Metodika molekulární determinace kmenů viru žluté zakrslosti ječmene

Transkript

1 VÝZKUMNÝ ÚSTAV ROSTLINNÉ VÝROBY, V.V.I. Metodika molekulární determinace kmenů viru žluté zakrslosti ječmene (foto Johnson & Townsend, University of Kentucky, USA) Metodika pro Státní rostlinolékařskou správu Jiban Kumar & Jana Jarošová Praha, 2008

2 Metodika molekulární determinace kmenů viru žluté zakrslosti ječmene Ing. Jiban Kumar, Ph.D * Ing. Jana Jarošová výzkumný ústav rostlinné výroby v.v.i. odbor rostlinolékařství, oddělení virologie Drnovská 507, Praha-Ruzyně * korespondujicí autor: jiban@vurv.cz Tato práce byla financována z projektu NAZV QH Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008 ISBN:

3 Anotace (česky): Ţlutá zakrslost ječmene (Barley yellow dwarf - BYD) je jednou z nejdůleţ itějších virových onemocnění obilí celosvětového významu. Dokáţ e způsobit závaţ né ztráty na výnosech u většiny obilných druhů, jako pšenice, ječmen, rýţ e, kukuřice, oves a ţ ito. V této metodice uvádíme metody reverzní transkripce polymerázové řetězové reakci (RT-PCR) pro citlivou detekci viru ţ luté zakrslosti ječmene a metodu RFLP pro specifickou identifikaci kmenů BYDV: PAV, PAS a MAV, které jsou nejčastěji se vyskytujícím virem obilnin v ČR. Metodika bude slouţ it pracovníkům státní správy k monitoringu výskytu jednotlivých kmenů BYDV na území ČR. Anotace (anglicky): Barley yellow dwarf is one of the most important viral diseases of cereals in the world. It can cause significant yield losses in most cereal species, including wheat, barley, rice, corn, oat and rye. In this methodology we provide assays for reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) for sensitive detection of barley yellow dwarf virus as well as for RFLP enabling specific identification of three strains of BYDV occurring in the Czech Republic: PAV, PAS and MAV. The methodology is meant to serve the employees of State Phytosanitary Administration as a tool for individual strain occurrence monitoring in the Czech Republic. Oponenti: Ing. Gabriela Červená, Ph.D. Státní rostlinolékařská správa Šlechtitelů 23/773, Olomouc Ing. Ondřej Veškrna SELGEN, a.s. Stupice 24, 25084, Sbřina Metodika byla schválena odborem vědy a výzkumu, MZe ČR pod č. j.: 4780/ , ze dne

4 Obsah Cíl... 5 Úvod... 5 Současná klasifikace BYDV... 6 Přenos BYDV... 7 Symptomatika... 9 RT-PCR Odběr vzorků Homogenizace Izolace RNA Výběr primerů Protokol 1) One Step RT-PCR Protokol 4) Two Step RT-PCR Vizualizace PCR produktů RFLP Protokol 5) RFLP Hodnocení diagnostické citlivosti a specificity Vyuţ ití molekulární metod pro monitoring BYDV Závěr Srovnání novosti postupů Seznam pouţ ité související literatury Seznam publikací, které předcházely metodice

5 Cíl Cílem metodiky bylo vyvinout rutinní diagnostickou metodu schopnou spolehlivě a citlivě detekovat a identifikovat kmeny viru ţ luté zakrslosti ječmene BYDV PAV, PAS a MAV. Úvod Ţlutá zakrslost ječmene (Barley yellow dwarf - BYD) je jednou z nejdůleţ itějších virových onemocnění obilí celosvětového významu. Dokáţ e způsobit závaţ né ztráty na výnosech u většiny obilných druhů, jako pšenice, ječmen, rýţ e, kukuřice, oves a ţ ito (Rastgou et al., 2005). Virus jako původce choroby prokázali poprvé v roce 1951 Oswald and Houston. Téměř všechny rostliny z čeledi Poaceae (Gramineae) mohou být infikovány, tudíţ přes 150 druhů slouţ í jako potencionální zdroje infekce (Bisnieks et al., 2004). BYDV se v ČR v poslední dekádě vyskytuje epidemicky u všech druhů obilnin. Z hlediska epidemiologie je velmi významná u ozimů, kde dochází k vysokým hospodářským ztrátám, intenzita napadení obvykle bývá tak vysoká, ţ e takto napadené porosty jsou často zaorávány. Spolehlivá a časná detekce BYDV je velmi důleţ ité pro účinná ochranná opatření vůči této viróze. Současně pouţ ívaná metoda pro rutinní detekci je ELISA, která není schopna specificky identifikovat jednotlivé kmeny BYDV. Z tohoto důvodu můţ e dojít k úniku detekce tohoto viru. Proto je nutno doplnit sérologický detekční systém ELISA metodou citlivější a kmenově specifickou - molekulárními metodami jako jsou RT-PCR v kombinaci s RFLP. V této metodice uvádíme metody jedno krokové reverzní transkripce polymerázové řetězové reakci (one-step-rt-pcr) pro citlivou detekci viru ţ luté zakrslosti ječmene a metodu RFLP pro specifickou identifikaci kmenů BYDV: PAV, PAS a MAV, které jsou nejčastěji se vyskytujícím virem obilnin v ČR. Tyto metody byly vyvinuty v posledních letech výzkumu obilnin v našem oddělení. 5

