RNDr. Jaroslava Ovesná, CSc. Mgr. Jan Hodek VYUŽITÍ AFLP PRO DNA GENOTYPIZACI ROSTLIN METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
Metodika byla vypracována pracovníky Národní Referenční laboratoře pro identifikaci GMO díky finančnímu přispění MZe ČR na VZ: 0002700602. Oponent: Ing. Ivan Branžovský, CSc. Metodika je určena laboratořím, které se zabývají molekulární biologií a genotypizací rostlin. Metodika byla schválená Ministerstvem zemědělství ČR - odborem rostlinných komodit pod č.j. 696/2008-17220. Ministerstvo zemědělství doporučuje tuto metodiku pro využití v praxi. O uplatnění metodiky byla dne 23.11.2007 uzavřena smlouva podle ustanovení $269 zákona 513/1991 Sb., obchodního zákoníku. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2007 ISBN: 978-80-87011-36-2
Autoři: RNDr. Jaroslava Ovesná, CSc. Mgr. Jan Hodek, Název: Vydal: Využití AFLP pro DNA genotypizaci rostlin Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06 Praha 6 Ruzyně Redakce: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Drnovská 507, 161 06 Praha 6 Ruzyně Metodika je veřejně přístupná na adrese www.vurv.cz Náklad: 7 výtisků Vyšlo v roce 2007 Vydáno bez jazykové úpravy Kontakt na autory: ovesna@vurv.cz hodek@vurv.cz Autor fotografií: Jan Hodek Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2007 ISBN: 978-80-87011-36-2
Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007
Jan Hodek, Jaroslava Ovesná VYUŽITÍ AFLP PRO DNA GENOTYPIZACI ROSTLIN METODIKA PRO PRAXI Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007 5
Využití AFLP pro DNA genotypizaci rostlin Tento dokument byl vypracován pracovníky Národní Referenční laboratoře pro identifikaci GMO a je určen laboratořím, které se zabývají molekulární biologií a genotypizací rostlin. Metodika popisuje AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism = délkový polymorfismus amplifikovaných fragmentů) prováděnou na DNA rostlin. Podstatou metody AFLP je štěpení DNA restrikčními enzymy a následná selektivní amplifikace vzniklých DNA fragmentů. AFLP je možné aplikovat bez předběžných znalostí DNA sekvence daných organismů a je možné ji provozovat pomocí vysokokapacitních přístupů. Utilization of AFLP analysis for DNA genotyping of plants This document was preapared by the members of National Reference laboratory for idetification of GMO. It is intended for laboratories which practise molecular biology and consider in plant genotyping. This methodology describes AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) in use of plant genotyping analysis. The principle of AFLP method is DNA cleaving using restriction enzymes. DNA fragments are then selective amplified. The AFLP analysis could be applied without preliminary knowledge of DNA sequence and there is a possibility to apply it with hight-throughput aproaches. 6
OBSAH: 1. Úvod 8 1.1 Cíl metodiky a dedikace 8 2. Všeobecmé požadavky a definice 8 2.1 Pokyny k bezpečnosti práce 8 2.2 Nakládání se vzorkem a jeho značení 8 2.3 Příjem vzorku a jeho skladování 8 3. Princip 9 4. Rozsah použití 9 5. Definice 9 6. Přístroje a vybavení 10 7. Činidla 11 8. Roztoky 11 9. Ostatní materiál 12 10. Izolace DNA 13 10.1 Kontrola DNA 14 11. Zpracování DNA 14 11.1 Příprava adaptérů 15 11.2 Restrikční štěpení DNA a ligace adaptérů 15 11.3 Pre-amplifikace DNA 15 11.4 Selektivní amplifikace 16 11.5 Separace produktů 17 11.6 Vyhodnocení signálů 17 12. Tvorba DNA fingerprintingu 18 13. Příčiny neshodných výsledků 18 Přehled použité literatury 19 Příloha č. 1 Příprava roztoků 20 7
