VÝZNAM VYŠETŘENÍ TROMBOFILNÍCH

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE VÝZNAM VYŠETŘENÍ TROMBOFILNÍCH MUTACÍ V REPRODUKČNÍ MEDICÍNĚ Diplomová práce David Kubíček Vedoucí práce: Mgr. Jakub Horák, Dr. rer. nat. Brno 2013

Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Bc. David Kubíček Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Význam vyšetření trombofilních mutací v reprodukční medicíně Biologie Studijní obor: Molekulární biologie a genetika Vedoucí práce: Mgr. Jakub Horák, Dr. rer. nat. Akademický rok: 2012/2013 Počet stran: 71 Klíčová slova: Hemostáza, koagulace, fibrinolýza, Trombofilie, trombofilní mutace, reprodukční medicína

Bibliographic Entry Author Title of Thesis: Degree programme: Bc. David Kubíček Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology The Relevance of Testing for Thrombophilic Mutations in reproductive Medcine Biology Field of Study: Molecular Biology and Genetics Supervisor: Mgr. Jakub Horák, Dr. rer. nat. Academic Year: 2012/2013 Number of Pages: 71 Keywords: Hemostasis, Coagulation, Fibrinolysis, Thrombophilia, Thrombophilic mutations, Reproductive Medcine

Abstrakt Vrozená trombofilie zvyšuje riziko trombotických stavů a v poslední době je také spojována s reprodukčními komplikacemi. V této diplomové práci srovnáváme genotypové i alelické četnosti 9 vybraných polymorfismů u 156 pacientek s reprodukčními komplikacemi s vybranou kontrolní skupinou z bioinformatické databáze Ensembl. Zjištěné četnosti také porovnáváme mezi 20 pacientkami s hematologickým nálezem a referenční skupinou 136 pacientek bez hematologického nálezu. Následující 4 polymorfismy jsme identifikovali jako rizikové faktory pro výskyt hematologického nálezu u žen s reprodukčními komplikacemi: FV Leiden (OR = 4,206; 95% CI 1,173 až 15,09), PTH G20210A (OR = 3,462; 95% CI 0,306 až 39,1); FV R2 (OR = 2,41; 95% CI 0,956 až 6,079) a FXIII Val34Leu (OR = 2,167; 95% CI 1,085 až 4,328). Protektivní charakter jsme zjistili u obou haplotypových skupin EPCR A1 (OR = 0,739; 95% CI 0,376 až 1,453) i haplotypu A3 (OR = 0,767; 95% CI0,221 až 2,633). Asociaci s reprodukčními komplikacemi jsme objevili u polymorfismů PAI-1 4G/5G (p =0,002), FXIII Val34Leu (p = 0,018), FV R2 (p = 0,019) a FV Leiden (p = 0,025). Na základě našich výsledků je možné konstatovat, že některé ze studovaných polymorfismů jsou asociovány s hematologickým nálezem i reprodukčními komplikacemi. Abstract Inherited thrombophilia not only causes an increased risk of thrombosis, but it is also associated with reproductive complications. In this diploma thesis we compare genotypic and allelic frequencies of 9 selected polymorphisms from 156 patients with reproductive complications to a control group obtained from the Ensembl bioinformatics database. In addition to this, we compare these identified frequencies between 20 patients with positive hematologic record and a group of 136 patients without any hematological difficulties. The following 4 polymorphisms have been identified as risk factors for the incidence of hematological findings: FV Leiden (OR = 4,206; 95% CI 1,173 to 15,09), PTH G20210A (OR = 3,462; 95% CI 0,306 to 39,1); FV R2 (OR = 2,41; 95% CI 0,956 to 6,079) and FXIII Val34Leu (OR = 2,167; 95% CI 1,085 to 4,328). On the contrary, both haplotypes EPCR A1 (OR = 0,739; 95% CI 0,376 to 1,453) and A3 (OR = 0,767; 95% CI0,221 to 2,633) show rather a protective character. In adition to this, polymorphisms PAI-1 4G/5G (p =0,002), FXIII Val34Leu (p = 0,018), FV R2 (p = 0,019) and FV Leiden (p = 0,025) have been observed in patiens with reproductive complications. It can be therefore concluded that some of the studied polymorphisms are associated with hematological and reproductive problems.

Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat svému školiteli, Mgr. Jakubovi Horákovi, Dr. rer. nat., za příkladné vedení, cenné rady a čas, který mi věnoval nad rámec svých povinností. Chtěl bych touto cestou také poděkovat ředitelce MUDr. Kateřině Veselé, Ph.D., za možnost vypracovat tuto diplomovou práci v Sanatoriu Repromeda. Závěrem bych chtěl poděkovat Mgr. Miroslavu Horňákovi, Ph.D., Mgr. Kristině Beránkové a Jitce Dufkové za podnětné konzultace a velmi příjemný pracovní kolektiv.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 13. května 2013 David Kubíček

Obsah 1 Seznam zkratek... 11 2 Úvod a problematika... 12 2.1 Hemostáza krve a fibrinolýza... 12 2.1.1 Koagulace krve... 12 2.1.2 Fibrinolýza... 16 2.2 Trombofilie a trombotické stavy... 19 2.2.1 Trombotické stavy... 19 2.2.2 Vrozená trombofilie... 19 2.2.3 Získaná trombofilie... 20 2.2.4 Trombofilie v reprodukční medicíně... 20 2.3 Vyšetřované trombofilní mutace... 23 2.3.1 Faktor V Leiden (G1691A)... 23 2.3.2 Faktor V R2 (A4070G)... 25 2.3.3 Protrombin (PTH G20210A)... 25 2.3.4 Metylentetrahydrofolát reduktáza (MTHFR C677T)... 26 2.3.5 Metylentetrahydrofolát reduktáza (MTHFR A1298C)... 27 2.3.6 Faktor XIII (Val34Leu)... 27 2.3.7 Inhibitor plazminogen aktivátoru (PAI -1: 4G/5G )... 28 2.3.8 Endoteliální receptor pro protein C (EPCR A1/A2/A3)... 29 3 Cíle diplomové práce... 32 4 Materiál a metody... 33 4.1 Výběr pacientů... 33 4.2 Odběr a zpracování materiálu... 34 4.2.1 Izolace DNA... 34 4.2.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR)... 34 4.2.3 Reverzní hybridizace... 35 4.3 Statistické vyhodnocení... 37

5 Výsledky... 39 5.1 Faktor V Leiden (G1691A)... 39 5.2 Faktor V R2 (A4070G)... 41 5.3 Protrombin (G20210A)... 42 5.4 Metylentetrahydrofolát reduktáza (C677T)... 43 5.5 Metylentetrahydrofolát reduktáza (A1298C)... 45 5.6 Faktor XIII (Val34Leu)... 46 5.7 Inhibitor plazminogen aktivátoru (PAI-1: 4G/5G )... 47 5.8 Endoteliální receptor pro protein C (EPCR A1/A2/A3)... 49 5.8.1 Endoteliální receptor pro protein C (A4600G)... 50 5.8.2 Endoteliální receptor pro protein C (G4678C)... 51 6 Diskuze... 53 6.1 Vliv trombofilních mutací na výskyt pozitivního hematologického nálezu... 53 6.2 Význam trombofilních mutací v reprodukční medicíně... 58 6.3 Hardy-Weinbergova rovnováha... 62 7 Souhrn... 64 8 Summary... 65 9 Literatura... 66

1 Seznam zkratek ADP Adenosin Diphoshate Adenozin difosfát APC Activated Protein C Aktivavaný protein C APLS Antiphospholipid Syndrom Antifosfolipidový syndrom AT Antithrombin Antitrombin CI Confidence Interval Interval spolehlivosti ECM Extracelular Matrix Exstracelulární matrix EPCR Endothelial Protein C Receptor Receptor pro endoteliální protein C FVL Factor V Leiden Faktor V Leiden HW Hardy-Weinberg Hardy-Weinberg IVF In Vitro Fertilization In vitro Fertilizace MeTHF Methyltetrahydrofolate Metyléntetrahydrofolát MMP Matrix Metalloproteinase Matrix metaloproteinázy PAI Plasminogen Activator Inhibitor Inhibitor plazminogen aktivátoru PC Protein C Protein C PCR Polymerase Chain Reaction Polymerázový řetězová reakce PS Protein S Protein S RR Relative Risk Relativní riziko SAM S Adenosyl Methionine S adenosil metionin TF Tissue Factor Tkáňový faktor TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor Inhibitor cesty tkáňového faktoru TKF Tyrosine Kinase Factor Tyrozin kinázový faktor tpa Tissue Plasminogen Activator Tkáňový plazminogen aktivátor upa Urine Plasmonogen Activator Aktivátor plazminogenu urokinázového typu vwf von Willebrand Factor von Willebrandův faktor α2-pi α2 Plasmin Inhibitor α2 inhibitor plazminu

2 Úvod a problematika 2.1 Hemostáza krve a fibrinolýza Jedním ze znaků, který je společný pro všechny obratlovce, je přítomnost uzavřené oběhové soustavy. Současně s evolucí oběhové soustavy se u obratlovců vyvíjel i hemostatický systém, jehož úkolem je zastavit krvácení a opravit poškozené cévy. Hemostatický systém se skládá ze dvou hlavních dějů. Koagulační reakce vedou ke srážení krve a zabraňují tak nadměrnému krvácení. Naopak fibrinolytické reakce rozpouští krevní sraženinu a umožňují obnovu krevního toku v řečišti, čímž přispívájí k znovuobnovení poraněných tkání. Za fyziologických podmínek je zachována hemostatická rovnováha mezi srážlivostí krve a rozpouštěním krve sražené. Základní složky hemostatického systému jsou stejné u všech obratlovců, což svědčí o jeho silné konzervovanosti. 2.1.1 Koagulace krve Při poranění endotelia dochází ke koagulaci krve (hemokoagulace), což je několikastupňový proces vedoucí k vytvoření nerozpustného fibrinového agregátu v místně poranění. Na hemokoagulaci se podílí koagulační faktory (označované římskými číslicemi), které jsou v krvi přítomny zejména v neaktivní formě jako tzv. zymogeny (Tabulka 1). Pro svoji aktivaci (označení a z anglického activated) většinou vyžadují proteolytické štěpení, v jehož důsledku vzniká aktivní serinová proteáza - enzym schopný štěpit další zymogen. Díky této postupné aktivaci jednotlivých faktorů vzniklo v literatuře označení koagulační kaskáda. Iniciace V iniciačním kroku hemokoagulace hraje zásadní roli tkáňový faktor (TF), také známý jako tromboplastin nebo faktor III. TF je integrální membránový protein, syntetizovaný mnoha druhy buněk, a je exprimován na jejich povrchu (Tanaka et al., 2009). Proces hemokoagulace 12

