Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-rt-pcr

VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, v.v.i. Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-rt-pcr Metodika pro Státní rostlinolékařskou správu Jana Jarošová, Jaroslav Polák & Jiban Kumar Praha, 2008

Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-rt-pcr Ing. Jana Jarošová Doc. Ing. Jaroslav Polák, DrSc. Ing. Jiban Kumar, PhD. * Výzkumný ústav rostlinné výroby v.v.i. odbor rostlinolékařství, oddělení virologie Drnovská 507, 161 06 Praha-Ruzyně * korespondujicí autor: e-mail: jiban@vurv.cz Tato práce byla financována z projektu QG0123. Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008 ISBN: 978-80-87011-86-7 2

Anotace (česky) Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-rt-pcr Předkládaná metodika detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-rt-pcr zahrnuje takové metodické přístupy, které umožňují diagnostikovat tři nejběžnější viry peckovin (virus šarky švestky - PPV, virus zakrslosti slivoně - PDV, virus nekrotické kroužkovitosti slivoně - PNRSV) v jedné reakci, čímž snižují ekonomické i časové nároky potřebné pro detekci. Podstatou zkoušky je zjistit ve vzorku RNA přítomnost nukleotidových sekvencí specifických pro PPV, PDV a PNRSV. Metodika je využitelná pro potřeby orgánů státní správy při provádění monitoringu viróz na peckovinách i pro zprostředkované využití soukromými pěstiteli. Metodika zahrnuje přesný postup od odběru vzorku až po vyhodnocení výsledků. Anotace (anglicky) Methodology of molecular detection of stone fruit viruses by RT-PCR and multiplex RT-PCR The methodology of molecular detection of stone fruit viruses by RT-PCR and multiplex RT- PCR includes approaches, which enable to detect the most common stone fruit viruses (Plum pox virus - PPV, Prune dwarf virus - PDV, and Prunus necrotic ringspot virus - PNRSV) in one reaction and thus reduces time and money requirements. The essence of the test is to detect presence of RNA specific for each virus in the sample. The methodology is usable for state administration bodies when monitoring stone fruit viruses occurrence as well as mediated for purposes of private growers. The methodology includes exact procedure description, from collecting samples to results evaluation. Oponenti: Ing. Gabriela Červená, Ph.D. Státní rostlinolékařská správa Šlechtitelů 23/773, 779 00 Olomouc Doc. Ing. Pavel Ryšánek, CsC. ČZU, FAPPZ, Katedra ochrany rostlin Kamýcká 129, 165 21 Praha 6 Suchdol Metodika byla schválena odborem vědy a výzkumu, MZe ČR pod č. j.:47968/08-18020 ze dne 30.12.2008. 3

Obsah Cíl... 5 Úvod... 5 Rozšíření virů peckovin v ČR... 6 Principy ochrany... 7 Biologie a škodlivost virů peckovin... 7 Biologie vektorů PPV... 11 Zjišťování výskytu... 13 Metodika Multiplex RT-PCR pro detekci PPV, PDV a PNRSV... 14 Odběr vzorku... 15 Izolace RNA... 15 One-step-RT-PCR... 17 Two-step-RT-PCR... 19 Vizualizace PCR produktů... 20 Srovnání novosti postupů... 21 Popis uplatnění metodiky... 21 Seznam použité související literatury... 21 Seznam publikací, které předcházely metodice... 24 4

Cíl Cílem metodiky bylo vyvinout rutinní diagnostickou metodu schopnou spolehlivě a citlivě současně detekovat tři nejběžnější viry peckovin - virus šarky švestky (PPV), virus zakrslosti slivoně (PDV) a virus nekrotické kroužkovitosti slivoně (PNRSV). Úvod Pěstování peckovin je důležitá součást zemědělství mírného a subtropického pásma, z jak ekonomického, tak i kulturního hlediska. Peckoviny jsou důležitou skupina ovoce, z nějž nejvýznamnějšími druhy jsou švestky (Prunus domestica), broskvoně (Prunus persica), meruňky (Prunus armeniaca), třešně (Prunus avium) a višně (Prunus cerasus). Světová produkce peckovin dosahuje přibližně 30 miliónů tun ročně, přičemž přes deset miliónů tun je vyprodukováno v Evropě a 30 000 tun v České republice (FAOSTAT databáze). Existuje mnoho virových původců chorob infikujících peckoviny. Nejzávažnější virovou chorobou je bezesporu šarka švestky, způsobená virem šarky švestky-plum pox virus (PPV). Způsobuje významné ztráty na výnosech, které mohou dosáhnout u náchylných odrůd až 95%, a je široce rozšířena ve většině států Evropy, v řadě zemí Asie a na severu Afriky - Turecko, Egypt, Sýrie, Indie (Simon et al., 1997), pravděpodobně i Čína, v Severní i Jižní Americe - Chile, Argentina, USA a Kanada (Malinowski et al., 2006). PPV je přenášen velkým počtem mšic necirkulativním, nepersistentním způsobem. PPV virulentní mšice může tudíž strom nakazit jediným akvizičním sáním na zdroji infekce. Mezi nejzávažnější Ilarviry napadající peckoviny patří virus zakrslosti slivoně - Prune dwarf virus a virus nekrotické kroužkovitosti slivoně - Prunus necrotic ringspot virus. Tyto viry, samotné nebo v kombinaci, mohou snížit výnos, dozrávání plodů a růst stromů. Krom vegetativního přenosu jsou přenášeny i pylem a semenem, což napomáhá jejich rozšíření (Saade et al., 2000). Všechny tyto viry mohou být přítomny v pletivech stromů samostatně nebo v kombinacích. Vyšší rostliny jsou běžně napadány několika viry současně, a mnoho chorob je způsobeno interakcí dvou nebo více nezávislých virů (Pruss et al., 1997). Ochrana peckovin proti virovým chorobám spočívá v získávání a produkci zdravého množitelského materiálu, čehož se v Evropě dosahuje certifikačními programy, které jednotlivé státy samostatně vypracovávají podle certifikačního schématu EPPO. Stromy jsou pěstovány z otestovaného viruprostého množitelského materiálu v izolaci od potencionálních zdrojů choroby a před předáním pěstitelům testovány. Nejčastěji používanou metodou je 5

