Technické a teoretické aspekty mikroskopie živé buňky Dalibor Štys Škola komplexních systémů Nové Hrady
Ţivé systémy jsou nejzjevnějším příkladem samoorganizující komplexních systémů a jsou zaloţené na chemo-mechanických jevech. Podobné problémy jsou řešeny při popisu samoorganizujících technických systémů jako jsou sítě, počítačové sémantické struktury apod. Společným problémem při jejich studiu je otázka jak měřit experimentálně pozorovatelnou samoorganizaci?
Systémová biologie Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita Současná systémová biologie se snaží kvantifikovat co nejvíce látek ve studovaném biologickém objektu. Biologické objekty ale nejsou pytlíky s chemikáliemi, mají svou trojrozměrnou strukturu. Struktura biologických objektů je udržována dynamickými ději. Biologické objekty jsou sobě podobné a Ljapunovovsky / asymptoticky (?) stabilní. Cílem mikroskopie ţivé buňky kvantitativního zobrazování - (z pohledu termodynamiky) je hledání makroskopických proměnných v chemomechanickém prostoru, které buňku nebo její části správně charakterizují. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Urban J., Vaněk J., Soukup J. and Štys D., Expertomica Metabolite Profiling: Getting more information from LC- MS using the stochastic systems theory approach, (2009) Bioinformatics 25, 2764-2767 Urban J, Hrouzek P. and Štys D., Time alignmnent in HPLC-MS 2012 Lambert Academic Publishing, ISBN: 979-3-659-13020-5
Mikroskopie ţivé buňky zvětšení 18 století 19 století Airy difrakční disk Abbe koncept kondenzoru, difrakční limit Koch barvení buněk 1934 Zernike Mikroskopie s fázovým kontrastem 1957 - Konfokální mikroskop mechanické omezení budícího svazku 1969 Reynolds - mikroskopie s videozesílením 1990 současnost: mnoho druhů mikroskopů se superrozlišením, zejména pro fluorescenčně značené vzorky 2012 Sub-mikroskop nanoskop pro neznačené ţivé buňky Mikroskopie ţivé buňky velikost pozorovaného pole Popis optického chování mikroskopu 1942 Nijboer Zernike integrál 1951 Toraldo di Francia optická mikroskopie nemá teoretický limit rozlišení Rozlišení 1990 současnost: teoretický popis optické mikroskopie se superrozlišením 2000 současnost: digitální kamery 2009 mikroskop jako informační kanál Mikroskopie mrtvé buňky 1590 Jansen 10x 1665 Hook 1820 Mikrotomie 1837 Purkyně 1900 Barvení 1931 Elektronový mikroskop 200000x zvětšení
Skutečná zobrazovací funkce mikroskopu - point spread function μm μm μm
Mikroskopie živé buňky Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita Mikroskopický experiment, konstrukce a funkce nového mikroskopu HeLa buňky hlavní model pro lidské tkáňové kultury
Skutečný záznam z primární kultury pacienta s rakovinu tlustého střeva Experimenty jsou dlouhodobé a vznikají tisíce obrázků, které se v současné době zpracovávají ručně. Prvotní motivací bylo automatické zpracování obrazu. Za praxe vyplynula nutnost pochopení vzniku mikroskopického obrazu nad rámec dostupných popisů a pochopení vzniku principiálních zákonistostí vzniku struktur uvnitř živé buňky.
Buněčný cyklus Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita Buněčný cyklus je nejzjevnější událost v životě buňky. Během ní se buňka rozdělí na dvě a více buněk. Předpokládá se, že počet dělení odráží stupeň integrace buňky do tkáně. Proto se počet dělení v čase používá, například, v akreditovaných laboratořích pro hodnocení biokompatibility a toxicity. Buněčný cyklus se skládá z fází stavů.
