J09 Průkaz nukleové kyseliny VLLM0421c (jaro 2016)
Osnova využití a metody průkazu NK PCR a její modifikace proces prokazování specifické sekvence NK 2/55
Přímé vs. nepřímé metody přímé hledáme mikroba, jeho část či jeho produkt (produktem může být například nějaký bakteriální antigen či jed toxin) agens je přítomno nyní nepřímé hledáme protilátky protilátka není součástí ani produktem mikroba (produkt makroorganismu, odezvou na činnost mikroba) agens bylo přítomno někdy v minulosti 3/55
Přímé metody přehled Metoda Průkaz ve vzorku Identifikace kmene Mikroskopie ano ano Kultivace ano ano Biochemická identifikace ne ano Průkaz antigenu, toxinu ano ano Pokus na zvířeti ano v praxi ne Molekulární metody ano v praxi ne* *netýká se molekulární epidemiologie (sledování příbuznosti kmenů) 4/55
Využití průkazu nukleové kyseliny dg. bakteriálních i virových nákaz, když není možné (nebo velmi obtížné) použít jiné metody (mikroskopie, kultivace, ) bakterie: Mycobacterium tuberculosis (kultivace trvá týdny), Borrelia burgdorferi (dlouhá a složitá kultivace) viry: virové průjmy, virus vztekliny, virus hepatitidy B, enteroviry, viry chřipky, adenoviry, RS-virus, viry parainfluenzy, herpex simplex virus, virus příušnic pro běžné patogeny se příliš nehodí (velká citlivost) virologická vyšetření často epidemiologický nebo výzkumný cíl 5/55
Metody průkazu nukleové kyseliny bez amplifikace: genové sondy s amplifikací: PCR (polymerázová řetězová reakce), LCR (ligázová řetězová reakce), NASBA (nucleic acid sequence based amplification) PCR: 1983 vyvinuta (dr. Karry Mullis) 1985 použita termostabilní polymeráza reakce jak ji známe dnes (Taq polymeráza) 1993 Nobelova cena za chemii (Mullis, Smith) LCR vyvinuta v roce 1991 NASBA vyvinuta v roce 1991 6/55
Genové sondy proces hybridizace není přímo viditelný molekuly sondy značeny (digoxigenin, biotin, ) značky specificky rozpoznány konjugátem (konjugace s fluoroforem nebo enzymem pro zviditelnění reakce) 7/55
Polymerázová řetězová reakce templátová DNA primery ohraničující cílovou sekvenci polymeráza deoxynukleotidy pufr s hořečnatými ionty 8/55
Polymerázová řetězová reakce (2) cyklus: denaturace (oddělení vláken DNA) annealing (hybridizace primerů ke komplementární sekvenci DNA) elongace (prodlužování řetězce DNA polymerázou) 9/55
Polymerázová řetězová reakce (3) 10/55
Polymerázová řetězová reakce (4) klasická PCR: end-point analýza (po proběhnutí všech cyklů analýza produktů gelovou elektroforézou) real-time PCR: sledování amplifikačních produktů po každém proběhlém cyklu ( in real time ), nejčastěji používána kvantitativně (qpcr) reverzně transkripční PCR (RT-PCR): analýza RNA; samotné PCR předchází přepis RNA do cdna reverzní transkriptázou qrt-pcr (RT-qPCR): kvantitativní (real-time) reverzně transkripční PCR 11/55
Polymerázová řetězová reakce (5) qpcr: denaturace annealing elongace kvantifikace nespecifická fluorescenční barviva (SYBR Green) sekvenčně specifické sondy (oligonukleotidy s fluoroforem) TaqMan, FRET, Molecular beacon,... 12/55
Polymerázová řetězová reakce (6) hybridizační sondy (FRET) Fluorescence Resonance Energy Transfer 13/55
Polymerázová řetězová reakce (7) hydrolyzační sondy (TaqMan ) využívá 5 3 exonukleázové aktivity Taq DNA polymerázy ke štěpení sondy 14/55
Polymerázová řetězová reakce (8) průběh a kvantifikace qpcr 15/55