imunologická metoda ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), nicméně její výsledky by měly být brány s jistou dávkou obezřetnosti, neboť distribuce viru v rostlině není jednotná a předvídatelná (Ogawa et al., 1995). ELISA také není schopna detekovat virus přítomný ve velmi nízkém titru, což je u směsných infekcí možné (Sánchez-Navarro et al., 2005). Alternativně se dají použít klasické biologické testy na indikátorových rostlinách, jako broskvoně cv. GF 305 nebo višeň plstnatá (Prunus tomentosa) (Ogawa et al., 1995). Tyto testy jsou ovšem časově velmi náročné (od měsíců po 2-3 roky), drahé a ve většině případů musí být výsledky potvrzeny jinou detekční metodou (Sánchez-Navarro et al., 2005). Krom ELISY se v mnoha zemích používá molekulárních metod jako RT-PCR (Ogawa et al., 2005). Molekulární metody nabízí praktickou alternativu metodám předchozím, díky své vysoké specifičnosti a detekčním limitům. Multiplex polymerázová řetězová reakce (PCR) je variantou PCR, v níž dvě a více cílových míst je současně amplifikováno v jedné reakci. Od svého prvního popisu v roce 1988 (Chamberlain et al, 1998) byla tato metoda úspěšně uplatněna v mnoha oblastech molekulární biologie (Henegariu et al., 1997). Metody, které umožní simultánní detekci více virů jsou pro rutinní testování žádoucí, neboť vyžadují méně času, práce a nákladů. V tomto smyslu multiplex RT-PCR je schopna spolehlivě detekovat viry a viroidy v rutinní diagnostice (Sánchez-Navarro et al., 2005). Rozšíření virů peckovin v ČR V České republice byl výskyt viru šarky švestky prokázán v přírodě i v ovocných sadech na všech druzích peckovin vyjma třešně a višně. Je široce rozšířen ve stromech švestky a myrobalánu i v některých výsadbách meruňky a broskvoně. Onemocnění peckovin šarkou se v současné době vyskytuje plošně nejen v nížinách, ale i v podhůří a vyšších polohách, kde ještě před třiceti nebo čtyřiceti lety byly švestky zdravé. Slabší výskyt viru je pouze v jižních Čechách a na jižní Moravě. K přírodním hostitelům tohoto viru patří trnky, které byly infikovány přenosem mšicemi ze švestek, slivoní a myrobalámu a staly se sekundárním zdrojem infekce (Polák, 2006). Virus zakrslosti slivoně je v současnosti rozšířen převážně na trnkách, třešni a myrobalánu. Na třešni a myrobalánu je také rozšířen virus nekrotické kroužkovitosti slivoně (Polák, 2007). Výskyt viru chlorotické skvrnitosti jabloně (ACLSV) a viru mozaiky jabloně, které na švestce a slivoních mohou vyvolávat příznaky podobné šarce, tzv. pseudošarku, je v ČR ojedinělý. Ve výsadbách třešně se může také vyskytnout virus 6

svinutky třešně (Cherry leaf roll virus - CLRV), avšak i jeho výskyt je sporadický. Rozšíření virů v ČR je uvedeno v tabulce č. 1. Tab.č.1. Rozšíření virů na peckovinách v ČR, uvedeno v procentech infikovaných rostlin (Polák, 2007). Virus PPV PDV PNRSV ACLSV ApMV CLRV Švestka 74% 2% 27% 1% 1% - Myrobalán 26% 11% 18% 1,8% 0,6% - Trnka 5% 27% 4% 0% 0% - Třešně a višně 0% 25% 22% - - 1,8% Principy ochrany Základem ochrany proti virům peckovin je zdravý výsadbový materiál. Vysazení zdravého, viruprostého školkařského materiálu nám však ještě nemusí zaručit, že během několika málo let nedojde k infikování mladých stromů virem šarky švestky, který je snadno přenosný mšicemi. Virem infikované stromy nelze léčit, neexistují žádné chemické ani biologické prostředky, kterými by bylo možno stromy ošetřit a uzdravit nebo je před virovou infekcí chránit tak, jako tomu je v případě bakteriálních a houbových chorob. Jedinou možností účinné ochrany proti rostlinným virům je pěstování odolných rezistentních, nebo dokonce imunních odrůd peckovin. Problém viru šarky švestky můžeme proto vyřešit pěstováním odrůd slivoní, švestky, meruňky a broskvoně rezistentních k viru šarky švestky (Polák, 2006). Proti ostatním virům nejsou zatím známy zdroje rezistence ani naprosto rezistentní odrůdy. Biologie a škodlivost virů peckovin Všechny výše zmíněné viry jsou jednovlákné RNA viry. Existuje šest skupin viru šarky švestky: PPV-D (Dideron), PPV-M (Marcus), PPV-EA (El Amar), PPV-C (Cherry), PPV-Rec (Recombinant) a nedávno identifikovaný PPV-W (W3174) (James a Varga, 2004). PPV-D a PPV-M jsou dvě hlavní skupiny viru, obě široce rozšířené v Evropě, a vykazují závažné rozdílnosti v patogenitě a některé ve svých epidemiologických vlastnostech. Liší se hlavně v intenzitě choroby mezi jednotlivými druhy Prunus spp. a schopnosti infikovat broskvoň (P. persica) přenosem mšicemi (Quijot et al., 1995). Skupina kmenů PPV-M a konkrétně originální kmen PPV-M izolovaný ve Francii vykazuje nejvyšší patogenitu a nejsilnější 7