Software e-cell Dalibor Štys, School of Complex Systems FFPW USB Czech Republic Software: www.expertomica.eu/ software Manuální vyhodnocení vývoje buněk, anotační nástroj Expertomica Hela Cells 3.03 RC Expertomica Ecell Publikace: Levitner T, Timr S, Stys D., Expertomica Cells: analysis of cell monolayer development, (2010) Bioinformatics, 26, 278-279
Buněčné události pohled z hlediska obecné teorie systémů Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita Analýza dává jen malý počet dokončených buněčných cyklů je třeba zvětšit zorné pole a automatizovat analýzu. Levitner T, Timr S, Stys D., Expertomica Cells: analysis of cell monolayer development, (2010) Bioinformatics, 26, 278-279
Buněčné události pohled z hlediska obecné teorie systémů Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita Stochastické chování ţivé buňky není primárně způsobeno fluktuacemi popisovaným rovnováţnou termodynamikou Rozdělení pravděpodobností v chování živých systémů závisí na počtu signálů, které si buňky vymění Levitner T, Timr S, Stys D., Expertomica Cells: analysis of cell monolayer development, (2010) Bioinformatics, 26, 278-279
Mikroskopický experiment, konstrukce a funkce nového mikroskopu. Technické poţadavky na nový experimentální mikroskop - Snadné a rychlé zahájení experimentu za kontrolovaných podmínek teplota, vlhkost, CO 2 - Nízký celkový světelný výkon dopadající na buňku a odpovídající snímání kamerou - Skenování ve všech třech osách, kontrola pozice s přesností 1 pixel (cca 20 nm při 80x zvětšení) - Řízení založené na počítačové analýze obrazu Vypsali jsme veřejnou soutěţ v níţ zvítězilo konsorcium českých firem Compotech a Optax
Mikroskopie fázového kontrastu poskytuje informaci o celém obsahu buňky Image taken from Nikon http://www.microscopyu.com
Principy mikroskopie s videozesílením Mizushima, Y., (1980) Detectivity limit of very small objects by videoenhanced microscopy. Applied Optics, 27, 2587-2594 Mikroskopie s videozesílením je moderní variantou mikroskopie v temném poli Mizushima, Y., (1980) Image taken from Nikon http://www.microscopyu.com
Principy mikroskopie s videozesílením Image taken from Nikon http://www.microscopyu.com Van Haver S., The extended Nijboer Zernike Theory and its Applications, PhD. Thesis 2010 Výpočet zobrazení pozorovaného objektu (bod, jednoduchý tvar) v různé vzdálenosti od ohniska při různých vlastnostech (vadách) čočky Braat, Jansen a spol
Principy mikroskopie s videozesílením Lipson S.G., 2003. Why is super-resolution so inefficient? Micron 34, pp. 309-312 Při vysoké intenzitě světla velkém počtu současně dopadajících fotonů - má čočka vysoké teoretické rozlišení za zachování velkého zorného pole Lipson S.G., 2003 Image taken from Nikon http://www.microscopyu.com
Optické schéma nového mikroskopu
Reálné výsledky mikroskopie s videozesílením Závislost tvaru obrazu latexové kuličky o velikosti 0,22 μm v blízkosti ohniska na intenzitě světla. Prokázala se změna zobrazení v závislosti na zvýšení intenzity světla. 200 ma 500 ma 1000 ma 1500 ma 2000 ma 2500 ma 3000 ma 3500 ma 4000 ma
2000 ma Při zobrazování živé nebarvené buňky nehledáme nejvyšší rozlišení, ale nejlépe zpracovatelnou a reprezentativní informaci o dané buňce v daném čase. 200 ma
Pozorování živé, neznačené, buňky Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita Karusel s výměnou metod optického kontrastování Karusel pro výměnu barevných filtrů Sub-mikroskop - nanoskop Řízený zdroj světla vysoké intenzity založený na LED technologii Kamera s vysokou rychlostí snímání a ukládání neredukovaných dat (200 f/s, 2000x1100 bodů) Kamera s velkým počtem bodů na čipu (kinofilmová velikost), 4500x3000 bodů Optický stůl z kompozitních materiálů Stolek s přesným xy pohybem Karusel s automatizovanou výměnou objektivů a přesným z-pohybem Sejmuta po dobu testování byla plexisklová klimatizovaná skříň
Informační příspěvek bodu - point information gain (PIG, ΔI x,y,α ) počítáme pro kaţdý bod v obrazu ve třech barevných kanálech pomocí Rényiho entropie. Stys D., Urban J., Vanek J., Císar P. Analysis of biological time-lapse microscopic experiment from the point of view of the information theory. Micron. 2011a, 42, 360-365. Epub 2010 Feb 12. Stys, D., Vanek, J., Nahlik, T., Urban, J., Cisar, P.: The cell monolayer trajectory from the system state point of view. Mol. BioSyst. 7, 2824-2833 (2011)
2000mA
2000 ma
Nevyloučili jsme, že jsme schopni rozlišit objekty jejichž velikost je menší než nejmenší objekt, který jsme schopni promítat na kameru
No. of points No. of points Modely PIG pro různá alfa normální rozdělení No. of points No. of points
Stys D., Jizba P., Papacek S., Nahlik T., and Cisar P., On measurement of internal variables of komplex self-organized systems and their relation to multifractal spectra, 2012, IWSOS 2012, LCNS 7166, pp. 36-47, Kuipers and Heegaard eds. Springer: Heidelberg Dordrecht London New York, ISBN 978-3-642-28582-0 Entropie informačního příspěvku bodu Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita Existuje unikátní makroskopický (v termodynamickém smyslu) identifikátor obrazu buňky? Lze pro strukturované systémy zavést něco jako Gibbsova energie pro nestrukturované systémy? Zavedli jsme veličiny entropie informačního příspěvku bodu - point information gain entropy (PIE, ΔI α ) a hustota entropie informačního příspěvku bodu point - information gain entropy density (PIE/points, ΔI α.r ) Sada hodnot PIE nebo PIE/points je unikátním identifikátorem obrazu. Rényiho entropie je základem pro zobecněnou dimenzi, která charakterizuje multifraktální objekty jako jsou chaotické atraktory a jiné samoorganizující systémy.