1. Úvod 1.1. Cíl metodiky a dedikace Cílem metodiky je poskytnout metodický základ pro provedení AFLP analýzy DNA rostlin za účelem jejich genotypizace. Metoda umožňuje rozdělit studované rostliny na základě DNA genotypizace a vytvořit jim tzv. fingerprint, a to bez nutnosti znalosti jejich konkrétní DNA sekvence. Metodika je dedikována MZe ČR smlouvou na VZ: 0002700602. 2. Všeobecné požadavky 2.1 Pokyny k bezpečnosti práce Při provádění zkoušky je nutné plnit povinnosti stanovené ze zákona pro práci v laboratořích a nakládání s jedy a kacinogeny a dodržovat zásady bezpečnosti a hygieny práce. Zejména je třeba Při práci používat laboratorní oděv a pravidelně vyměňovat jednorázové ochranné rukavice a další ochranné prostředky (štíty, brýle apod., viz dále) Před použitím jakékoliv uvedené chemikálie je nutné seznámit se: s informacemi obsaženými v R-větách (standardní věty označující rizikovost chemických látek) a v S-větách (standardní pokyny pro bezpečné nakládání s chemickými látkami). s obsahem bezpečnostních listů chemických látek. Desky pracovních stolů se před zahájením a po ukončení práce desinfikují roztokem (1-2%) NaClO nebo Sava. Při práci s UV zářením u fotodokumentačního zařízení je nutné používat brýle chránící oči před UV zářením. Odpad se likviduje v souladu se zákonem o odpadech likvidují odbornou firmou. Při práci s tekutým dusíkem je třeba dbát na to, že jeho teplota za atmosférického tlaku dosahuje až -196 0 C a že je-li za tohoto tlaku vystaven teplotě okolí, začne prudce vřít, přičemž odnímá svému okolí velké množství tepla. Přímý styk kapalného dusíku s tělesnými tkáněmi vede k jejich rasantnímu poškození, jež se podobá spáleninám. Proto je nutné při manipulaci s kapalným dusíkem užívat ochranné pomůcky (tepelně izolované rukavice, vysoké boty z neprodyšného materiálu, průhledný štít na obličej a ochrannou neprodyšnou zástěru na trup) a používat nástroje a pomůcky vyrobené z nehořlavých materiálů. 2.2 Nakládání se vzorkem a jeho značení 2.3 Příjem vzorku a jeho skladování Každý vzorek, který je třeba analyzovat, se doporučuje evidovat v souladu se zvyklostmi uživatele této metodiky. Pro metodu je třeba využívat čerstvě sklizených materiálů, aby bylo možné následně získat vysokomolekulární DNA Proto je třeba rychle stanovit hmotnost vzorku a uložit ho až do dalšího zpracování do hlubokomrazícího boxu. 8
3. Princip AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism = délkový polymorfismus amplifikovaných fragmentů) je metoda, která využívá odlišnosti v DNA sekvenci mezi skupinami příbuzných organismů (např. odrůd nebo klonů) nebo mezi jedinci, kterou je možné detekovat pomocí restrikčních enzymů a následnou amplifikací určité populace restrikčních fragmentů. Nejprve proběhne specifické štěpení celkové DNA dvěma restrikčními endonukleázami MseI a Eco RI. AFLP je možné aplikovat bez předběžných znalostí DNA sekvence daných organismů. AFLP je možné provozovat bez předběžných znalostí DNA sekvencí daného organismu. AFLP je možné provozovat pomocí vysokokapacitních přístupů. AFLP může být vysoce přesné s použitím fluorescečně značených primerů. Základní schéma je uvedeno na Obr. 1 na následujíci straně. Obr.1. Základní kroky AFLP Izolace DNA Kontrola kvality DNA Restrikční štěpení Pre-amplifikace Selektivní amplifikace Separace Sběr dat Vyhodnocení dat 4. Rozsah použití Postup je možné používat pro jednoznačnou identifikaci jakéhokoliv vzorku, který obsahuje dostatečné množství vysokomolekulární DNA, zejména tedy čerstvých materiálů (listy, semena). Metoda se používá pro DNA fingerprinting. Metoda není vhodná pro zpracované materiály jako jsou některé potraviny. 5. Definice Amplifikace zesílení, v případě DNA zmnožení. DNA kyselina deoxyribonukleová. DNA je nositelkou genetické informace. dntp deoxynukleotidy, stavební kameny DNA. EcoRI restrikční enzym, rozpoznává 6bp (G AATTC) dlouhou sekvenci DNA a molekulu štěpí ji v daném místě. Fluorochrom sloučenina schopná emitovat fluorescenční záření. Ligace spojování dvou řetězců DNA kovaletní vazbou. Ligáza enzym, který provádí spojování dvou řetězců DNA a katalyzuje tvorbu kovalentní vazby. 9