Faktor I (fibrinogen) Faktor II (protrombin) Faktor III (tkáňový faktor, tromboplastin) Jméno Popis Funkce Faktor IV (vápenáté ionty) Faktor V (proakcelerin, tzv stabilní faktor) Faktor VI Faktor VII (prokonvertin) Faktor VIII (antihemofilický faktor A) Faktor IX (Christmasův faktor) Faktor X (Stuart-Prowerové faktor) 340 kda, glykoprotein 72 kda, vitamín K- dependentní serinová proteáza 37 kda Ca++ 330 kda, kofaktor Není znám 50 kda, vitamín K- dependentní serinová proteáza u živých organismů začíná v okamžiku, kdy se krev dostane do kontaktu s buňkami nesoucími tkáňový faktor. TF je ve zdravém organismu přítomen převážně na povrchu buněk sousedících s krevním řečištěm. Poranění endotelia umožní kontakt těchto buněk s krví. Doposud u lidí nebyla popsána absence TF, z čehož se dá usuzovat, že je pro život nepostradatelný. Jakmile se dostane TF do kontaktu s krví, váže se na faktor VIIa a tvoří FVIIa-TF komplex (shrnuto v Morrissey et al., 2012). Zymogen fibrinu (polymery fibrinu tvoří hlavní složku krevní sraženiny) Na konci iniciační fáze aktivován na trombin, v propagační fázi reguluje faktory V, VIII, IX, XI, XII Při kontaktu s krví spouští iniciační fázi koagulace Nezbytné pro většinu koagulačních reakcí Kofaktor aktivace protrombinu na trombin Dříve tak byl označován aktivovaný faktor V Společně s TF spouští iniciační fázi koagulace 330 kda, kofaktor Kofaktor aktivace faktoru X 55 kda, vitamín K- dependentní serinová proteáza 59 kda, vitamín K- dependentní serinová proteáza Kofaktor aktivace faktoru X Aktivuje protrombin na trombin Faktor XI (plazmatický V propagační fázi aktivuje faktor 160 kda, serinová proteáza předchůdce tromboplastinu) IX Faktor XII (Hagemanův Faktor) 80 kda, serinový proteáza Aktivuje faktor XI a prekalikrein Faktor XIII (Faktor stabilizující faktor) Tabulka 1: Koagulační faktory 320 kda transamidáza Kovalentně váže fibrin s dalšími molekulami za vzniku krevní sraženiny Souhrnný přehled koagulačních faktorů a jejích funkcí. Faktory IV a VI jsou uvedeny šedě, protože se nejedná o koagulační faktory v pravém slova smyslu (převzato a upraveno podle Lefkowitz,2006). 13

Faktor VII, vitamín K-dependetní serinová proteáza, je nejvýznamnějším aktivátorem hemokoagulace in vivo (Sullivan et al., 2013). V krvi se na rozdíl od ostatních faktorů vyskytuje i v aktivní formě. Aktivního faktoru VIIa je v cirkulující plazmě za fyziologických podmínek asi 1% (Morrissey, 1996). Faktor VII může být aktivován koagulačními faktory FIXa, FXa, FXIIa, trombinem, plazminem nebo FVII aktivující proteázou. Není zcela jasné, který způsob aktivace je nejvýznamnější, nicméně Morrissey et al. (2012) a další práce naznačují, že by se dokonce mohlo jednat o autoaktivaci. FVIIa-TF komplex vzniká na povrchu buněk nesoucích TF, které se skrze poraněné endotelium dostaly do kontaktu s krví. Komplex FVIIa-TF může aktivovat neaktivní komplexy FVII-TF na dalších buňkách (Morrissey et al., 2012). Na základě studií s in vivo experimenty se zdá, že FVIIa-TF je jediný přirozený aktivátor koagulace v živých organismech (Sullivan et al., 2013). VIIa-TF komplex poté aktivuje faktor IX na IXa a faktor X na Xa (obrázek 1). Faktor Xa následně na povrchu těchto buněk aktivuje protrombin na aktivní serinovou proteázu trombin (Takanaka et al., 2009). V iniciační fázi koagulace je uvolněno jen stopové množství Obrázek 1: Iniciační fáze koagulace (a): při poranění se dostanou do krve buňky nesoucí TF. Faktor VIIa z krve se naváže na TF za vzniku FVII-TF komplexu. (b): Tento komplex aktivuje faktory X na Xa (i FVII-TF na FVIIa-TF a IX na IXa, tyto aktivace nejsou na obrázku zobrazeny). (c): Aktivovaný FXa následně aktivuje protrombin na trombin, ústřední molekulu koagulačních reakcí. (d) Trombin disociuje z buněk nesoucích TF a přispívá k aktivaci krevních destiček, na kterých probíhá propagační část koagulačních reakcí a také aktivuje další koagulační faktory (Převzato a upraveno podle McMichael., 2012). 14

trombinu, protože komplex VIIa-TF-Xa je ihned blokován inhibitory cesty tkáňového faktoru (TFPI). Nejvýznamnějším inhibitorem faktoru Xa a trombinu je antitrombin (AT). Trombin hraje klíčovou roli v celém procesu koagulace. Jde o serinovou proteázu, která aktivuje mnoho dalších faktorů. Trombin nejen štěpí rozpustný fibrinogen na nerozpustný fibrin, ale také aktivuje koagulační faktory V, VIII, XI a XIII. Na druhou stranu trombin skrze aktivaci proteinu C také inhibuje koagulaci (shrnuto v Lancellotti and De cristofaro, 2009). Díky aktivaci faktorů V, VIII a XI je stopové množství trombinu dostatečné, aby mohl být koagulační signál amplifikován v propagační fázi. Stopové množství trombinu, které je aktivovano na konci iniciační fáze disociuje z komplexu na povrchu buněk nesoucích TF. Uvolněný trombin napomáhá k aktivaci krevních destiček, které adherovaly k poškozeným buňkám endotelia v místě poranění. Vazba trombinu na receptory krevních destiček vede ke změnám na jejich povrchu. Krevní destičky změní tvar na kulovitý, ve všech směrech vytvoří filopodie a vytvoří tak prostor, na kterém se odehrají další koagulační reakce. Krevní destičky dále uvolní granule, které obsahují prokoagulační proteiny, nezbytné pro následující reakce a molekuly urychlující aktivaci více krevních destiček. Trombin k aktivaci krevních destiček přispívá i proteolytickým štěpením von Willebrandova faktoru (vwf) a faktoru VIII, které kolují v plazmě dohromady. Uvolněný vwf urychluje adhezi a agregegaci krevních destiček (shrnuto v Morrell and Maggirwar, 2011). Propagace Na konci iniciační fáze jsou v plazmě přítomny faktory FIXa, FXa a kofaktory FVa a FVIIIa, které umožňují sestavení tenázového komplexu na povrchu aktivovaných krevních destiček (obrázek 2). Faktor IXa se spolu s faktorem VIIIa naváže na membránu krevních destiček. Tento komplex je nazýván Tenázový a to díky schopnosti aktivovat faktor X ( Ten ). Tenázový komplex se skládá z faktorů VIIIa, který působí jako kofaktor a serinové proteázy FIXa štěpící faktor X. Naprostá většina faktoru Xa je generována právě aktivitou tenázového komplexu a nikoliv TF-FVIIa komplexu, který se účastní iniciace. Tenázový komplex dokáže aktivovat FX na FXa s 50x větší účinností než TF-FVIIa (Baugh et al., 1998). Větší množství faktoru Xa umožňuje výstavbu protrombinázového komplexu, schopného aktivace velkého množství protrombinu na trombin (shrnuto v McMichael, 2012). Protrombinázový komplex je také tvořen na povrchu aktivovaných krevních destiček a skládá se z kofaktoru Va, který drží celý komplex pohromadě, serinové proteázy Xa a protrombinu, který je faktorem Xa 15

Obrázek 2: Propagační fáze koagulace K sestavení tenázového komplexu dochází na povrchu aktivované krevní destičky. Tenázový komplex se skládá ze serinové proteázy FIXa, kofaktoru VIIIa a Faktoru X. Aktivovaný faktor Xa se následně může podílet na sestavení protrombinázového komplexu schopného aktivace protrombina na trombin. Protrombinázový komplex se skládá z kofaktorů Va, serinové proteázy Xa a protrombinu (Převzato a upraveno podle McMichael, 2012). aktivován na aktivní serinovou proteázu trombin. Trombin poté aktivací faktorů V, VIII a IX přispívá k pozitivní zpětné vazbě, vedoucí ke vzniku velkého množství trombinu, štěpícího rozpustný fibrinogen na nerozpustný fibrin v místě poranění. Fibrinogen se vyskytuje v plazmě ve formě dimeru Aα, Bβ a γ řetezců (obrázek 3), které jsou spojené disulfidickými můstky. Je složen z dvou bočních globulárních domén (D doména) a jedné centrální E domény (Mosesson, 2005). Trombin z nerozpustného fibrinogenu odštěpí fibrinopeptidy A (FpA) a B (FpB) za vzniku monomeru fibrinového vlákna. Doména D jednoho monomeru se následně kovalentně váže na doménu E druhého monomeru. Tuto vazbu zprostředkovává faktor XIIIa s tranglutaminázovou aktivitou (Muszbek et al., 1988.). Výsledná krevní sraženina se skládá z fibrinových agregátů, tvořených polymery fibrinu, mezi které jsou faktorem XIIIa kovalentně vázány další molekuly (např. plazminogen inhibitory α 2- PI, zajišťující rezistenci před fibrinolýzou). 2.1.2 Fibrinolýza Hemokoagulace krve vede ke vzniku krevní sraženiny. Opačný proces, kdy se polymerizovaný fibrin rozpouští, se nazývá fibrinolýza. Za fyziologicky normálních 16

Obrázek 3: Struktura a tvorba fibrinového polymeru (A) Dimer fibrinogenu je tvořen doménami Aα, Bβ a γ. Fibrinogen je složený z dvou D domén a jedné centrální E domény (B). Po odštěpení fibrinopeptidů FpA a FpB trombinem je fibrinogen aktivován na fibrinové monomery, které jsou následně za pomoci faktoru XIIIa kovalentně spojeny za vzniku fibrinového polymeru, hlavní složku krevní sraženiny (převzato a upraveno podle Lefkowitz,2006). podmínek, kdy není endotelium narušeno, je fibrinolýza potlačena, jelikož v krvi koluje nadbytek jejich inhibitorů. Plazmin je hlavní fibrinolytickou proteázou účastnící se fibrinolýzy, která je zodpovědná za degradaci fibrinového polymeru. (obrázek 4). Plazminogen, neaktivní forma plazminu, je aktivována molekulami tc-tpa (two chain tissue Plasminogen Activator) a tc-upa (two chain urokinase plasminogen activator), což jsou přirozené aktivátory plazminogenu sekretované endoteliálními buňkami nebo makrofágy ve formě jednořetězců (sc-upa respektive sc-tpa). V cévách je plazminogen aktivován pomocí tpa, zatímco v extravaskulárních tkáních pomocí upa. Kromě degradace fibrinového polymeru plazmin urychluje fibrinolýzu i tím, že štěpí scupa i sc-tpa z jednořetězcové formy do aktivnější dvouřetězcové formy (shrnuto v Heissig et al., 2007). Na regulaci fibrinolýzy se podílí velké množství molekul. Mezi nejdůležitější patří TAFI, PAI-1 a α2pi Nejvýznamnějším inhibitorem plazminu je TAFI (thrombin activatable fibrinolysis inhibitor), který štěpí plazmin a snižuje jeho koncentraci v plazmě, čímž 17