Stavová trajektorie v prostoru PIE a PIE/points Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita V prostoru 3x13 souřadnic tvořených hodnotami PIE/points pro hodnoty parametru α = 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1; 1,3; 1,5; 1,7; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 jsme provedli multivariantní analýzu a analýzu klastrů Stys D., Jizba P., Papacek S., Nahlik T., and Cisar P., On measurement of internal variables of komplex self-organized systems and their relation to multifractal spectra, 2012, IWSOS 2012, LCNS 7166, pp. 36-47, Kuipers and Heegaard eds. Springer: Heidelberg Dordrecht London New York, ISBN 978-3-642-28582-0
Provedli jsme analýzu hlavní komponenty pro 39 hodnot PIE/point jako stavových proměnných a analýzu klastrů. Byli jsme schopni detekovat další tvary nad rámec expertní klasifikace.
Závislost PIE na alfa pro normální rozdělení 1,60E-02 1,40E-02 1,20E-02 1,00E-02 PIE /points 8,00E-03 6,00E-03 4,00E-03 2,00E-03 PIE 0,00E+00 0,00E+00 1,00E+00 2,00E+00 3,00E+00 4,00E+00-2,00E-03 α -4,00E-03
A model relevant to cellular metabolism: The Belousov Zhabotinsky reaction
Sémantická a syntaktická informace v statistice rozdělení bodu v obrazu
Konstrukce stavové trajektorie pomocí PCA sémantická informace PC-1 56.91% PC-2 79.47% PC-3 88.30% PC-4 91.68% PC-5 94.15%
Konstrukce stavové trajektorie s využitím sémantické informace PC-1 63.67% PC-2 92.83% PC-3 97.25% PC-4 98.09% PC-5 98.40%
A model relevant to cellular metabolism: The Belousov Zhabotinsky reaction Extraction of image statistics: TO BE ADDED cross statistics
Závislost kovariance jednotlivých PIE pro různá alfa s různými hlavními osami - celá trajektorie 0,31 PC1-red PC1-green PC1-blue 0,26 PC2-red PC2-green PC2-blue PC3-red PC3-green PC3-blue 0,21 0,16 0,11 0,06 0,01 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4-0,04
Klastrová analýzy trajektorie
Závislost kovariance PIE pro různá alfa s hlavními osami pro první klastr 0,4 PC1-red PC1-green 0,35 PC1-blue PC2-red PC2-green 0,3 PC2-blue PC3-red PC3-green 0,25 PC3-blue 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4-0,05
Typická rozdělení PIG pro různá alfa 0,4 PC1-blue PC2-blue 0,35 PC3-blue 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4
Rozdíly mezi syntaktickou a sémantickou informací
Porovnání záznamu z modrého kanálu a přepočtené obrazové entropie při α=1.3 1500 ma
Problémy automatické detekce stavů buňky Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita Momentální problémy pouţití PIG pro automatickou klasifikaci stavů buněk z časosběrné mikroskopie: Neexistuje dobrá metoda automatizace oddělení buňky od pozadí
Porovnání záznamu z modrého kanálu a přepočtené obrazové entropie při α=1.5 1500 ma
Porovnání záznamu z modrého kanálu a přepočtené obrazové entropie při α=1.5 1500 ma
Popis stavu buněčné kultury a) definice fenomenologických proměnných pro danou buňku - PIE ( V i,ϕ ) b) definice informačních vazeb mezibuněčné interakce a jejich klasifikace ( C i ) c) nalezení funkce rozdělení pravděpodobností buněčných osudů událostí ( P i ) Vytvoření stochastického modelu dynamiky ţivé buňky i, V i, i T, C PCS, C, P Zampa P., The principle of causality and new approach to system theory, In: Cybernetics and Systems, 2004, pp. 3-8, ISBN 3-85206-169-5 Ţampa P. 1996 Habilitační práce, Západočeská univerzita v Plzni
