VLIV CHLADOVÉ AKLIMACE NA BIOCHEMICKÉ A MOLEKULÁRNÍ PARAMETRY ŠESTI VYBRANÝCH GENOTYPŮ ŘEPKY OZIMÉ VE VZTAHU K PARAMETRŮM FLUORESCENCE CHLOROFYLU Cold acclimation influence on biochemical and molecular parameters in relation to chlorophyll fluorescence of six selected winter oilseed rape genotypes Urban M. O. 1, Holá D. 2, Klíma M. 1, Vítámvás P. 1, Kosová K. 1, Hilgert-Delgado A. A. 1, Prášil I. T. 1 1 Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i., Praha Ruzyně 2 Univerzita Karlova, Albertov, Praha 2 Abstrakt: V článku se pojednává o vlivu chladové aklimace na vybrané fotosyntetické, biochemické a molekulární parametry 6 odrůd řepky olejky ve vztahu k jejich fluorescenčním parametrům. Byla stanovena akumulace osmolytů, parametry fotosyntetické, akumulace dehydrinů a mrazuvzdornosti, kteréžto byly dány do souvislosti s parametry fluorescence chlorofylu. V námi zvoleném typu pokusu žádný ze sledovaných parametrů výrazně nekoreloval s hodnotou mrazuvzdornosti, stanovenou pomocí výtoku elektrolytů z listových terčíků. Stanovení diferenčních křivek primárních fotosyntetických procesů ovšem v sobě skrývá potenciál selektovat odlišně reagující genotypy. Klíčová slova: řepka olejka, aklimace, dehydriny, fluorescence chlorofylu, mrazuvzdornost Abstract: In this article, the six selected winter oilseed rapes is evaluated according to their photosynthetic, biochemical and molecular response to cold acclimation with special interest to their chlorophyll fluorescence characteristics. Osmolyte accumulation, photosynthetic parameters, dehydrins accumulation and frost tolerance were measured and related to chlorophyll fluorescence. In our experiment, there is no clear and significant correlation between parameters, even though the differential fluorescence-based curves of primary photosynthetical processes enable the future possibility of genotype selection. Keywords: oilseed rape, acclimation, dehydrins, chlorophyll fluorescence, frost-tolerance Úvod Řepka olejka se řadí mezi nejvýznamnější olejniny, odhad světové produkce pro rok 2014 je 69 mil. tun semene 1. Vzhledem k významnému postavení řepky je jejímu výzkumu a šlechtění celosvětově věnována velká pozornost. Výsledkem vysokého konkurenčního prostředí je setrvalý nárůst výkonnosti nových odrůd (cca o 5 % ročně). Vlivem intenzivního a dlouhodobého šlechtění řepky na omezený okruh znaků a vlastností došlo k výraznému zúžení genofondu, vedoucímu k omezení diverzity 2-3. Nejnovější poznatky naznačují, že dehydriny by se mohly stát perspektivními markery pro identifikaci mrazuvzdorných genotypů i u ozimé řepky 4-5. Zatímco u biomarkerů na bázi proteinů lze zaznamenat první reakci na stres v řádu dnů, v případě fluorescenčních změn v thylakoidní membráně chloroplastu se jedná o reakci v řádu hodin. Cílem práce bylo vyhodnotit fyziologické, biochemické a molekulární reakce vybraných odrůd řepky olejky na chlad, mrazovou teplotu a následnou reaklimaci rostlin v optimálních podmínkách.