Obrázek 4: Schématické znázornění fibrinolýzy Plazmin je enzym s fibrinolytickou aktivitou, který štěpí fibrinové polymery na menší fragmenty. Zymogen plazminogen je aktivován tc-tpa a tc-upa do aktivní formy plazminu. Plazmin štěpí oba plasminogen aktivátory na dvouřetězcovou formu, čímž urychluje fibrinolýzu. Nejvýznamnějšími inhibitory fibrinolýzy (zeleně) jsou PAI-1, který inhibuje oba plazminogen aktivátory a TAFI s α2pi inhibující přímo plazmin (převzato a upraveno podle Cesarman-Maus and Hajjar, 2005) stabilizuje krevní sraženinu. Mezi další regulátory fibrinolýzy patří PAI-1 (plasminogenactivator inhibitor), který inhibuje tpa i upa a také α2pi (α2 plasminogen inhibitor) inhibující plazmin přímo ve fibrinových polymerech. (Mutch et al., 2007). Plazmin štěpí fibrinový polymer za vzniku D-dimerů a dalších fragmentů (obrázek 5). Fragmenty označované jako D-dimery jsou tvořeny dvěma D doménami fibrinového polymeru (shrnuto v Mosesson, 2005). Přítomnost D-dimerů v krvi indikuje rozpad fibrinového polymeru, zatímco ostatní fragmenty mohou vzniknout i degradací fibrinového monomeru nebo fibrinogenu. U pacientů s podezřením na žilní tromboembolismus se měří hladina D-dimerů a při zvýšené hladině se nasazuje antikoagulační léčba. (Wells et al., 2003). Obrázek 5: Schématické znázornění degradace fibrinového polymeru za vzniku D- dimerů (převzato a upraveno podle Cesarman-Maus and Hajjar, 2005). 18

2.2 Trombofilie a trombotické stavy Pojem trombofilie označuje poruchu hemostázy, která je patofyziologicky a statisticky asociována se zvýšeným rizikem vzniku trombózy a dalších trombotických stavů. Jde o narušení fyziologické rovnováhy mezi koagulačními a antikoagulačními faktory ve prospěch procesů podporujících srážení krve. Příčiny trombofilie mohou být vrozené nebo získané v průběhu života. Nejčastěji jde o jejich kombinaci. 2.2.1 Trombotické stavy Hyperkoagulace způsobuje větší srážlivost krve a může vést ke vzniku trombů na endoteliu (trombóza). Podle výskytu rozlišujeme žilní a arteriální trombózu. Trombus brání dostatečnému prokrvení organismu a může způsobit podvyživení a hypoxii tkání vedoucí až ke smrti. Téměř u 50 % případů trombózy je příčinou právě narušená hemostatická rovnováha (Kyrle et al., 2010). Nejčastějším projevem trombofilie je hluboká žilní trombóza doprovázená plicní embolií, dohromady označované jako žilní tromboembolismus (VTE). Hluboká žilní trombóza označuje vznik krevní sraženiny postihující nejčastěji hluboké žíly dolní končetiny a pánve. Vzniklý trombus se může uvolnit (embolizace) ze stěny endotelia a proudit krevním řečištěm až do plícnice, hlavní tepny přivádějící krev do plic. Podle velikosti krevní sraženiny může docházet k dušení, kašli, krátkodobé ztrátě vědomí či náhlému úmrtí (shrnuto v Scarvelis and Wells, 2006). Vedle VTE se trombofilie může klinicky projevit tromby ve většině orgánů. Mezi nejzávažnější trombotické stavy patří krevní sraženina v mozku, která způsobuje ischemii (nedostatečné prokrvení) a může vést až k mozkové mrtvici. Podobně trombus v srdeční svalovině může způsobit odumírání tkáně, projevující se infarktem myokardu. 2.2.2 Vrozená trombofilie Pojmem vrozená trombofilie rozumíme genetické predispozice k vývoji trombofilie. Vrozená mutace nebo polymorfismus mohou zvyšovat riziko vzniku trombotických stavů. Něktreré mutace způsobující deficienci antikoagulačních faktorů představují závažné riziko pro vznik trombofilie. Jde především o deficienci antitrombinu, proteinu C a proteinu S. Antitrombin je hlavní inhibitor trombinu, protein C se spolu s kofaktorem proteinem S podílí na inaktivaci 19

faktoru V a VIII (Khan and Dickerman, 2006). Kromě těchto nejzávažnějších deficiencí existují další trombofilní mutace, např. mutace v protrombinu nebo leidenská mutace pátého faktoru, které zvyšují riziko vzniku trombotických stavů (Podrobněji v kapitole 2.3 Vyšetřované trombofilní mutace). 2.2.3 Získaná trombofilie Vedle vrozené trombofilie může zvýšit riziko vzniku trombotických stavů mnoho jevů v průběhu života. Mezi nejčastější z nich se řadí antifosfolipidový syndrom (APLS). Jedná se o autoimunitní onemocnění, které je způsobeno tvorbou antikardiolipinových protilátek, lupus antikoagulants nebo protilátkami proti β2 glykoproteinu. APLS se může klinicky projevit vznikem trombózy ve většině tkání, či orgánů i komplikacemi v průběhu těhotenství, vedoucími až ke spontánním potratům (shrnuto v Gado and Domjan 2012). Mezi další jevy způsobující trombofilii patří například užívání estrogenů z důvodu antikoncepce, nebo obezita. Také nádorové buňky při metastázováni produkují více prokoagulačních faktorů (shrnuto v Heit, 2007). Trombofilie může být u některých lidí způsobena i reakcí na heparin, lék podávající se proti trombotickým stavům (Rosendaal, 2005). 2.2.4 Trombofilie v reprodukční medicíně V průběhu těhotenství probíhají velké změny v hemostatickém systému. Hladina prokoagulačních faktorů je výrazně vyšší, což může být evoluční mechanismus, který zabraňuje výrazným ztrátám krve při porodu (Lindqist and Merlo, 2006). Na druhou stranu snížená hladina fibrinolýzy a zvýšená hladina koagulačních faktorů zvyšuje riziko žilního tromboembolismu. V kombinaci s vrozenou nebo získanou trombofilií je toto riziko výrazně vyšší (Scarvelis and Wells, 2006). Lockwood (2002) naměřil v průběhu těhotenství 20-200% nárůst hladiny vwf, faktorů II, V, VII, VIII i faktoru X. Největší nárůst zaznamenal u fibrinogenu, antikoagulační faktory byly zvýšeny jen minimálně. I fibrinolytický systém vykazuje rozdílné hladiny některých komponent v průběhu těhotenství. Mírně zvýšené jsou hladiny plazminogenu, i tpa, zatímco PAI-1 je zvýšen až 5x. U těhotných žen je také exprimována molekula PAI-2, která je přítomna jen v průběhu těhotenství. Výrazně zvýšená hladina PAI-1 spolu s PAI-2 způsobují sníženou aktivitu fibrinolytického systému v průběhu těhotenství (Lockwood, 2002). Všechny tyto změny v průběhu těhotenství vedou k hyperkoagulaci. 20

Uhnízdění blastocysty Uhnízdění (nidace) blastocysty k epitelu endometriální sliznice v průběhu těhotenství je klíčový a velmi komplexní proces. Na úspěšnosti nidace se podílí celá řada faktorů od věku matky, hladiny jejích hormonů, kvality genomu embrya až po správnou funkci mnoha extracelulárních molekul, které zajištují přestavbu endometria, či molekul účastnících se hemostázy krve (shrnuto v Large and DeMayo 2012). K nidaci embrya může dojít jen v krátkém období mezi šestým a dvanáctým dnem po ovulaci, první kontakt mezi buňkami blastocysty a endometria zprostředkovává integrin αvβ3. Konkrétně jeho podjednotka β3, která je součástí i dalších integrinů, například αiibβ3, integrinu účastnícího se agregace krevních destiček při poranění endotelia (Lessey, 1998). Pro správné uchycení blastocysty je nezbytné, aby se trofoblast postupně zanořil do děložní sliznice endometria. K úspěšnému zanoření přispívají faktory exprimované matkou i embryem, z nichž většina způsobuje degradaci extracelulární matrix (ECM) buněk endometria, či prorůstání cév endometriem za vzniku primitivní placenty. Při uhnízdění blastocysty se zvyšuje exprese matrix metaloproteináz (MMP), které jsou zodpovědné za degradaci ECM (Liu et al., 2003). Migrace části trofoblastu endometriem je kontrolována upa, který aktivuje některé MMP účastnící se tohoto procesu. Tento upa je rovněž součástí fibrinolytického procesu, v němž se aktivuje plazminogen, enzym s fibrinolytickou aktivitou. Na druhou stranu je inhibován molekulou PAI-1(Ye et al., 1995). PAI-1 se také podílí na regulaci buněčné adheze a migrace jelikož je schopen štěpit vazbu mezi integriny respektive upa receptorem a vitronektinem. 4G/5G polymorfismus v PAI-1 ovlivňuje hladinu proteinu v krvi. I přesto, že je 4G alela je spojována s větším rizikem žilního tromboembolismu, její role při nidaci není dosud objasněna (Coulam et al., 2006). Zanořený trofoblast se dostává do kontaktu s cévami endometria, čímž vzniká primitivní placenta. V této fázi těhotenství je v endometriu zvýšená hladina trombinu, pravděpodobně jako důsledek zvýšené hladiny TF a také molekuly PAI-1, v důsledku čehož dochází k hyperkoagulaci (Lockwood et al., 2007). Patofyziologie placenty Úspěšná nidace blastocysty do děložní sliznice endometria spolu s vývojem feto-maternálního oběhu, který je závislý na správném vývoji placenty, jsou klíčové pro úspěšné těhotenství. Trombofilie zvyšuje riziko vzniku mikrotrombů v placentě, které mohou být příčinou mnoha 21

patologických komplikací v těhotenství, jako je preeklampsie (narušený fetomaternální oběh), intrauterinní růstová restrikce, infarkty placenty či opakové potraty. Many et al. (2001) zkoumal vliv maternální trombofilie na abnormality placenty u žen se závažnými problémy v těhotenství. Ženy s trombofilií měly častější infarkty placenty než kontrolní skupina žen se stejnými problémy bez trombofilie. K podobným závěrům došel i Gogia and Machin (2008), kteří zjistili, že ženy s trombofilií oproti kontrolní skupině během těhotenství častěji prodělaly infarkt placenty, případně měly detekované zvýšené množství trombů v placentě. V protikladu s těmito závěry Mousa and Alfirevic (2000) nenašli žádné rozdíly v patofyziologii placent mezi ženami s trombofilií a kontrolní skupinou. Podobně Kahn et al. (2009) došel k závěru, že ačkoliv jsou abnormality placent častější u pacientek s preeklampsií, než u kontrolní skupiny, nejsou tyto abnormality placent způsobené vrozenou trombofilií. Většina prací se zaměřuje pouze na maternální trombofilii, přestože téměř všechny trombofilní mutace se dědí autozomálně a je tedy jen 50% pravděpodobnost, že tento genotyp přejde i na plod. Jelikož je větší část placenty tvořena genotypem embrya, mohly by patofyziologické abnormality placent být způsobeny vrozenou trombofilií plodu zděděnou od otce. Zda tomu tak je, není zcela jasné. Ačkoli Ariel e al. (2004), nenašel rozdíly v četnosti placentárních abnormalit u fetální trombofilie ve srovnání s maternální trombofilií, Ozdemir et al. (2012) došel k závěru, že záleží na genotypu obou rodičů. Konkrétně jsou-li oba rodiče homozygotní pro 4G alelu PAI-1, MTHFR C677T, nebo heterozygotní pro FVL, je vyšší riziko výskytu opakovaných potratů v prvním trimestru. Je potřeba zdůraznit, že z prospektivních (kohortních) studií vyplývá, že naprostá většina žen s vrozenou trombofilií prodělá standardní těhotenství bez jakýchkoliv komplikací. Jednotlivé trombofilní mutace mají spíše aditivní efekt, kdy u pacientek s více trombofilními mutacemi je riziko potíží v těhotenství vyšší (Coulam et al., 2006). Těhotenství je velmi komplexní proces, a proto je velmi obtížné asociovat jednotlivé příčiny vrozené či získané trombofilie s konkrétními problémy během těhotenství. 22