6 Obrázek č. 1: Zaorávky pole ozimého ječmene totálně napadeného ţ lutou zakrslostí ječmene. Současná klasifikace BYDV (Foto, J. Kumar, VÚRV v.v.i.) Choroba je způsobem osmi druhy virů (Chain et al., 2005) náleţ ícími do rodu Luteovirus (BYDV-PAV, BYDV-PAS, BYDV-MAV a BYDV-GAV), Polerovirus (CYDV- RPV), nebo momentálně nezařazené druhy (BYDV-RMV, BYDV-SGV, BYDV-GPV) čeledi Luteoviridae (D`Arcy & Domier, 2005). Taxonomie virů ţ lutých zakrslostí ječmene prošla několika fázemi v souvislosti s rozvojem technologií schopných virus charakterizovat. Zpočátku byla taxonomie zaloţ ena na specifičnosti přenosu mšicemi, hostitelích a kříţ ové ochraně jednotlivých kmenů BYDVs. V současnosti, s ohledem na sérologické vlastnosti viru, cytopatologii a sekvence nukleových kyselin jsou viry ţ luté zakrslosti rozděleny do dvou hlavních rodů - Luteovirus - BYDV; přičemţ existují minimálně dva sérotypy viru: BYDV- PAV a BYDV-MAV. Dřívější BYDV-RPV byl na základě novějších poznatků přeřazen do rodu Polerovirus jako Cereal yellow dwarf virus-rpv (CYDV-RPV) (Miller et al., 2002). Kmen PAV byl později rozdělen na dva odlišné kmeny BYDV-PAV a BYDV-PAS, podle svých nukleotidových sekvencí genu pro obalový protein (Rastgou et al., 2005). Isoláty BYDV-PAS se liší ve více neţ 10% v nukleové sekvenci genu pro obalový protein a výrazné odlišnosti se nachází i v jiných částech genomu (Bisnieks et al., 2004). BYDV-PAV je povaţ ován za nejrozšířenější virus obilnin v ČR i ve světě (D Arcy, 1995). Vyšší výskyt PAV je dán větším poměrem přenosu a širokým spektrem preference přenašečů (Power, 2000). Kromě efektivity přenosu se jednotlivé kmeny liší i příznaky, preferencí hostitele a především sérologickými a molekulárními vlastnostmi. PAV se obvykle projevuje silnými příznaky onemocnění na obilninách (krouţ kování listů). Některé odrůdy 6

7 ječmene tolerantní k PAV mohou být vysoce náchylné k viru ţ luté zakrslosti obilnin kmenu RPV. Tento virus se často vyskytuje i na planých obilninách a travách (Lapierre et al., 2004), které jsou přirozeným rezervoárem i pro další kmeny BYDV. V ČR byly identifikovány pouze dva kmeny BYD - PAV a MAV - biologickým avšak převáţ ně pouze sérologickým testováním. Výskyt ostatních kmenů BYDV je v ČR méně zkoumán. Sérologické testy jsou schopny odlišit PAV kmen od MAV kmenu, nicméně PAS kmen sérologickými testy dává pozitivní signál jako kmen PAV. Spolehlivá metoda molekulární detekce na úrovni kmenů je tudíţ vysoce potřebná a ţ ádaná. V této metodice předkládáme protokol pro spolehlivou detekci kmenů BYDV - PAV, PAS a MAV. Přenos BYDV Viry jsou všechny přenášeny mšicemi ţ ijícími na Poaceae s různým stupněm speficičnosti přenosu (Dedryver et al., 2005). Přes 25 druhů mšic je známo jako přenašečů virů; viry se přenáší persistentně nepropagativně (cirkulativně) a jsou omezeny na floém infikovaných rostlin (Rastgou et al., 2005). Efektivnost přenosu luteovirů je regulována mnohými faktory: hostitelskými rostlinami, environmentálními podmínkami, abundancí vektorů a povrchovou strukturou virionu. Přenos viru mšicemi je především závislý na molekulárních interakcích virionů s vektory (Gary & Gildow, 2003). Virus se nepřenáší vajíčky ani nymfami. Dospělé mšice se stávají vironosnými při akvizičním sání na zdroji infekce jiţ po 5-15 minutách. Cirkulační proces perzistentního viru přes zaţ ívací trakt trvá nejméně 16 hodin, v přenašečích je virus stálý asi 120 hodin. Je přenášen při teplotách nad 12 C z důvodu vyšší letové aktivity mšic (Muška a Procházka, 2008). Obilniny jsou infikovány jednak na podzim (primární infekce), kdy jejich přenašeči migrují na vzcházející ozimy. Druhým obdobím je jaro aţ léto (sekundární infekce) od fáze sloupkování a později. Nejnebezpečnější jsou podzimní infekce, způsobené migrujícími infikovanými mšicemi z porostů trav a infikovaného výdrolu obilnin (Köhler, 2008). Kaţ dý serotyp je efektivně přenášen pouze omezeným počtem druhů mšic. Specificita vektoru u BYDV ovšem ne vţ dy koreluje se serotypem (Miller a Rasochová, 1997). Mezi nejefektivnější vektory jednotlivých kmenů BYDV patří: PAV - Rhopalosiphum padi (mšice střemchová), Sitobion avenae (kyjatka osenní), Metopolophium dirhodum (kyjatka travní) a další, MAV - S. avenae a M. dirhodum, PAS - R. padi a S. avenae, RPV - R. padi, GPV - Schizaphis graminum (mšice obilná) a R. padi, RMV - R. maidis (mšice kukuřičná), SGV - S. 7

