Transformace ptdna tabáku fúzním genem E7/GUS a eliminace selekčního genu za využití homologní rekombinace Jiřich ich BřízaB 1,, Josef Vlasák 1, Štěpán n Ryba, Viera Ludvíkov ková 3, Hana Niedermeierová 1 1 Biologické centrum AV ČR, v.v.i., Ústav molekulárn rní biologie rostlin, Branišovsk ovská 31, 37 5 České Budějovice, ČR Biologická fakulta Jihočesk eské univerzity, Branišovsk ovská 31, 37 5 České Budějovice, ČR 3 Ústav hematologie a krevní transfuze, Oddělen lení experimentáln lní virologie, U Nemocnice 1, 18 Praha, ČR http://www.hybridmedicalanimation.com/pages/chloroplast.html
Úvod v rámci grantu zabývajícího se produkcí proteinů lidského papilomaviru (HPV16) v rostlinách jsme přistoupili mj. k transformaci ptdna tabáku naše e předchozp edchozí práce ukázaly (Šmahel( et al.. 6, Bříza et al.. 7), že e samotný onkoprotein E7 je v buňkách vysoce nestabilní jeho stabilizace jsme dosáhli fúzovf zováním m s β- glukuronidázou (Vlasák et. al.. 6) pro transgenozi ptdna jsme se však v nejdříve rozhodli vyzkoušet fúzi f onkogenu E7 s genem aada (Ryba 6), který kóduje k enzym adenosyl-3 -adenyl adenyl transferázu a slouží tedy při p i plastidové transformaci jako gen selekční (rezistence ke spektinomycinu) ukázalo se však, v že e protein E7 byl v chloroplastech i ve fúzi se selekčním m proteinem aada velmi nestálý
transformační vektor obsahoval mezi sekvencemi plastidové DNA z oblasti sousedících ch genů rpob a trnc v oblasti LSC (integrační místo č.. 3) fúzní gen E7/GUS s promotorem z genu pro 16S rrna a s terminační sekvencí z genu rbcl z Chlamydomonas reinhardtii a gen aada se stejnými regulačními sekvencemi
listové segmenty velikosti zhruba x cm z in vitro rostlin tabáku Nicotiana tabacum var. Samsun položených vrchní stranou listu na agarovém médiu RMOP (Svab( et al.. 199) bez spektinomycinu zařízen zení od firmy Bio-Rad PDS 1/He Au částice velikosti,6 µm tlak hélia h 11 (asi 4,7 atm) ) psi, snížen ení tlaku v komoře e o 8 Hg,, vzdálenost mezi průtr tržným diskem a nosičem Au částic 6 mm, vzdálenost pohybu nosiče e Au částic 11 mm,,5 mg Au a,8 µg g DNA na střelu, vzdálenost letu Au částic 9 cm po dvou dnech kultivace při p i 4 C C a 16 hod. fotoperiodě s nízkou intenzitou osvětlen tlení byly segmenty rozstříhány na velikost zhruba 5x5 mm a umíst stěny spodní stranou na médium RMOP s 5 mg/l spektinomycinu regenerované prýty byly přeneseny p k zakořen enění na bezhormonáln lní médium se spektinomycinem
celkem získz skáno z x1 střel 9 spektinomycin rezistentních prýtů,, z toho zakořenilo na spektinomycinu a byla u nich změř ěřena aktivita GUS a PCR ověř ěřena integrace transgenu do ptdna Č. rostliny Aktivita* Č. rostliny Aktivita* Č. rostliny Aktivita* 31 46 336 169 346 3 15 337 347 8 33 187 338 535 348 34 98 339 349 14 35 114 34 35 368 36 13 341 351 46 33 8 34 185 35 48 333 3948 343 353 73 334 1646 344 354 791 335 345 7 * aktivita GUS v pmol/min/mg listu
