LIPIDY Analytické úkoly: izolace lipidů stanovení celkového obsahu lipidů (stanovení tuku) charakterizace tuku stanovením tukových čísel stanovení frakcí lipidů triacylglyceroly, vosky fosfolipidy... stanovení složení mastných kyselin stanovení stupně žluklosti tuku stanovení oxidační stability stanovení doprovodných látek lipidů 1
IZLACE A STANVENÍ TUKU bvyklý postup izolace a vážkového stanovení tuku příprava vzorku k extrakci tuku (uvolnění tuku z vazby na bílkoviny a sacharidy hydrolýza a dále vysušení vzorku) extrakce tuku nepolárním až středně polárním rozpouštědlem odpaření rozpouštědla z extraktu a zvážení odparku Tuk = všechny nepolární netěkavé látky extrahované ze vzorku nepolárním rozpouštědlem (petrolether, hexan, diethylether...) Provedení extrakce extrakce tuhého vzorku umístěného v extrakční patroně kondenzátem par rozpouštědla (Soxhletův nebo Twisselmannův extraktor) extrakce varem v rozpouštědle s následným promýváním kondenzátem rozpouštědla (zařízení Soxtec) extrakce tuhého vzorku v uzavřené nádobě velkým přebytkem rozpouštědla (např. při metodě dle Folche) extrakce kapalina kapalina v uzavřené nádobě (např. v přístroji pro extrakci dle Röseho a Gottlieba) 2
Některé extrakční metody stanovení tuku Metoda dle Soxhleta spočívá v extrakci (rozemletého a vysušeného) vzorku (příp. rozmíchaného s mořským pískem) hexanem, petroletherem nebo diethyletherem v Sohletově nebo Twisselmannově extraktoru po dobu 4-6 hod. Z extraktu ve varné baňce se odpaří rozpouštědlo (vakuová odparka, sušárna 103 C) a odparek se zváží. Použití: materiály s vysokým obsahem tuku, malým obsahem vody a sacharidů (olejniny) Postup dle Grossfelda (Použití: cereální materiály...) částečná hydrolýza vzorku kys. chlorovodíkovou filtrace, promytí vodou, vysušení extrakce vysušeného vzorku dle Soxhleta Metoda dle Folche Použití: vzorky s vysokým obsahem bílkovin (maso) extrakce směsí CHCl 3 CH 3 H (2:1) homogenizací za studena filtrace reextrakce filtrátu vodou odpaření rozpouštědla z organické fáze, zvážení Metoda dle Röseho a Gottlieba Použití: mléko, syrovátka, podmáslí... (rozhodčí metoda) hydrolýza bílkovin amoniakem, přídavek ethanolu opakovaná extrakce směsí petrolether diethylether odpaření rozpouštědla, zvážení odparku 3
Další metody stanovení tuku hlavní výhoda: rychlost stanovení Butyrometrická metoda Použití: mléko, mléčné výrobky přídavkem H 2 S 4 se rozpustí bílkoviny v obalu tukových kuliček uvolněný tuk se odstředí (přídavkem amylakoholu se dosáhne ostrého rozhraní) a v kalibrované části butyrometru se odečte objem tuku (butyrometr je cejchován v % tuku) Denzitometrická metoda Použití: semena olejnin homogenizace vzorku s 1,2-dichlorbenzenem filtrace stanovení hustoty filtrátu odečtení obsahu tuku z tabulky (nutná kalibrace pro každý druh materiálu) NIR spektrometrie Použití: vzorky s obsahem tuku nad 0,2 % měření log (1/R) tuhého vzorku 800-2500 nm signály skupin mastných kyselin 1200, 1734, 1765, 2310, 2345 nm individuální kalibrace pro každý typ vzorku 1 H-NMR spektrometrie 4