Polymerázová řetězová reakce (9) specifické PCR (specifický gen pro enzym, faktor patogenity apod.) multiplex PCR (několik specifických cílových míst v jedné reakci) univerzální (cílové místo je gen, který mají všechny bakterie, nejčastěji gen pro 16S rrna) nested PCR (dvě sady primerů použité ve dvou následujících PCR; omezuje vznik nespecifický produktů) 16/55
DNA microarray (DNA chip, gene chip, biochip) soubor různých krátkých vláken DNA (oligonukleotidů) přichycených na podkladu ve známých konkrétnách místech (spotech) v konkrétním místě je přichyceno více kopií stejného oligonukleotidu (sonda, próba, reportér) vzorek: DNA (stanovování genového profilu různých organismů, často i blízce příbuzných) RNA jako cdna (předchází krok RT-PCR) pro analýzu exprese cílové molekuly označeny flouroforem 17/55
DNA microarray (2) cílové molekuly hybridizují s komplementarními vlákny oligonukleotidů přichycenými k destičce promytí odplaví všechny neuchycené molekuly kvantifikace fluorescence v každém z míst (spotů) zpracování bioinformatickými postupy 18/55
DNA microarray (3) two-color microarrays nebo two-channel microarrays: využíváme jeden mikročip pro zpracování dvou rozdílných vzorků každý vzorek označen jiným fluoroforem nejčastěji zelená a červená obyčejně pro porovnání genové exprese pracujeme s cdna (původně RNA) vzorky smíchány hybridizaze promytí detekce zelená/červená: gen exprimován pouze v jednom ze vzorků žlutá: gen exprimován v obou vzorcích 19/55
DNA microarray (3) two-color microarrays nebo two-channel microarrays: využíváme jeden mikročip pro zpracování dvou rozdílných vzorků každý vzorek označen jiným fluoroforem nejčastěji zelená a červená obyčejně pro porovnání genové exprese pracujeme s cdna (původně RNA) vzorky smíchány hybridizaze promytí detekce zelená/červená: gen exprimován pouze v jednom ze vzorků žlutá: gen exprimován v obou vzorcích 20/55
DNA microarray (3) 21/55
Ligázová řetězová reakce amplifikace DNA pomocí dvou těsně sousedících sond a ligázy dvě sondy a ligáza vytváří specifičtější primer pro následnou PCR (tento krok není nutný) specifičtější, detekce SNP Wiedmann, M et al. (1994) Ligase chain reaction (LCR) -- Overview and applications. PCR Methods and Applications 22/55
Ligázová řetězová reakce (2) Wiedmann, M et al. (1994) Ligase chain reaction (LCR) -- Overview and applications. PCR Methods and Applications 23/55
Nucleic acid sequence based amplification (NASBA) amplifikace RNA (využíváno pro dg. a kvantifikaci HIV v séru) izotermická reakce (41 C) reakce obsahuje: templátovou RNA dva primery (první obsahuje promotor pro T7 RNA polymerázu) reverzní transkriptázu (RdDp, DdDp) Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase (AMV RT) RNázu H (v DNA/RNA hybridu odbourává RNA) T7 RNA polymerázu 24/55
NASBA (2) 25/55
Postup analýzy DNA izolace DNA amplifikace specifického úseku DNA detekce produktu amplifikace gelovou elektroforézou metodou ELISA ( serologická ELISA k průkazu mikrobiálních antigenů nebo protilátek!) použitím fluorescenční sondy 26/55
Úkol 1: Izolace DNA prohlédněte si videoklip Izolace DNA ukazuje jen jednu z možností izolace, lze najít řadu dalších přečtěte si text a pokuste se odpovědět na dané otázky 27/55
