Mikroskopické metody SEM, TEM, AFM
Rozlišení v optické mikroskopii důvod pro vyvíjení nových technik omezení rozlišení světelné mikroskopie nejmenší vzdálenost dvou bodů, kterou ještě rozlišíme závisí na vlnové délce světla λ a indexu lomu n na vzduchu přibližně d min = 0,61λ, tj. asi 200 nm zvýšení rozlišení lze dosáhnout: snížením λ např. elektronová mikroskopie zvýšením n imerze (jen zanedbatelné) existuje ještě jeden způsob blízké pole uvedené vztahy platí pro vzdálenost d λ Bude-li d < λ, informace se nestihne rozmáznout a můžeme získat úplnou informaci o vzorku. Používá se ostrý hrot a skenování postupný sběr světelné informace lokálně po jednotlivých bodech.
Konstrukce Příprava vzorků Aplikace Transmisní elektronová mikroskopie vysoké urychlovací napětí 100 kv odpovídá d min = 2,35 pm (λ h 2meU )
Zdroje elektronů Transmisní elektronová mikroskopie Konstrukce Příprava vzorků Aplikace různé typy termoemisní zdroje wolframové vlákno 2 700 C LaB 6 2 100 C autoemisní zdroje (FEG) základní požadavky: jas, stálost, doba života, monochromatičnost
Zobrazovací soustava TEM Konstrukce Příprava vzorků Aplikace čočky elektrostatické nebo elektromagnetické čočky lze ovládat napětím či proudem nedokonalé prvky zkreslení (sférická, chromatická vada) citlivé na vnější magnetické pole
Další konstrukční části Konstrukce Příprava vzorků Aplikace držák vzorku posun v osách x, y a z rychlá výměna vzorku (předčerpání) clony zachycení mimoosových paprsků vakuový systém prostor katody: 10 5 10 7 Pa prostor preparátu: 10 5 Pa prostor záznamu obrazu: 10 3 Pa
Pozorování obrazu Konstrukce Příprava vzorků Aplikace luminiscenční stínítko fotografická emulze speciální kamery různé možnosti pozorování obraz je okamžitý
Příprava vzorků Transmisní elektronová mikroskopie Konstrukce Příprava vzorků Aplikace vzorek musí být průhledný pro elektrony (omezení tloušťky) uchycení na nosné mřížky (Cu) případný povlak (formvar, uhlík) vzorek musí oddolat vakuu
Příprava vzorků Transmisní elektronová mikroskopie Konstrukce Příprava vzorků Aplikace práškové vzorky dispergace ve vhodném médiu (voda, líh,... ), UZ nanesení na mřížku s povlakem vysušení biologické vzorky fixace konzervace struktury tkáně odvodnění nahrazení volné vody kontrastování biovzorky s nízkým Z mají malý kontrast zalití do bločku krájení ultratenkých řezů další vzorky zajištění vhodné tloušťky (odleptání, zpracování iontovým svazkem apod.) repliky vzorků pro jinak nezobrazitelné vzorky kontrast ovlivní: orientace krystalů, protonové číslo, hustota
Základní režimy Transmisní elektronová mikroskopie Konstrukce Příprava vzorků Aplikace zobrazení ve světlém poli aperturní clona ponechá pouze hlavní svazek zobrazení v temném poli aperturní clona se posune mimo osu soustavy prochází difraktované svazky zvýšení konstrastu krystalů difrakční obraz je nutno přeostřit projektiv na obrazovou ohniskovou rovinu lze posuzovat krystalickou strukturu Si
Informace z TEMu Konstrukce Příprava vzorků Aplikace laterální velikosti objektů morfologie vizualizace povrchových vrstev a modifikací určení fázového složení potvrzení krystalického/amorfního charakteru
Transmisní elektronová mikroskopie Konstrukce Příprava vzorků Aplikace Informace o rozměrech
Transmisní elektronová mikroskopie Konstrukce Příprava vzorků Aplikace Informace o morfologii
Transmisní elektronová mikroskopie Konstrukce Příprava vzorků Aplikace Zviditelnění struktur a objektů
Transmisní elektronová mikroskopie Konstrukce Příprava vzorků Aplikace Analýza atomární struktury
Konstrukce Aplikace detekce jiných než primárních elektronů (analogie mikroskopie v odraženém světle) obraz se sestavuje postupně (skenování) vzorek není prozářen najednou, ale jen bod po bodu typické napětí do 50 kv rozsah zvětšení od 5 do 1 000 000 rozlišení až 0,5 nm (typicky jednotky nm) obraz může mít prostorovou informaci při interakci svazku se vzorkem vzniká další záření