STANVENÍ TUKVÝCH ČÍSEL slouží k charakterizaci vlastností tuku Vlastnost tuku obsah volných mastných kyselin obsah veškerých mastných kyselin obsah esterově vázaných mastných kyselin obsah hydroxylových skupin obsah dvojných vazeb obsah polyenových kyselin Ukazatel číslo kyselosti číslo zmýdelnění esterové číslo hydroxylové číslo jodové číslo rhodanové číslo Číslo kyselosti je mírou obsahu volných mastných kyselin v tuku; vyjadřuje se jako hmotnost KH (v mg) potřebného k neutralizaci kyselin obsažených v 1 g tuku Stanovení čísla kyselosti rozpuštění tuku ve směsi ethanol diethylether (1+1) titrace alkoholickým roztokem KH (c = 0,1 mol/l) na fenolftalein nebo thymolftalein číslo kyselosti = 56,11. c KH. V KH / m v [mg/g] Poznámka: od spotřeby odměrného roztoku při titraci vzorku je třeba odečíst spotřebu při titraci slepého pokusu Přípustné hodnoty čísla kyselosti sádlo max. 1,3 olivový olej panenský max. 6,6 rostlinné oleje rafinované max. 0,6 5
Číslo zmýdelnění se vyjadřuje jako hmotnost KH (v mg) potřebného k neutralizaci mastných kyselin a hydrolýze (zmýdelnění) jejich esterů v 1 g tuku Stanovení čísla zmýdelnění vzorek tuku se neutralizuje a hydrolyzuje varem (pod zpětným chladičem) s nadbytkem 0,5M alkoholického roztoku KH přebytek KH se stanoví titrací roztokem HCl číslo zmýdelnění = 56,11. c HCl. (V 1 -V 2 ) / m v V 1 je spotřeba při titraci slepého pokusu V 2 je spotřeba při titraci vzorku [mg/g] Typické hodnoty čísla zmýdelnění sádlo 192-203 olivový olej 184-196 slunečnicový olej 188-194 podzemnicový olej 187-196 sójový olej 189-195 řepkový olej 168-193 Esterové číslo vyjadřuje obsah esterově vázaných mastných kyselin; udává se jako hmotnost KH (v mg) potřebného k hydrolýze esterů mastných kyselin obsažených v 1 g tuku esterové číslo = číslo zmýdelnění číslo kyselosti Násobením esterového čísla faktorem 0,547 se vypočte obsah vázaného glycerolu v tuku (v mg/g) 6
Hydroxylové číslo se používá k vyjádření obsahu parciálních esterů glycerolu v tuku; vyjadřuje se jako hmotnost KH (v mg) ekvivalentní obsahu hydroxylových skupin Titrační stanovení hydroxylového čísla parciální estery glycerolu obsažené v tuku se acetylují acetanhydridem CH H C R C R + (CH 3 C) 2 CH C R C R + C CH 3 CH 3 CH acetylovaný tuk se oddělí od acetanhydridu a octové kyseliny extrakcí hexanem a promytím organické fáze vodou. V acetylovaném vzorku se stanoví číslo zmýdelnění. Hydroxylové číslo se vypočte jako rozdíl čísel zmýdelnění acetylovaného a původního tuku. Spektrofotometrické stanovení hydroxylového čísla zvýšení obsahu esterových skupin po acetylaci parciálních esterů glycerolu se určí na základě těchto kroků: 1. konverze esterů glycerolu na hydroxamové kyseliny reakcí s NH 2 H v alkalickém prostředí CH C R NH C R + 3 NH 2 H 2 R NHH C + CH3 C H + H CHH C CH 3 H 2. tvorba barevných komplexů hydroxamových kyselin s Fe 3+ a spektrofotometrické měření (530 nm) 7