MseI restrikční enzym, rozpoznává 4bp (T TAA) dlouhou sekvenci DNA a molekulu štěpí ji v daném místě. PCR (The Polymerase Chain Reaction) in vitro technika používaná pro enzymatickou amplifikaci specifického regionu DNA (100 5000bp), ohraničeného párem primerů. K množení vybraných úseků DNA se používá enzym polymeráza. Reakční směs (MasterMix) se vytvoří z: DNA (templát) dntps, stavební kameny DNA (datp = deoxyadenosin trifosfát, dgtp = deoxyguanosin trifosfát, dttp = deoxythymidin trifosfát, dctp = deoxycytidin trifosfát), dvou specifických primerů (F a R) oligonukleotidů o délce cca. 20 bází nesoucí sekvenci komplementární k části DNA, pracovního pufru s MgCl 2 DNA polymerázy Cyklus se skládá ze třech kroků. V prvním kroku se templát, tj. šroubovice dvouvláknové DNA sloužící polymeráze jako vzor pro kopírování, rozdělí v zahřáté reakční směsi na dvě samostatná vlákna (denaturace 95 o C). V druhém kroku se reakční směs mírně ochladí v závislosti na možnostech primerů, které začnou nasedat na vlákna DNA (annealing 50 65 o C). Ve třetím kroku Taq polymeráza umožní prodlužováním primerů napojených na vlákna vytvoření kopie požadované sekvence DNA (syntéza 72 o C). Cyklus se pak opakuje v závislosti na množství přítomné DNA a délce amplikonu. Výsledný počet kopií c po amplifikaci je dán vztahem: c = 2 n, kde n je počet cyklů. Množství DNA, které se do reakční směsi vloží tedy roste geometrickou řadou. Primer úsek DNA, komplementární k vybranému úseku genomu, oligonukleotid, který postačuje DNA dependentní DNA polymeráze k zahájení syntézy nového vlákna DNA kopírujícího předem zvolený úsek (gen nebo jeho část, nekódující sekvence ). Taq polymeráza DNA dependentní DNA polymeráza izolovaná původně z termofilní bakterie Thermofilus aquaticus, nyní k dispozici v upravených rekombinantních verzích. Templát jednořetězcový poly(deoxy)ribonukleotid, využívaný jako zdroj informace při řízené biologické polymeraci. Při replikaci a transkripci je templátem jeden z řetězců DNA. Ten slouží jako matrice i při PCR. 6. Přístroje a vybavení Centrifuga s rotorem pro 50 ml kyvety, schopná dosáhnout zrychlení 13 000xg. Elektroforetická vana pro elektroforézu v agarózovém gelu. Elektroforetický zdroj, zdroj stejnosměrného proudu. Fotodokumentační zařízení s filtrem pro UV záření. Hlubokomrazící box, -80 C. Chladnička s mrazícím boxem, -20 C. Kapilární nebo desková elektroforéza se čtečkou fuorescenčních signálů, např. ABI PRISM 310, Beckman Coulter nebo odpovídající. Minicentrifuga s rotorem pro 1,5 ml mikrozkumavky schopná doháhnout zrychlení 13.000 x g. ph metr s přesností 0,05. Porcelánové třecí misky s tloučkem, předchlazené na -20 C. Sada pipet v rozsazích 0,5-10 μl, 10-100μl, 100-1000 μl. Spektrofotomer, schopný odečítat absorbanci při vlnových délkých 260 a 280 nm. Termoblok s rozsahem, 37 60 C. 10