8 graminum (Rochow & Muller, 1971; Halbert et al., 1992; Power & Gary, 1995) (obr. č. 5&6). V Evropě je za jednoho z nejzávaţ nějších přenašečů povaţ ována mšice střemchová a kyjatka osenní, obzvláště pak kmenu PAV na jaře, kdy šíří virus z ozimých hostitelů (pšenice a ječmen) na jarní ječmen a kukuřici (Dedryver et al., 2005). Kromě R. padi, S. avenae a M. dirhodum (Honěk et al., 2006) se v ČR obvykle vyskytují i další přenašeči jako jsou S. graminum, R. maidis, Myzus persica (mšice broskvoňová), atd. V teplejších oblastech ČR se na obilních porostech hojně vyskytuje hlavně S. avennae, R. padi a R. maidis (Starý, 1996). V posledních letech se vzhledem k dlouhodobému oteplování v ČR rovněţ vyskytuje Diuraphis noxia (mšice zhoubná) (Starý, osobní sdělení). D. noxia můţ e přenášet s velkou účinností kmen SGV (Halbert et al., 1992). Z hlediska ţ ivotního cyklu mšic (Honěk et al., 2006) a epidemiologie BYDV v Evropě (Plumb, 1995) se dá předpokládat výskyt i ostatních kmenů BYDV v ČR. Obrázek č. 2: Diagram přenosu viru mšicemi (zdroj: James et al. 2004) 8

9 Obrázek č. 3. Metopolophium dirhodum, Sitobion avenae a Rhopalosiphum padi. (Ilustrace: M. Kocián, zdroj: Honěk et al. 2002) Obrázek č. 4. Schizaphis graminum - bezkřídlá forma (vlevo) a Rhopalosiphum maidis - bezkřídlá forma (vpravo). (zdroj: College of Applied Science & Technology, ISU, USA) Symptomatika Typickými symptomy napadení je zlatoţ luté aţ oranţ ové zbarvení listů a retardace růstu (obr.č. 6). Ţloutnutí postupuje od špiček a okrajů listů a zachvacuje postupně celou listovou čepel. Ţloutnutí většinou začíná 7-20 dnů po infekci a můţ e být předcházeno tvorbou vodovatých skvrn na listech (D Arcy, 1995). Zakrslost doprovází deformace listů a 9

10 listových čepelí (u ovsa se listy stáčí do ruliček), redukce nadzemní i podzemní biomasy, poruchy v metání, sterilita kvítků, redukce počtu klásků a tvorba zadinového zrna. V dalším stádiu choroby se můţ e objevovat nekróza cévních svazků a redukce kořenového systému. Napadené rostliny nemetají nebo nevytvářejí semena. Symptomy jsou v některých případech těţ ko odlišitelné od příčin neparazitického původu (Čača et al., 1981). Intenzita příznaků závisí především na době infekce. Čím dříve je rostlina infikována, tím bouřlivější je symptomatický projev a tím větší jsou ztráty na výnosu zrna. Ztráty na výnosech se pohybují v závislosti na lokalitě a ročníku mezi 11 aţ 47% (Zaharieva et al., 2001). U ječmene se setkáváme se ţ loutnutím, u pšenice, ţ ita a tritikale obvykle se ţ loutnutím, občas červenáním, u ovsa s oranţ ověním aţ červenáním listů (obr.č. 5). Ţloutnutí a červenání můţ e přecházet v nekrózy, objevuje se zasychání listů a rostliny mohou odumírat. Na špičkách a okrajích starších listů kukuřice infikované BYDV se vytváří ţ luté, červené aţ nafialovělé skvrny (D Arcy, 1995). Rostliny napadené viry jsou rovněţ náchylnější k biotickým (škůdci, houby) a abiotickým (mráz, sucho) stresům (Perry et al., 2000). Obrázek č. 5. Příznaky BYDV na obilninách - zleva doprava pšenice, ječmen, oves. Vpravo zdravá rostlina. (Foto, J. Vacke, VÚRV Praha) 10

11 Obrázek č. 6. Ţlutavě červená ohniska infekce. (Foto, J. Kumar, VÚRV v.v.i.) RT-PCR Jsou zde uvedeny protokoly pro One Step RT-PCR i Two Step RT-PCR (reverzní transkripce v jedné reakci a PCR v druhé). Jsou pouţ ity primery pro univerzální detekci všech kmenů BYDV na území ČR, tedy kmenů PAV, MAV a PAS. Teoreticky by měl být touto metodou detekován i kmen GAV, vyskytující se v Číně, ale nemáme ozkoušeno. Tato metoda se dá tedy pouţ ít jednak pro univerzální detekci BYDV (kdy pouze potřebujeme vědět, zda je virus přítomný nebo ne, určení kmene pro nás není podstatné), ale slouţ í i jako výchozí produkt pro následné štěpení amplifikovaného produktu restrikční endonukleázou (RFLP), jímţ je moţ no určit kmen viru. Odběr vzorků Odebíráme na prvním místě rostliny symptomatické, nebo rostliny, na nichţ byl zaznamenám výskyt mšic. Pokud v porostu takové rostliny nejsou, odebíráme náhodně více vzorků z různých míst porostu. U mladých rostlin je moţ no odebírat celé nadzemní části nebo jen listy, u starších rostlin je opět moţ né obojí, nicméně z hlediska úspory času při homogenizaci a kvality izolované RNA je vhodnější odebírat jen mladší listy bez stébel. Při odběru dbáme na zabránění kontaminace z rostliny na rostlinu (pracujeme v rukavicích, nůţ ky, skalpel nebo 11

