LABORATOŘ OBORU Výroba léčiv Ústav organické technologie (111) Testování pevných lékových forem: Zkouška disoluce Vedoucí práce: Ing. Diem Trang Tran Doc. Ing. Petr Zámostný, PhD. Umístění práce: S25b
Úvod Klíčovým aspektem při vývoji perorální lékové formy je zajištění dostatečné biodostupnosti léčivé látky. Ta může být u pevných lékových forem určena rychlostí uvolňování léčivé látky z lékové formy, která se zkouší in vitro tzv. zkouškou disoluce. Požadavky na zkoušku disoluce, včetně popisu aparatury, provádění a vyhodnocování výsledků jsou uvedeny v českém, evropském i americkém lékopise. Podle lékopisu se tuhé lékové perorální lékové formy dělí pro potřeby zkoušky disoluce na lékové formy s běžným uvolňováním, lékové formy s prodlouženým uvolňováním a lékové formy se zpožděným uvolňováním. Jednotlivé lékové formy se mezi sebou liší jak v provádění zkoušky disoluce, kdy je či není nutná změna disolučního média v průběhu zkoušky, tak v následném vyhodnocení. První skupina lékových forem musí splnit pouze jednu podmínku, tj. uvolnit minimální předepsané množství léčivé látky v požadovaném časovém intervalu. Lékové formy zbylých dvou skupin musí splnit minimálně 2 limity nebo se u nich hodnotí celá disoluční křivka. Cílem této práce bude provedení zkoušky disoluce tablet obsahujících ibuprofen. Úkoly 1. Seznamte se s kapitolou Zkouška disoluce pevných lékových forem v Českém lékopise 2009, Doplněk 2012. 1 2. Na základě vizuálního hodnocení chování částic rozpadlé lékové formy stanovte optimální rychlost otáčení míchadla. 3. Proveďte zkoušku disoluce zadané lékové formy ibuprofenu ve dvou disolučních médiích, z nichž jedno napodobuje prostředí žaludku (ph = 1,2) a druhé o ph 7,2 simulující další části trávicího traktu. Pro každé disoluční médium provádějte zkoušku paralelně v šesti disolučních nádobách. Pro obě zkoušky použijte vždy dvě trojice tablet od různých výrobců. 4. Sledujte vizuálně průběh zkoušky a diskutujte rozdíly v rychlosti rozpadu tablet, vzhledu lázně případně tvorbu bublin. 5. Zkonstruujte disoluční profily (závislost uvolněného množství na čase) všech vzorků a diskutujte rozdíly mezi oběma přípravky a vliv ph prostředí na uvolňování léčivé látky. Přístroje a postupy Příprava disolučních médií a disolučního přístroje: Zkouška disoluce se v rámci této práce bude provádět v disolučním přístroji Sotax AT7-smart v uspořádání s pádly (Obr. 1). Pozor! - Při práci s přístrojem smí jeho komponenty včetně disolučních nádob přijít do styku pouze s vodou a disolučním médiem. V žádném případě nesmí být vystaven působení organických rozpouštědel, včetně zředěného ethanolu, neboť hrozí znehodnocení polykarbonátových částí. 1 Český lékopis je k dispozici k prezenčnímu vypůjčení v Národní technické knihovně. Popřípadě kapitolu Zkouška disoluce pevných lékových forem naleznete na http://tresen.vscht.cz/kot/studium/studijni-materialy