Jodové číslo je měřítkem nenasycenosti tuku (oleje) tj. obsahu dvojných vazeb udává se jako množství halogenu vyjádřené jako hmotnost jodu v gramech, které se může adovat na 100 g tuku Stanovení jodového čísla spočívá v adici interhalogenové sloučeniny (Hanušova metoda IBr, Wijsova metoda ICl) na vzorek tuku; reakční doba je 1-2 hod Hanušova metoda: adice jodmonobromidu -CH=CH- + IBr -CHBr-CHI- nadbytek IBr se převede reakcí s KI na ekvivalentní množství jodu IBr + KI KBr + I 2, které se stanoví titrací thiosíranem: I 2 + 2S 2 3 2-2I - + S 4 6 2- jodové číslo = 100. c Na2S23. (V 1 -V 2 ). 0,1269 / m v V 1 je spotřeba odm. roztoku Na 2 S 2 3 při titraci slepého pokusu [ml] V 2 je spotřeba při titraci vzorku [ml] Hodnoty jodového čísla sádlo 45-70 olejová kys. 89,9 olivový olej 75-94 linolová kys. 181,0 slunečnicový olej 110-143 linolenová kys. 273,5 podzemnicový olej 80-106 TAG (S,,S) 28,5 sójový olej 120-143 TAG (S,L,S) nebo (S,,) 57,2 řepkový olej 94-126 TAG (S,L,) 86,0 TAG (,L,) 114,9 TAG (L,L,) nebo (,Ln,) 144,0 TAG (L,Ln,) 173,2 8
STANVENÍ FRAKCÍ LIPIDŮ TRIACYLGLYCERLY Separační metody (dělení podle počtu C a dvojných vazeb) TLC, Ag + -TLC RP-HPLC, Ag + -HPLC (detekce RID, ELSD) GC FSFLIPIDY obsah fosfolipidů v některých potravinách (% v sušině) sádlo < 0,1 vaječný žloutek 20 rostlinné oleje játra 3-4 surové 0,5-3 ledviny 1,5-3 rafinované < 0,01 ovoce, zelenina 0,5-1,5 máslo 0,5-1,5 cereálie 0,5-1,5 Stanovení celkového obsahu fosfolipidů izolace lipidového podílu (extrakce dle Folche) mineralizace tuku (nejčastěji směsí HN 3 + H 2 S 4 ) stanovení fosforu (spektrofotometrie) přepočet na obsah fosfolipidů Přepočítávací faktory fosfolipid/fosfor palmitoyl linoloyl fosfatidylcholin 24,51 oleoyl linoloyl fosfatidylcholin 25,35 palmitoyl linoloyl fosfatidylethanolamin 23,12 palmitoyl linoloyl fosfatidylinositol 26,96 palmitoyl linoloyl fosfatidylserin 24,54 9
SLŽENÍ MASTNÝCH KYSELIN LIPIDŮ Důvody pro stanovení složení MK nutriční a biologická hodnota tuku (esenciální MK) identifikace druhu oleje nebo tuku posouzení oxidační stability (nasycené vs. polyenové MK) sledování technologických procesů Analytické metody chromatografické (GC, HPLC): základní složení spektrometrické: doplňkové ukazatele UV spektrometrie: obsah konjugovaných dienů, trienů MIR spektrometrie: obsah trans - nenasycených MK enzymové: stanovení esenciálních MK Stanovení mastných kyselin v tucích plynovou chromatografií vyžaduje derivatizaci. Mastné kyseliny (volné i vázané v lipidech) se převádějí nejčastěji na: methylestery butylestery (při analýze tuku, který obsahuje také nižší mastné kyseliny C 4 -C 10 např. mléčný tuk) Příprava methylesterů MK 1) hydrolýza (zmýdelnění) tuku záhřevem s 0,5M KH v CH 3 H v inertní atmosféře (tento krok se vynechává při stanovení volných MK) 2) esterifikace methanolem za přít. kyselého katalyzátoru (nejčastěji BF 3 ), vzniklé methylestery se extrahují do hexanu nebo isooktanu 10
Alternativní postup: transesterifikace triacylglycerolů methoxidem sodným C R Na CH C R + 3 CH 3 Na 3 R C CH 3 + CH Na C R Na (volné MK s methoxidem methylestery neposkytují) Podmínky GC stanovení MK (ve formě methylesterů) náplňové nebo kapilární kolony s polární až středně polární stacionární fází teplota kolony > 175 C detektor FID kvantifikace vnitřní normalizace (s korekčními faktory) vnitřní standard (methylester kyseliny s lichým počtem uhlíků např. pentadekanové) GC analýza methylesterů mastných kyselin řepkového oleje kolona 30 m 0,75 mm i.d., film 1µm; stac. fáze Supelcowax 10; teplota kolony 180 C 11