příznaky na listech i plodech peckovin. Ve střední Evropě v Polsku (Malinowski, 2003), České republice (Polák a Pívalová, 2005) i v Rakousku (Laimer et al., 2003) převládá rozšíření slaběji patogenního kmenu PPV-D, více než 90% infikovaných stromů je infikováno PPV-D. Mezi přírodními hostiteli se jiný kmen než PPV-D téměř nevyskytuje. Přesto existují sady meruněk a broskvoní infikovaných PPV-M. Ojedinělě byl zjištěn i rekombinantní kmen PPV-Rec. Jiná situace je v dalších evropských zemích a v jihovýchodní Evropě, v Bulharsku a Řecku, kde převládají kmeny ze skupiny PPV-M. Např. Kamenova et al. (2003) zjistili v Bulharsku na meruňkách a broskvoních pouze PPV-M, na švestkách dosahuje podíl PPV-M 88%. Virus zakrslosti slivoně byl pojmenován svými objeviteli v roce 1936. Jméno zůstalo, ačkoli výskyt PDV na slivoni je mnohem méně běžný než na jiných druzích rodu Prunus. Nejčastěji se vyskytuje na višni (P. avium) (Németh, 1986). Příznaky se obvykle několik let po infekci vůbec neprojeví, občas může být v prvním roce infekce zaznamenáno žloutnutí listů. Projev příznaků je nejpravděpodobnější asi dva týdny poté, co se noční teploty pohybují okolo 10-15 C a denní vyšplhají nad 30 C. Napadené listy jsou zkroucené, žlutozelené, zelené podél hlavních žil. Může docházet k opadávání listů. U napadených stromů se může vyvinout vrbovitý vzhled s růstem dlouhých holých větví. Na třešních (P. cerasus) napadených PDV mají listy normální zabarvení a vigor, ale jsou užší a delší než je obvyklé. Symptomy mohou být omezeny jen na část stromu. Výnos u višní může být snížen až o 50% (Pscheidt, 2008). PNRSV je lehce přenosné očkováním a roubováním. Šíří se také přirozeně v sadech infikovaných semenem a pylem, tudíž, přirozené šíření je až do věku stromů, kdy začnou kvést, značně omezené. Virus se šíří rychleji na višních (P. avium) než na třešních (P. cerasus). Díky šíření pylem může vysoké procento semen obsahovat PNRSV (Pscheidt, 2008). Některé izoláty nejsou symptomatické, zatímco jiné vyvolávají tvorbu charakteristických chlorotických kroužků a dírek v mladých listech. U třešní byly popsány dva izoláty podle toho, zda tvoří jemné kadeřavění listů (M) nebo mozaiku (R) (Aparicio et al., 1999). Mezi klasické příznaky patří také deformace listů a zakrslost. Postiženy mohou být celé rostliny nebo jen část. Na rozdíl od PDV, příznaky jsou více viditelné při vysokých teplotách (Németh, 1986). Výnos stromů napadených běžným izolátem klesá o cca 5% (Pscheidt, 2008). Stubbs a Smith (1971) a Scott et al. (2001) zaznamenali synergickou reakci Prune dwarf virus a Prunus necrotic ringspot virus způsobující zakrslost broskvoně. Častým příznakem této směsné infekce je tvorba rozet. 8

Obrázek č. 1. Plody meruňky (P. armeniaca) se symptomy PPV. Zdravý plod je vpravo dole. (foto INRA Bordeaux, France). Plod meruňky (P. armeniaca) s charakteristickými kroužkovými mozaikami na pecce (foto J. Kumar, VÚRV v.v.i.). Obrázek č. 2. Kroužky a difúzní skvrny na listech meruňky (P. armeniaca)cv. Carola, infikované PPV. (foto J. Polák, VÚRV v.v.i.) Obrázek č. 3. Symptomy na listech slivoně (P. domestica) způsobené PPV. (foto J.Kumar, VÚRV v.v.i.). 9

Obrázek č. 4. Povrchové propadliny a vnitřní nekrózy způsobené PPV na plodech švestky domácí (P. domestica). (foto INRA Bordeaux, France). Obrázek č. 5. Symptom na listech náchylné broskvoně (P. persica). (foto J. Polák, VÚRV v.v.i.). Obrázek č. 6. Plod broskvoně cv. Catherina s typickými kroužky a difuzními skvrnami vyvolanými PPV. (foto J. Polák, VÚRV v.v.i.). Obrázek č. 7. Příznaky PNRSV na listech broskvoně (P. persica). (foto E.V.Podleckis, West Virginia University) 10

Obrázek č. 8. Listy třešně s příznaky chlorotické skvrnitosti a kroužkovitosti v nichž byla prokázána přítomnost PNRSV (P. cerasus) (foto a. Oregon State University; b. J. Polák, VÚRV v.v.i.) Obrázek č. 9. Příznaky PDV na listech a) višně (P. avium) (foto Oregon State University) a b) třešně (foto J. Polák, VÚRV v.v.i.). Biologie vektorů PPV V přírodě je šarka šířena mšicemi. Virus šarky švestky je přenášen mšicemi nepersistentním způsobem na stiletech mšic. Mšice je schopna virus získat nasátím již při zkusmém sání během několika minut. Po nabývacím sání je schopna jej přenést na zdravou rostlinu během několika minut inokulačního sání. Použití insekticidů je prospěšné pro hubení mšic, ale nezabrání přenosu viru v případě, že mšice již má virus na stiletech a přilétá z neošetřených stromů. V tom případě může virus přenést dříve, než se projeví působení insekticidu. PPV přenáší řada druhů mšic, proto jmenujeme jen ty nejvýznamnější a nejrozšířenější vektory: mšice broskvoňová (Myzus persicae) - obr.14, mšice chmelová (Phorodon humuli) - obr.13, a 11

mšice slívová (Brachycaudus helichrysi) - obr.11. Zdroji infekce pro přenos šarky mšicemi jsou nemocné stromy peckovin v sadech a zahradách. Infikované stromy švestky, meruňky, broskvoně, ale především i planě a přirozeně rostoucí stromy myrobalánu, švestky, a v oblastech se silným výskytem šarky i keře trnky, jsou zde sekundárním zdrojem infekce. Významnými rezervoáry viru jsou stará stromořadí švestky, keře a stromy myrobalánu rostoucí podél venkovských silnic a cest (Polák, 2002). Obrázek č. 10. Mšice švestková Hyalopterus pruni. (foto W.Cranshaw, Colorado State University) Obrázek č. 11. Mšice slívová Brachycaudus helichrysi. (foto H.J.Buhr, Germany) Obrázek č. 12. Mšice bodláková Brachycaudus cardui. (foto INRA Bordeaux, France) 12