Termocykler, programovatelný. Transiluminátor. Vortex (nebo jiný odpovídající mixer). 7. Činidla (pozn. katalogová čísla a dodavatelé jsou uváděni jen jako pomoc uživatelům postupu, mohou být použita činidla od dalších dodavatelů) 100 x TE pufr Concentrate, Fluka, k.č. 86377 AFLP plant/microorganism mapping kit, Applied Biosystem, kt.č. 4303050 Agaróza, Serva k.č.11404 Bromphenol blue, Merck k.č.108122 deionizovaná voda (sterilní) Délkový standard DNA Gene Ruler 100 bp DNA Ladder, Fermentas k.č.smo 241 Délkový standard DNA Ladder HIND III, Fermentas k.č. SMO 101 EDTA, Serva, k.č.11278 Ethanol (C 2 H 5 OH) = (98%), Analytika k.č.set0015 Ethidium bromid, Sigma k.č.e1510 Ethylendiamintetraacetát disodný (Na 2 -EDTA) (C 10 H 14 N 2 O 8 Na 2 ), Sigma k.č.e-513 Hexadecyl-trimethyl-ammonium-bromid (CTAB)(C 19 H 42 BrN), Sigma 52365 Chlorid sodný (NaCl), Merk k.č.1.06404.1 Chloroform multisolvent (CHCl 3 ), Sigma k.č.c2432 Isoamylalkohol p.a., Serva, 39557 Kyselina chlorovodíková p.a. 37% (HCl), Analytika k.č.un 1789 Ledová kyselina octová p.a., Lachema Ligáza, 1000U Merkaptoethanol-2, Fluka k.č.63700 PCR Ultra H 2 O, TOP- Bio k.č.p040 Propan-2-ol (CH 3 CH(OH)CH 3 ),Scharlau k.č.un1219 Proteináza K, Merck k.č.1.245680100 Restrikční endonukleáza Eco RI, 5 000U Restrikční endonukleáza MseI, 5000U RNáza A, Sigma k.č. R6513 Tekutý dusík TRIS (hydroxymethyl) aminomethan (TRIS) (C 4 H 11 NO 3 ), Serva k.č.37190 Xylen cyanol, Merck k.č.110590 8. Roztoky TRIS-acetátový pufr předpis č. 1, Příloha č. 1 CTAB pufr předpis č. 2, Příloha č. 1 TE pufr předpis č. 3, Příloha č. 1 Glycerolový pufr předpis č. 4, Příloha č. 1 EDTA 0,5M předpis č. 5, Příloha č. 1 11
9. Ostatní materiál Mikrozkumavky 0,5ml, sterilní, k.č.u343700, P-LAB Mikrozkumavky 1,5ml, sterilní, k.č.4092.2ns/250ks, Biogen Mikrozkumavky 2 ml, sterilní, k.č.4092.6ns/250, Biogen Očkovací kličky plastové, sterilní, k.č.002650, P-LAB PCR mikrozkumavky 0,2 ml, sterilní, k.č.bo-02k, Biotech PCR mikrozkumavky 0,5 ml, sterilní, k.č.u343700, P-LAB PCR mikrozkumavky 2 ml, sterilní, k.č.4092.2ns, Biogen PP zkumavky Falcon 15 ml, sterilní, k.č.409920, Biogen PP zkumavky Falcon 50 ml, sterilní, k.č.409926, Biogen Špičky 0,5-10 μl, sterilní Špičky 0,5-10 μl sterilní, pro spektrofotometrii Špičky 10ml, sterilní Špičky 5ml, sterilní Špičky s filtrem 2-10 ul Špičky s filtrem 1-100 ul Špičky s filtrem 20-200 ul Baňka podle Erlenmayera, 100ml Baňka podle Erlenmayera, 500ml Odměrný válec, 100 ml Odměrný válec, 500 ml Dekontaminace laboratorního nádobí a pomůcek Dekontaminace laboratorního skla a pomůcek, které nejsou určeny k jednorázovému použití, se provádí ručním mytím v teplé vodě s přídavkem detergentu, oplachem teplou vodou, oplachem deionizovanou vodou a 120 min. sterilizací v sušárně při 120 o C. 10. Izolace DNA DNA je polymerní molekula. Může být degradována mechanicky, DNA štěpícími enzymy, proto je třeba pracovat s opatrností a dodržovat pravidla bezpečnosti práce. Je třeba pracovat se sterilním materiálem, který neobsahuje DNázy. Postup izolace DNA: 1g rostlinného materiálu se dobře zhomogenizuje v tekutém dusíku v předchlazených porcelánových miskách tloučkem homogenizovaný rostlinný materiál se přenese do 15 ml zkumavky přidá se 5 ml CTAB pufru a 10 μl 2-merkaptoethanolu, důkladně se promíchá (Vortex) inkubuje se v termobloku 1 hod. při teplotě 60 C, během inkubace se 2-3x promíchá (vortex ) po inkubaci se přemístí vzorky do nádoby s ledem a inkubují se 5 min. na ledu mikropipetou se přidá 1x objem (cca. 5 ml) směsi chloroform: isoamylalkohol 24:1 (v/v) promíchává se 30 minut, poté 30 min. se centrifuguje v centrifuze při 13.000x g do oddělení fází 12