2.3 Vyšetřované trombofilní mutace Mnoho jednonukleotidových polymorfismů v DNA způsobuje hyperkoagulaci či zvyšuje riziko vzniku trombotických stavů. Tyto polymorfismy, dále označované jako trombofilní mutace ve většině případů narušují rovnováhu mezi koagulací a fibrinolýzou. Tato kapitola se věnuje devíti trombofilním mutacím (tabulka 2), které byly detekovány v rámci diplomové práce. Název proteinu Mutace Poznámka nukleotid aminokyselina Faktor V (Leiden) G1691A Arg506Gln Faktor V (R2) A4070G His1299Arg Protrombin G20210A mutace v 3`UTR mrna MTHFR C677T Ala222Val MTHFR A1298C Glu429Ala Faktor XIII G103T Val34Leu PAI-1-675 4G/5G mutace v promotorové sekvenci EPCR H1/H2/H3 A4600G G4678C Ser219Gly mutace v 3`UTR mrna Tabulka 2: Přehled studovaných trombofilních mutací 2.3.1 Faktor V Leiden (G1691A) Mezi nejvíce studované proteiny koagulačního systému patří faktor V, někdy také nazývaný jako labilní faktor nebo proakcelerin. Faktor V byl objeven na konci čtyřicátých let minulého století (Owren and Oslo, 1947). Faktor V je protein skládající se z 6 domén (obrázek 6), který se, po své aktivaci, účastní procesu koagulace jako kofaktor protrombinázového komplexu (Corral-Rodriquez et al., 2011). FV se skládá z A1, A2, B, A3, C1 a C2 domén a může být aktivován trombinem i Faktorem Xa. Aktivace probíhá štěpením zymogenu v pozicích 709, 1018 a 1545, což vede ke vzniku heterodimeru skládajícího se z těžkého a lehkého řetězce. Aktivovaný faktor V je součástí protrombinázového komplexu, který se skládá z faktorů Va, Xa, protrombinu a vápenátých iontů. Protrombinázový komplex štěpí protrombin za vzniku trombinu. Aktivita protrombinázového komplexu je přísně regulována, aby zajistila správné množství trombinu. 23

Obrázek 6: Aktivace a inaktivace faktoru V Faktor V je složen ze šesti domén. A1, A2, B, A3, C1, C2. Při aktivaci jsou odštěpeny domény B a A3 proteolytickým štěpením v pozicích 709, 1018 a 1545 čímž vzniká heterodimer z těžkého a lehkého řetězce. Inaktivace FVa může probíhat v pozicích 306, 679 a 506. Mutace v pozici 506 je označována jako Leidenská mutace (převzato a upraveno podle Corral- Rodríguez et al., 2011) Na této regulaci se podílí i aktivace a inaktivace faktoru V (shrnuto v Morrell and Maggirwar, 2011). Nejčastější mutací v genu pro faktor V je Leidenská mutace (FVL), která vede ke zvýšenému množství aktivovaného faktoru Va (Bertina et al. 1994). Jde o substituci na pozici 1691, kde guanin je nahrazen adeninem. Tato substituce způsobuje výměnu původního argininu za glutamin v pozici 506. Leidenská mutace vede ke strukturní změně proteinu v místě vazby s aktivovaným proteinem C (APC), což je přirozeně se vyskytující antikoagulant, který má proteázovou aktivitu a je schopen štěpit aktivní faktor V v pozici 506, a tím jej inaktivovat. FVL mutace zvýšuje hladinu faktoru Va v plazmě a vede k APC rezistenci. Mutace FVL zvyšuje riziko vzniku VTE (Gohil, et al., 2009) i opakovaných potatratů v prvním trimestru (Goodman et al., 2006; Rodger et al., 2010), na druhou stranu má pravděpodobně pozitivní efekt na implantaci blastocysty (Gopel et al., 2001). 24

2.3.2 Faktor V R2 (A4070G) Další vyšetřovanou mutací v genu pro pátý faktor, je substituce na pozici 4070, kde je adenin nahrazen guaninem, což vede k záměně původního histidinu za arginin. Tato mutace je označovaná jako R2 (Lunghi et al., 1996) a patří mezi 13 polymorfismů v FV genu, které jsou přenášeny jako jedna haplotypová skupina HR2. Sedm z těchto mutací způsobuje substituci v aminokyselinové sekvenci měnící strukurní a funkční vlastnosti faktoru V. HR2 haplotyp zvyšuje koncentraci FV v plazmě a zvyšuje riziko vzniku rezistence k APC (Castoldi and Rosing 2004). Vliv mutace FV R2 na vznik VTE je nejistý. Někteří autoři uvádí rizikový charakter této mutace (Gohil et al,. 2009), zatímco jiní autoři uvádí pouze aditivní efekt k mutaci FVL (Folsom et al., 2002). Význam v reprodukční medicíně zatím nebyl potvrzen (Goodman et al., 2006). 2.3.3 Protrombin (PTH G20210A) Protrombin (faktor II), zymogen trombinu kódovaný genem F2, byl izolován roku 1987 (Degan and Davie). Jedná se o vitamín K-dependentní glykoprotein syntetizovaný v játrech, který se skládá z 622 aminokyselin a pěti domén, z nichž jedna zajištuje funkci serinové proteázy. Protrombin je v průběhu koagulace aktivován na trombin, klíčovou molekulu koagulačního procesu (viz obrázek 1 a 2). Faktor Xa umožňuje výstavbu protrombinázového komplexu, který je tvořen faktorem Va, Xa a vápníkem. Protrombinázový komplex štěpí protrombin na serinovou proteázu alfa-trombin skládající se z těžkého a lehkého řetězce. Aktivita protrombinázového komplexu vede ke vzniku velkého množství trombinu, který následně zesiluje koagulační signál skrze aktivaci koagulačních faktorů V, VIII, XIII a přeměny fibrinogenu na fibrin. Na druhou stranu trombin může díky aktivaci proteinu C také inhibovat koagulaci (shrnuto v Lancellotti and De cristofaro, 2009). Nejčetnější mutací protrombinu je substituce původního guaninu za adenin v pozici 20210, která způsobuje značné zvýšení hladiny protrombinu (Poort et al. 1996). Záměna G A se nachází v 3` nepřekládané oblasti a zvyšuje akumulaci mrna i syntézu protrombinu v játrech. 25

Mutace PTH G20210A zvyšuje riziko vzniku VTE (Gohil et al., 2009). Názory na význam v reprodukční medicíně se rozcházejí, kdy existují práce potvrzující vliv na opakové potraty v prvním trimestru (Robertson et al., 2006) i práce, které tuto asociaci nepotvrdily (Rodger et al., 2010). 2.3.4 Metylentetrahydrofolát reduktáza (MTHFR C677T) Metylentetrahydrofolát (MTHFR) reduktáza je enzym účastnící se přeměny homocysteinu na methionin. Je kódován genem MTHFR a skládá se z 656 aminokyselin, které tvoří homodimer (Goyette et al., 1994). MTHFR je součástí cyklu kyseliny listové, která mimo jiné hraje roli jak v syntéze, tak i v metylaci DNA (obrázek 7; shrnuto v Laanpere et al., 2010). MTHFR katalyzuje redukci 5,10- metyléntetrahydrofolátu (5,10-MeTHF) na 5-metyltetrahydrofolát (5-MeTHF), který společně s vitamínem B12 konvertuje homocystein na metionin. Metionin je součástí S-adenosyl metioninu (SAM), molekuly, která je donorem metylové skupiny při mnoha anabolických reakcích jako jsou transmetylace, transsulforace, či aminopropilace. Obrázek 7: Úloha MTHFR v anabolických procesech MTHFR redukuje 5,10-MeTHF na 5-MeTHF, molekulu účastnící se přeměny homocysteinu na metionin. Metionin je zabudován do SAM, molekuly, která je donorem metylové skupiny pro analbolické procesy jako je transmetylace, transsulforace, aminopropilace a další (převzato a upraveno Laanpere et al., 2010). Polymorfismus C677T nacházející se v genu MTHFR leží v katalytické doméně. Jde o substituci cytozinu za guanin v pozici 677, způsobující záměnu, která vede k záměně původní aminokyseliny valinu za alanin v proteinové sekvenci (Frosst et al., 1995). Jedná se o běžný 26

polymorfismus vyskytující se v bělošské populaci s frekvencí 0,38. Výsledný protein s pozměněnou terciální strukturou je termolabilní a má sníženou enzymatickou aktivitu na 30%. Při nedostatečné aktivitě MTHFR se v buňkách hromadí homocystein, způsobující hyperhomocystemii. Polymorfismus C677T je častým jevem, který vykazuje etnické rozdíly, kdy pro bělošskou populaci pravděpodobně nepředstavuje ani riziko pro vznik VTE (Gohil et al., 2009), ani pro opakované potraty (Robertson et al., 2006), zatímco v asijské populaci je rizikovým faktorem pro VTE (Gohil et al., 2009) i opakované potraty v prvním trimestru (Wu et al., 2012). 2.3.5 Metylentetrahydrofolát reduktáza (MTHFR A1298C) Van der Put et al. (1998) identifikoval další častý polymorfismus v genu MTHFR. Jde o substituci původního adeninu za cytozin v pozici 1298 nukleotidové sekvence, která vede ke vzniku alaninu namísto kyseliny glutamové v aminokyselinové sekvenci. Tento polymorfismus se vyskytuje v bělošské populaci s frekvencí 0,33. Zatímco polymorfismus C677T se nachází v katalytické doméně MTHFR, substituce A1298C leží v doméně s regulační fukncí. Polymorfismus A1298C stejně jako C677T snižuje aktivitu MTHFR, u homozygotů je enzymatická aktivita snížena přiližně na 60%. Heterozygotní ani homozygotní jedinci překvapivě nevykazují vyšší hladinu homocysteinu v krvi ani sníženou hladinu 5- MeTHF, což jsou znaky běžně se vysyktující u C677T polymorfismu. Polymorfismus A1298C má aditivní účinek u pacientů s polymorfismem C677T (Ogino and Wilson, 2003). U Složených heterozygotů byla pozorována vyšší hladina homocysteinu než u jednoduchých heterozygotů C677T, zatímco u jednoduchých heterozygotů A1298C je hladina v normě Podobně jako u C677T i u polymorfismu A1298C byla zjištěna korelace se zvýšeným rizikem k potratům pouze u asijské populace (Nair et al., 2013). 2.3.6 Faktor XIII (Val34Leu) Faktor XIII je tetramerický zymogen s protransglutaminázovou aktivitou, skládající se ze dvou potenciálně aktivních podjednotek A a dvou inhibičních podjednotek B (FXIII A 2 B 2 ) (Muszbek et al., 2008). V plazmě se FXIII váže B podjednotkou na γ-řetězec fibrinu. Syntéza obou podjednotek probíhá v odlišných buňkách. Tetramerický komplex je tvořen v plazmě. Podjednotka A je syntetizována v buňkách kostní dřeně (Buluk, 1955), zatímco 27