Obrázek č. 13. Mšice chmelová Phorodon humuli (foto G. Eickelmann, Geisenfeld, Germany) Obrázek č. 14. Mšice broskvoňová - Myzus Persicae (foto University of Minnesota) Zjišťování výskytu Jediná možná spolehlivá metoda zjišťování výskytu je testování rostlin. Mnohé infikované rostliny nevykazují, alespoň ze začátku, příznaky choroby, stejné příznaky mohou být vyvolány různými viry, a je tudíž u mnoha případů nemožné chorobu diagnostikovat čistě symptomaticky. Symptomatika tedy slouží pouze jako pomocné kritérium hodnocení infekce (Pscheidt, 2008). Virus nemusí být ve stromech rovnoměrně rozšířen, je distribuován nerovnoměrně, a jeho koncentraci ovlivňují klimatické podmínky a roční období. Pro diagnostiku za pomoci testu ELISA jsou nejvhodnější listy a květy. V podmínkách ČR se provádí stanovení PPV v květech během měsíce dubna a května, a v listech koncem května a v červnu, později obsah viru v listech klesá. V diagnostice méně příznivých obdobích, jako je zima, kdy je nutno odebírat vzorky zelené kůry, by tedy neměly být výsledky dosažené metodou ELISA brány jako spolehlivé (Spiegel and Martin, 1993). Polymerázová řetězová reakce (PCR) je vysoce citlivá spolehlivá metoda, která našla uplatnění při mnoha problematických detekcích, obzvláště v diagnostice kmenů virů a stanovení přítomnosti 13

virů v odrůdách se zvýšenou rezistencí. Multiplex RT-PCR je schopna detekovat více virů současně a tudíž je výhodná z hlediska časového i ekonomického. Metodika Multiplex RT-PCR pro detekci PPV, PDV a PNRSV Předkládaná multiplex RT-PCR byla otestována na vzorcích odebraných ze švestky domácí (Prunus domestica L.), třešně ptačí (P. avium (L.) L.), třešně višně (P. cerasus L.), višně plstnaté (P. tomentosa Thunb.), meruňky obecné (P. armeniaca L.), broskvoně obecné (P. persica (L.) Batsch), a trnky obecné (P. spinosa L.) a na její citlivost nebyl zaznamenám vliv druhu rostliny. Dále byla otestována a potvrzena schopnost detekovat jednotlivé kmeny viru šarky švestky nacházející se na území ČR, a to PPV-D, PPV-M a PPV-Rec. U PDV a PNRSV jsme testovali dostupné izoláty z ČR a Rumunska. Diagnostická citlivost a specifičnost byla testována celkem na 80 vzorcích a porovnána s metodou simplex RT-PCR schopnou detekovat v jedné reakci pouze jeden virus (viz tabulka č. 2). Mezi oběma metodami nebyly shledány žádné rozdíly. Tabulka č. 2: Porovnání diagnostické citlivosti a specifičnosti metody simplex one-step-rt-pcr a multiplex one-step-rt-pcr. Izolát Hostitel Původ Počet vzorků Simplex one-step-rt-pcr Multiplex one-step-rt-pcr PPV PDV PNRSV PPV PDV PNRSV Peach Broskvoň CZ 5 + + + + + + Cherry Třešeň CZ 12 + + + + Sour cherry Višeň CZ 14 + + Blackthorn Trnka CZ 3 + + Plum1 Slivoň CZ 5 + + + + Plum2 Slivoň Rumunsko 8 + + + + Plum3 Slivoň CZ 5 + + + + Nanking Cherry Višeň plstnatá Itálie 2 + + Plum4 (a) Slivoň (a) CZ 5 + + Plum5 (b) Slivoň (b) CZ 20 + + Apple (c) Jabloň (c) CZ 1 - - - - - - (a) PNRSV isolates, (b) PPV isolates, (c) ApMV isolates., CZ-Česká republika 14

Odběr vzorku Správný odběr vzorku je nesmírně důležitý pro úspěšnou detekci. Ideální čas k odběrům je pozdní jaro, kdy je obvykle koncentrace viru ve stromech vysoká. Odebíráme nejlépe symptomatické středně staré listy, pokud možno rovnoměrně ze čtyř míst po obvodu koruny a z jednoho místa středu koruny stromu. Odebereme 1-2 g vzorku k homogenizaci. Listy dopravíme v chladu do laboratoře, kde je buď ihned zpracujeme, nebo uchováváme při -80 C. Je také možno odebírat kůru nebo okvětní plátky, přičemž platí stejná pravidla. Izolace RNA Dalším důležitým krokem pro úspěšnost reakce je izolace kvalitní RNA v dostačující kvantitě a kvalitě. Pletiva dřevitých rostlin, obzvláště venku rostoucích, obsahují vyšší množství fenolických složek a polysacharidů, které mají inhibující vlastnosti (Nassuth et al., 2000). Tyto látky tvoří chemické vazby s nukleovými kyselinami i proteiny při homogenizaci vzorku (Newbury & Possingham, 1977). Přítomnost inhibitorů poté ovlivňuje aktivitu reversní transkriptázy anebo polymerázy a tím i spolehlivost celé reakce. Výsledek může být tedy negativní, ačkoli je virus v pletivu přítomen (Nassuth et al., 2000). Doporučujeme tedy modifikovaný postup izolace přizpůsobený pro pletiva stromů jako je popsána v Singh et al. (2002), pokud upřednostňujete izolaci fenol-chloroformem; nebo v případě používaní kolonkové metody izolace, modifikaci podle Mekuria et al. (2003). Kvalitu izolované RNA je vhodné zkontrolovat spektrofotometricky a na agarózovém gelu. Při spektrofotometrickém měření se vzorek nejprve naředí destilovanou vodou, obvykle 1:9 (RNA:H 2 O). Měří se při vlnových délkách 260, 230 a 280 nm. To umožní hodnocení čistoty vzorku, očekávané poměry 260/280 a 260/230 jsou 2.0 pro RNA. Poměr absorbancí 260/280 menší než 1.75 svědčí pro obsah kontaminujících bílkovin. Absorbance při 230 nm značí nečistoty, jako jsou karbohydráty, fenolické sloučeniny, aromatické složky. Při výpočtu koncentrace optická hustota 1 odpovídá přibližně 40 ng/µl pro RNA. Vypočtená koncentrace by se měla pohybovat mezi 200-1000 ng/µl. Tyto hodnoty slouží pouze k orientačnímu odhadu čistoty a koncentrace RNA, hodnoty, které nám umožní utvrdit se v konečném výsledku RT-PCR (např. v případě izolace RNA o koncentraci 700 ng/µl, poměrům 260/280 a 260/230 rovným 2 a negativního výsledku RT-PCR, kdy byl pozitivní výsledek u pozitivní kontroly, máme jistotu, že v daném vzorku virus opravdu není). Integritu izolované RNA je dále dobré zkontrolovat na denaturujícím agarózovém gelu. Většinu izolované RNA tvoří RNA rostlinná a opět z rostlinné RNA převládá ribozomální RNA. Ta se na gelu rozdělí na dva silné bandy - 18s a 28s ribozomální RNA, přičemž 15