mikropipetou se ihned odebere svrchní vodná fáze do nové sterilní 15 ml zkumavky, znovu se přidá 1x objem směsi chloroform: isoamylalkohol 24:1 (v/v) promíchává se 10 min., poté 30 min. se centrifuguje v centrifuze při 13.000x g do oddělení fází mikropipetou se ihned odebre svrchní vodná fáze do nové sterilní 15 ml zkumavky, přidá se 1x objem vychlazeného (-20 C) isopropanolu a DNA se ponechá srážet 30 min. při 4 C na ledu DNA se navine na sterilní skleněný háček a přemístí se do nové sterilní zkumavky s 2 ml 75 % ethanolu Ponechá se 1/2 hod. až několik hodin (maximálně 12 hod.) při 4 C na ledu, poté se ethanol slije a doplní znovu na 2 ml 75 % ethanolem, nechat se inkubovat 1/2 hod. při 4 C na ledu háček s DNA se opatrně vyjme, otočí a DNA se nechá oschnout DNA se opatrně přemístit do sterilní 1,5 ml mikrozkumavky se 100-500 μl TE pufru po rozpuštění se přidá 15 μl RNázy A a nechat se inkubovat v termobloku 30 min. při 37 C Pak se DNA přemístí do 4 C a použije k dalším kontrolám a analýzám. 10.1 Kontrola DNA Kontrola se provádí separací v agarózovém gelu a/nebo spektrofotometricky. Elektroforetická separace umožní kontrolu integrity DNA a hrubý odhad množství, spektroforometrie umožňuje přesnější odhad kvality a čistoty. DNA se separuje elektroforeticky na základě svého náboje a molekulární hmotnosti. Délka doby elektroforetické separace je závislá na požadované délce migrace, protékajícím proudu, použitém pufru a koncentraci agarózy v gelu. Ethidium bromid se naváže na DNA a při excitaci UV zářením vyzařuje oranžové fluorescenční záření. Protože množství fluorescence je přímo úměrné celkovému množství DNA, může být kvantita DNA ve vzorku odhadnuta srovnáním fluorescence neznámého vzorku se sérií kvantitativních standardů. Pro porovnání velikosti produktu PCR se používá 6 μl délkového standardu DNA HIND III Ladder. Pro analýzu kvality se používá 0,8% agarózový gel, tj. 100ml TRIS-acetátového purfru se přelije 0,8g agarózy, přivede se k varu, dobře se rozpustí, nechá se za občasného promíchání schladnout na teplotu 50 C, přidá se 10 μl roztoku ethidium bromidu (10mg/ml), promíchá a naleje se do připraveného nosiče. Vloží se hřeben. Gel se nechá dobře utuhnout. Obr. 2. Připravený gel s jamkami (a), záznam elektroforetické separace (b) (1) délkový standard (1,6), (2,3) vysokomolekulární DNA, (4,5) degradovaná DNA 1 2 3 4 5 6 (a) (b) 13
Příprava vzorku k nanášení na gel do mikrozkumavek se vzorkem DNA (10 μl) se přidá 3 μl glycerolového pufru s bromfenol blue, promíchá se špičkou mikropipety a celý objem se nanese na gel elektroforetická separace probíhá při elektrickém napětí 30 V cca. 60 min. DNA se vizualizuje po UV světlem, obraz se zaznamená Měření koncentrace a čistoty DNA se provádí na spektrofotometru. DNA v roztoku absorbuje UV (ultrafialové) světlo v rozmezí 210 až 500 nm, s absorpčním maximem 260 nm. Protože DNA, RNA a nukleotidy mají stejné absorpční maximum, tj. 260 nm, nemůže být v roztoku DNA určena koncentrace RNA a nukleotidových kontaminantů. Pro tento případ je RNA během extrakce enzymaticky odstraňována, stejně tak případné oligonukleotidy a nukleotidy, získané během hydrolýzy RNA. Pokud nedojde k jejich odstranění, může to vést ke špatnému vyhodnocení koncentrace DNA. Změří se absorbance TE pufru jako slepého vzorku při vlnových délkách 260 a 280 nm. Vypočítají se poměry a koncentrace DNA. Optická hustota (absorbance) λ 260 nm =1.0 odpovídá 50 g dvouřetězcové DNA. Čistota izolované DNA A260/A280 je vyhovující, pokud se pohybuje v rozmezí 1,7-1,9. Je-li čistota DNA <1,2 nebo > 2,1, DNA se musí izolovat znovu. Její purifikace obvykle nepřináší dobré výsledky. Pro AFLP analýzu je třeba 0,5 μg DNA v objemu nejvíce 100 μl. Doporučuje se ředit DNA na koncentraci 20 50 ng/μl. 11. Zpracování DNA Izolovaná DNA se fragmentuje na úseky velikosti cca 500 bp pomocí restrikčních