podjednotka B je syntetizována hepatocyty (Wolpl et al., 1987). Dimer FXIII-A je přítomný i v buňkách krevních destiček a monocytů. Faktor XIII se stává aktivním (FXIIIa) v poslední fázi koagulace, kdy je aktivován trombinem a vápenatými Ionty. Trombin odštěpí z podjednotky FXIII-A kratší sekvenci, která se rozpustí a dá vznik podjednotkce FXIII-A` Za přítomnosti Vápenatých iontů se naruší vazba mezi inhibičními podjednotkami FXIII-B, a podjednotkami FXIII-A`. V důsledku tohoto procesu vzniká enzymaticky aktivní FXIII-A* 2 (v koagulační literatuře označován jen jako FXIIIa) (Lorand et al., 1993). Hlavní funkcí Faktoru XIIIa v plazmě je kovalentně vázat α 2- PI (inhibitor plazminu) do fibrinových vláken za vzniku krevní sraženiny (Mosesson et al., 2008). Začlenění α 2- PI do fibrinové sítě chrání nově syntetizovaný fibrinový polymer před jeho degradací plazminem. Faktor XIIIa váže do fibrinového polymeru další komponenty fibrinolýzy, jako je PAI-2 s fibronektinem, i když fukce těchto vazeb zatím není plně objasněna (Ritchie et al., 2000). Mezi nejlépe prostudovaný polymorfizmus v genu pro faktor XIII-A patří mutace Val34Leu (Mikkola et al., 1994). Jedná se o polymorfizmus v genu F13A1 kódující podjednotku A, kdy je na 103 pozici primární struktury zaměněn původní guanin za tymin. V důsledku toho je v aminokyselinové sekvenci valin namísto leucinu. Tato mutace vede k vyšší aktivitě Faktoru XIII (Ariens et al., 2000). Polymorfismus Val34Leu má pravděpodobně protektivní charakter před VTE (Gohil, et al., 2009). Polymorfismus Val34Leu nemá vliv na uhnízdění blastocysty, ale je klíčový pro následné udržení těhotenství (Asahina et. Al., 2007), což dokládá také fakt, že přítomnost této mutace zvyšuje u žen riziko opakovaných potratů v prvním trimestru (Goodman et al., 2006). 2.3.7 Inhibitor plazminogen aktivátoru (PAI -1: 4G/5G ) PAI-1 je hlavní inhibitor upa i tpa, který byl objeven v roce 1984 (van Mourik et al.) a patří do rodiny inhibitorů serinových proteáz (tzv. serpiny). PAI-1 je exprimován mnoha buněčnými typy jako jsou buňky sleziny, endoteliální buňky a adipocity. Syntetizován je vždy v aktivní podobě, za fyziologických podmínek je však konvertován do neaktivní formy. V plazmě je aktivní forma PAI-1 stabilizována vazbou na vitronektin. (Loskutoff and Samad, 1988). 28

PAI-1 hraje klíčovou roli v regulaci fibrinolýzy inhibicí plazminogen aktivátorů. Degradaci fibrinu v krevních sraženinách zprostředkovává plazmin. Plazminogen je konvertován na aktivní plazmin molekulami upa a tpa. Molekula PAI-1 je primárním inhibitorem obou těchto plazminogen aktivátorů, čímž ovlivňuje hladinu fibrinolytického plazminu v plazmě. (obrázek 4). Při vyšší hladině PAI-1 je v plazmě méně plazminu, což vede ke snížené fibrinolýze. (Ye et al., 1995). V sekvenci PAI-1 se vyskytuje polymorfismus označovaný jako 4G/5G. Jedná se o deleci v promotorové sekvenci v pozici -675 před začátkem transkripce. Jedna alela má v této pozici 5 guaninů za sebou (5G), druhá má pouze 4 guaniny (4G) (Dawson et al., 1993). Obě alely obsahují vazebné místo pro aktivátor transkripce, alela 5G navíc obsahuje vazebné místo pro represor, snižující transkripci PAI-1 (Burzotta et al., 1998). U nositelů 4G alely v homozygotním stavu byla naměřena vyšší hladina PAI-1. Rozdíly v hladině 4G a 5G alely nejsou stabilní, záleží na přítomnosti environmentálních faktorů i rizikových faktorů pro různá onemocnění, které jsou schopny stimulovat expresi PAI-1 (Hekman and Loskutoff, 1985). Pacientky s genotypem 4G/4G mají vyšší riziko výskytu VTE (Gohil et al., 2009). Tento genotyp se také objevuje častěji u pacientek s problémy při uhnízdění blastocysty (Coulam et al., 2006) a opakovanými potraty (Subrt et al., 2013). S těmito závěry však některé práce nesouhlasí (Su et al., 2013). 2.3.8 Endoteliální receptor pro protein C (EPCR A1/A2/A3) Endoteliální protein C receptor byl objevený v devadesátých letech (Fukudome and Esmon, 1994). Je to transmembránový protein, homologní s hlavním kompatibilním komplexem třídy I, který hraje důležitou roli v imunitní odpovědi. Gen EPCR se skládá ze 4 exonů a leží na dlouhém raménku dvacátého chromozomu. EPCR je exprimován buňkami na vnitřní straně endotelia. EPCR je součástí dráhy aktivující protein C, která je fyziologicky významným regulátorem koagulace (Obrázek 8). Dráha se spouští, navázáním trombinu (centrální molekula koagulace) na endotelialní receptor trombomodulin. Protein C (PC) se naváže na receptor EPCR. Trombin-trombomodulinový komplex aktivuje protein C na APC (aktivovaný protein C). APC díky změně konformace následně disociuje do plazmy, kde se váže na kofaktor, protein S (PS). Komplex APC-PS 29

inaktivuje faktory Va a VIIIa. Protein C je pomocí vazby mezi na EPCR přibližován ke komplexu trombin-trombomodulin, čímž může docházet k jeho aktivaci. Snížená aktivita EPCR ve svém důsledku vede k vyšší hladině Faktorů Va i VIIIa a tím i k vyšší srážlivosti krve (Shrnuto v Khor and Cott, 2009). Obrázek 8: Dráha aktivující protein C Navázáním trombinu na receptor tromobodulin a PC na EPCR (a) vzniká trombomodulinový komplex (b), který konvertuje PC na APC. APC se uvolní z komplexu a v plazmě se váže na PS (c). APC-PS komplex inaktivuje faktory Va a VIIIa (d) (převzato a upraveno podle Khor and Cott, 2009). V sekvenci EPCR genu se vyskytuje více polymorfních míst, která mohou dát vznik čtyřem haplotypům A1, A2, A3, A4 (Medina et al., 2007), z nichž jsou pro tuto diplomovou práci důležité A1, A2, A3 (tabulka 2). Tyto haplotypy jsou definovány změnami v pozicích 4600 a 4678. Zatímco haplotyp A1 má v pozici 4600 adenin a v pozici 4678 cytozin, haplotyp A2 adenin, respektive guanin a haplotyp H3 má guanin v obou pozicích. Haplotyp Pozice 4600 4678 A1 A C A2 A G A3 G G Tabulka 2: Haplotypy EPCR Tři haplotypy (A1-A3) v genu EPCR lišící se v pozicích 4600 (A/G) a 4678 (C/G) Převzato a upraveno podle Medina et al., 2007 30

Haplotyp A1 má pravděpodobně protektivní účinek před VTE (Medina et al., 2004) zatímco názory na roli haplotypu A3 se rozcházejí (Medina et al., 2004; Saponik et al. 2004;). Význam haplotypů A1 ani A3 v reprodukční medicíně není plně objasněn, ale zdá se, že haplotyp A3 zvyšuje riziko opakovaných potratů u nositelů mutace FVL. (Hopmeier et al., 2008). 31

3 Cíle diplomové práce Tato diplomová práce s názvem Význam trombofilních mutací v reprodukční medicíně si klade za cíl zjistit, zda existuje asociace mezi četností vyšetřovaných trombofilních mutací a reprodukčními komplikacemi u pacientek Sanatoria Repromeda. Mezi vyšetřované mutace patří FV Leiden (G1691A), FV R2 (A4070G), PTH G20210A, MTHFR C677T, MTHFR A1298C, Faktor XIII Val34Leu, PAI-1 4G/5G, EPCR A4600G a EPCR G4678C. K naplnění tohoto cíle byla zvolena metoda asociační studie, do které byl vybrán soubor 156 pacientek ze Sanatoria Repromeda s reprodukčními komplikacemi a kontrolní skupina čítající 85 osob s předky ze střední a západní Evropy. U obou skupin jsou studovány genotypové i alelické četnosti, které jsou následně porovnávány pomocí statistických metod (Fisherův test, χ 2 test) na hladině významnosti 5%. Součástí tohoto cíle diplomové práce je také ověřit, zda se obě populace nacházejí v Hardy-Weinbergově (HW) rovnováze a zjištěná data srovnat s relevantními publikacemi. Dalším cílem této diplomové práce je ověřit trombofilní charakter vyšetřovaných mutací. K dosažení tohoto cíle byla skupina pacientek rozdělena na dvě podskupiny. První z nich představuje 20 pacientek s pozitivním hematologickým nálezem. Druhá, referenční podskupina, se skládá ze 136 pacientek bez hematologického nálezu. U těchto dvou podskupin je zkoumána asociace výskytu pozitivního hematologického nálezu s četností mutatních alel. Výsledný charakter mutantních alel je vyjádřen pomocí poměru šancí (OR, odd ratio). 32

4 Materiál a metody 4.1 Výběr pacientů Do asociačního hodnocení bylo zařazeno celkem 173 pacientů Sanatoria Repromeda vyšetřovaných v letech 2012-2013. Z této skupiny byli z důvodu malého souboru vyřazeni všichni muži (17). Jako kontrolní skupina byla vybrána náhodná skupina čítající 85 osob s předky ve střední a západní Evropě zapojená do projektu 1000 genomů. Výjimku tvoří polymorfismus PAI-4G/5G, u kterého nebyly zveřejněny informace o genotypových a alelických četnostech, a proto byl vybrán menší kontrolní vzorek (n=23) se stejnými parametry a předky jako výše zmíněná kontrolní skupina. Informace o konkrétních genotypech byly čerpány z bioinformatické databáze Ensembl (Fernández-Suárez and Schuster, 2010; URL 1). Polymorfismy byly vyhledány za pomoci referenčních čísel (tabulka 3). Konvenční název SNP FVL G1691A FV R2 A4070G PTH G20210A MTHFR C677T MTHFR A1298C Faktor XIII Val34Leu PAI-1 4G/5G EPCR A4600G EPCR G 4678C referenční číslo rs6025 rs1800595 rs1799963 rs1801133 rs1801131 rs5985 rs1799889 rs867186 rs9574 Tabulka 3: Přehled studovaných polymorfismů a jejich referenčních čísel Zpracované výsledky byly následně odeslány klinickému genetikovi k vyhodnocení a posouzení dalšího postupu. Ze 156 vyšetřených pacientek jich 20 mělo pozitivní hematologický nález, na který byla nasazena léčba. Skupina 136 vyšetřených žen bez hematologického nálezu tvoří referenční skupinu. 33