Materiál a metody Šest kontrastních odrůd řepky olejky (Brassica napus L.; Californium - CAL, Cortes - COR, Slapy 737 - SLA, Ladoga - LAD, Viking - VIK a Zhongshuang 9 - ZHO) bylo kultivováno v řízených podmínkách po dobu 4 týdnů do fáze 4. listu (BBCH 14); teplota kultivace 20/15±1 C (den/noc); fotoperioda 12 hod, osvětlení 400 µmol/m 2 /s. Poté byla teplota snížena na na 4/4±1 C na dobu 6 týdnů; následoval mráz (-2 C, tma) a reaklimace tj. obnova (20/15±1 C; den/noc) po dobu 48 hodin. Vzorky nejmladších plně vyvinutých listů byly odebírány pro stanovení akumulace dehydrinů (DHN), osmotického potenciálu (OP), a paralelně byly na těchto listech měřeny fluorescenční parametry přístrojem Fluor Pen 100 (Photon Systems Instruments, Česká Republika). Aktuální mrazová odolnost rostlin všech odrůd byla stanovena v kontrolních podmínkách, a poté ve 2., 4. a 6. týdnu (v obrázcích označeno jako 2W, 4W atd.) chladové kultivace ve dvou opakováních pomocí poškození plasmatických membrán listových terčíků během mrazového testu 6. Výsledné hodnoty LT50 (letální teplota pro 50 % vzorků) mrazových testů byly vypočteny dle 7. Extrakce proteinů rozpustných po varu a SDS-PAGE a následná hybridizace rozdělených proteinů s anti-dehydrin protilátkou proběhla dle 8. Kvantitativní analýza akumulace specifických proteinů (dehydrinů) programem Quantity One 4.6.7 (Bio-Rad) následovala po skenování membrány na kalibrovaném denzitometru. Hodnoty PRI a NDVI byly měřeny přístroji PlantPen PRI 200 a PlantPen NDVI (Photon Systems Instruments, Česká Republika). Gazometrické parametry spojené s fotosyntézou a transpirací byly měřeny na přístroji LCpro+ (BioScientific, Velká Británie). K fluorescenčním a fotosyntetickým měřením a pro stanovení dehydrinové akumulace byly k chladovým odběrům (2. - 6. týden) odebírány rostliny ze kontrolních podmínek ve shodné vývojové fázi (rostliny s totožným výsledkem součinu kladných teplot v C a počtu dnů tzv. degree-days ). Výsledky a diskuze Podle obrázku 1 je patrné, že s rostoucí délkou expozice rostlin nízkým teplotám se také zvyšovala záporná hodnota osmotického potenciálu (OP, obr. 1), tj. docházelo ke zvýšené akumulaci solutů (buněčný obsah se více zahušťoval). Zvyšování záporné hodnoty OP v buněčné šťávě je obecně spojováno se zvýšením tolerance rostlin k nedostatku vody 9. Statisticky významné rozdíly mezi genotypy byly zjištěny až 4. a 6. týden odběru, a také po mrazu. Z obr. 1 je patrné, že trend zvyšování OP byl v průběhu otužování strmější u odrůd COR, SLA a LAD. Tyto genotypy zároveň dosáhly v závěru otužování vyšší absolutní hodnoty OP na rozdíl od ZHO a VIK, s pozvolným nárůstem, resp. nižší hodnotou OP. Vysoké hodnoty OP po mrazovém působení (-2 C) jsou pravděpodobně způsobeny vymrznutím vody v apoplastu a následným větším zahuštěním cytoplasmy buněk. Stanovení hodnot OP v tomto případě poskytlo pouze omezené informace o odolnosti genotypů a spíše ukázalo jejich individuální odpověď, pravděpodobně závislou na provenienci genotypů. Po reaklimaci se hodnoty OP vrátily v průměru na stejné hodnoty, jako byly před zahájením otužování (obr. 1).