intenzita bandu 28s by měla být u intaktní neporušené RNA přibližně dvojnásobná intenzitě bandu 18s. Pokud nesouhlasí poměr 2:1 nebo jsou na gelu viditelné jen šmouhy, celistvost RNA byla porušena. Protokol I. Izolace RNA modifikovanou kolonkovou metodou firmy Qiagen - RNeasy Plant Mini Kit A) Homogenizace vzorku za použití tekutého dusíku 1. Pro izolaci RNA potřebujeme 0,2 g rostlinného pletiva. Výhodnější je ovšem homogenizovat více a z homogenátu 0,2 g navážit. Vzorky homogenizujeme v tekutém dusíku, u vzorků uchovávaných na -80 C dbáme na to, aby nedošlo k jejich rozmražení, ideálně odebíráme z mrazicího boxu po každém vzorku zvlášť. Vzorek pečlivě homogenizujeme v předmražené třecí misce. 2. Homogenát vpravte do min. 3 ml sterilní zkumavky (pokud jsou uchovávány na -80 C v 2 ml mikrozkumavkách, doporučujeme celou zkumavku před začátkem izolace ponořit do tekutého dusíku a poté obsah jednoduše přesypat do větší zkumavky). 3 ml zkumavky je také možno předmrazit krátkým ponořením do tekutého dusíku. Je velmi důležité nepřesáhnout danou váhu, neboť u kolonkových metod izolace RNA dochází v tomto případě ke sníženému výtěžku i kvalitě RNA. Jakmile máme vzorky navážené, je opět nutno zabránit jejich rozmražení před samotnou izolací - vhodné je uchování v tekutém dusíku nebo v mrazicím boxu. 3. Přidejte 2 ml extrakčního RLT pufru s přídavkem PVP-40 (4,4% - hmotnost/objem) a sodium metabisulphite (1% - hmotnost/objem). 4. Krátce vortexujte. B) Homogenizace vzorku bez tekutého dusíku Bez tekutého dusíku lze homogenizovat pouze listy čerstvé. Jeho druhou nevýhodou je, že je před homogenizací nutno odvážit 0,2 g, a tedy ztrácíme možnost homogenizovat větší množství materiálu a zvýšit tím pravděpodobnost výskytu viru právě v daném odebraném materiálu. 1. Připravte si modifikovaný RLT pufr z komerční soupravy RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) - k pufru přidejte PVP-40 (4,4% - hmotnost/objem) a sodium metabisulphite (1% - hmotnost/objem). Na jeden vzorek bude zapotřebí 2 ml takto připraveného extrakčního pufru. 2. 0,2 g rostlinného pletiva vložte do homogenizačního igelitového pytlíku (stejný jako pro přípravu vzorků na ELISA test). 16

3. Přidejte 2 ml extrakčního RLT pufru z komerční soupravy RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) s přídavkem PVP-40 (4,4% - hmotnost/objem) a sodium metabisulphite (1% - hmotnost/objem) 4. Pečlivě homogenizujte. Izolace RNA 5. 500 µl homogenátu odeberte do 2 ml mikrozkumavky, přidejte 60 µl 20% sarcosylu (N-lauroyl-sarcosine, Sigma). 6. Inkubujte při 70 C po dobu 10 minut. 7. Obsah přeneste do QIAshredder mini kolonky (fialová) a centrifugujte 5 min při rychlosti 14 000 rpm. 8. Do nové 2 ml mikrozkumavky odeberte supernatant (cca 350 µl) a přidejte 315 µl 95% etanolu. 9. Promíchejte a celkový obsah napipetujte do QIA spin kolonky (růžová) a centrifugujte 15 s při 8000 x g (10,000 rpm). 10. Supernatant odstraňte. 11. Přidejte 700 µl RW1 promývacího pufru. Centrifugujte 15 s při 8000 x g (10,000 rpm). 12. Supernatant odstraňte. 13. Přidejte 500 µl RPE pufru, správně rozředěného čistým etanolem. Centrifugujte 15 s při 8000 x g (10,000 rpm). 14. Supernatant odstraňte. 15. Ještě jednou přidejte 500 µl RPE pufru, správně rozředěného čistým etanolem. Centrifugujte 2 min při 8000 x g (10,000 rpm). 16. Supernatant odstraňte. 17. Vložte kolonku do nové zachycovací 2 ml mikrozkumavky a na sucho centrifugujte po dobu 1 min na nejvyšší rychlost centrifugy. 18. Kolonku přendejte do 1,5 mikrozkumavky; přímo na membránu napipetujte 40 µl RNase free vody a stočte na 10,000 rpm po dobu 1 min. Tím se uvolní RNA. 19. Kolonku odstraňte, RNA uchovávejte v -20 C nebo -80 C. One-step-RT-PCR Z hlediska rychlosti a spolehlivosti je vhodnější používat one-step-rt-pcr, neboť redukcí kroků je sníženo riziko chyby a kontaminace. Při použití kitu QIAGEN OneStep RT-PCR je protokol následující: 17