Stanovení konjugovaných dienových a trienových mastných kyselin UV spektrometrií Systém konjugovaných dvojných vazeb vzniká v lipidech při oxidaci polyenových kyselin na hydroperoxidy nebo během technologického zpracování olejů (např. při bělení). Kojugované dieny absorbují UV záření při 233 nm, konjugované trieny vykazují absorpční maxima při 268 a 278 nm a minima při 262 a 274 nm. Postup: vzorek se rozpustí v hexanu a změří se absorbance proti čistému rozpouštědlu. Absorbance se přepočtou na absorptivity a = A/(b.m) m je hmotnost tuku [mg] v 1 ml měřeného roztoku bsah konjug. dienů = 0,91. (a 233 0,07) [%] bsah konjug. trienů = 1,316. (a 268 0,5. (a 262 +a 274 )) [%] Poznámka: stanovení je rušeno přítomností barviv (karotenoidů...) Stanovení trans nenasycených kyselin v lipidech infračervenou spektrometrií Triacylglyceroly se konvertují na methylestery, které se rozpustí v sirouhlíku a měří se IČ spektrum v intervalu 1100-910 cm -1 (9-11 µm). Výška absorbačního píku při 970 cm -1 je úměrná obsahu dvojných vazeb v konfiguraci trans (deformační vibrace vazby C-H na uhlících vázaných dvojnou vazbou trans). Ke kvantifikaci se použijí kalibrační roztoky methylesteru elaidové (trans 9- oktadecenové) kyseliny. 12
Stanovení esenciálních mastných kyselin Podstatou stanovení je selektivní oxidace esenciálních MK kyslíkem za katalýzy lipoxygenasou (linoleát: 2 -oxidoreduktasou). Do molekuly se zavádí hydroperoxidová skupina a vzniká konjugovaný systém dvojných vazeb: R 2 H R H + R Měřeným ukazatelem obsahu esenciálních MK může být změna koncentrace kyslíku nárůst absorbace při 233 nm (konjugované dieny) nárůst obsahu hydroperoxidů lze měřit spektrofotometricky např. na základě detekce Fe 3+ vzniklých oxidací železnatých iontů hydroperoxidem: Fe 2+ + R---H + H + Fe 3+ R--H + H 2 Fe 3+ + n SCN - [Fe(SCN) n ] 3-n 13
STANVENÍ STUPNĚ ŽLUKLSTI TUKU Žluknutí: soubor chemických změn tuku, který vede ke zhoršení organoleptických vlastností. Zahrnuje především oxidační a hydrolytické reakce. Fáze oxidačního žluknutí a analytické ukazatele Fáze Ukazatel 1) tvorba hydroperoxidů peroxidové číslo obsah polárních látek 2) vznik aldehydů (epoxidů, p-anisidinové číslo cyklických peroxidů, thiobarbiturové číslo derivátů furanu...) obsah polárních látek 3) vznik oligomerních lipidů obsah oligomerů Peroxidové číslo je ukazatelem obsahu primárních produktů oxidace tuku. Vyjadřuje se v µval na 1 gram tuku (tj. v µmol (1/2 RH) nebo µmol (1/2 0 2 ) na gram tuku) nebo v µg aktivního kyslíku (1/2 0 2 ) na 1 gram tuku. Jodometrické stanovení peroxidového čísla probíhá na základě reakcí RH + 2I - + 2H + I 2 + RH + H 2 I 2 + 2S 2 3 2-2I - + S 4 6 2-. Vzorek tuku rozpuštěný v chloroformu se po přídavku octové kyseliny a nadbytku KI titruje odměrným roztokem Na 2 S 2 3. 14