Konstrukce Aplikace Interakce elektronů se vzorkem interakce elektronů s energií E 0 vybudí různá záření sekundární elektrony excitované z vnějších slupek, 50 ev zpětně odražené elektrony energie cca 0,8E 0 Augerovy elektrony vyražené z vnitřních slupek rentgenové záření interakční objem závisí na Z, úhlu dopadu, energii E 0
Režimy detekce Transmisní elektronová mikroskopie Konstrukce Aplikace zpětně odražených elektronů topografický kontrast neobsahuje detaily (přímočarý pohyb) materiálový konstrast pro větší Z je signál silnější, mapování prvků magnetický kontrast doménové stěny, změna B ovlivní pohyb elektronů sekundárních elektronů pochází z hloubky max. 50 nm, vytváří je jak primární, tak zpětně odražené elektrony topografický kontrast je silný intenzita závisí na úhlu dopadu 1/ cos β napěťový kontrast malá energie vede ke snadnému ovlivnění, studium funkce IO rozlišení průměr svazku, typ interakce, stabilita vzorku doba měření sekundy až minuty
Konstrukce Transmisní elektronová mikroskopie Konstrukce Aplikace zdroj elektronů jako v TEM jiný typ zobrazovací soustavy: svazek je na vzorku zaostřen do jednoho bodu zařazení vychylovací soustavy generátor skenování synchronizace s monitorem (CRT) opět ve vakuu podstatným prvkem je detektor zvětšení Z = l obr l vz
Konstrukce Aplikace Detekce sekundárních elektronů požadavky: vysoká citlivost: signál cca na pa (10 6 10 9 e /s) široký dynamický rozsah (změna při přechodu mezi body až 1 : 100) účinnost: detektor registruje slabý signál v neideální pozici odolnost: detektor pracuje ve vakuu, světlo při výměně vzorku nejčastější konfigurace: scintilátor s vodivou folií na povrchu (potenciál 10 kv) světlovod (odvod signálu mimo vakuum) fotonásobič polovodičové detektory
Konstrukce Aplikace Everhart-Thornleyova konstrukce detektoru detekce sekundárních elektronů kladné napětí +400 V odsaje elektrony ze vzorku napětí 10 kv je urychlí před dopadem na scintilátor detekce zpětně odražených elektronů záporné napětí 100 V zbrzdí zpětně odražené elektrony a odpuzuje sekundární
Příprava vzorků Transmisní elektronová mikroskopie Konstrukce Aplikace požadavky na vzorky: minimální podíl cizorodých částic stabilita ve vakuu i pod elektronovým svazkem minimální efekt nabíjení maximální odvod tepla lze zkoumat i velké vzorky, není podmínka na tloušťku (polo)vodivé vzorky nevyžadují zvláštní zpracování pro nevodivé vzorky je třeba: je pokovit zobrazovat s nižším urychlovacím napětím (1 kv) použít environmentální SEM biologické vzorky připravit podobně jako pro TEM
Problémy při měření Konstrukce Aplikace nabíjení vzorku náboj odchyluje elektrony, dopadají na detektor a zahlcují ho pohyb volných částí vlivem nabíjení vhodná volba napětí: vysoké napětí zvyšuje rozlišení nízké napětí snižuje efekt nabíjení nedokonalost zobrazovací soustavy okolní vlivy vibrace, elektromagnetické pole
Aplikace v biologii Konstrukce Aplikace Pyl
Transmisní elektronová mikroskopie Konstrukce Aplikace Aplikace na částice
Historie Transmisní elektronová mikroskopie první návrhy Synge, 1928, světelný princip časově srovnatelné s EM, ale bez využití experimentální ověření jeho závěrů O Keefe, 1956, centimetrové vlny první mikroskop Young, Topografiner, 1972, elektrický princip první úspěšná realizace G. Binnig a H. Rohrer, 1981, tunelování STM nejvýznamnější metoda AFM, 1986
Charakteristické vlastnosti SPM trojrozměrný obraz až s atomárním rozlišením měření bod po bodu skenování působení lokálních interakcí, rozlišení nezávisí na λ sběr informace jednotky až stovky nm od vzorku citlivost na povrch vzorků měření jen upevněných vzorků měření v různých prostředích (vzduch, vakuum, kapaliny) necitlivost na chemickou podstatu prezentace v pseudobarvách