Obr. 1: Disoluční přístroj K přípravě disolučních médií použijte degasovanou demineralizovanou vodu. Vodu nejprve ohřejte na cca 40 C a poté deaerujte v ultrazvukové lázni. Pokud to není z hlediska vytížení laboratoře možné, odplynění vody proveďte jejím převařením. Objem všech disolučních médií je 1000 ml. Disoluční médium A připravte rozpuštěním 6,8 g KH 2PO 4 a 0,9 NaOH v příslušném objemu deaerované demineralizované vody. Výsledný roztok má ph asi 7,2 a značnou iontovou sílu a tlumivou kapacitu. Disoluční médium B připravte upravením demineralizované vody na hodnotu ph = 1,2 pomocí přídavku HCl 36 % (ρ = 1,18 g.cm -3 ). Potřebné množství přidané HCl vypočtěte. 1. Do disolučního přístroje vložte disoluční nádobu a zajistěte ji pomocí trojice plastových držáků. 2. Pomocí odměrného válce odměřte potřebný objem demineralizované vody a převeďte do disoluční nádoby. 3. Přidejte potřebné množství HCl, KH 2PO 4 či NaOH tak, aby byl objem disolučního média v každé nádobě 1000ml/min. 4. Postupně takto umístěte všech sedm disolučních nádob. Sedmou nádobu naplňte pouze deaerovanou vodou. Tato nádoba bude použita ke stanovení optimální rychlosti otáčení míchadla. 5. Opatrně uzavřete víko disolučního přístroje tak, aby nedošlo k poškození disolučních nádob či teplotního čidla. 6. Vsuňte teplotní čidlo, zapněte disoluční přístroj a spusťte míchadlo a termostat. Následně specifikujte disoluční metodu. 2 7. Do otvorů ve víku disolučního přístroje vsuňte kanyly s PP filtrem a nasaďte na ně injekční stříkačky pro odběr vzorků. 2 Video-návod k obsluze přístroje a ke specifikování metody naleznete na http://tresen.vscht.cz/kot/studium/studijni-materialy nebo na http://youtu.be/wr_f2mzlbji
Stanovení optimální rychlosti otáčení míchadla 1. Do disoluční nádoby naplněné pouze deaerovanou vodou vložte pomocí táhla na pravé straně přístroje tabletu APO ibuprofenu, zapněte míchadlo a nastavte rychlost jeho otáčení na 150 ot./min. 2. Vyčkejte, až dojde k rozpadu tablety, poté vypněte míchadlo a nechte částice rozpadlé tablety dosednout na dno disoluční nádoby. 3. Nastavte rychlost otáčení míchadla na 30 ot./min., zapněte jej a pozorujte pohyb částic. 4. S odstupem 10 ot. /min postupně zvyšujte rychlost otáčení míchadla až do takové nejmenší hodnoty, kdy jsou právě všechny částice v pohybu, tzn. na dně disoluční nádoby není vytvořena stacionární kopička částic. Průběh zkoušky disoluce Samotná disoluční zkouška je velmi náročná na rychlé a správné provedení potřebných úkonů. Zkuste si proto vložení tablet a odběr první série naslepo (bez skutečného vložení tablety). 1. Disoluční zkouška se provádí ve více nádobách najednou. Vkládání tablet se provádí tak, že se tableta s předstihem připraví do barevně označeného dávkovacího otvoru a v určený čas se uvolní stiskem táhla na pravém okraji víka přístroje. 2. Vzorky odebírejte v časech 2, 5, 10, 15, 30, 45 minut pomocí PP stříkaček. 3. Změřte koncentraci ibuprofenu ve vzorcích pomocí UV spektrofotometrie. Příprava kalibračních roztoků Připravte 4 kalibrační roztoky tak, aby rovnoměrně pokrývaly rozsah měřených koncentrací. Za tímto účelem vypočtěte maximální možnou koncentraci ibuprofenu, která se může vyskytnout při disolučním testu. Tuto zvyšte o hodnotu 100 mg/l a vzniklý interval rozdělte na 4 stejné díly. Koncentrace kalibračních roztoků tak budou následující: c 1 = c max + 100 mg/l c 2 = c 1*3/4 mg/l c 3 = c 1*1/2 mg/l c 4 = c 1*1/4 mg/l Postup přípravy kalibračních roztoků je následující: 1. Jako rozpouštědlo vzorků použijte předem připravené disoluční médium A. 2. Navažte potřebné množství analytického standardu ibuprofenu do odměrných baňek 50 ml, naplňte disolučním médiem do cca 2/3, promíchejte krouživými pohyby a vložte na 15 minut do ultrazvukové lázně. 3. Doplňte baňky disolučním médiem po rysku, uzavřete a promíchejte. 4. Ověřte, zda došlo k úplnému rozpuštění látky.