enzymů EcoRI a MseI. Vznikají tak 3 typy fragmentů. Díky dalšímu postupu dochází k redukci komplexity genomu a zpracovávají se dále jen úseky vznikající současným štěpením enyzmů EcoRI a MseI (Obrázek 3). Obr. 3. Úsek DNA štěpený současně enzymy EcoRI a MseI. štěpící místo EcoRI štěpící místo MseI 5 G AATTC CTTAA G T AAT TAA T 3 Restrikční endonukleázy a zejména ligáza jsou velmi citlivé enzymy..musí se s nimi pracovat na ledu a směs s ligázou jen opatrně promíchávat. Správné úseky se množí v kroku označovaném jako pre-amplifikace. Ta dá vzniknout směsi obsahující dostatek templátu pro následující specifickou, tzv. selektivní amplifikaci. 14
11.1 Příprava adaptérů Příprava vzorků musí probíhat při teplotě 4 C, mikrozkumavky a činidla musí být během přípravy uchovávány na ledu nebo musí být jinak zajištěna odpovídající teplota. Roztok adaptérů se zahřeje na 95 C po dobu 5 min. Pak se nechá ochladit při laboratorní teplotě. 11.2 Restrikční štěpení a ligace adaptérů Na ledu se v mikrozkumavce smíchá 0,5 μg genomické DNA, 1μl 10x koncentrovaného pufru pro T4 ligázu obsahující ATP, 0,5 μl roztoku BSA 10 mg/ml, 1.0 μl 0,5 M NaCl, 1,0 μl adaptérového páru MseI, 1,0 μl adaptérového páru EcoRI, 1,0 μl směsi enzymů (EcoRI 5U, MseI 1U a 1U T4 DNA ligázy). Opatrně se promíchá, centrifuguje po dobu 1 minuty a inkubuje se 2 hodiny při 37 o C. Doporučuje se používat termocykler s vyhřívaným víkem. Směs se ředí 189 μl 10x zředěného TE pufru. Promíchá se. Skladuje se až 1 měsíc při teplotě 4 o C nebo až 1 rok při -20 o C. Na Obrázku 4 je znázorněn příklad ligace adaptérů EcoRI a MseI na štěpná místa. Obr. 4. Ligace adaptérů EcoRI a MseI na molekulu DNA. EcoRI adaptér C GTTAA MseI adaptér TAC G CAATT GTTAA TTAC AATG Je možné kontrolovat úspěšnost restrikčního štěpení. Celkem 25 μl směsi se smíchá s glycerolovým pufrem obsahující bromfenolovou modř a nanese se na 1,5% agarózový gel (příprava viz bod 9.1, s výjimkou navážky agarózy 1,5 g na 100 ml). Fragmentovaná DNA se spolu s délkovým standardem separuje v elektrickém poli. Maximum fragmentů by mělo dosahovat délky 500 bp. To se zjišťuje porovnáním s délkovým standardem, např. Fermentas, 100bp Laddder. 11.3 Pre-amplifikace V této části postupu se amplifikuje populace fragmentů EcoRI x MseI a snižuje se komplexita templátu. Práce se provádí na ledu nebo musí být činidla a enzymy chlazena jiným způsobem. Taq polymeráza může být částečně aktivní i za pokojové teploty a reakce pak může vést. k nesprávným výsledkům. Alternativně lze využívat Taq polymerázy aktivované tzv. horkým startem (95 C po dobu 5 minut). Je však třeba všechny reakce vždy provádět se stejnou Taq 15
polymerázou od stejného dodavatele. Použití odlišných Taq polymeráz vede často k odlišným výsledkům. V mikrozkumavce se smíchá 4 μl směsi připravení v kapitole 11.2, 1.0 μl pre-selektivních primerů a 15 μl směsi Taq polymerázy (1U), dntp (15mM) a 2 μl reakčního pufru 10x koncentrovaného. V termocykleru se směs zahřeje na 72 C po dobu 2 min., 94 C po dobu 1 s pak následuje 30 s 56 C a 72 C po dobu 2 min., cyklus se opakuje 20. Pak se směs ochladí na 4 C. Po ukončení reakce lze směs skladovat až do dalšího použití při -20 C 11.4 Selektivní amplifikace Výrobce dodává sadu selektivních primerů. Pro každou skupinu organismu (např. druh) je třeba vybrat sadu nejvhodnějších z nich. Zatímco cizosprašné druhy rostlin a druhy plané vykazují vysokou míru polymorfimu, pro samosprašné druhy to neplatí. Proto pro některé druhy je třeba pracovat se širším souborem selektivních primerů. Zatímco pro plané druhy může postačovat soubor dobře zvolených 3 