čas/min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 α 0,1 0,007784 0,008543 0,007637 0,006309 0,006456 0,004844 0,005356 0,005232 0,005515 0,006024 0,3 0,023004 0,025658 0,023764 0,020705 0,020699 0,016284 0,017431 0,016951 0,01772 0,019191 0,5 0,046907 0,048603 0,043681 0,040346 0,038172 0,036042 0,033144 0,047665 0,037972 0,032871 0,7 0,089456 0,088756 0,087721 0,080975 0,078754 0,073938 0,071601 0,071939 0,069289 0,075715 1 0,020834 0,019427 0,020502 0,019509 T 0,018838 0,019409 0,019982 0,018267 0,019018 0,021295 1,3-0,10248-0,09349-0,1066-0,10165-0,10081-0,10606-0,09438-0,09285-0,09188-0,09916 1,5-0,06185-0,05592-0,06646-0,06091-0,06161-0,07018-0,05881-0,05577-0,05913-0,06191 1,7-0,04437-0,0398-0,05034-0,04466-0,04667-0,05339-0,04339-0,04115-0,04473-0,04637 2-0,03083-0,02774-0,03854-0,03248-0,03538-0,04084-0,03178-0,03028-0,03414-0,03497 2,5-0,02085-0,01828-0,02986-0,02297-0,02655-0,03127-0,02285-0,02187-0,02627-0,02664 3-0,01666-0,01417-0,02631-0,01865-0,02203-0,02728-0,0188-0,01793-0,02311-0,02343 3,5-0,01501-0,01179-0,02476-0,01628-0,01969-0,02515-0,0167-0,01548-0,02162-0,02211 4-0,01405-0,01005-0,02409-0,01466-0,01818-0,02388-0,0152-0,01416-0,02108-0,02147 Popis stavu buněčné kultury Teorie stochastických systémů ilustrována pomocí skutečně naměřených hodnot PIE 3 T V3, 2 T V2,, V C, 1 1, C, C 2 PCS, C, P 3, C 4 T V4, 1 4 5 T V5, 6 T V6,, C 5, C 6 7 T V7, 8 T V,, C P 2 7 čas/min 11 12 13 14 α 0,1 0,007322 0,004967 0,004871 0,007328 0,3 0,02115 0,015351 0,016073 0,021476 0,5 0,040076 0,034655 0,040219 0,037749 0,7 0,071052 0,062796 0,065873 0,070482 1 0,0192 0,019045 0,020097 0,021095 1,3-0,08752-0,07945-0,08954-0,08488 1,5-0,0574-0,04789-0,0576-0,05347 1,7-0,0446-0,03537-0,04268-0,04114 2-0,03545-0,0259-0,03136-0,03241 2,5-0,02893-0,01836-0,02257-0,02625 čas/min 3-0,02629-0,01458 11-0,01849-0,02421 12 3,5 α -0,02517-0,01259-0,01645-0,0235 13 14 4-0,0245 0,1-0,01134 0,005785-0,0153 0,007466-0,02333 0,006564 0,007618 0,3 0,016517 0,021546 0,019756 0,022243 0,5 0,028229 0,037912 0,036982 0,042973 0,7 0,056585 0,070462 0,073581 0,078296 1 0,017672 0,02097 0,019865 0,0209 1,3-0,06593-0,07363-0,08415-0,09213 1,5-0,04369-0,04464-0,05179-0,06215 1,7-0,03216-0,03235-0,03766-0,0463 2-0,02341-0,02319-0,02718-0,03452 2,5-0,01649-0,01592-0,01916-0,02546 čas/min 11 3-0,01308 12 13-0,01244 14-0,01571-0,02116 α 3,5-0,01166-0,01066-0,01385-0,01908 0,1 0,00517 4 0,005563-0,01022 0,00561-0,00941 0,006116-0,01255-0,01794 0,3 0,017467 0,018111 0,017996 0,018702 0,5 0,032819 0,034549 0,036328 0,038578 0,7 0,075559 0,076319 0,073574 0,069814 1 0,02139 0,021874 0,02095 0,01915 8 8 1,3-0,0941-0,10996-0,08234-0,08504 1,5-0,05805-0,07646-0,04693-0,05246 1,7-0,04256-0,0598-0,03198-0,03886 2-0,03066-0,04764-0,02037-0,02877 2,5-0,02115-0,03886-0,01146-0,02113 3-0,01665-0,03538-0,00734-0,01776 3,5-0,01406-0,03429-0,00506-0,01613 4-0,01237-0,03413-0,00395-0,01503, C