12 jiné nástroje omýváme mezi odběry jednotlivých vzorků lihem, vzorky uskladňujeme kaţ dý zvlášť). Odebrané vzorky uchováváme v chladu a co nejdříve buď ihned homogenizujeme, nebo uskladníme na -80 C. Homogenizace Pro izolaci RNA potřebujeme 0,1 g rostlinného pletiva. Jednodušší je ovšem homogenizovat více a z homogenátu 0,1 g odváţ it. Vzorky homogenizujeme v tekutém dusíku, u vzorků uchovávaných na -80 C dbáme na to, aby nedošlo k jejich rozmraţ ení, ideálně odebíráme z mrazicího boxu po kaţ dém vzorku zvlášť. Vzorek pečlivě homogenizujeme v předmraţ ené třecí misce a do 2 ml sterilní mikrozkumavky odváţ íme 0,1 g homogenátu. Mikrozkumavky je také moţ no předmrazit krátkým ponořením do tekutého dusíku. Je velmi důleţ ité nepřesáhnout danou váhu, neboť u kolonkových metod izolace RNA (Qiagen, Sigma) dochází v tomto případě ke sníţ enému výtěţ ku i kvalitě RNA. Jakmile máme vzorky naváţ ené, je opět nutno zabránit jejich rozmraţ ení před samotnou izolací - vhodné je uchování v tekutém dusíku nebo v mrazicím boxu. V případě pouţ ívání kolonkového systému izolace je opravdu velmi záhodno pouţ ít tekutý dusík. Je moţ né homogenizovat i bez něj, ale je zde veliké riziko sníţ ení výtěţ ku i kvality izolované RNA. Izolace RNA Existuje mnoho způsobů izolace RNA. V současnosti se často preferuje tzv. kolonkový způsob metody izolace. Tato izolační metoda je zaloţ ena na zjištění, ţ e nukleové kyseliny v přítomnosti tzv. chaotropních solí adherují na silikátový povrch. Tradiční fenolchloroformová extrakce je pracnější a je pouţ ívána obvykle pro práci s větším mnoţ stvím nukleových kyselin nebo v některých speciálních postupech. Výhodou metody zaloţ ené na adsorpci na silikát je rychlost a pohodlnost, proto jsou na ní zaloţ eny komerční soupravy (kity) pro rutinní extrakce NK. Kity jsou optimalizovány pro pouţ ití na konkrétní typ a mnoţ ství vzorku a poskytují standardizované výsledky. Pohodlnost pouţ ití kitů je dále zvýšena tím, ţ e obvykle pouţ ívají nástavce do mikrozkumavek, obsahující jemný filtr, který zadrţ í silikátové částice. Zpracování pak probíhá tak, ţ e jsou roztoky promývány přes kolonku (filtr se zachycenými částicemi). Namísto tradičního silikátu kity často vyuţ ívají speciální pryskyřice a mají různě upravené sloţ ení pufrů tak, ţ e např. preferují při adsorpci molekuly NA určitého velikostního rozpětí. V našem případě doporučujeme pouţ ití komerční soupravy Spectrum Plant Total RNA Kit (Sigma - kat.č. STRN10, STRN50 a STRN250), která v porovnání s Qiagen Plant RNeasy kit 12

13 poskytuje vyšší výtěţ ky kvalitnější RNA. Za zmínku jistě stojí i fakt, ţ e cena za izolovaný vzorek je téměř poloviční. Izolujeme podle následujícího návodu (návodu výrobce). Protokol izolace RNA komerční soupravou Spectrum Plant Total RNA Kit (Sigma) Lyzace 1. Předem si nachystejte směs lyzačního pufru s 2-mercaptoethanolem (na kaţ dý vzorek je zapotřebí 500μl Lysis solution a 5 µl 2-ME) 2. Do homogenizovaného vzorku napipetujte 500 µl lyzačního roztoku předem namíchaného s 2-mercaptoethanolem a pořádně zvortexujte. Přečištění-filtrace 3. Všechny vzorky vloţ te do vodní lázně a inkubujte 5 min při 56 C. Centrifugujte vše 3 min při g. 4. Přepipetujte supernatant do Filtration column (modrý krouţ ek), zavřete a centrifugujte 1 min při RPM. Navázání RNA na kolonku 5. 3) Kolonku zahoďte a připipetujte po 500 μl Binding solution, zvortexujte a 700 μl napipetujte do Binding column. To proveďte postupně se všemi vzorky. 6. Poté kolonky centrifugujte 1 min při RPM. Vylijte supernatant, osušte Collection tube o filtrační papír, vraťte do ní kolonku, napipetujte zbytek směsi a centrifugujte 1 min při RPM. 7. Vylijte supernatant, osušte Collection tube o filtrační papír a vraťte do ní kolonku. Promytí RNA na kolonce 8. 4) Do kolonky napipetujte 500 μl Wash Solution 1 a centrifugujte 1 min při RPM. 9. Vylijte supernatant, osušte Collection tube o filtrační papír a vraťte do ní kolonku. 10. Do kolonky napipetujte 500 μl Wash Solution 2 a centrifugujte 30 s při RPM. 11. Vylijte supernatant, osušte Collection tube o filtrační papír a vraťte do ní kolonku. 12. Do kolonky znovu napipetujte 500 μl Wash Solution 2 a centrifugujte 30 s při RPM. 13. Vylijte supernatant, osušte Collection tube o filtrační papír a vraťte do ní kolonku. Vypláchnutí RNA z kolonky 14. Centrifugujte kolonku 1 min při RPM, aby se osušila. Poté kolonku vyjměte a vloţ te ji opatrně do nové popsané 2 ml eppendorfky (jsou v kitu). Do středu kolonky (přímo na membránu) napipetujte 50 μl Elution Solution, zavřete víčko a nechte stát 13