4.2 Odběr a zpracování materiálu 4.2.1 Izolace DNA Ke genetickému vyšetření byly použity vzorky periferní krve, které byly odebírány na pracovišti Sanatoria Repromeda po předchozím získání informovaného souhlasu k vyšetření trombofilních mutací. Pro odebrání periferní krve byly použity speciální zkumavky s EDTA (antikoagulans) a krev byla následně převezena do genetické laboratoře při teplotě 2-8 C. Maximální délka skladování vzorků při této teplotě nepřesáhla 3 dny. K izolaci DNA bylo použito 200µl krevního koláče obsahujícího bílé krvinky, který byl odebrán po centrifugaci odběrové zkumavky s periferní krví po dobu 10 minut při 250 g (Universal 320R, Hettich Zentrifugen). Samotná izolace DNA byla provedena pomocí komerčního kitu JetQuick Blood &Cell Culture DNA Spin Kit od společnosti Genomed podle protokolu výrobce ve variantě s využitím centrifugace. Koncentrace a čistota izolované DNA byla následně měřena UV spektrofotometrem (Bio Photometr 6131, Eppendorf). Za čistý vzorek vhodný pro další zpracování byla považována DNA s poměrem absorbance při vlnových délkách 260 nm a 280 nm (A 260 /A 280 ) v rozmezí 1,7 2,0. 4.2.2 Polymerázová řetězová reakce (PCR) Naizolovaná DNA byla následně amplifikována pomocí multiplex PCR. U všech pacientů byl použit komerční mix CVD StripAssay T od společnosti ViennaLab, který obsahuje amplifikační mix, umožňující zmnožení 9 cílových polymorfismů v jedné PCR reakci (FV Leiden (G1691A), FV R2 (A4070G), PTH G20210A, MTHFR C677T, MTHFR A1298C, Faktor XIII V34L, PAI-1 4G/5G, EPCR A4600G, EPCR G4678C). Kit dále obsahuje ředící pufr a je dodáván s Dream Taq polymerázou. PCR byla provedena v termocykleru (Thermal cykler XP-A, Bioer) v reakci (tabulka 4), kde každý vzorek obsahoval 15µl amplifikačního mixu, 5µl naředěné Dream Taq polymerázy (2U) a 100 ng templátové DNA naředěné vodou Polymerázová řetězová reakce Reakční směs objem (µl) teplota Čas opakování Amplifikační mix 15 94 C 5 min Tabulka 4: složení reakční směsi a teploty jednotlivých kroků PCR Ředěná Dream taq polymeráza (2U) 5 94 C 15s 58 C 30s 35x DNA templát (100ng) 5 72 C 30 72 C 3min 34

do objemu 5µl. Reakce proběhla po počáteční denaturaci DNA (94 C 5 min) v 35 cyklech při teplotách 94 C 15s, 58 C 30s a 72 C 30s s finální extenzí 72 C 3 min. Přítomnost amplikonů po PCR reakci byla ověřena pomocí elektroforetické separace na 3% agarozovém gelu (AGAROSE I TM, Amresco). Elektroforéza probíhala pod dobu 30 minut při 120V/14cm. Vizualizace byla provedena pomocí netoxické barvičky (GelRed TM,Biotinum). Gel byl umístěn na UV transiluminátor a nasnímán digitálním fotoaparátem Kodak DC-290 ZOOM (obrázek 9). Obrázek 9: Vizualizace PCR amplikonů U pacientů (linie 1-8) je vidět úspěšná amplifikace všech DNA fragmentů. Kontrolní vzorek (linie 0) obsahuje vodu místo DNA, v linii M je délkový standard 4.2.3 Reverzní hybridizace Hybridizace nukleových kyselin je v obecném smylslu jejich schopnost tvořit dvouřetězcové molekuly ze dvou jednořetězcových molekul o vysoké komplementaritě. Reverzní hybridizací rozumíme detekční metodu, kdy je sonda fixována na nosič a hybridizujeme značeným vzorkem, oproti klasické hybridizaci využívající značené sondy a vzorku fixovaného na nosiči. V rámci této diplomové práce byly vyšetřovány polymorfismy FV Leiden (G1691A), FV R2 (A4070G), PTH G20210A, MTHFR C677T, MTHFR A1298C, Faktor XIII Val34Leu, PAI-1 4G/5G, EPCR haplotyp A4600G, EPCR G4678C metodou reverzní hybridizace s využitím komerčního kitu CVD StripAssay T od společnosti ViennaLab. Pomocí multiplex PCR s biotinem značenými primery byly namnoženy a označeny cílové sekvence vyšetřovaných genů, které byly po chemické denaturaci hybridizovány ke specifickým oligonukleotidům imobilizovaným na membránových proužcích. Po inkubaci se streptavidinem konjugovaným s alkalickou fosfatázou, byl výsledek hybridizace vizualizován pomocí substrátu obsahující chromogen (BCIP/NTB). Hybridizace a promývání probíhaly dle návodu výrobce s využitím automatického promývacího robota (B20 TM verze 1.5, Bee Robotics). 35

Odečítání výsledků z membránového proužku bylo provedeno po nalepení suchého proužku na laboratorní protokol Collector TM CVDT StripAssay T pro odečítání a zaznamenání výsledků. Protokol byl naskenován kalibrovaným skenerem (Perfection V33, EPSON) a vyhodnocen za pomoci programu ViennaLab StripAssay (obrázek 10) Evaluator Pro každý polymorfismus (kromě EPCR haplotypu) jsou na proužku dvě sondy, jedna odpovídající standardní a druhá mutantní alele. Genotyp každého pacienta byl určen podle pozitivně vizualizovaných proužků (obrázek 11). Obrázek 10: Ukázka výhodnoceného proužku za pomoci programu ViennaLab StripAssay Evaluator Polymorfismy v genu EPCR (A4600G, G4678C) jsou díky 78pb vzdálenosti součástí jednoho amplikonu, a jsou proto interpretovány jako haplotypy A1, A2, A3. Pro tyto haplotypy jsou na proužku 4 sondy, které určují výslednou kombinací haplotypů (A1/A1, A1/A2, A1/A3, A2/A2, A2/A3 nebo A3/A3; obrázek 12). 36

Wild type alela mutantní alela Genotyp NOR Pozitivní Negativní Normální HET Pozitivní Pozitivní Heterozygot HOM Negativní Pozitivní homozygotní mutant Obrázek 11: Určování genotypu u polymorfismů Na proužku jsou přihybridizovány dvě sondy pro každý polymorfismus, pokud je vizualizovaná pouze standardní alela, jedinec má normální genotyp, pokud jsou vizualizovány obě alely, jedná se o heterozygota a třetí možností je vizualizace pouze mutantní alely, pak jde o homozygotního mutanta Obrázek 12: EPCR haplotypy Podobně jako u ostatních trombofilních mutací jsou EPCR haplotypy určovány podle vizualizace pozitivních alel, jde o dva polymorfismy, pro které jsou 4 alely.jejich kombinací vzniká 6 různých haplotypů 4.3 Statistické vyhodnocení Studovaná data byla statisticky zpracována a vyhodnocena za pomoci softwarů Microsoft Excel (Redmond, USA, Microsoft, 2010) a GraphPad Prism (San Diego, USA, verze 6). Za pomoci Excelu byly vytvořeny kontingenční tabulky, které obsahují počty pacientů a kontrolních osob v kombinaci s jednotlivými genotypy daného polymorfismu/mutace. Ve stejném softwaru byly spočítány genotypové a alelické četnosti. Statistické srovnání genotypových četností mezi kontrolní skupinou a pacienty bylo provedeno z kontingenčních tabulek za pomoci χ 2 testu. Alelické četnosti byly srovnány specializovaným softwarem GraphPad Prism za využití Fisherova dvoustranného exaktního testu, který je více kritický ve srovnání s χ 2 testem. Získané hodnoty byly porovnány se zvolenou hladinou významnosti 37

p = 0,05. Při statisticky významném rozdílu je hodnota p <0,05. V případě zjištění nerovnováhy v genotypovém zastoupení byly následně srovnávny počty osob s konkrétními genotypy pomocí Fisherova dvoustranného exaktního testu. Dále bylo pomocí χ 2 testu ověřeno, zda se obě populace nachází v Hardy-Weinbergově rovnováze. U každého polymorfismu byly také srovnány alelické četnosti 20 pacientek s nasazenou léčbou oproti 136 pacientkám bez léčby Fisherovým dvoustranným exaktním testem. Vztah mutantní alely k hematologickému nálezu byl vyčíslen pomocí OR vypočítaného za pomoci GraphPad Prism. Interval spolehlivosti (CI ) byl zvolen na 95%. OR udává podíl šancí výskytu mutantní alely u pacientek s pozitivním hematologickým nálezem a šance výskytu mutantní alely u pacientek bez hematologického nálezu (tabulka 5). alela Hematologický nález pozitivní negativní standardní a b mutantní c d OR = a/c b/d Tabulka 5: Výpočet poměru šancí z kontingenční tabulky Pokud je OR > 1, mají pacientky s hematologickým výskytem větší šanci výsyktu mutantní alely a lze hovořit o rizikovém faktoru. OR = 1 udává stejnou šanci výskytu mutantní alely u pacientek i referenční skupiny. Hodnotu OR < 1 je možné interpretovat jako protektivní charakter mutantní alely. Při interpretaci OR je potřeba vzít v úvahu rozptyl intervalu spolehlivosti. 38

5 Výsledky Četnost trombofilních mutací (FV Leiden, FV R2 A4070G, PTH G20210A, MTHFR C677T, MTHFR A1298C, Faktor XIII Val34Leu, PAI-1 4G/5G, EPCR A4600G, EPCR G4678C) a jejich statistické srovnání bylo testováno na souboru 156 žen ze Sanatoria Repromeda. Jako kontrolní skupina byla vybrána náhodná populace čítající 85 osob s předky ve střední a západní Evropě z bioinformatické databáze Ensembl (Fernández-Suárez and Schuster, 2010). Výjimkou je kontrolní skupina u trombofilní mutace PAI-1 4G/5G, která má pouze 23 osob 1. Pro každkou trombofilní mutaci byl stanoven počet osob s daným genotypem, genotypové a alelické četnosti. Alelické a genotypové četnosti byly srovnány s kontrolním vzorkem. Pro obě skupiny bylo vypočítáno, zda jsou v HW rovnováze. Dále byly porovnány alelické četnosti trombofilních mutací u 20 pacientek, které měly pozitivní hematologický nález s referenčními pacientkami (136). Na závěr byla vypočítána šance, že pacientky s hematologickým nálezem budou mít častější výskyt mutované alely pomocí poměru šancí (OR). 5.1 Faktor V Leiden (G1691A) Trombofilní mutace ve faktoru V, označovaná jako Leidenská mutace představuje substituci na pozici 1691 (G A). Tabulka 6 obsahuje počet osob s daným genotypem, kde alela G je standardní, zatímco alela A mutantní. V tabulce jsou dále genotypové a alelické četnosti a jejich statistické srovnání pomocí χ2 testu, respektive Fisherova exaktního testu. Na závěr je uveden χ2 HW rovnováhy pro obě skupiny. U pacientek (P) se vyskytoval genotyp v heterozygotním stavu s četností 0,071, zatímco u kontrolní skupiny (K) byla tato četnost 0,035. Na druhou stranu FVL mutace v homozygotním stavu nebyla detekována ani u jedné pacientky, oproti jednomu případu u kontrolní skupiny. 1 V bioinformatické databázi Ensembl nejsou na stejné kontrolní skupině, která je použita u všech ostatních SNP zpřístupněny data pro polymorfismus PAI-1 4G/5G. Z toho důvodu byla ze stejné bioinformatické databáze vybrána populace se stejnými předky, čítající menší množství osob (23). Označení populace nese kód: PGA- UW-FHCRC:PGA-EUROPEAN-PANEL. 39