Stanovení koncentrace léčivé látky ve vzorcích Obsah ibuprofenu ve vzorcích stanovte pomocí UV spektrofotometru Shimadzu UVmini 1240. (Obr. 2) Obr. 2: Spektrofotometr UV mini-1240 Uvedení přístroje do provozního režimu trvá několik minut, a proto jej proveďte v předstihu. Před započetím analýzy vzorků je třeba určit analytické podmínky a vytvořit kalibrační vztah mezi absorbancí a koncentrací. Vzorky je třeba analyzovat v křemenných kyvetách. Kyvety se umisťují do prostoru vzorku v levé části přístroje po otevření víka. Paprsek při čelním pohledu na přístroj prochází zprava doleva, a proto i čirá okénka kyvet musí být orientována v tomto směru. Po vložení kyvety do prostoru vzorku je třeba vždy víko uzavřít a teprve poté provádět měření. Kyvetu vždy vypláchněte nejméně dvakrát testovaným vzorkem a poté naplňte cca 0,5 cm pod horní okraj. 1. Před zapnutím přístroje vložte do prostoru vzorku kyvetu naplněnou cca 0,5 cm pod okraj demineralizovanou vodou. Pokud se vlhkost nebo nečistoty dostanou na vnější povrch kyvety, je třeba je otřít buničitou vatou a důkladně očistit okénka kyvety. 2. Přístroj zapněte síťovým vypínačem na zadní straně a nechte zinicializovat. Vyčkejte, dokud se na displeji nezobrazí řídící menu. Obr. 3: Řídící menu 3. Na klávesnici spektrofotometru stiskněte klávesu 2 pro volbu Spectrum. Dále znovu volbu 2 pro volbu λ range a zadejte číselný rozsah od 400 do 250 nm. Jednotlivé vlnové délky potvrďte klávesou ENTER.
Obr. 4: Volba Spectrum 4. Vložte do prostoru vzorku kyvetu naplněnou kalibračním roztokem o největší koncentraci analytu ve vzorku. 5. Změřte UV spektrum roztoku stisknutím tlačítka START Obr. 5: Měření UV spektra 6. Na vlnovém spektru najděte maximum. Pokud je hodnota absorbance tohoto maxima menší než 2, pak pro měření zvolte vlnovou délku tohoto maxima. Pokud je maximum větší, nebo nelze identifikovat, je roztok příliš koncentrovaný (neplatí Lambert-Beerův zákon) a je nutné provádět měření mimo maximum. Vyberte proto vhodnou vlnovou délku tak, aby absorbance roztoku c 1 byla v rozmezí 1 1,2. Tuto vlnovou délku si poznamenejte. 7. Na klávesnici spektrofotometru stiskněte opakovaně klávesu RETURN k návratu do hlavního menu. V případě dotazu potvrďte smazání naměřeného spektra OK. 8. Na klávesnici spektrofotometru stiskněte klávesu 1 pro volbu Photometric. Obr. 6: Volba Photometric
9. Na klávesnici spektrofotometru stiskněte klávesu Go to WL a poté zadejte zvolenou vlnovou délku pro měření. Tato vlnová délka by se měla zobrazit v horní části displeje. 10. Vložte do prostoru vzorku kyvetu naplněnou demineralizovanou vodou. 11. Na klávesnici spektrofotometru stiskněte klávesu Autozero. Absorbance indikovaná ve spodní části displeje by se měla nastavit na nulu. 12. Vložte do prostoru vzorku kyvetu naplněnou testovaným vzorkem, zavřete víko přístroje a odečtěte naměřenou hodnotu absorbance. 13. Nejprve proveďte slepý pokus, tj. změřte absorbanci čistého rozpouštědla, bez přítomnosti analytu. Poté změřte kalibrační roztoky a z hodnot jejich absorbancí a z absorbance při slepém pokusu sestrojte pětibodovou kalibrační křivku - závislost koncentrace na absorbanci. 14. Kalibrační závislost proložte přímkou, zhodnoťte její linearitu a zapište kalibrační rovnici ve tvaru c = k1 * A + k2. 15. Následně změřte absorbance vzorků odebraných při disoluční zkoušce a pomocí kalibrační křivky určete koncentraci ibuprofenu ve vzorcích, kterou pak vyneste do grafu jako časovou závislost. Náležitosti protokolu Hlavičku, stručně uvedené cíle práce, postup práce Kalibrační závislost, kalibrační rovnici, hodnocení linearity závislosti Popis vizuálního pozorování průběhu zkoušky Grafy disolučních profilů jednotlivých tablet nebo průměrných disolučních profilů jednotlivých vzorků. Diskusi opakovatelnosti stanovení profilu podle zvolené statistické charakteristiky variability Diskusi vlivu ph na uvolňování účinné látky Diskusi rozdílů v uvolňování obou přípravků na základě disolučních profilů a vizuálního pozorování Grafickou podobu protokolu upravte dle návodu pro vypracování protokolů laboratoří oboru