1) 5 µl 5x pufr (konečná koncentrace 2.5 mm MgCl 2 ), 1 µl dntps (konečná koncentrace 200 µm každý nukleotid), 1 µl Q solution, 0.6 µl každého primeru (viz tabulka č. 3) o koncentraci 10 µm, doplnit RNase a DNase free H 2 O do 23 µl a přidat 2 µl RNA. 2) Podmínky reakce jsou: I) 50 C po dobu 30 min (reverzní transkripce); II) 95 C po dobu 10 min (aktivace HotStarTaq polymerázy); III) 35 cyklů ve třech krocích: 94 C po 20 s (denaturace), 51 C po 30 s (dosedání) a 72 C po dobu 1 min (polymerizace); IV) 72 C po dobu 10 min (konečné prodlužování) a V) 10 C uchovávání. Obrázek č. 15. Schéma zpracování vzorků metodou One Step RT-PCR. 18

Two-step-RT-PCR Při two-step-rt-pcr v jedné reakci nejprve dojde reverzní transkripcí k tvorbě cdna a v druhé reakci (PCR) k amplifikaci daných cílových úseků nukleové kyseliny. Protokol je následující: 1) Pro reverzní transkripci použijeme I) 10 µl H 2 O, 0.6 µl reverzních primerů (viz tabulka č. 3) o koncentraci 10 µm (PPV- RR, PNcpinR, PDVdpR) a 2 µl RNA a necháme po dobu 5 minut při 70 C dosednout primery. II) Okamžitě zchladíme a III) podle návodu výrobce používané reverzní transkriptázy pokračujeme. Zde je pro ukázku protokol za použití AMV reverzní transkriptázy (Promega). V mastermixu smícháme 5μl AMV Reverse Transcriptase 5X Reaction pufru, 2 μl dntps mix (konečná koncentrace 200 µm každého nukleotidu), 40 jednotek (40mM) RNasin Ribonuclease Inhibitor sodium pyrofosfát (předehřátý na 42 C), 2.5μl AMV RT (30 jednotek) a doplníme vodou bez nukleáz tak aby celkové množství i s již předtím namíchanou směsí RNA-primer-voda bylo 25 µl, tedy v tomto mastermixu do 12.4 µl. IV) Rozpipetujeme do směsi RNA-primer-voda - při pipetování jednou špičkou pozor na možnost kontaminace! 2) Při PCR použijeme v mastermixu I) 0.6 µl každého primeru o koncentraci 10 µm (při konečném obsahu jedné reakce 25 µl) a 2 µl cdna. II) PCR podmínky se mohou lišit podle používané polymerázy, proto zde jen pro ilustraci uvedeme protokol za použití Go Taq polymerázy s 5X Green GoTaq reakčním pufrem, který v sobě již obsahuje barvivo DNA (Promega). Mastermix se v tomto případě skládá z (1) 5 µl pufru (1.5 mm MgCl 2 ), 2 µl dntps (200 µm každého nukleotidu), 0.6 µl každého primeru o koncentraci 10 µm, 0.2 µl (2,5 U) GO Taq polymerázy (Promega, Medison, USA) a doplníme RNase-free H 2 O do celkového množství 23 µl. (2) Rozpipetujeme do jednotlivé mikrozkumavky velikosti 0,5 ml nebo 0,2 ml (dle typu termocycleru) a přidáme 2 µl cdna. III) Podmínky reakce jsou 95 C po dobu 2 min (iniciální denaturace); 19

IV) 35 cyklů po třech krocích - 95 C po dobu 20s (denaturace), 51 C po dobu 30s (dosedání primeru neboli aneling), 72 C po dobu 1 min (polymerizace); V) 72 C po dobu 10 min (konečné prodlužování) a VI) 10 C uchovávání. Vizualizace PCR produktů Vizualizace PCR produktů probíhá za pomoci eletroforetického rozdělení fragmentů v agarózovém gelu (je doporučeno použití 1,5-2,5 % gelu pro lepší oddělení jednotlivých produktů) s předchozím označením DNA za použití etidium bromidu (0,5 µg/ml) nebo Syber Greenu (0,1 µl Syber Green/ 10 ml gel). Agarózový gel se připravuje v TAE (40 mm Trisacetát, 1 mm EDTA, ph 8) nebo TBE pufru (89 mm Tris base, 89 mm kyseliny trihydrogenborité, 1 mm EDTA, ph 8). Etidium bromid nebo Syber Green se dá používat buď přímo do gelu nebo namíchat do PCR produktu. Z hlediska bezpečnosti práce však doporučujeme používat Sybr Green, u kterého nebyl prokázán negativní dopad na lidský organismus. 5 μl produktu obarveného barvivem (6x loading dye), je nanášeno na gel a podstoupeno 3-9 V/cm po dobu 60-90 min dle velikosti gelu. V případě použití zeleného pufru dodávaného k enzymu Go Taq (Promega) - viz. two step RT-PCR - již není zapotřebí produkty barvit a můžeme přímo z cykleru nanášet na gel. Produkt primerů PPV-RR a F3 je dlouhý 345 bp; PDVdpR a PDVdpuF 220 bp a PNcpR a PNcpinF tvoří 425 bp dlouhý produkt (viz. Obrázek č. 16). Tabulka č. 3 Seznam primerů Primer Sekvence 5-3 T m Target By PPV-RR CTCTTCTTGTGTTCCGACGTTTC 59 C PPV F3 GGAATGTGGGTGATGATGG 57 C PPV PDVdpR CCT TTA ATG AGT CCG T 56 C PDV PDVdpuF CCG AGT GGA TGC TTC ACG 58 C PDV PNcpR CTTTCCATTCGGAGAAATTCG 54 C PNRSV PNcpinF GAGTATTGACTTCACGACCAC 57 C PNRSV Varga & James, 2005 Varga & James, 2006 20