Tabulka 6:Genotypové a alelové četnosti FVL mutace a jejich statistické vyhodnocení Srovnáním genotypových četností (graf 1) pomocí χ2 testu vyšla hodnota p = 0,025; p < 0,05, která poukazuje na statisticky významný rozdíl. Následujícím srovnáním počtu heterozygotních jedinců pomocí kritičtějšího Fisherova dvoustranného exaktního testu vyšla statisticky nevýznamná hodnota p = 0,389; p <0,05. Srovnáním alelických četností pomocí Fisherova dvoustranného exaktního testu také vyšel statisticky nevýznamný rozdíl (p = 0,797; p > 0,05). Jak kontrolní skupina (p = 0,161; p > 0,05), tak soubor pacientek (p = 0,464; p > 0,05) je v Hardyho-Weingergově rovnováze. četnost 0,08 0,071 0,06 0,04 0,035 Pacienti 0,02 0 GA 0 AA 0,013 Kontrolní skupina Graf 1: Četnost mutace v heterozygotním a homozygotním stavu Srovnáním alelických četností mezi 20 pacientkami s hematologickým nálezem, kterým byla předepsána medikace se 136 pacientkami bez medikace vyšla při použití Fisherova dvoustranného exaktního testu statisticky významná hodnota p = 0,039 (p < 0,05). U této skupiny byl vypočítán poměr šancí (OR), který představuje podíl šancí výskytu mutantní alely u pacientek s pozitivním hematologickým nálezem a šance výskytu mutantní alely u pacientek bez hematologického nálezu. OR = 4,206 (95% CI 1,173 až 15,09). 40

Je možné konstatovat, že neplatí nulová hypotéza o rovnoměrném rozložení genotypových četností u souboru pacientů a kontrolní skupiny ani u pacientek s nasazenou léčbou a pacientek bez léčby. 5.2 Faktor V R2 (A4070G) Další trombofilní mutací ve faktoru V je substituce na pozici 4070 (A G), označovaná jako R2 mutace. Tabulka 7 zobrazuje počet osob s daným genotypem, dále jsou v tabulce genotypové i alelické frekvence a jejich statistické vyhodnocení. Alelické frekvence se liší o 7%, kdy mutantní alela A se vyskytuje u pacientek (P) s četností 0,093 oproti 0,024 u kontrolní skupiny (K), což je 3,75x častější výskyt. Srovnáním těchto četností Fisherovým dvoustranným exaktním testem vyšla statisticky významná hodnota p = 0,004 (P > 0,05), která poukazuje na statisticky velmi významný rozdíl v alelických četnostech. U pacientek se Tabulka 7:Genotypové a alelové četnosti FV R2 mutace a jejich statistické vyhodnocení vyskytl heterozygotní genotyp s četností 0,147 oproti 0,047 u kontrolní skupiny (Graf 2). Homozygotní genotyp GG byl detekován pouze 3x ve skupině pacientek (četnost0,019). Z důvodu nezachycení homozygotního genotypu GG u kontrolní skupiny není možné ověřit genotypové rozložení pomocí χ 2 testu. Místo toho byl vypočítán Fisherův test s cílem zjistit, zda se statisticky významně liší rozdíl v počtu heterozygotním pacientů. Výsledná hodnota p = 0,019 je nižší než srovnávaná hladina p =0,05, což poukazuje na statisticky významný rozdíl v počtu heterozygotních jedinců. Obě populace se nacházejí v HW rovnováze (P: p =0,116; K: p = 0,824). 41

četnost 0,2 0,147 0,1 0,047 0,019 0,000 0,0 AG GG Graf 2: Četnost mutantní alely G v heterozygotním a homozygotním stavu Pacienti Kontrolní skupina Z 20 pacientek s pozitivním hematologickým nálezem jich bylo 5 heterozygotních a jedna homozygotní pro mutaci pátého faktoru R2. V kontrolní skupině 136 pacientek bez hematologického nálezu bylo 18 heterozygotních a 2 homozygotní pacientky. Alelickým srovnáním pomocí Fisherova dvoustranného exaktního testu vyšla statisticky nevýznamná hodnota p = 0,075 (p > 0,05). Relativní riziko mutantní alely bylo vyčísleno pomocí OR na 2,414 (CI 95% 0,956 až 6,079). Lze zamítnout nulovou hypotézu o rovnoměrném genotypovém i alelickém rozložení u pacientek a kontrolní skupiny. Naopak pacientky s hematologickým nálezem ve srovnání s pacientkami bez hematologického nálezu vykazují rovnoměrné rozložení alel. 5.3 Protrombin (G20210A) Mezi další studované mutace paří substituce v 3` UTR mrna protrombinu. V tabulce 8 jsou zaznamenány počty osob s daným genotypem, alelické a genotypové četnosti spolu s omezeným statistickým vyhodnocením. Mutace v pozici 20120 (G A) je v rámci této diplomové práce nejméně častá. U skupiny pacientů (P) byla zachycena pouze 3x a to Tabulka 8: Genotypové a alelové četnosti PTH G20210A mutace a jejich statistické vyhodnocení 42

v heterozygotním stavu, což odpovídá alelické četnosti (0,019). U kontrolní skupiny (K) čítající 85 osob nebyla tato mutace zachycena ani jednou. Z toho důvodu není definovaný (ND) χ 2 test pro ověření genotypového rozložení, ani nelze ověřit, zda je kontrolní skupina v HW rovnováze. Místo toho byl pomocí Fisherova dvoustranného exaktního testu ověřen rozdíl v počtu heterzygotů. Hodnota p = 0,108 (p > 0,05) poukazuje na statisticky nevýznamný rozdíl. Stejnou metodou bylo otestováno i rovnoměrné rozložení alel, kdy p = 0,555; p > 0,05 také neprokázalo statisticky významný rozdíl. Skupina pacientek se nachází v WH rovnováze (p = 0,903; p > 0,05). Srovnáním 20 pacientek s pozitivním hematologickým nálezem se 136 kontrolními pacientkami Sanatoria Repromeda bez hematologického nálezu nevyšla statisticky významná závislost (p =0,371; p > 0,05) v rozložení mutantní alely. Poměrem šancí bylo vyčísleno relativní riziko na 3,462 (95% CI 0,465ž 12,05). Lze konstatovat, že by bylo dobré zvětšit studovaný soubor pacientek i kontrolní skupiny, aby bylo možné detekovat a srovnat četnost genotypového rozložení za pomocí χ 2 testu. Přestože nebyla detekována mutace u kontrolní skupiny, pomocí Fisherova dvoustranného exaktního testu se nepotvrdil statistickyvyšší výskyt této mutace v heterozygotním stavu u pacientek. Pacientky s pozitivním hematologickým nálezem mají 3,4x větší šanci výskytu mutantní alely oproti ostatním pacientkám. 5.4 Metylentetrahydrofolát reduktáza (C677T) Substituce na pozici 677 (C T) v genu MTHFR představuje další trombofilní mutaci. Tabulka 9 uvádí genotypové zastoupení a četnosti statisticky vyhodnocené pomocí χ2 testu, dále alelické četnosti a jejich srovnání pomocí dvoustranného Fisherova exaktního testu a na závěr bylo otestováno pomocí χ2 testu HW ekvilibrium pro obě skupiny. Častější alelou pro polymorfismus MTHFR C677T je alela C vyskytující se s četností 0,708 u pacientek (P) a 0,688 u kontrolní skupiny (K). Genotypová četnost (graf 3) pro alelu C v homozygotním stavu je stejná s přesností na 3 desetinná místa v obou skupinách a to konkrétně 0,494. U pacientů bylo větší zastoupení heterozygotů 0,429 oproti 0,388 u kontrolní skupiny. Na druhou stranu homozygotů bylo více u kontrolní skupiny (0,077 respektive 0,118). 43

Tabulka 9:Genotypové a alelové četnosti MTHFR C677T polymorfismu a jejich statistické vyhodnocení Statistickým srovnáním genotypového rozložení za pomocí χ 2 testu na hladině významnosti p = 0,05 vyšla statisticky nevýznamná hodnota p = 0,237. Srovnáním alelových frekvencí za pomoci dvoustranného Fisherova testu na stejné hladině významnosti vyšla také statisticky nevýznamná hodnota p = 0,678. Hodnota χ 2 testu pro testování HW ekvilibria vyšla u pacientek p = 0,678; p > 0,05 a kontrolní skupiny p = 0,389; p > 0,05. Obě populace se tedy nacházejí v HW rovnováze. četnost 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,494 0,494 0,429 0,388 0,077 0,118 Pacienti Kontrolní skupina 0,0 CC CT TT Graf 3: Četnost genotypového zastoupení MTHFR C677T Pomocí Fisherova exaktního dvoustranného testu nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl (p = 0,855; p > 0,05) v alelickém rozložení mezi 20 pacientkami s hematologickým nálezem a 136 pacientkami bez hematologického nálezu. Také poměrem šancí (OR = 1,04; 95% CI 0,493 až 2,194) nebyl zjištěn zásadní rozdíl. Na závěr lze konstatovat, že v obou případech platí nulová hypotéza o rovnoměrném genotypovém a alelickém rozložení. 44

5.5 Metylentetrahydrofolát reduktáza (A1298C) Také substituce na pozici 1298 (A C) v genu MTHFR představuje trombofilní mutaci studovanou v rámci této diplomové práce. V tabulce 10 jsou uvedeny počty osob s daným genotypem i genotypové a alelické frekvence pro polymorfismus MTHFR A1298C a jejich vyhodnocení pomocí statistických testů (χ 2 test pro genotypové frekvence a HW rovnováhu, Fisherův test pro alelické frekvence). Rozdíl v alelických frekvencích je jen 2,8%, kdy alela A je četnější u kontrolní skupiny s frekvencí 0,676 respektive 0,638 u pacientek. Genotypové rozložení (graf 4) odpovídá alelickému, kdy u kontrolní skupiny (K) je častější genotyp AA s četností 0,471, zatímco u skupiny pacientek (P) je četnější heterozygotní genotyp AC (0,455) i homozygoti AA (0,135). Tabulka 10: Genotypové a alelové četnosti MTHFR A1298C polymorfismu a jejich statistické vyhodnocení Rozdíly v alelických frekvencích jsou statisticky nevýznamné (p = 0,424; p >0,05). Genotypové rozložení testované χ 2 kvadrátem kdy p = 0,317; p >0,05 také poukazuje na statisticky nevýznamný rozdíl. Dále bylo testováno, zda jsou populace Hardyho-Weinbergově rovnováze. Pro pacientky vyšla hodnota testu p = 0,852; p >0,05 a pro kontrolní skupinu p = 0,852; p >0,05. Obě tyto hodnoty neukazují statisticky významný rozdíl a je možné je považovat v rovnováze. Srovnáním alelických četností u 20 pacientek s hematologickým nálezem s kontrolními pacientkami bez hematologického nálezu nevyšla statisticky významná závislost (p = 0,383; p > 0,05). Dále byl vypočítán poměr šancí (OR = 1,355; 95% CI 0,691 až 2,660), který díky velkému rozptyplu pod hodnotu 1 nepoukazuje na zvýšenou šanci výskytu alely C u pacientek s hematologickým nálezem. Lze shrnout, že oba polymorfismy v genu MTHFR C677T i A1298C vykazují náhodné genotypové i alelické rozložení a jsou v Hardyho-Weinbergově rovnováze. 45