primerových kombinací, u sladovnického jarního ječmene je např. třeba 15 selektivních primerů k naprosto jednoznačné identifikaci. Jednotlivé primerové kombinace se mohou ve své schopnosti odlišovat genotypy v rámci druhu lišit. Proto je třeba provést předběžný výběr na určitém rozsahu genotypů. Pro celý soubor se pak používá shodný soubor selektivních primerů. Práce se provádí na ledu nebo musí být činidla a enzymy chlazena jiným způsobem. Taq polymeráza může být částečně aktivní i za pokojové teploty a reakce pak může vést. k nesprávným výsledkům. Alternativně lze využívat Taq polymerázy aktivované tzv. horkým startem (95 C po dobu 5 minut). Je však třeba všechny reakce vždy provádět se stejnou Taq polymerázou od stejného dodavatele. Použití odlišných Taq polymeráz vede často k odlišným výsledkům. Smíchá se 10 μl reakčního produkt získaného v kapitole 11.3 s 2 μl 10x koncentrovaného reakčního pufru obsahujícího hořečnaté ionty, 1 μl každého selektivního primeru (Mse I-xxx, 5 μm a EcoRI-xxx, 1μM), 1 μl dntp (25 mm směs), 2U Taq polymerázy a doplní se sterilní vodou prostou DNáz na objem 20 μl. Pak se nechá probíhat PCR amplifikace podle Tabulky 5. Tabulka 5. Selektivní PCR amplifikace. Aktivace AmpliTaq Gold 95 C 12 min. polymerasy Amplifikace 40 cyklů Denaturace Annealing Extenze Konečná extenze 95 C 30 s 70 C 1 min. 72 C 30 s 72 C 10 min. Po ukončení reakce lze směs skladovat až do dalšího použití při -20 C 16
11.5 Separace produktů Separace amplifikačních produktů se provádí na deskové elektroforéze v polyakrylamidovém gelu nebo v kapilární elektroforéze. Zpracování probíhá podle vybavení laboratoře a je třeba dbát pokynů výrobce příslušného přístroje. Amplifikační produkty se obecně smísí s délkovým standardem dodávaným výrobcem (např. Applied Biosystem, délkový standard ROX 500) a nanesou se na polyakrylamidový gel nebo jsou automaticky nasáty do kapiláry. Většina přístrojů využívá laserových zářičů. Je proto třeba s nimi zacházet s opatrností. Gely používané jako náplň kapilár a gely polyakrylamidové mohou obsahovat kancerogeny a toxické látky. Za provozu jsou přístroje zdroji vysokého napětí. Separace produktů probíhá automaticky v elektrickém poli a podle typu přístroje je snímána a zaznamenávána odpovídajícím softwarovým programem. Signály (Obrázek 6) se dále vyhodnocují. Obr. 6. Signály separovaných produktů. 11. 6 Vyhodnocení signálů AFLP s fluorescenčně značenými sondami je robustní metoda, která produkuje v průměru 20 80 polymorfních signálů na jednu kombinaci selektivních primerů. Signály musí být dostatečně intenzivní, aby byl možný správný odečet. Metoda musí být na každé pracovišti verifikována a musí být ověřeno, že je reproducibilní. Doporučuje se do každé série běhů zařadit jeden nebo dva kontrolní materiály pro zajištění shody výsledků. V každém běhu je zařazen délkový standard, ke kterému se vztahují všechna data a podle kterého se odečítají délky signálů. Porovnávají se spektra fragmentů, seřazených podle délky, shodné signály se nepoužívají. Zaznamenávají se signály, které se vyskytují jen v některých genotypech. 17