Obrázek 1 Osmotický potenciál (OP) listů během kultivace Podle obrázku 2 můžeme vyhodnotit vliv chladu na fotosyntetické parametry genotypů. V části A je viditelný strmý pokles hodnot asimilace CO 2 (čistá fotosyntéza Pn) v počáteční fázi působení chladu u všech genotypů. V průběhu chladové expozice se hodnoty opět zvyšovaly, pouze u genotypu ZHO došlo v průměru k ještě dalšímu mírnému snížení. Ostatní genotypy již 6. týden byly schopny se přizpůsobit chladu tzv. se aklimovat (tj. hodnoty jsou podobné hodnotám v kontrolních podmínkách). Genotypy LAD a COR vykázaly schopnost setrvalé a rychlé aklimace Pn k nízkým teplotám, zatímco VIK, CAL a SLA se aklimovaly pomaleji. Obrázek 2 Parametry související s fotosyntetickou aklimací genotypů. A) Hodnoty čisté asimilace CO2 listovými pletivy hodnoty čisté fotosyntézy (Pn); B) Vodivost průduchů (gs); C) Hodnoty efektivity využití vody (WUEi), stanovené jako poměr mezi A a B (Pn/gs); D) Hodnoty transpirace listů (výdej vodní páry průduchy a kutikulou listu). Zkratky: 2W kultivace po dvou týdnech chladu atp.; reacl po ukončení 6. týdne chladu následovala kultivace v optimálních podmínkách po dobu 48 hodin. Propustnost průduchů pro vodní páru (obr. 2, část B) vykazuje podobné tendence. Velmi důležité je ale všimnout si i hodnot kontrolních rostlin, které zvláště u ZHO, VIK, CAL a SLA naznačují vysoké vodivosti průduchů (a tedy i nízké WUEi efektivita využití vody). Na druhou stranu pouze genotypy LAD a COR byly schopny po šesti týdnech rychle obnovit vodivost průduchů na úroveň před stresovým působením. Hodnoty WUEi (obr. 2, část C) vyjadřují schopnost genotypu efektivněji hospodařit s vodou. Vysoké hodnoty WUEi znamenají vyšší hodnotu Pn (a tedy i vyšší akumulace biomasy) při přivřených průduších. Podle WUEi všechny genotypy (mimo ZHO) vykázaly poměrně
rychlou reakci na chlad, z toho COR, CAL a SLA vykázaly velmi rychlou aklimaci fotosyntetického aparátu. Naopak genotyp ZHO vykázal nízké hodnoty WUEi po celou dobu kultivace v chladu, což souvisí s jeho polo-jařiným charakterem. Je ovšem nutno říci, že ZHO je nízký a pomalu rostoucí genotyp, který akumulací biomasy nepředčí genotypy ostatní. Rychlost transpirace (obr. 2, část D) dokumentuje propustnost celé plochy listů pro vodní páru a sleduje stejné mezi-genotypové trendy jako předchozí gazometrické parametry. Obrázek 3 Hodnoty spektrálních optických indexů PRI a NDVI Hodnoty spektrálních indexů optické odrazivosti z listů (PRI fotochemický index odrazivosti a NDVI normalizovaný diferenční index vegetace) jsou běžně využívanými indexy při sledování stavu vegetace či jednotlivých rostlin po působení stresu. V našem případě chladové působení signifikantně snížilo hodnoty PRI, což je spojováno s nárůstem obsahu karotenoidů (přesněji snížení deepoxidace xantofylového cyklu). PRI index je citlivý na změny obsahu fotoprotektivních karotenoidů, které jsou indikátory efektivity využití fotosynteticky aktivní radiace. Chlad na snížení PRI indexu působil vyrovnaně, přesto k nejvyšší akumulaci karotenoidů došlo