Obrázek č. 16. Multiplex RT-PCR. Vzorky 1-7, postupně:1) PPV, PDV a PNRSV směsná infekce; 2) PPV a PNRSV směsná infekce; 3) PDN a PNRSV směsná infekce; 4) PPV a PDV směsná infekce; 5) PNRSV infekce; 6) PDV infekce; 7) PPV infekce; M) 100bp DNA ladder marker (Fermentas). Srovnání novosti postupů V rutinní diagnostice se běžně určuje jeden cílový organismus v jedné reakci. Metoda, umožňující detekce tří organismů současně je ekonomicky i časově výhodná. Popis uplatnění metodiky Cílem metodiky bylo vyvinout rutinní diagnostickou metodu schopnou spolehlivě a citlivě současně detekovat tři nejběžnější viry peckovin - virus šarky švestky (PPV), virus zakrslosti slivoně (PDV) a virus nekrotické kroužkovitosti slivoně (PNRSV). Metodika je určena pro Státní rostlinolékařskou správu k zjednodušení rutinních detekcí virů na peckovinách. Zprostředkovaně může sloužit i pro soukromé pěstitele peckovin. Seznam použité související literatury Al Rwahnih M., Turturo C., Minafra A., Saldarelli P., Myrta A., Pallás V., Savino V., 2004. Molecular variability of Apple chlorotic leaf spot virus in different hosts and geographical regions. J. Plant Pathol. 86 (2): 117-122. Aparicio F., Myrta A., Di Terlizzi B., Pallás V., 1999. Molecular Variability Among Isolates of Prunus Necrotic Ringspot Virus from Different Prunus spp. Virology 89(11): 991-999. 21

Candresse T., Lanneau M., Revers F., Macquaire G., German S., Grasseau N., Dunez J., Malinowski T., 1995. An immunocapture PCR assay adapted to the detection and the analysis of the molecular variability of the Apple chlorotic leaf spot virus. Acta Hortic. 386: 136-147. Chamberlain J.S., Gibbs R.A., Ranier J.E., Nguyen P.N., Caskey C.T., 1988. Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplification. Nucleic Acids Res. 16: 11141-11156. Desvignes, J.C., Boye R., 1989. Different diseases caused by chlorotic leaf spot virus on the fruit trees. Acta Hortic. 235: 31-38. Henegariu O., Heerema N.A., Dlouhy S.R., Vance G.H., Vogt P.H., 1997. Multiplex PCR: Critical Parameters and Step-by-Step Protocol. BioTechniques 23: 504-511. James D., Varga A., 2004: Preliminary molecular characterisation of plum pox potyvirus isolate W3174: evidence of a new strain. Acta Horticulturae 657: 177-182. Kamenova V., Milusheva S., Borisova A., Stoev A., Myrta A., 2003: Plum pox virus strains in Bulgaria. Options Mediterranéennes, Serie B, 45: 65-67. Laimer M., Mendonca D., Arthofer W., Hanzer V., Myrta A., Boscia D., 2003: Occurrence of different Plum pox virus strains in several stone fruit specias in Austria. Options Mediterranéennes, Serie B., 45: 79-83. Liberti D., Marais A., Svanella-Dumas L., Dulucq M. J., Alioto D., Ragozzino A., Rodoni B., Candresse T., 2005. Characterization of Apricot pseudo-chlorotic leaf spot virus, a Novel Trichovirus Isolated from Stone Fruit Trees. 10.1094/PHYTO-95-0420. Phytopathology Virology. The American Phytopathological Society. Malinowski T., 2003: Plum pox disease in Poland: the past and current situation. Options Medirranéennes, Serie B., 45: 99-101. Malinowski T., Cambra M., Capote N., Zawadzka B., Gorris M.T., Scorza R., Ravelonandro M., 2006. Field trials of plum clones transformed with the Plum pox virus coat protein (PPV- CP) gene. Plant Dis. 90:1012-1018. Mekuria G., Ramesh S.A., Alberts E., Bertozzi T., Wirthensohn M., Collins G., Sedgley M., 2003. Comparison of ELISA and RT-PCR for the detection of Prunus necrotic ring spot virus and prune dwarf virus in almond (Prunus dulcis). J. Virol. Methods 114: 65 69. Nassuth A., Pollari E., Helmeczy K., Stewart S., Kofalvi S.A., 2000. Improved RNA extraction and one-tube RT-PCR assay for simultaneous detection of control plant RNA plus several viruses in plant extracts. J. Virol. Methods 90: 37 49. 22