historicky první technika SPM využívá průchodu elektrického proudu mezi hrotem a vzorkem není kontakt dochází k tunelování elektronů pravděpodobnost tunelování E F Vzorek φ Vzorek d Vakuum Hrot Hrot E F P e 2 2m(E V) d v případě shodných kovů a nulového napětí je P = P po přiložení napětí V prochází měřitelný proud pa
Princip měření Transmisní elektronová mikroskopie využívá se skenování (bod po bodu), obraz se sestavuje postupně počítačem měří se proud režim s konstantní výškou ukládá se trojice (x, y, I) velice rychlý, velké změny proudu možnost poškození hrotu režim s konstantním proudem udržuje konstantní proud I 0 ukládá se trojice (x, y, z) pomalejší, vyžaduje zpětnou vazbu nepožaduje extrémně rovný povrch
Konstrukce STM mikroskopu hrot vodivý a ostrý drát, až jeden atom na špičce nejčastěji wolfram nebo Pt-Ir důležitým parametrem je koncový poloměr a čistota hrotu skener pohybové zařízení musí mít dobrou přesnost piezokeramický různé konstukční typy, často trubičkové detektor ampérmetr elektronika zdroj napětí, řídicí počítač pevná mechanická konstrukce tlumení vibrací
Skener Transmisní elektronová mikroskopie skener pohybové zařízení musí mít dobrou přesnost piezokeramický různé konstukční typy, často trubičkové velké rozlišení pohybu v ose z až 0,001 nm v osách x a y až 0,01 nm nutnost nezávislého pohybu ve všech třech osách rozsahy pohybu laterálně do 100 µm, vertikálně do 20 µm relativně pomalé 250 µm/s lze také na jiných principech
Aplikace STM Transmisní elektronová mikroskopie Si vzorek musí být (polo)vodivý HOPG
Problematika STM výsledek měření závisí na velikosti napětí závisí i na polaritě napětí důležité typicky pro polovodiče možnost tunelovací spektroskopie
využívá silového působení mezi atomy nevyžaduje vodivý vzorek měří ohnutí nosníku vlivem působících sil Nosník Síla kontaktní režim r 0 Vzdálenost Hrot bezkontaktní režim
Kontaktní režim Transmisní elektronová mikroskopie hrot je v přímém kontaktu se vzorkem nosník se ohýbá od povrchu nutná malá tuhost nosníku režimy měření režim s konstantní výškou velice rychlý vhodný pro vysoké rozlišení velké změny ohnutí, projev nelinearit nosníku možnost poškození hrotu režim s konstantním ohnutím pomalejší, vyžaduje zpětnou vazbu nepožaduje extrémně rovný povrch
Problémy kontaktního režimu kontakt hrotu se vzorkem může vést k poškození vzorku laterálním pohybem uvolnění vzorku deformaci vzorku přítlačnou silou poškození vrcholu hrotu (otupení) kontaminace hrotu v případě biologických vzorků statická detekce může být citlivější na některé rušivé vlivy (např. interference)
Dynamické režimy bez stálého kontaktu řešení problémů měření ve větší vzdálenosti slabé síly slabý signál dynamické režimy Síla kontaktní režim r 0 Vzdálenost bezkontaktní režim
Dynamické režimy bez stálého kontaktu řešení problémů měření ve větší vzdálenosti slabé síly slabý signál dynamické režimy nosník je nuceně rozkmitáván (piezokeramika) volný nosník má rezonanční frekvenci ω r = k m vlivem vzorku se mění rezonanční frekvence nosníku ( ) ω r keff k F = m = z ( r) ω 0 1 F z( r) m 2k registruje se změna stavu (A, f, φ) vlivem gradientu síly
Dynamické režimy bez stálého kontaktu detekce poklesu amplitudy A frekvence f bud je konstantní setpoint r = A A 0 velikost r určuje sílu interakce f 0 f bud A A0 f robustní technika s jednoduchou konstrukcí (oscilátor, lock-in detektor) obtížné získání informace o F z (mění se f 0 i A)
Bezkontaktní režim parametry režimu vzdálenost hrotu 10 nm využití přitažlivých sil amplituda kmitů je menší než vzdálenost hrotu ( 1 nm) síly pn nn interakci zprostředkovávají síly dlouhého dosahu (van der Waalsovy, elektrostatické apod.) chemické s krátkým dosahem v ideálním případě nedojde ke kontaktu se vzorkem nosník musí být hodně tuhý, aby nedošlo k zachycení ve vrstvě vody (energie 1 2 ka2 ) při malých amplitudách problémy s nestabilitou snadná linearizace teorie