u odrůd COR, SLA a LAD. Karotenoidy mají výrazný antioxidační účinek a působí jako stabilizátory chloroplastů. Obrázek 4 Stanovení mrazuvzdornosti pomocí terčíkové metody (LT50) Hodnoty NDVI (vpravo na obrázku 3) nevykázaly genotypově specifickou odpověď, k výraznějšímu poklesu došlo u ZHO a LAD. NDVI je optický index, který nepřímo indikuje množství chlorofylu a obecně vzato dusíku v listech. Tento index v chladu nevykázal vysokou citlivost. Z grafu v obrázku 4 je patrné, že rostliny odrůd ZHO a LAD patří k nejméně mrazuvzdorným; VIK a COR ke středně a CAL a SLA k nejvíce mrazuvzdorným odrůdám. Zimuvzdornost (schopnost přezimování na poli) je komplexní znak, polygenně založený s vysokou heritabilitou, ovlivněný mnoha faktory na různých úrovních (vernalizační geny, vliv fotoperiody, nedostatku vody, osmotického přizpůsobení apod.). Hodnoty mrazuvzdornosti, stanovené jako LT 50, ovšem ne vždy se zimuvzdorností signifikantně korelují. V našem případě však hodnoty LT 50 velmi dobře odpovídaly dlouhodobým trendům zimuvzdornosti jednotlivých genotypů. Na základě výše uvedených výsledků (a také fluorescenční kinetiky, viz níže) můžeme sledovat pomalý, ale setrvalý nárůst zimuvzdornosti u odrůd VIK, COR, CAL a SLA (tedy u těch odolnějších). Oba málo mrazu odolné genotypy ZHO a LAD již ve 2. týdnu velmi rychle zvyšují svoji mrazuvzdornost. Hypoteticky se tímto mohou 1) energeticky rychleji vyčerpat a 2) na jaře mohou rychleji přejít do generativní fáze vývoje a být citlivější vůči pozdním jarním mrazíkům. Je dobré si všimnout, že nejvíce odolné CAL a SLA mají vysokou konstitutivní (základní, nevyvolanou teplotami) mrazuvzdornost, patrnou již v kontrolních odběrech.
Na obrázku 5 můžeme sledovat akumulaci celkových dehydrinů (DHN) v listových vzorcích jednotlivých genotypů během všech odběrů. V části A i B vidíme nejvyšší akumulace DHN již v 2. týdnu kultivace u COR a CAL. U vysoce odolné odrůdy SLA bychom očekávali také vysoké hodnoty, které se ale v tomto pokusu neprokázaly. Slabě mrazuvzdorná ZHO vykázala nejnižší akumulaci DHN. Obrázek 5 Akumulace dehydrinů. A) Akumulace DHN podle jednotlivých genotypů; B) Akumulace DHN, vztažená k jednotlivým odběrům. Poslední část výsledků je věnována parametrům, které lze vypočítat a vyhodnotit z dat, která jsme změřili pomocí FluorPen 100. Z mnoha vypočítaných jsme vybrali dvě křivky diferenční kinetiky (delta W OJ a delta W OK ), které umožňují lépe pochopit vliv chladové aklimace na některé části Obrázek 6 Delta W OJ diferenční kinetika; A 2W; B 4W; C 6W; D Reaklimace; VIK žlutý, COR modrý, LAD fialová, SLA tm. žlutá, ZHO zelený a CAL černé. primárních fotosyntetických procesů u jednotlivých genotypů. Delta W OJ (normalizovaná diferenční kinetika OJIP křivky mezi O (50 us) a L (2 ms) krokem porovnání stresovaných a kontrolních rostlin) odhaluje tzv. K-pás (kolem 300 us), který se považuje za indikátor inaktivace OEC (komplexu na thylakoidní membráně, který dodává elektrony fotosystému 2 - PS2) a/nebo zvětšení velikosti funkční antény PS2. Pozitivní hodnoty