Pro potřeby jednoznačné identifikace genotypů je vhodné každému takovému signálu přiřadit jednoznačný identifikátor a při každém hodnocení genotypu zachovávat řazení těchto identifikátorů. 12. Tvorba DNA fingerprintingu Každý genotyp lze popsat přítomností nebo nepřítomností amplifikačního AFLP produktu. Pokud jsou vždy řazeny jednotlivé typy produktů ve stejném pořadí, lze získat jednoznačný DNA fingerprinting analyzované položky. Viz. Tabulka 7 na následující straně. Tabulka 7. Ukázka DNA fingerprintu. E1 E1 E1 E1 E2 E2 E2 E2 50bp 72bp 102bp 350bp 62bp 78bp 95bp Odrůda 1 0 1 0 0 1 1 A Odrůda 0 1 0 1 0 0 1 B Odrůda 0 1 0 0 1 1 0 C Při dostatečném počtu signálů lze pro každou položku odvodit určitý typ čárového kódu. V programu MS Excel se nastaví formát buňky přítomnosti signálu odpovídá zelená čára Viz. Obr. 8. Obr. 8. Příklad DNA fingerprintingu 13 odrůd ječmene pomocí 139 polymorfních AFLP fragmentů (markantů). Zeleně jsou znázorněny přítomné markanty, žlutě nepřítomné. Jubilant Kom pakt Lum ar Novum Profit Stabil Terno Atribut Olbram Viktor Sladko Primus Malvaz 13. Příčiny neshodných výsledků Pokud se nedosáhne očekávaných výsledků, je třeba zkontrolovat kvalitu kontrolní DNA zkontrolovat kvalitu enzymů zkontrolovat kvalitu ostatních činidel zkontrolovat kvalitu používaných primerů zkontrolovat činnost termocykleru provést reakci s kontrolní DNA 18
Přehled použité literatury Vos P, Hogers R, Bleeker M, Reijans M, van de Lee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, and Kuiper M AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 1995 23(21): 4407 4414. Leišová L., Kučera L., Minaříková V., Ovesná J., 2005, AFLP-based PCR markers that differentiate spot and net forms of Pyrenophora teres, Plant Pathology 54: 66-70 Leišová L., Minaříková V., Kučera L., Ovesná J., 2005, Genetic diversity of Pyrenophora teres isolates as detected by AFLP analysis, J. Phytopathology 153: 569-578 Ovesná J., Kučera L., Jiang J. L., Šídová-Vagnerová D., 2005, Characterisation of Chinese elite cultivars and genetic resources of chestnut by AFLP, Biologia Plantarum 49(1): 125-127 Ovesná J., Kučera L., Jiang J. L., Šídová-Vagnerová D., 2005, Characterisation of Chinese elite cultivars and genetic resources of chestnut by AFLP, Biologia Plantarum 49(1): 125-127 19
Příloha č. 1 Příprava roztoků Roztok č. 1 50 x TAE (TRIS-acetátový pufr) Příprava: 242 g TRIS base se rozpustí v 300 ml deionizované vody, přidá se 100 ml roztoku č. 5 (EDTA 0,5M) a 57,1 ml ledové kyseliny octové, doplní se do 1000 ml deionizovanou vodou a upraví ph = 8,5. Autoklávuje se při 121 C po dobu 15 minut. Roztok je použitelný 6 měsíců, uchovává se v chladničce, po 3 měsících se autoklávuje. Roztok č. 2 CTAB pufr Příprava: 7,5 g CTAB, 30,681 g NaCl, 11,81 g TRIS-HCl a 2,7915 g Na 2 EDTA se rozpustí v 250 ml sterilní deionizované vody, 1M roztokem NaOH se upraví ph roztoku na ph = 8, doplní se do 500ml a autoklávuje při 121 0 C programem č.7. Roztok se uchovává v chladničce při 4 0 C maximálně po dobu 6 měsíců. Roztok č. 3 TE pufr Příprava: Zásobní roztok 100 x TE pufru se naředí s PCR Ultra H 2 O v poměru 1:99, alikvoty se uchovávají v mikrozkumavkách v mrazáku při -20 C. Roztok č. 4 Nanášecí glycerolový pufr Příprava: 0,25 g bromfenolové modři a 0,25 g xylen cyanolu se rozpustí v 10 20 ml deionizované vody na magnetické míchačce, přidá se 14,4 ml glycerolu pro molekulární biologii (>99%) a v odměrném válci se doplní destilovanou deionizovanou vodu do 100 ml. 0,5 ml zásobního nanášecího pufr se ředí s 1,5 ml roztoku koncentrovaného glycerolu s destilovanou deionizovanou vodou v poměru 1:9, promíchá se na vortexu. Roztok se uchovává v chladničce při 4 0 C. Roztok č. 5 EDTA 0,5M Příprava: 93,05 g Na 2 -EDTA.2H 2 O se rozpustí v 300 ml deionizované vody na magnetické míchačce, přidá se cca 10 g NaOH. Měří se ph roztoku, pokud se jeho hodnota neblíží ph = 8, sůl se nerozpustí. Autoklávuje se při 121 C po dobu 15 minut. Roztok je použitelný 6 měsíců, uchovává se v chladničce, po 3 měsících se autoklávuje. 20
Vydal Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. 2007 21