14 1 min při pokojové teplotě. Centrifugujte kolonku 1 min při RPM. Vyndejte kolonku z eppendorfky a zahoďte ji. 15. Změřte koncentraci RNA Kvalitu izolované RNA měříme spektrofotometricky. Při spektrofotometrickém měření se vzorek nejprve naředí destilovanou vodou, obvykle 1:9 (RNA:H 2 O). Měří se při vlnových délkách 260, 230 a 280 nm. To umoţ ní hodnocení čistoty vzorku, očekávané poměry jsou 2.0 pro RNA. Poměr absorbancí 260/280 menší neţ 1.75 svědčí pro obsah kontaminujících bílkovin. Absorbance při 230 nm značí nečistoty, jako jsou karbohydráty, fenolické sloučeniny, aromatické sloţ ky. Při výpočtu koncentrace optická hustota 1 odpovídá přibliţ ně 40 mg/l pro RNA. Výběr primerů Na základě analýzy sekvence BYDV z genové banky NCBI byly navrţ eny primery v konzervativním úseku genomu BYDV. Tyto primery amplifikují PCR fragment o velikosti 640 bp společný pro všechny kmeny BYDV patřící do rodu Luteovirus, neboť mají homologii sekvence v daném úseku, ve kterém je primer navrţ en. Tab.č.1. Primery pouţ ité k amplifikaci PCR. Primer Sekvence (5-3 ) Pozice T m ( C) GC (%) BYcpR CCGATGTTGAGGAGTCTACC * 62,5 60 BYcpF CCACTAGAGAGGTGGTGAATG * 61,3 52,4 * Pozice odpovídá sekvenci EF genové banky NCBI. Protokol 1) One Step RT-PCR Z hlediska rychlosti a spolehlivosti je vhodnější pouţ ívat one-step-rt-pcr, neboť redukcí kroků je sníţ eno riziko chyby a kontaminace. Při pouţ ití kitu QIAGEN OneStep RT-PCR kitu je protokol následující: i) 5 µl 5x pufr (konečná koncentrace 2.5 mm MgCl2), 1 µl dntps (konečná koncentrace 200 µm kaţ dý nukleotid), 1 µl Q solution, 0.6 µl kaţ dého primeru 14

15 (viz tabulka č. 1) o koncentraci 10 µm, doplnit RNase a DNase free sterilní H 2 O do 24 µl a přidat 1 µl RNA. ii) Podmínky reakce jsou: iii) 50 C po dobu 30 min (reverzní transkripce); iv) 95 C po dobu 10 min (aktivace HotStarTaq polymerázy); v) 35 cyklů ve třech krocích: 94 C po 20 s (denaturace), 58 C po 30 s (dosedání) a 72 C po dobu 1 min (polymerizace); vi) 72 C po dobu 10 min (konečné prodluţ ování) a vii) 10 C uchovávání. Obrázek č. 7. Diagram one-step-rt-pcr (zdroj: Qiagen) Protokol 4) Two Step RT-PCR Při two-step-rt-pcr v jedné reakci nejprve dojde reverzní transkripcí k tvorbě cdna a v druhé reakci (PCR) k amplifikaci daných cílových úseků nukleové kyseliny. Protokol je následující: 15

16 1) Pro reverzní transkripci pouţ ijeme i) 10 µl H 2 O, 0.6 µl reverzního primeru BYDVcpR (viz tabulka č. 1) o koncentraci 10 µm a 2 µl RNA a necháme po dobu 5 minut při 70 C RNA zbavit se sekundárních struktur. ii) Okamţ itě zchladíme - dojde k nasednutí primeru a iii) podle návodu výrobce pouţ ívané reverzní transkriptázy pokračujeme. Zde je pro ukázku příklad s pouţ itím AMV reverzní transkriptázy od firmy Promega. iv) V mastermixu smícháme 5μl AMV Reverse Transcriptase 5X Reaction pufru, 2 μl dntp mix (konečná koncentrace 200 µm kaţ dého nukleotidu), 40 jednotek (40mM) RNasin Ribonuclease Inhibitor sodium pyrofosfát (předehřátý na 42 C), 2.5μl AMV RT (30 jednotek) a doplníme vodou bez nukleáz tak aby celkové mnoţ ství i s jiţ předtím namíchanou směsí RNA-primer-voda bylo 25 µl, tedy v tomto mastermixu do 12.4 µl. v) Rozpipetujeme do směsi RNA-primer-voda - při pipetování jednou špičkou pozor na moţ nost kontaminace! 2) Při PCR pouţ ijeme v mastermixu i) 0.6 µl kaţ dého primeru (viz tabulka č. 1) o koncentraci 10 µm (při konečném obsahu jedné reakce 25 µl) a 1 µl cdna. ii) PCR podmínky se mohou lišit podle pouţ ívané polymerázy, proto zde jen pro ilustraci uvedeme protokol za pouţ ití Go Taq polymerázy s 5X Green GoTaq reakčním pufrem (Promega). Mastermix se v tomto případě skládá z (1) 5 µl green Go TAQ pufru (1.5mM MgCl 2 ), 2 µl dntps (200 µm kaţ dého nukleotidu), 0.6 µl kaţ dého primeru (viz tabulka č.1) o koncentraci 10 µm, 0.2 µl GO Taq polymerázy a doplníme RNase-free H 2 O do celkového mnoţ ství 24 µl. (2) Rozpipetujeme a přidáme 1 µl cdna. iii) Podmínky reakce jsou 95 C po dobu 2 min (iniciální denaturace); iv) 35 cyklů po třech krocích - 95 C po dobu 20s (denaturace), 58 C po dobu 30s (dosedání), 72 C po dobu 1 min (polymerizace); v) 72 C po dobu 10 min (konečné prodluţ ování) a vi) 10 C uchovávání. 16