Nemeth M., 1986. Virus, Mycoplasma and Rickettsia Diseases of Fruit Trees. Martinus Nijhoff Publishers, The Netherlands and Akademini Kiado, Hungary, 840p. Newbury H.J., Possingham J.V., 1977. Factors Affecting the Extraction of Intact Ribonucleic Acid from Plant Tissues Containing Interfering Phenolic Compounds. Plant Physiol. 60: 543-547. Ogawa J.M., Zehr E.I., Bird G.W., 1995. Plum Pox Virus. From the Compendium of Stone Fruit Diseases. APS press, 98 pp, USA. Polák J., 2002. Virus šarky švestky nejškodlivější virus peckovin v České republice II. Díl. Dostupné na http://www.zahradaweb.cz/projekt/clanek.asp?pid=2&cid=5192. Polák J., 2006. Hosts and symptoms of Plum pox virus: woody species other than fruit and ornamental species of Prunus. OEPP/EPPO bulletin 36: 225 226. Polák J., 2007. Viruses of blackthorn and road-bordering trees of plum, myrobalan, sweet and sour cherries in the Czech Republic. Plant Protect. Sci. 43: 1 4. Polák J., Pívalová J., 2005: Sporadic distribution of Plum pox virus M strain in natural sources in the Czech Republic. Hort. Sci. (Prague), 32: 85-88. Polák J., Zieglerová J., Bouma J., 1997. Diagnostika a rozšíření viru chlorotické skvrnitosti jabloně na jádrovinách v České republice. Hort. Sci. Prague 24: 89-94. Pruss G., Ge X., Shi X.M., Carrington J.C., Vance V.B., 1997. Plant Viral Synergism: The Potyviral Genome Encodes a Broad-Range Pathogenicity Enhancer That Transactivates Replication of Heterologous Viruses. The Plant Cell.9: 859-868. Pscheidt J.W., 2008. An online guide to Plant Disease Control. Oregon State University. Dostupné na http://plant-disease.ippc.orst.edu/disease.cfm?recordid=293 Quiot J.B., Labonne G., Boeglin M., Adamolle C., Renaud L.Y., Candresse T., 1995. Behavior of two isolates of Plum pox virus inoculated on peach and apricot trees: First results. Acta Hortic. 386:290-297. Saade M., Aparicio F., Sanchez-Navarro J.A., Herranz M.C., Myrta A., di Terlizzi B., Pallas V., 2000. Simultaneous detection of the three ilarviruses affecting stone fruit trees by nonisotopic molecular hybridization and multiplex reverse-transcripton polymerase chain reaction. Phytopathology - Virology p. 1330-1336. Sanchez-Navarro J.A., Aparicio F., Herranz M.C., Minafra A., Myrta A., Pallas V., 2005. Simultaneous detection and identification of eight stone fruit viruses by one-step RT-PCR. Eur. J. Plant Pathol. 111: 77 84. 23

Scott S.W., Zimmerman M.T., Yilmaz S., Zehr E.I., Bachman E., 2001. The interaction between Prunus necrotic ringspot virus and Prune dwarf virus in peach stunt disease. Acta Hortc. 550: 229-236. Simon L., Saenz P., Garcia J.A., 1997. Filamentous viruses of woody plants. Chapter 7 Plum pox virus. pp. 75-86. Edited by P. Monnette. Trivandrum, India: Research Singspost. Singh R.P., Nie X., Singh M., Coffin R., Duplessis P., 2002. Sodium sulphite inhibition of potato and cherry polyphenolics in nucleic acid extraction for virus detection by RT-PCR. J. Virol. Methods 99: 123 131. Spiegel S., Scott S.W., Bowman-Vance V., Tam Y., Galiakparov N.N., Rosner A., 1996. Improved detection of prunus necrotic ringspot virus by the polymerase chain reaction. Eur. J. Plant Pathol. 102: 681-685. Spiegel S., Thompson D., Varga A., James D., 2005. An Apple chlorotic leaf spot virus isolate from Ornamental Dwarf Flowering Almond (Prunus glandulosa Sinensis ): Detection and Characterization. HortScience 40(5): 1401-1404. Stubs L.L., Smith P.R., 1971. The association of Prunus ringspot, prune dwarf, and dark green sunken mottle viruses in the rosetting and decline disease of peach. Austral. J. Agricul. Res. 22: 771 785. Varga A., James D., 2005. Detection and differentiation of Plum pox virus using real-time multiplex PCR with SYBR Green and melting curve analysis: a rapid method for strain typing. J. Virol. Methods 123: 213 220. Varga A., James D., 2006. Use of reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of Plum pox virus. J. Virol. Methods 138: 184 190. Yoshikawa N., 2007. Apple chlorotic leaf spot virus. Dostupné na http://www.dpvweb.net/dpv/showdpv.php?dpvno=386 Seznam publikací, které předcházely metodice Jarošová J. 2008. Interaction of Plum pox virus with Ilarviruses and Trichoviruses in stone fruit. MSc Thesis. Czech University of Life Sciences. 82pp. Polák J., Pívalová J., Kumar Kundu J., Jokeš M., Scorza R., Ravelonandro M. 2008. Behaviour of transgenic Plum pox virus-resistant Prunus domestica L. clone C5 grown in the open filed under a high and permanent infection pressure of the PPV-Rec strain. Journal of Plant Pathology 90 (1, Supplement): S1.33-S1.36. 24

Polák J., Ravelonandro M., Kumar Kundu J., Pívalová J., Scorza R., 2008. Interactions of Plum pox virus strain Rec with Apple chlorotic leafspot virus and Prune dwarf virus in fieldgrown transgenic plum Prunus domestica L., clone C5, Plant Protect. Sci. 44(1): 1-5. Kumar Kundu J., Briard P., Hilly M.J., Ravelonandro M., Scorza R. 2008. Role of the 25-26 nt sirna in the resistance of transgenic Prunus domestica graft inoculated with plum pox virus. Virus Genes 36(1):251-220. Ravelonandro M., Kumar Kundu J., Briard P., Monsion M., Scorza R., 2007. The effect of coexisting prunus viruses on transgenic Plum pox virus resistant plums. Acta Horticulturae 738: 653-656. Polák J., 2007. Viruses of blackthorn and road-bordering trees of plum, myrobalan, sweet and sour cherries in the Czech Republic. Plant Protect. Sci. 43: 1 4. Polák J., Pívalová J., Jokeš M., Svoboda J., Scorza R., Ravelonandro M., 2005. Preliminary results of interactions of Plum pox (PPV), prune dwarf (PDV), and apple chlorotic leafspot (ACLSV) viruses with transgenic plants of plum, Prunus domestica, clone C5 grown in an open field. Phytopathol. Pol. 36: 115-122. Kumar Kundu J. 2003. A rapid and effective RNA release procedure for virus detection in woody plants by reverse transcription-polymerase chain reaction. Acta virologica 47: 147-151. 25

(foto J.Kumar, VÚRV v.v.i.) Název: Metodika molekulární detekce virů peckovin pomoci RT-PCR a multiplex-rt- PCR Autoři: Jarošová J., Polák J. & Kumar J. Vydal: Výzkumný Ústav Rostlinné Výroby, v.v.i. Drnovská 507, 16106 Praha 6 Ruzyně Tisk: CD Počet stran: 26 Vydání: první Rok vydání: 2008 ISBN: 978-80-87011-86-7 Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008