Má využití hodnoty PIE/points oporu v teorii? Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita Existuje unikátní makroskopický (v termodynamickém smyslu) identifikátor obrazu buňky? Zle pro strukturované systémy zavést něco jako Gibbsova energie pro nestrukturované systémy? Zavedli jsme veličiny entropie informačního bodu - point information gain entropy (PIE) a hustota entropie informačního bodu point information gain entropy density (PIE/points) Sada hodnot PIE nebo PIE/points je unikátním identifikátorem obrazu. Rényiho entropie je základem pro zobecněnou dimenzi D α, která charakterizuje multifraktální objekty jako jsou chaotické atraktory a jiné samoorganizující systémy. Jako všechny dimenze, předpokládá se nalezení limity v přiblíţení k nulové délce měřítka r
Chaotický atraktor jako nástroj k diskuzi o vhodném modelu Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita Model samoorganizujícího systému Lorenzův atraktor Ortogonální proměnné v Lorenzově atraktoru jsou vztaženy ke konkrétnímu experimentu tzv. Bénardově cele. Jsou to: x celkový tok hmoty y rozdíl teplot horní a dolní plochy z maximální odchylka gradientu teploty od linearity Kaneko K. (2006). Life: An Introduction to Complex Systems Biology. Springer Grassberger,P., Procaccia,P.: Measuring the strangeness of strange attractors. Physica D 9, 189-208 (1983)
Chaotický atraktor jako nástroj k diskuzi o vhodném modelu Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita Měříme jeden bod, skupinu bodů, celou doménu atraktoru nebo celý atraktor. Jen v posledním případě můţeme rozumně interpretovat fraktální dimenzi.
Jaký by měl být tvar hlavní variety v ortogonálních souřadnicích získaných multivariantní analýzou?
Aktivity školy komplexních systémů ve vztahu k tématu Dalibor Štys, Škola komplexních systémů, Fakulta rybářství a ochrany vod, Jihočeská univerzita Škola komplexních systémů Laboratoř aplikované systémové biologie a Laboratoř tkáňových kultur Návrh a konstrukce přístrojů Software pro systémovou biologii Návrh a analýza experimentu Mezinárodní letní školy Jindřichův Hradec České Budějovice Technologie pro buněčnou biologii: Automatizovaná analýzy signálu LC-MS Analýza 2D gelů pro proteomiku Analýza buněčných osudů na základě teorie stochastických systémů Zesílení obrazu založené na výpočtu entropie a objektivní analýza buněčné trajektorie Sub-mikroskop, nanoskop
Poděkování studentům letních škol, kteří bývají sponzorováni řadou různých projektů strukturálních fondů EU
Děkuji všem spolupracovníkům, zejména Petrovi Císařovi, Petrovi Jizbovi, Vítěžslavu Březinovi, Janu Urbanovi, Jiřímu Soukupovi, Janu Vaňkovi, Tomáši Náhlíkovi, Tomáši Levitnerovi, Jindřichu Soukupovi, Karině Romanové, Anně Zhyrové, Štěpánu Papáčkovi a též Aliaxandru Pautsinovi, technikům z laboratoře Aplikované systémové biologie a Laboratoře tkáňových kultur ŠKS FROV JU a pracovníkům spolupracujících firem. Hlavní granty: Jihočeské centrum akvakultury a biodiverzity hydrocenóz CENAKVA (CZ.1.05/2.1.00/01.0024) EEA funds sub-projekt HTCFOOD (A/CZ0046/1/0008) Innovation 4 Welfare projekt sponzorovaný programem Interreg IVC Programme
Děkuji za laskavou pozornost