida CCM 7156 T 6000 8000 10000 12000 14000 m/z
Srovnání spekter uvnitř druhu P.aeruginosa CCM 1961, CCM 1959, CCM 1960 a.i. P. aeruginosa 1000 800 CCM 1961 600 CCM 1959 400 200 CCM 1960 0 6000 8000 10000 12000 14000 m/z
a.i. Srovnání spekter uvnitř druhu Pseudomonas putida CCM 3656, CCM 7156 T, CCM 1977 P. putida 1000 800 CCM 3656 600 CCM 7156 400 200 CCM 1977 0 6000 8000 10000 12000 14000 m/z
Chlororaphis group P. taetrolens, P.fragi, P.lundensis, P. chlororaphis a.i. 1600 Chlororaphis group 1400 CCM 1982 T 1200 1000 CCM 1974 800 600 CCM 3503 T 400 200 CCM 1975 T 0 6000 8000 10000 12000 14000 m/z
Fluorescens group P. fluorescens, P. rhodesiae a.i. 900 800 700 600 500 CCM 2115 T CCM 2115 400 300 200 100 CCM 4734 0 6000 8000 10000 12000 14000 m/z
Stutzeri group P. luteola, P. balearica, P. stutzeri a.i. Stutzeri group 900 800 700 CCM 4558 600 500 400 CCM 4563 T 300 200 100 CCM 2896 0 5000 7000 9000 11000 13000 m/z
Aeruginosa group typové kultury : P. mendocina, a.i. P. pseudoalcaligenes, P. alcaligenes, P. aeruginosa 1400 1200 CCM 3590 T 1000 800 CCM 3467 T 600 400 CCM 2655 T 200 CCM 1960 T 0 6000 8000 10000 12000 14000 m/z
Aeruginosa group typové kultury : P. mendocina, a.i. P. pseudoalcaligenes, P. alcaligenes, P. aeruginosa 1400 1200 CCM 3590 T 1000 800 CCM 3467 T 600 400 CCM 2655 T 200 CCM 1960 T 0 6000 8000 10000 12000 14000 m/z
Otázky Práce se spektry výskyt a kvalita píku? Je možné odlišit kmeny? Do jaké míry se liší mezi sebou jednotlivé kmeny jednoho druhu a do jaké míry příbuzné druhy? Proto: klastrování spekter pravděpodobnosti Software vstupní bod pro databázi
Závěr Optimalizace metody (jedna kultivace) na sbírkových kmenech pro identifikaci izolátů Zisk reprodukovatelných spekter z různých kultivací za stejných pomínek stejné výstupy Software: všechny druhy jsou navzájem odlišitelné (dominantní píky) a navíc se liší i v rámci kmenů, rozdíly mezi kmeny nezařadí jeden druh do jiného (Př: P. fluorescens asi 25 kmenů)
Výhody Srovnání s biochem., fenotypizač. a metodami MB: Vysoká rychlost a jednoduchá příprava vzorku Nízký objem vzorku Vysoká kapacita detekce, možnost nastavení rozsahu Mr (snížením rozpětí zvýšíme podíl signál/šum) Vysoce reprodukovatelný výstup Šetření chemikáliemi Široké spektrum analytů Rychle vyvíjející se metodika tvorby databází Možnost srovnání s informacemi sekvencování genomu, proteinů Analýza nekultivovatelných mikroorganismů
Cíle Stanovit MS profil vybraných skupin γ-proteobakterií Shodnotit reprodukovatelnost spekter v rámci jedné a více kultivací Optimalizace metodiky na sbírkových kulturách Vyhledat druhově a rodově specifické markery pro taxonom.diferenciaci Tvorba proteinové databáze rodu Pseudomonas
Poděkování Mé poděkování patří RNDr. Ludmile Tvrzové, PhD. za odborné vedení a poskytnutí podkladů pro diplomovou práci RNDr. Zbyňku Zdráhalovi, Dr. a Mgr. Ondřeji Šedo, Ph.D. za analýzy vzorků
Děkuji za pozornost