Úkol 1: Izolace DNA (2) promíchání lyzátu buněk s roztokem fenolu, případně se směsí fenolu a chloroformu fenol je organické rozpouštědlo používané k oddělení proteinů od NK proteiny jsou hydrofobnější a zůstávají v organické fázi NK jsou vysoce nabité a přecházejí do vodné fáze chloroform denaturuje proteiny, rozpouští tuky a napomáhá oddělení jednotlivých fází získaných v následujícím centrifugačním kroku 28/55
Úkol 1: Izolace DNA (2) centrifugace: dojde k oddělení spodní organické fáze, tvořené fenolem (případně směsí fenolu a chloroformu) mezifáze, tvořené denaturovanými proteiny a zbytky buněk horní vodné fáze, v níž jsou rozpuštěny NK odebrání horní fáze a vysrážení NK etanolem, případně izopropanolem shromáždění precipitátu nukleových kyselin centrifugací a rozpuštění získaného sedimentu ve vhodném roztoku 29/55
Úkol 2: Amplifikace specifických úseků DNA amplifikace PCR v termocykléru termocyklér (dokáže rychle a přesně měnit teplotu v termobloku a tedy ve zkumavkách) prohlédněte si videoklip Amplifikace, přečtěte si text a odpovězte na otázky 30/55
Interní kontrola v PCR dochází k tzv. inhibici reakce (běžné) inhibice reakce je dána přítomností různých interferujících látek (např. talek z rukavic) pro detekci použita směs, obsahující kromě vzorku a jemu příslušných primerů ještě kontrolní DNA a druhou sadu primerů pozitivita IC nedošlo k inhibici reakce pozor: IC může být negativní u vysoce pozitivních vzorků (reakce kompetují o nukleotidy) 31/55
Výsledky PCR s IC pozitivní výsledek: pozitivita vzorku IC je zpravidla také pozitivní, ale u silně pozitivních případů nemusí být negativní výsledek: negativní výsledek reakce při pozitivním výsledku IC vzorek i IC negativní = inhibice reakce 32/55
Výsledky PCR s IC: přehled Vlastní reakce Interní kontrola Interpretace negativní pozitivní negativní negativní negativní inhibice reakce pozitivní pozitivní pozitivní pozitivní negativní (vysoce) pozitivní 33/55
Úkol 3: Detekce PCR produktu gelovou elektroforézou přidává se barvivo pro detekci (ethidium bromid, SYBR Green) interkalační barviva (vmezeření mezi báze v malém žlábku DNA) ozáření gelu ultrafialovým zářením barvivo navázané na DNA emituje světlo produkty putují gelem od katody směrem k anodě zviditelněny pomocí UV-transluminátoru každý vzorek obsahuje také interní kontrolu (IC) kromě vzorků je použit také žebříček (ladder) jako měřítko 34/55
Úkol 3a: Detekce PCR produktu IC vlastní reakce Pacienti P3 a P4 pozitivní, pacient P2 negativní, pacient P1 inhibice reakce. IK = kontrola, PK = pozitivní kontrola, NK = negativní kontrola; zcela vlevo ladder 35/55
Úkol 3b: Specifická detekce PCR produktu gelovou elektroforézou Sta Fem MecA Podobné jako předchozí, ale paralelní detekce tří fragmentů DNA. Interní kontrola není zařazena, nelze tedy odlišit negativitu od inhibice reakce. 36/55
Úkol 4: Srovnání výsledků průkazu DNA s výsledky průkazu protilátek nelze spoléhat jen na výsledek jediné reakce pro interpretaci potřebujeme kombinaci výsledků různých reakcí máme k dispozici výsledek PCR a výsledek reakce ELISA PCR je přímý průkaz, ELISA k průkazu protilátek je průkaz nepřímý 37/55
Úkol 4a: PCR nukleové kyseliny u lymeské borreliózy 38/55
Úkol 4b: Průkaz protilátek proti původci lymeské borreliózy A1 K (negativní kontrola) B1 cut off č. 1 C1 cut off č. 2 D1 K+ (pozitivní kontrola) E1 pacient P1 F1 pacient P2 G1 pacient P3 Cut off = (B1 + C1) / 2 interpretace platí pro IgM i IgG 39/55
Úkol 4c: Závěr úkolů 4a a 4b Pacient PCR ELISA IgM ELISA IgG Závěr 1 + + + Aktuálně nakažen 2 + Prodělal infekci 3 Nikdy se nesetkal s i. 40/55