17 Vizualizace PCR produktů Vizualizace PCR produktů probíhá za pomoci eletroforetického rozdělení fragmentů v agarózovém gelu (je doporučeno pouţ ití 1,0-1,5 % gelu) s předchozím označením DNA za pouţ ití etidium bromidu (0,5 µg/ml) nebo Syber Greenu (0,1 µl Syber Green/ 10 ml gel). Agarózový gel se připravuje v TAE (40 mm Trisacetát, 1 mm EDTA, ph 8) nebo TBE pufru (89 mm Tris base, 89 mm kyseliny trihydrogenborité, 1 mm EDTA, ph 8). Etidium bromid nebo Syber Green se dá pouţ ívat buď přímo do gelu nebo namíchat do PCR produktu. Z hlediska bezpečnosti práce však doporučujeme pouţ ívat Sybr Green, u kterého nebyl prokázán negativní dopad na lidský organismus. 5 μl produktu obarveného barvivem (6x loading dye), je nanášeno na gel a podstoupeno 3-9 V/cm po dobu min dle velikosti gelu. V případě pouţ ití zeleného pufru dodávaného k enzymu Go Taq (Promega) - viz. two step RT-PCR - jiţ není zapotřebí produkty barvit a můţ eme přímo z cykleru nanášet na gel. Produkt primerů BYcpR a BYcpF je dlouhý 640 bp (viz. Obrázek č. 8). Obrázek č. 8. PCR produkt BYDV pozitivních vzorků. Amplifikovaný fragment má délku 640 bp. Vzorky 1-10 jsou vzorky obilnin infikovaných různými kmeny BYDV. M je DNA marker - rozlišení 100 bp (Fermentas). RFLP 17

18 Restrikční analýza DNA (RFLP - délkový polymorfizmus restrikčních fragmentů) je metodou charakterizace DNA pomocí jejího štěpení restrikčními endonukleasami na fragmenty. Identifikace a analýza produktů štěpení se provádí elektroforetickým dělením. Je známo velké mnoţ ství komerčně dodávaných bakteriálních restrikčních endonukleas, které se liší od sebe tím, ţ e rozpoznávají různé krátké sekvence nukleotidů - 4, 6, 8 a ţ e štěpí DNA na různě dlouhé fragmenty podle individuálního pořadí bazí a podle rozpoznané sekvence. Za daných podmínek vzniká reprodukovatelný počet restrikčních fragmentů o určité opět reprodukovatelné délce (= počtu bazí). Počet i délka fragmentů je pro daného jedince specifická. Následující protokol umoţ ňuje za pomoci restrikční endonukleasy HpaII rozštěpit amplikon získaný RT-PCR (viz protokoly RT-PCR) na definovaný počet fragmentů, specifický pro kaţ dý jednotlivý kmen BYDV (MAV, PAV a PAS). Amplikon kmene MAV je tímto enzymem rozštěpen na tři fragmenty o délce přibliţ ně 440, 120 a 80 bp. U kmene PAS vznikají obvykle fragmenty 2, přičemţ větší je asi 400 bp dlouhý, následován fragmentem o délce přibliţ ně 240 bp. Někdy můţ e vzniknout i zbytkový fragment o délce přibliţ ně 100 bp. Poslední kmen, PAV, tvoří fragmenty čtyři, z nichţ jeden je stejně velký jako menší fragment kmene PAS (tj. cca 240 bp) a další tři fragmenty mají okolo 150, 120,100 bp, a (obrázek č. 9). Můţ e dojít k situaci, kdy menší fragmenty nejsou jednoznačně viditelné, ale i v této situaci lze jednoznačně určit kmen BYDV. Protokol 5) RFLP 1) Do mastermixu dáme 12.5 µl sterilní H 2 O, přidáme 2 µl pufru a 5 U (0.5 µl) enzymu HpaII (New England Biolabs) 2) Rozpipetujeme a přidáme 5 µl RT-PCR produktu. 3) Podmínky reakce jsou: i) 37 C po dobu 3 hod (štěpení); ii) Zchladit a pokud okamţ itě nenanášíme na gel, uchovávat na -20 C 4) Vizualizace produktů: i) Na 2.5% agarózový gel nanášíme minimálně 5 µl barvivem (ethidium bromid, SYBR Green stejný systém jako u PCR) označeného produktu - pokud se nám do jamek vejde větší mnoţ ství produktu, je z hlediska kvalitnější vizualizace výhodné nanášet produktu více. 18