v druhém týdnu (u COR výrazně v obr. 6A, 6D) signalizují inaktivaci OEC (hlavně Mn-komplex), a/nebo zvětšení PS2 antény; předpokládáme (vzhledem k výsledkům v Obrázek 2), že spíše došlo k pozitivnímu zvětšení PS2 antény. Odrůdy ZHO a VIK vystavené chladu naopak setrvale vykazovaly lepší stav OEC ve srovnání s kontrolními rostlinami (a to i při obnově; obr. 6 A-D). Naopak silně mrazuvzdorná SLA vykázala rychlou aklimaci hodnot (obr. 6 B-D). COR, LAD, SLA a CAL také vykázaly (obr. 6D) rychlou obnovu po ukončení chladu. Při vizualizaci křivky O-J-I-P (data nezobrazena) je jednoznačně patrné, že hodnoty fluorescence chlorofylu stresovaných genotypů nejvíce odolných odrůd SLA a CAL jsou 4. a 6. týden a také po obnově stále nejnižší v porovnání s ostatními. Tento trend si nedokážeme vysvětlit. Patrně zde působí přebytek oxidovaných přenašečů (quinonů), související s nízkou tvorbou koncových elektronových akceptorů (a tedy s pomalejší tvorbou ATP a NADPH). Naopak hodnoty ZHO
Obrázek 7 Delta WOK diferenční kinetika; A 2W; B 4W; C 6W; D Reaklimace; VIK žlutý, COR modrý, LAD fialová, SLA tm. žlutá, ZHO zelený a CAL černé. a VIK jsou v kontrolních vzorcích stále nejvyšší. Tyto výsledky pro ZHO a VIK patrně souvisí s raností odrůd a jejich velikostí (v porovnání s ostatními jsou velmi malé). Na obr. 7 je zobrazena křivka diferenční kinetiky delta W OK. Je to normalizovaná křivka mezi O (50 us) a K (300 us) krokem, která odhaluje tzv. L-pás kolem 150 us, který je indikátorem energetické konektivity ("seskupování") fotosystému 2 (PS2) jednotek. Čím vyšší a pozitivnější je hodnota, tím menší je předpokládaná konektivita mezi jednotkami PS2. Nízkou konektivitu např. jasně vidíme u všech genotypů v obr. 7A. Dobrá energetická konektivita (záporné hodnoty) může znamenat vyšší účinnost primárních fotosyntetických procesů. Naše výsledky tedy ukázaly, že vystavení rostlin chladu po dobu 2 týdnů (obr. 7A) mělo na tuto konektivitu negativní efekt, ale s postupujícím chladem (obr. 7 B-D) se primární fotosyntetické procesy u odrůd ZHO a VIK zřejmě dokázaly přizpůsobit tak, že energetická konektivita mezi PS2 byla dokonce lepší než u kontrolních rostlin. Obrázek 8 Index PI abs; 2T-6T - 2. - 6. týden chladové aklimace Kromě křivek diferenční kinetiky jsme hodnotili mj. i různé parametry tzv. J-I-P testu; uvedeny jsou zde pouze hodnoty performančního indexu PI ABS (obr. 8), který vyjadřuje využití energie fotonů absorbovaných anténou PS2 až po redukci QB. Obr. 8 vyjadřuje procentuální změny tohoto indexu u chladem stresovaných rostlin ve srovnání s kontrolními rostlinami. Je zřejmé, že největšímu snížení účinnosti primárních fotosyntetických procesů v PS2 došlo na začátku chladového období (2 týdny). Poté se tento pokles postupně snižoval a po navrácení rostlin do normálních teplot došlo k plné obnově fotosyntetické účinnosti PS2 (v případě odrůdy VIK dokonce i k lepšímu výkonu). Mezi odrůdami byly jisté rozdíly v tom, jak tyto změny probíhaly; zejména odrůda COR se v tomto ohledu od ostatních odrůd odlišovala nejvíce.