Semikontaktní režim princip podobný jako u nekontaktního režimu kmitání na volné rezonanční frekvenci amplituda kmitů tak velká, že dochází k periodickému kontaktu hrotu se vzorkem velká amplituda zabraňuje zachycení hrotu působí i odpudivé interakce laterální posuv nezpůsobí poškození silná interakce může vést k deformaci povrchu složitější teorie než u bezkontaktního režimu Vzorek
Semikontaktní a bezkontaktní režim semikontaktní režim je citlivý i na lokální elastické vlastnosti může zobrazit i podpovrchové struktury silná interakce může deformovat povrch vzorku bezkontaktní režim může zobrazovat vodní vrstvu místo vzorku problémy se stabilitou při malých amplitudách
Způsoby měření Transmisní elektronová mikroskopie Obdobně jako v kontaktním režimu: s konstantní amplitudou využívá zpětnou vazbu ke změně výšky hrotu, uchovává trojici (x, y, z V piezo ) možnost měření chybového signálu běžný setpoint 50 % s konstantní výškou stálá výška hrotu, uchovává trojici typu (x, y, A )
Konstrukce AFM mikroskopu složitější elektronika (detekce) hrot nejčastěji je integrovaný s nosníkem materiály Si, Si 3 N 4, příp. opatřené vrstvou koncové poloměry 10 nm, lepší jen dalším zpracováním využití nanotrubiček potřeba detektoru ohnutí laserová páka Laser Detektor Zrcátko Skener Nosník Hrot
Příprava vzorků Transmisní elektronová mikroskopie pevné materiály jen vhodné rozměry a vyhovující pevnost, nelepivé, očištěné práškové materiály nutnost částice nanést na vhodný povrch volba roztoku (nejlépe voda) vliv podmínek vysoušení teplota, doba deformace částic na podložce dispergace částic, použití UZ selekce velikostí způsobem přípravy selekce výběrem místa měření (velké shluky obtížně měřitelné) možnost ovlivnění i upevněním (magnetické částice)
Podložky Transmisní elektronová mikroskopie je třeba velmi hladkých podložek nejčastěji sloupnutá slídová destička, sklo, Si lze použít chemickou fixaci (APTES, poly-l-lysin a další) drsnost vrstvy musí být znatelně menší než velikost částic vrstva nesmí ovlivňovat hrot
Aplikace AFM Transmisní elektronová mikroskopie griphywaldense Nanočástice Fe 2 O 3 Magnetospirillum
Monovrstvy částic latexu kalibrační kuličky 1,1 µm velmi snadno tvoří monovrstvy
Semikontaktní a kontaktní režim tkanina z nanovláken
Semikontaktní a kontaktní režim tkanina z nanovláken
Atomární a subatomární rozlišení Si 7 7, NC-AFM obrácené role vzorek HOPG, hrot W, vakuum, 4,2 K rozlišení 77 pm
Artefakty zobrazení prostorová konvoluce zkreslení vlivem konečné tloušťky hrotu ovlivňuje i výsledné rozlišení projeví se vznikem opakujících se struktur
Rozlišení AFM Transmisní elektronová mikroskopie schopnost atomárního rozlišení skutečné at. rozlišení v současnosti v nekontaktním režimu často jen atomární periodicita i rozlišení různých atomů zvětšení laterálních rozměrů
Srovnání EM a AFM trojrozměrné a dvojrozměrné zobrazení vertikální a laterální ohodnocení shlukování částic při přípravě, podložky velikost zobrazované plochy energie elektronového svazku interakce s hrotem rozdílnost atomárních zobrazení požadavky na vzorky a snadnost přípravy okolní prostředí, in-situ možnost měření dalších parametrů
Odvozené metody založené na STM skenovací kapacitní mikroskopie (SCM) teplotní skenovací mikroskopie (SThM) mikroskopie šumového napětí (SNM) založené na AFM mikroskopie laterálních sil (LFM) mikroskopie magnetických sil (MFM) mikroskopie modulovaných sil (FMM) vodivostní AFM (C-AFM) mikroskopie chemických sil
Mikroskopie laterálních sil vychází z AFM, detekuje zkrut nosníku je citlivá na laterální síly tření umožňuje materiálový kontrast nežádoucí projevy topografie ideální rovinný vzorek
Optická mikroskopie v blízkém poli řada měřicích režimů rozlišení 20 30 nm sondy z leptaných optických vláken