19 ii) Podstoupíme 3-9 V/cm po dobu min dle velikosti gelu Opět je výhodnější delší doba, neboť se nám jednotlivé fragmenty se od sebe více oddělí a hodnocení je jednoduché. Obrázek č. 9: Fragmenty vzniklé RFLP amplikonů PCR za pouţ ití restrikční endonukleasy HpaII. Vzorky 1 aţ 15 jsou infikovány kmenem PAS; vzorky jsou infikovány kmenem PAV; a vzorky jsou infikovány kmenem MAV. Hodnocení diagnostické citlivosti a specificity Při vyhodnocení specificity a citlivosti této eseje bylo nutno porovnávat s metodou analýzy sekvence, neboť jiná dostupná metoda neexistovala. Ze vzorků byla izolována RNA, provedeno RT-PCR, amplifikovaný produkt byl dále podstoupen RFLP a současně, část produktu byla osekvenována. Sekvence byly porovnány se známými sekvencemi z databáze NCBI, identifikován kmen, a dané výsledky byly porovnány s výsledky RFLP. Celkem bylo RFLP prokázala 100% jednotu výsledků s analýzou sekvencí. takto hodnoceno 38 vzorků z různých hostitelů a lokalit v ČR (tabulka č. 2). Metoda RT-PCR- Tabulka č. 2. Hodnocení citlivosti a specificity RT-PCR-RFLP RT- Izolát viru Hostitel ELISA PCR- RT-PCR RFLP Analýza sekvence Blatno85 Ječmen jarní + + PAV PAV 1561 Pšenice ozimá + + MAV MAV Pšenice ozimá + + MAV MAV 8334 Ječmen ozimý + + MAV MAV Ječmen ozimý + + PAS PAS 6815 Oves setý + + MAV MAV Pšenice ozimá + + MAV MAV Pšenice ozimá + + PAS PAS Jílek mnohokvětý + + PAV PAV Oves setý + + PAV PAV Ječmen jarní + + PAS PAS Ječmen ozimý + + PAV PAV ČICOV Ječmen ozimý + + PAS PAS LITOM Ječmen ozimý + + PAS PAS 19

20 Ječmen ozimý + + PAS PAS PODOUSY Pšenice ozimá + + PAS PAS CHŘASTANY Pšenice ozimá + + PAS PAS Ječmen ozimý + + PAS PAS Ječmen ozimý + + PAS PAS Pšenice ozimá + + PAS PAS Ječmen ozimý + + PAS PAS Ječmen ozimý + + PAS PAS Pšenice ozimá + + PAS PAS Pšenice ozimá + + MAV MAV PS Pšenice ozimá + + PAS PAS A120 Ječmen ozimý + + PAS PAS 1646 Ječmen ozimý + + PAS PAS Ječmen ozimý + + MAV MAV Ječmen ozimý + + MAV MAV Pšenice ozimá + + MAV MAV 6219 Ječmen jarní + + MAV MAV Policko1 Pšenice ozimá + + PAS PAS Policko2 Ječmen ozimý + + MAV MAV Pšenice ozimá + + MAV MAV Pšenice ozimá + + MAV MAV Ječmen ozimý + + MAV MAV Pšenice ozimá + + PAS PAS Ječmen ozimý + + MAV MAV Využití molekulární metod pro monitoring BYDV V ČR byly zatím identifikovány kmeny PAV, MAV, PAS. Mezi polními izoláty zatím převaţ ují podle našich studií kmeny MAV (Kundu et al., nepublikované výsledky) a PAS (Kundu, 2008). Nejdůleţ itější přenášeči ţ lutých zakrslostí obilnin jsou: pro PAV Rhopalosiphum padi (mšice střemchová) & Sitobion avenae (kyjatka osenní); pro MAV S. avenae; pro PAS R. padi; pro RPV R. padi; pro GPV Schizaphis graminum (mšice obilná) & R. padi; pro RMV R. maidis (mšice kukuřičná), a pro SGV to je S. graminum. Tyto údaje jsou ovšem ovlivněny několika faktory. Neexistuje běţ ně přístupná, praxí vyuţ ívaná metoda detekce kmenu PAS, který je podle našich předběţ ných výsledků v ČR hojně rozšířen, avšak diagnostikován jako kmen PAV. Kmen PAS je velmi agresivní a virulentní. Dalším faktorem, ovlivňující situaci je fakt, ţ e rutinní detekce viru se uskutečňuje pouze v polních plodinách, zatímco takové rezervoáry viru, jako jsou trvalé travní porosty, jsou opomíjeny. Nehledě na ekonomický faktor těchto infekcí, ovlivňují i druhové spektrum vektorů BYDV, vyskytujících se v obilninách a nepřímo i rozšíření viru. Některé studie 20

21 uvádějí rozdílnou četnost jednotlivých kmenů BYDV na travách v blízkosti obdělávaných ploch a v oblastech vzdálenějších od polí osetých obilninami. Některé kmeny jsou specificky přenášeny pouze některými druhy mšic, jiné mají minimálně druhy preferované. Rozpoznání všech vazeb mezi hostiteli, kmeny viru a druhy vektorů napomůţ e správné prognóze a volbě ochrany. Spolehlivá detekce je první krok, umoţ ňující monitoring a analýzu situace v ČR. Závěr Virus ţ luté zakrslosti ječmene je jeden z nejrozšířenějších a nejškodlivějších virů na obilninách. Jeho kmeny se liší mimo jiné specifičností přenosu, virulencí i rozšířením. Správná diagnostika těchto kmenů napomůţ e lepšímu zhodnocení situace v ČR, pochopení interakcí hostitel - vektor - virus, a tím i efektivnějšímu způsobu vyuţ ití ochranných metod. Srovnání novosti postupů V ČR dosud nebyla známa metoda schopná identifikace všech tří kmenů BYDV. Běţ ně pouţ ívaná sérologická metoda není schopna spolehlivě odlišit kmeny BYDV (PAV, MAV, PAS) a kmen PAS či MAV detekuje jako PAV. Seznam použité související literatury Bisnieks M., Kvarnheden A., Sigvald R., a Valkonen J. P. T Molecular diversity of the coat protein-encoding region of Barley yellow dwarf virus-pav and Barley yellow dwarf virus-mav from Latvia and Sweden. Brief Report. Arch Virol 149: Chain F., Riault G., Trottet M. a Jacquot E Analysis of accumulation patterns of Barley yellow dwarf virus-pav (BYDV-PAV) in two resistant wheat lines European Journal of Plant Pathology 113: Čača a kol Zemědělská fytopatologie, SZN, Praha, 1981, 344 s. D Arcy C. J Symptomology and host range of barley yellow dwarf. In: D Arcy CJ, Burnett PA (Eds.), Barley Yellow Dwarf; 40 Years of Progress. American Phytopathological Society, St. Paul, MN, pp D`Arcy C. J., Domier L. L In: C. M. Fauquet et al. (eds) Virus Taxonomy-Eighth Report of the ICTV, Springer-Verlag, NewYork, pp