potenciáln lně homoplasmické rostliny byly získz skány dlouhodobou kultivací případně regenerací (1-x) listových explantátů na médiu m RMOP se spektinomycinem poté byly tyto rostliny (celkem 15) přivedeny p do květu a zkříženy s netransgenní samčí rostlinou stejného kultivaru sklizená semena každé rostliny byly v množstv ství -4 vyseta na selekční médium (se spektinomycinem) bylo-li li potomstvo homogenně zelené,, usuzovali jsme na homoplasmii z hlediska genu aada vyskytly se však v i štěpné poměry zel. x žl.. resp. zel x bílé, b které značily heteroplasmii mateřských rostlin z hlediska genu aada (Tab. )
Č. rostliny Počet reg. cyklů Č. prim. transformanta Aktivita* mateř. r. Štěpnýpoměr zel. žl. bíl. 31X 31 46 196 367X 1 33 1557 198 46X 1 338 86 47X 1 338 197 49X 3 175 196 4 43X 3 1913 196 435X 33 5 199 437X 33 89 195 438X 3 1136 379 1 449X 33 376 198 454X 33 1431 146 53 46X 1 31 117 198 47X 31 19 17 7 475X 31 4 95 11 5X 1 34 175 73 15 * aktivita GUS v pmol/min/mg listu
část žlutých a bílých b semenáčků (tj. senzitivních čili bez genu aada) ) byla co nejdříve přenesena p ze selekčního média m na půdu p bez selekční látky tím m se podařilo zachránit většinu v těchto t rostlin (celkem 9 jedinců), které byly dále analyzovány ny měřm ěřením m aktivity GUS a PCR Č. rostliny Aktivita* Č. rostliny Aktivita* Č. rostliny Aktivita* 49X1 544 438X5 171 47X5 498 49X 543 438X6 9 47X7 377 49X3 537 438X7 665 47X8 883 49X4 653 438X8 79 47X9 889 43X1 599 438X9 37 5X1 118 43X 637 438X1 463 5X 84 438X1 586 47X1 19 5X3 185 438X 559 47X 58 5X4 65 438X3 46 47X3 65 5X5 774 438X4 77 47X4 46
9 rostlin s vysokou aktivitou GUS bylo autogamizováno no,, získanz skaná semena byla vyseta na MS médium m a u 15 náhodnn hodně vybraných semenáčků každého potomstva byla změř ěřena aktivita GUS z analyzovaných rostlin bylo vybráno 6 jedinců s vysokou aktivitou GUS (a jeden bez aktivity), kteří byli analyzováni ni PCR s primery P1 a P (průkaz přítomnosti genu aada) ) resp. P3 a P4 (průkaz přítomnosti genu gus) na základz kladě těchto výsledků bylo vybráno 8 rostlin, které byly dále d analyzovány ny Southernovou hybridizací (soy gus a rpob), RT-PCR na E7/GUS i aada a westernovou hybridizací (antigus,, antie7)
Č. rostliny Aktivita* Prům. aktivita potomstva Aktivita vybraných rostlin 438X8 79 6 5; 484; 453 47X 58 387 539; 494; 538 47X3 65 53 68; 661; 771; 677 47X4 46 45 64; 618 47X5 498 458 56; 59; 813; 855 47X9 889 336 445; 481 5X1 118 63 1374; 9; 155 5X 84 394 475; 635; 673; 469 5X3 185 48 851; 11 * aktivita GUS v pmol/min/mg listu
PCR: primery P1+P PCR: primery P3+P4
SB: soa rpob SB: soa GUS
RT-PCR: E7/GUS RT-PCR: aada
WB: antigus Transformace genem E7/GUS
výsledkem je získz skání 6 homoplasmických rostlin nesoucích ch pouze gen E7/GUS,, jedné rostliny pouze s genem aada a jedné rostliny nesoucí v její ptdna buď oba geny v původnp vodní konfiguraci nebo pouze fúzní gen E7/GUS fúzní protein E7/GUS však, v zdá se, ani v tomto případě nevzniká,, detekován n byl pouze protein GUS