četnost 0,5 0,4 0,410 0,471 0,455 0,412 0,3 0,2 0,1 0,135 0,118 Pacienti 0,0 AA AC CC Graf 4: Četnost genotypového zastoupení MTHFR A1298C 5.6 Faktor XIII (Val34Leu) Substituce na pozici pozici (G T) v genu pro FXIII vede k záměně aminokyseliny leucinu za původní valin. V tabulce 11 je přehled počtu osob s daným genotypem FXIII Val34Leu, kde G alela odpovídá aminokyselině valin, zatímco alela T má v této pozici leucin. Dále jsou v ní genotypové četnosti a alelické četnosti a jejich statistické vyhodnocení. Nejčastějším genotypem je u pacientek (P) i u kontrolní skupiny (K) homozygotní stav GG (Graf 5). U kontrolní skupiny se vyskytuje s četností 0,647což je téměř o 10% více než u pacientek (0,551). Četnost heterozygotů činí u pacientek 0,385 a u kontrolní skupiny 0,318. Homozygoti TT jsou pak téměř dvakrát častěji u pacientek (0,064) než u kontrolního vzorku (0,035). Alela T se u pacientek vyskytuje o 6% častěji než u kontrolní skupiny (0,256 respektive 0,194). Tabulka 11: Genotypové a alelové četnosti faktor XIII Val34Leu polymorfismu a jejich statistické vyhodnocení Srovnáním genotypového rozložení pomocí χ 2 testu, kdy p = 0,018 (p <0,05) byl zjištěn statisticky významný rozdíl. Alelické rozložení, které bylo testováno pomocí Fisherova dvoustranného exaktního testu, neprokázalo statisticky významný rozdíl (p = 0,143; p > 0,05). Hodnoty χ 2 testu pro HW ekvilibrium vyšly pro pacientky p = 0,914 (p > 0,05) a pro kontrolní 46

0,7 0,647 četnost 0,6 0,551 0,5 0,4 0,385 0,318 0,3 0,2 0,1 0,064 0,035 0,0 GG GT TT Graf 5: Četnost genotypového zastoupení faktoru XIII Val34Leu Pacienti Kontrolní skupina skupinu p = 0,886 (p > 0,05). Vysoké hodnoty poukazují na statisticky velmi nevýznamný rozdíl. Mezi 20 pacientkami s nasazenou léčbou bylo 5 žen homozygotních pro alelu T. U zbylých 136 pacientek byl tento genotyp zaznamenán pouze 7x. Srovnáním alelických četností u těchto dvou skupin pomocí Fisherova dvoustranného exaktního testu vyšel statisticky významný rozdíl (p = 0,032; p < 0,05). Stejným testem byla také prokázána nerovnováha v počtu zachycených homozygotů TT (p = 0,025; p < 0,05). Dále bylo za pomoci poměru šancí (OR = 2,167; 95% CI 1,085 až 4,328) zjištěna více jak dvojnásobná šance výskytu alely u pacientek s pozitivním hematologickým nálezem oproti ostatním pacientkám. Lze konstatovat, že genotypové četnosti neodpovídají nulové hypotéze o rovnoměrném rozložení, kdy u pacientek je téměř 2x více homozygotů pro alelu T. Stejně tak byl zaznamenán statisticky významný rozdíl v alelických četnostech mezi pacientkami s hematologickým nálezem, oproti pacientkám bez nasazené léčby. 5.7 Inhibitor plazminogen aktivátoru (PAI-1: 4G/5G ) Delece guaninu v promotorové sekvenci genu pro PAI-1 je označována jako alela 4G, oproti standardní alele 5G, kde se vyskytuje 5 guaninů za sebou. Tabulka 12 ukazuje genotypové i alelické rozložení polymorfismu PAI-1 u pacientek (P) i kontrolní skupiny (K) a jejich statistické vyhodnocení pomocí χ 2 testu u genotypového rozložení, respektive Fisherova 47

dvoustranného exaktního testu u alelických četností. U kontrolní skupiny je častější 5G alela a to s četností 0,543 oproti 0,429 u pacientek. Naopak alela 4G se vyskytuje s vyšší četností u pacientek (0,571) než u kontrolního vzorku (0,457). Srovnáním těchto hodnot pomocí Fisherova dvoustranného exaktního testu vyšla statisticky nevýznamná hodnota p = 0,098 (p > 0,05). Tabulka 12 : Genotypové a alelové četnosti PAI-1 4G/5G polymorfismu a jejich statistické vyhodnocení Srovnáním genotypových četností (graf 6) je vidět, že 4G/4G genotyp je častější u pacientek (P = 0,314; K = 0,261). Rozdíl je v i 4G/5G genotypu, který je u pacientek o 12% častější (0,513 oproti 0,319 u kontrolní skupiny). 5G/5G je naopak 2x frekventovanější u kontrolní skupiny (0,348) v porovnání s pacientkami (0,173). Srovnáním těchto četností pomocí χ 2 testu vyšla statisticky významná hodnota p = 0,002 (p <0,05). Populace pacientek (p = 0,562; p > 0,05) i kontrolní skupiny (p = 0,301; p > 0,05) se nacházejí v HW ekvilibriu. četnost 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,314 0,261 0,513 0,391 0,173 0,348 Pacienti Kontrolní skupina 0,1 0,0 4G/4G 4G/5G 5G/5G Graf 6: Četnost genotypového zastoupení PAI-1 4G/5G Pomocí Fisherova exaktního dvoustranného testu byly srovnány alelické četnosti pacientek s pozitivním hematologickým nálezem s pacientkami, které měly hematologické hodnoty v normě. Hodnota p = 0,865 (p >0,05) neprokázala statisticky významný rozdíl. Poměr šancí 48

poukazuje na 10% nárůst šance výskytu 5G alely u pacientek s hematologickým nálezem (OR = 1,10; 95% CI 0,564 až 2,146). Závěrem lze shrnout, že genotypové rozložení mezi srovnávaným souborem pacientů a kontrolní skupiny nepodporuje nulovou hypotézu o shodě mezi skupinami. Alelické četnosti tento závěr sice nepotvrdily, ale i zde je vidět podobný trend. Výsledky statistického vyhodnocení mohou být v tomto případě s velkou pravděpodobností zkresleny menším kontrolním vzorkem oproti ostatním mutacím. Alelické četnosti u pacientů s pozitivním hematologickým nálezem mají stejné alelické rozložení, jako u pacientek bez hematologického nálezu. 5.8 Endoteliální receptor pro protein C (EPCR A1/A2/A3) Haplotypy A1, A2 a A3 v genu EPCR jsou determinovány dvěma substitucemi vzdálenými 78 bp v pozicích 4600 (A G) a 4678 (G C). Graf 7 ukazuje haplotypové rozložení u skupiny pacientek, které není možno srovnat s kontrolní skupinou. 2 V následujících podkapitolách jsou s kontrolní skupinou srovnány oba polymorfismy samostatně. U pacientek byly nejčetnějším haplotypem haplotyp A1 s četností 0,464 a haplotyp A2 (0,442). Haplotyp A3 má četnost pouze 0,092, když byl detekován pouze jednou (0,6%) v homozygotním stavu, 80 60 40 20 0 A1/A1 A1/A2 A1/A3 A2/A2 A2/A3 A3/A3 pacienti 35 61 14 32 13 1 Graf 7: Počet pacientek s jednotlivými haplotypovými variantami 2 Bionformatická databáze Ensembl neumožňuje zjistit rozložení haplotypů u kontrolní skupiny, protože se jedná o dva samostatné polymorfismy. 49

13x s haplotypem A2 a14x v kombinaci s A1/A3. Haplotyp A1/A1 byl detekován u 35 pacientek oproti 32 pacientkám s haplotypema2/a2. Nejčastější kombinací haplotypů pak byla varianta A1/A2 detekována u 61 pacientek (39,1%). Zda odpovídá rozložení haplotypových kombinací četnostem jednotlivých haplotypů bylo vypočítáno pomocí χ 2 testu. Výsledná hodnota p = 0,802; p > 0,05 tuto hypotézu nevyvrací. 5.8.1 Endoteliální receptor pro protein C (A4600G) Prvním z polymorfismů, který determinuje haplotypové skupiny v EPCR A1/A2/A3 je substituce na pozici 4600 (A G). Tabulka 13 udává počet osob s daným genotypem, kde alela G reprezentuje haplotyp A3, zatímco alela A je součástí haplotypu A1 i A2. Dále jsou v tabulce genotypové i alelické frekvence a jejich statistické vyhodnocení. Alelické frekvence se liší o 1%, kdy původní alela A se vyskytuje u pacientek (P) s četností 0,907 oproti 0,918 u kontrolní skupiny (K). Fisherovým dvoustranným exaktním testem vyšla hodnota p = 0,741 (P >0,05), která nepoukazuje na statisticky významný rozdíl v alelických četnostech. U pacientek se vyskytl heterozygotní genotyp s četností 0,173 oproti 0,165 u kontrolní skupiny (graf 8). Homozygotní genotyp GG byl přítomen pouze u jedné pacientky (0,006). Z důvodu nezachycení homozygotního genotypu GG u kontrolní skupiny není možné ověřit genotypové rozložení pomocí χ 2 testu. Místo toho byl vypočítán Fisherův test s cílem zjistit, zda je statisticky významný rozdíl u počtu heterozygotním pacientů. Hodnota Fisherova jednostranného i dvoustranného testu poukazuje na statisticky velmi nevýznamný rozdíl (0,517 respektive 1,0). Obě populace se nacházejí v HW rovnováze (P: p =0,741; K: p = 0,408). Tabulka 13 : Genotypové a alelové četnosti EPCR A4600G polymorfismu a jejich statistické vyhodnocení 50

četnost 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 0,821 0,835 0,173 0,165 0,006 AA AG GG Graf 8: Četnost genotypového zastoupení EPCR A4600G 0,000 Pacienti Kontrolní skupina Alelické četnosti pacientek s hematologickým nálezem nevykazují oproti kontrolním pacientkám statisticky významný rozdíl. (p = 0,473; p >p 0,05). Dále byl vypočítán poměr šancí (OR = 0,739; 95% CI 0,376 až 1,453), podle které lze považovat haplotyp A3 za protektivní faktor. Lze shrnout, že počet heterozygotů odpovídá nulové hypotéze o rovnoměrném rozložení u obou skupin. Podobně je v rovnováze i alelické rozložení pacientek s pozitivním hematologickým nálezem v porovnání s ostatními pacientkami. Alela G v pozici 4600, která odpovídá haplotypu A3 má protektivní charakter ve vztahu k pozitivnímu hematologickému nálezu. 5.8.2 Endoteliální receptor pro protein C (G4678C) Druhým polymorfismem, který determinuje haplotypy A1/A2/A3 v genu EPCR je substituce v pozici 4678 (G C). Tabulka 14 obsahuje počet osob s daným genotypem, kde alela G může reprezentovat haplotypovou skupinu A2 i A3, zatímco alela C odpovídá haplotypu A1. V tabulce jsou dále genotypové a alelické četnosti a jejich statistické srovnání pomocí Tabulka 14 : Genotypové a alelové četnosti EPCR G4678A polymorfismu a jejich statistické vyhodnocení 51