Výpočet: PČ = 1000. c Na2S23. (V 1 -V 2 ) / m [µmol (1/2 RH).g -1 ] PČ = 1000. 16. c Na2S23. (V 1 -V 2 ) / m [µg (1/2 0 2 ).g -1 ] V 1 je spotřeba při titraci se vzorkem V 2 je spotřeba při titraci bez vzorku (slepý pokus) m je navážka tuku Zhodnocení výsledku Max. přípustná hodnota PČ tuku 10 µmol (1/2 RH)/g Tuk vysoké jakosti < 2 Zcela čerstvý tuk (olej) < 0,5 p-anisidinové číslo je měřítkem obsahu aldehydů (zejména 2-alkenalů), které vznikají jako sekundární produkty oxidace lipidů. Stanovuje se spektrofotometricky na základě reakce CH 3 NH 2 + R CH CH CH CH 3 N CH CH CH R - H 2 Reakce probíhá v roztoku tuku v isooktanu (nebo hexanu); rozpouštědlo a činidlo nesmí obsahovat zbytky vody. Absorbance produktu se měří při 350 nm. p-anisidinové číslo se vyjadřuje jako 100 násobek absorbance roztoku obsahujícího 1 g tuku spolu s činidlem ve 100 ml roztoku změřené v 1 cm kyvetě. Normální hodnota p-anisidinového čísla: 2,0 ± 0,5 15
Thiobarbiturové číslo se používá také k vyjádření obsahu aldehydů, zejména malondialdehydu a 2-alkenalů, s nimiž poskytuje 2-thio-barbiturová kyselina červeně zbarvené produkty (absorbance se měří při 530 nm) HS N H 2 + N HC CH H - 2 H 2 H N S CH CH CH N H H H N N SH reakcí činidla s alkanaly vznikají žlutě zbarvené produkty. Thiobarbiturové číslo je vhodné ke sledování střední fáze žluknutí, pokud tuk obsahuje polyenové mastné kyseliny. Thiobarbiturové číslo se vyjadřuje jako zvýšení absorbance při 530 nm v 1 cm kyvetě vyvolané reakcí vzorku s činidlem v roztoku obsahujícím 1 mg tuku v 1 ml. Hodnoty thiobarbiturového čísla čerstvý olej 0,005-0,02 žluklý olej > 0,1 16
bsah oligomerních lipidů se používá jako kritérium jakosti tuků ve smažících lázních. bsah oligomerů nesmí být vyšší, než 12 %. bsah oligomerů se stanovuje gelovou permeační chromato-grafií s refraktometrickou detekcí. Výsledný obsah se určí metodou vnitřní normalizace. Příklad Voltage [mv] 250 Triacylglyceroly 200 11,62 3 150 100 Látky s vyšší molekulovou hmotností 10,79 2 A Volné mastné kyseliny 50 0 10,35 1 A 14,59 4 16,15 5 Voda 0 5 10 15 20 Time [min.] Stanovení oligomerních triacylglycerolů metodou GPC (= píky označené A, obsah 14,9 %) Podmínky analýzy: Kolona: PL gel Mixed E 300 mm 7,5 mm 3 µm (Hewlett-Packard) Mobilní fáze: tetrahydrofuran, průtok 0,6 ml/min Příprava vzorku: 100 µl oleje vysušeno bezvodým Na 2 S 4 a rozpuštěno v 1,5 ml tetrahydrofuranu Nástřik: 5 µl Detekce: refraktometr, teplota 30 C 17
STANVENÍ XIDAČNÍ STABILITY TUKU xidační stabilita tuku závisí na přítomnosti nenasycených (zvláště polyenových) MK fyzikálních a chemických podmínkách přístup kyslíku, koncentrace kovů (Cu, Fe) teplota, osvětlení obsahu antioxidačních látek Důvody pro stanovení oxidační stability odhad doby skladovatelnosti tuku (oleje) účinnost antioxidantů Schaalův test 25 g oleje (tuku) se ve 150 ml kádince zahřívá na 60 C za přístupu vzduchu; průběžně (po 24 hodinách, později po několika dnech) se stanovuje peroxidové číslo (nebo se sleduje změna hmotnosti); z křivky PČ=f(t) se odečte indukční perioda (doba potřebná k nastartování rychlé tvorby peroxidů) Metoda aktivního kyslíku (100 C, probublávání oleje vzduchem) xipres (100 C, tlak 2 : 0,5 MPa, měření tlaku) 18