22 Dedryver C.-A., Riault G., Tanguy S., Le Gallic J. F., Trottet M. a Jacquot E Intraspecific variation and inheritance of BYDV-PAV transmission in the aphid Sitobion avenae. European Journal of Plant Pathology 111: Gray S. a Gildow F. E Luteovirus-Aphid Interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 41: Halbert S. E., Cornelly J., Lister R. M., Klein R. E. a Bishop G. W Vector specificity of barley yellow dwarf virus serotypes and variants in southwestern Idaho. Ann. Appl. Biol. 121: Honěk A., Jarošík V., Dixon A Comparing growth patterns among field populations of cereal aphids reveals factors limiting their maximum abundance. Bulletin of Entomological Research 96: Honěk A., Martinková Z., Vacke J., Lukášová H Mšice na obilninách: biologie, prognóza a ochrana. Výzkumný ústav rostlinné výroby, Praha-Ruzyně, pp. 44. James C.K. NG, Perry L.K Transmission of plant viruses by aphid vectors. Mol. Plant Pathol., 5(5): Köhler A Prognóza výskytu virových zakrslostí obilnin a obilních mšic v jarním období roku Kundu J. K First Report of barley yellow dwarf virus- PAS in wheat and barley grown in the Czech Republic. Plant Dis. 92 (11): Lapierre H., Signoret P. A Viruses and Virus Diseases of Poaceae (Gramineae). Editions Quae, ISBN , pp: 857. Miller W. A., Liu S. a Beckett R Barley Yellow Dwarf Virus: Luteoviridae or Tombusviridae? Molecular Plant Pathology 3( 4 ): Muška F. a Procházka P Problematika viróz ozimých obilovin. Oswald, J. W., Houston, B. R A new virus disease of cereals, transmissible by aphids. Plant Dis. Rep 15: Perry K. L., Kolb F. L., Sammons B., Lawson C., Cisar G., a Ohm H Yield Effects of Barley yellow dwarf virus in Soft Red Winter Wheat. Virology 90: Plumb R. T Epidemiology of barley yellow dwarf in Europe. In: D Arcy CJ, Burnett PA (Eds.), Barley Yellow Dwarf; 40 Years of Progress. American Phytopathological Society, St. Paul, MN, pp Power A. G., Gary S. M Aphid transmission of barley yellow dwarf viruses: interactions between viruses, vectors, and host plants. In: D Arcy CJ, Burnett PA (Eds.), 22

23 Barley Yellow Dwarf; 40 Years of Progress. American Phytopathological Society, St. Paul, MN, pp Rastgou M., Khatabi B., Kvarnheden A. a Izadpanah K Relationships of Barley yellow dwarf virus-pav and Cereal yellow dwarf virus-rpv from Iran with viruses of the family Luteoviridae European Journal of Plant Pathology 113: Rochow W. F., Muller I A fifth variant of barley yellow dwarf in New York. Plant Dis. 55: Starý P Occurrence of anholocylic strains of pest aphids on winter barley and wheat in South Moravia, Czech republic. Anz. Schadlingskde., Pflanzenshutz, Umweltschutz 69: Zaharieva M., Monneveux P., Henra M., Rivoal R., Valkoun J., Nachnit M. M Evaluation of a collection of wild wheat relative Aegilops geniculata Roth and identification of potential sources for useful traits, Euphytica 119: Seznam publikací, které předcházely metodice Kundu J. K First Report of barley yellow dwarf virus- PAS in wheat and barley grown in the Czech Republic. Plant Dis. 92 (11): Kundu J.K., Chrpová J., Šíp V Biological and molecular diversities of Barley yellow dwarf virus infection in the presence/absence of resistance gene Yd2 on barley cultivars and breeding lines, In: Book of Abstracts of the "International Symposium on Management of Vector-Borne Viruses", 7-10 February 2006, Andhra Pradesh, India, p. 35 Kundu J.K Genetic diversity of Barley yellow dwarf virus-pav isolate "Blatno85" in the presence/absence of tolerant gene in barley, wheat and oat cultivars and bridging lines, In: Sborník abstraktů "XVII. česká a slovenská konference o ochraně rostlin", září 2006, ČZU Praha, pp

24 (Foto, J. Kumar, VÚRV v.v.i.) Název: Metodika molekulární determinace kmenů viru ţ luté zakrslosti ječmene Autoři: Kumar J. & Jarošová J. Vydal: Výzkumný Ústav Rostlinné Výroby, v.v.i. Drnovská 507, Praha 6 Ruzyně Tisk: CD Počet stran: 24 Vydání: první Rok vydání: 2008 ISBN: Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., 2008