Závěr Akumulace osmolytů (OP) byla nejrychlejší a nejvyšší u COR, CLA a LAD. Optické indexy PRI a NDVI u vybraných genotypů ovšem nevykázaly dostatečnou citlivost s nastupujícím chladem. Fotosyntetické parametry genotypů aklimovaných chladu vykázaly výraznější změny u odrůd VIK a COR. Odrůdy CAL a SLA snížily vodivost průduchů i transpiraci na minimum při zachování vysoké rychlosti čisté fotosyntézy. Tyto čtyři odrůdy také prokázaly schopnost nejlépe odolávat mrazu (měly nejvyšší mrazuvzdornost) a COR a CAL také výrazně více akumulovaly dehydriny již druhý týden chladové aklimace. Tyto více mrazuvzdorné odrůdy (VIK, COR, CAL a SLA) také vykázaly vyšší hodnoty Pn a WUEi již 2. týden chladu, což může být spojeno se silnější poplachovou fází stresu u odolných odrůd. Fluorescenční kinetika stresovaných rostlin oddělila skupiny velmi mrazuvzdorných genotypů. Kinetika rostlin z kontrolních podmínek nevykázala rozlišovací efekt. V námi zvoleném typu pokusu žádný ze sledovaných parametrů výrazně nekoreloval s hodnotou mrazuvzdornosti (LT50). Naopak, méně odolné genotypy (ZHO, VIK) se podle některých indexů fluorescence chlorofylu chovaly spíše jako odolné vůči chladu. Stanovení vhodných diferenčních křivek primárních fotosyntetických procesů tudíž v sobě skrývá potenciál selektovat odlišně reagující genotypy na nízké teploty. Dedikace Řešení uvedené problematiky bylo podpořeno projekty Mze ČR č. QJ1510172, RO0414 a MŠMT ČR č. LH1283. Použitá literatura 1 Ash M. (2014). Oil Crops Outlook/OCS-14f/June 13, 2014. Economic Research Service, USDA, 11 pp. Available online http://www.ers.usda.gov/publications/ocs-oil-crops-outlook/ocs-14f.aspx#.u60tqeco6-z 2 Girke A., Schierholt A., Becker H.C. (2012). Extending the rapeseed genepool with resynthesized Brassica napus L. I: Genetic diversity. Genet Resour Crop Ev 59:1441 1447. 3 Klíma, M., Vítámvás, P., Zelenková, S., Vyvadilová, M., Prášil, I.T. (2012): The cold-induced accumulation of dehydrin and proline under two irradiation intensities in Brassica napus and B. carinata. Biologia Plantarum, 56: 157-161. 4 Rahman H. (2013). Breeding spring canola (Brassica napus L.) by the use of exotic germplasm. Can J Plant Sci 93:363 373. 5 Urban, M. O., Klíma, M., Vítámvás, P., Vašek, J., Hilgert-Delgado, A. A., Kučera, V. (2013): Significant relationship between frost tolerance and net photosynthetic rate, water use efficiency and dehydrin accumulation in cold-treated winter oilseed rapes. J. Plant Physiol. 170: 1600-1608. 6 Prášil, I., Zámečník, J.: (1998) The use of a conductivity measurement method for assessing freezing injury. I. Influence of leakage time, segment number, size and shape in a sample on evaluation of the degree on injury, Environ.exp.Bot., 40:1-10. 7 Janáček, J., Prášil, I.: (1991) Quantification of plant frost injury by nonlinear fitting of an S-shaped function, Cryo-Letters. 12:47-52. 8 Vítámvás, P., Saalbach G., Prašil I. T., Čapkova V., Opatrna J., Jahoor A.:(2007) WCS120 protein family and proteins soluble upon boiling in cold-acclimated winter wheat. Journal of Plant Physiology Vol. 164 (9), 1197 1207. 9 Hare P.D., Cress W.A., Van Staden J. (1998): Dissecting the roles of osmolyte accumulation during stress. Plant Cell and Environment, 21: 535 553. Kontaktní adresa: Ing. Milan O. Urban, DiS., Laboratoř fenotypování odolnosti rostlin k abiotickým stresům. Výzkumný tým Biologie stresu a biotechnologie ve šlechtění, Drnovská 507/73, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v. v. i. Praha-Ruzyně 161 06 e-mail: olinek.vcelar@vurv.cz