Úkol 5: Průkaz DNA pomocí PCR s detekcí produktu pomocí ELISA v minulém praktiku J08 využití metody ELISA k průkazu antigenů a protilátek ELISA k průkazu protilátek byla také použita jako součást předchozího úkolu zde nejde o sérologické použití této reakce detekce produktu PCR pomocí ELISA vedle důlku vzorku také důlek patřící IC 41/55
Úkol 5: Průkaz DNA pomocí PCR s detekcí produktu pomocí ELISA (2) A1 = pozitivní kontrola, D1 = negativní kontrola B1 a C1 = důlky cut off (cut off = jejich průměr) hodnoty nad cut off (referenční hodnota) jsou považovány za pozitivní hodnoty. E1, F1, G1, H1 = pacienti 1, 2, 3, 4 E2, F2, G2, H2 = interní kontroly k 1, 2, 3, 4 pozitivní reakce = pozitivní výsledek negativní reakce, positivní IC = negativní výsledek negativní reakce, negativní IC = inhibice reakce 42/55
Úkol 6: Real-time PCR vyhodnoťte pozitivní a negativní kontroly a čtyři obrázky Real-time PCR, které máte na pracovním stole osa x ukazuje počet cyklů osa y vyjadřuje množství produktu pozitivní křivka by měla dosáhnout limitní linie ( threshold ) před 42. cyklem plná čára označuje produkt vlastní reakce, čerchovaná čára ukazuje interní kontrolu 43/55
Úkol 6: Real-time PCR (2) průběh Real-time PCR 44/55
Úkol 7: Real-time PCR: kvantifikace díky Real-time PCR detekujeme nejen pozitivitu vzorku, ale kvantifikujeme i virovou nálož spočítejte virovou nálož u čtyř případů podle vzorce v protokolu 45/55
Úkol 7: Real-time PCR: kvantifikace díky Real-time PCR detekujeme nejen pozitivitu vzorku, ale kvantifikujeme i virovou nálož spočítejte virovou nálož u čtyř případů podle vzorce v protokolu počet kopií viru na μl počet kopií viru na 1 ml plné krve P1 14,75 1,5.103 P2 2,3 230 P3 1589 1,6.105 P4 0,5 <100 46/55
Sekvenování DNA biochemické metody zjišťující pořadí nukleotidových bází v sekvenci DNA MaxamGilbertova metoda (chemické sekvenování, radioaktivní značky, dnes téměř nepoužívaná) Sangerova metoda (současná modifikace: fluorescenční barviva navázaná na jednotlivé dideoxynukleotidy) Pyrosekvenování (uvolnění pyrofosfátu z nově začleněného nukleotidu dalšími reakcemi je energie v pyrofosfátu (difosfát) využita na vznik ATP využito luciferázou k oxidaci luciferinu a emise světelného kvanta) Next-generation sequencing (NGS) 47/55
Pyrosekvenování 48/55
Sangerova metoda současná modifikace: fluorescenční barviva navázaná na jednotlivé dideoxynukleotidy proces připomíná PCR: místo dvou primerů pouze jeden kromě deoxynukleotidů ještě dideoxynukleotidy detekce elektroforézou (vetšinou kapilární nebo gelová) 49/55
Sangerova metoda (2) 50/55
Vzorek pro sekvenování vzorek do laboratoře izolace DNA amplifikace DNA vizualizace gelovou elektroforézou vyříznutí vzorku z gelu prečištění sekvenace 51/55
Přiřazení sekvence známému organismu bioinformatické přístupy: BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (NCBI) další (specializované) databáze: 16SpathDB vyhledávání podobností v databázi 52/55
Přiřazení sekvence známému organismu (BLAST) 53/55
Úkol 8 správné odpovědi 54/55
Po tomto cvičení byste měli umět: vysvětlit využití a metody používané pro průkaz NK (zejména detailně popsat klasickou PCR a Real-time PCR) uvést příklady dg. NK vysvětlit postup při izolaci DNA a následném zpracování popsat metody sekvenování (zejména Sangerovu metodu) 55/55