Metody studia exprese mrna. jádro a genová exprese 2007

Podobné dokumenty
Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Metody studia genové exprese

Polymerázová řetězová reakce. Základní technika molekulární diagnostiky.

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KOLOREKTÁLNÍHO KARCINOMU

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIDUÁLNÍ CHOROBY U KARCINOMU PANKREATU

Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci. reg. č.: CZ.1.07/2.2.00/

Hybridizace nukleových kyselin

Klonování DNA a fyzikální mapování genomu

Molekulární genetika

DIAGNOSTICKÝ KIT PRO DETEKCI MINIMÁLNÍ REZIUDÁLNÍ CHOROBY MRD EGFR

Mikročipy v mikrobiologii

J09 Průkaz nukleové kyseliny

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

Amplifikační metody umožňují detekovat. k dispozici minimálně kopií DNA,

GENOTOXICITA A ZMĚNY V GENOVÉ EXPRESI

Modifikace PCR, sekvenování. Molekulární biologie v hygieně potravin Molekulárně biologická analýza potravin Přednáška 5, 2017/18, Ivo Papoušek

MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE. 2. Polymerázová řetězová reakce (PCR)

KVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE

MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÉ METODY V ENVIRONMENTÁLNÍ MIKROBIOLOGII. Martina Nováková, VŠCHT Praha

KVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE

Izolace RNA. doc. RNDr. Jan Vondráček, PhD..

studium množství určitého transkriptu v daném vzorku a v množství dané molekuly mrna v dané buňce a v daném

Výzkumné centrum genomiky a proteomiky. Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i.

Molekulární základy dědičnosti. Ústřední dogma molekulární biologie Struktura DNA a RNA

2. Z následujících tvrzení, týkajících se prokaryotické buňky, vyberte správné:

Modifikace PCR, sekvenování. Molekulární biologie v hygieně potravin 5, 2013/14, Ivo Papoušek

Enzymy v molekulární biologii, RFLP. Molekulární biologie v hygieně potravin 3, 2014/15, Ivo Papoušek

Hybridizace. doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D.

KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR (q-real-time PCR)

Kvantitativní detekce houbových patogenů v rostlinných pletivech s využitím metod molekulární biologie

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav biologie rostlin

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

Inovace studia molekulární a buněčné biologie

Metody molekulární biologie

Stanovení Ct hodnoty. Stanovení míry variability na úrovni izolace RNA, reverzní transkripce a real-time PCR

Detekce geneticky modifikovaných organizmů v potravinách a potravinářských surovinách

RNA molekuly. Analýza genové exprese pomocí cytometrických (a jiných) metod. Analýza exprese a funkce microrna. Úrovně regulace genové exprese

Metody používané v MB. analýza proteinů, nukleových kyselin

PCR v reálném čase. doc. RNDr. Milan Bartoš, Ph.D.

cdna synthesis kit First-Strand cdna Synthesis System Verze 1.2

Využití rekombinantní DNA při studiu mikroorganismů

Základy praktické Bioinformatiky

Exprese genetické informace

POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)

Moderní metody analýzy genomu

Molekulárn. rní. biologie Struktura DNA a RNA

Změny sazebníku výkonů pro mikrobiologické obory

co to je genový čip (DNA microarray)? DNA šikování

DNA TECHNIKY IDENTIFIKACE ŽIVOČIŠNÝCH DRUHŮ V KRMIVU A POTRAVINÁCH. Michaela Nesvadbová

PRINCIPY A VYUŽITÍ qpcr (kvantifikace změn genové exprese)

Inovace studia molekulární a buněčné biologie reg. č. CZ.1.07/2.2.00/

ZDRAVOTNÍ NEZÁVADNOST POTRAVIN

ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR. VI. Aplikace qrt-pcr

Příprava rekombinantních molekul pro diagnostické účely

Principy a využit. ití qpcr. KBC/BAM Pokročil. rní biologie

Polymorfizmy detekované. polymorfizmů (Single Nucleotide

genové čipy co to je genový čip (DNA microarray)? DNA šikování 15/03/2010

OBSAH. PP Master Mixy PPP Master Mix 12 Plain PP Master Mix 13 Combi PPP Master Mix 14

Lekce z analýz genových expresních profilů u MM a návrh panelu genů pro ČR. Mgr. Silvie Dudová

Genové knihovny a analýza genomu

Některé vlastnosti DNA důležité pro analýzu

Ivo Papoušek. Biologie 8, 2015/16

Příprava vektoru IZOLACE PLASMIDU ALKALICKÁ LYZE, KOLONKOVÁ IZOLACE DNA GELOVÁ ELEKTROFORÉZA RESTRIKČNÍ ŠTĚPENÍ. E. coli. lyze buňky.

Polymerázová řetězová reakce (PCR) Molekulární biologie v hygieně potravin 4, 2013/14, Ivo Papoušek

DNA microarrays Josef Srovnal, Michaela Špenerová, Lenka Radová, Marián Hajdúch, Vladimír Mihál

Centrum aplikované genomiky, Ústav dědičných metabolických poruch, 1.LFUK

METODA RLB (REVERSE LINE BLOT) V DETEKCI ARBOVIRŮ

Rekombinantní protilátky, bakteriofágy, aptamery a peptidové scaffoldy pro analytické a terapeutické účely Luděk Eyer

Diagnostika retrovirů Lentiviry - HIV. Vladislava Růžičková

Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin. 10. Další metody

Praktický kurz Příprava buněčného lyzátu, izolace celkové RNA pomocí kolonek/tripure reagent, stanovení koncentrace RNA

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA

Mgr. Veronika Peňásová Laboratoř molekulární diagnostiky, OLG FN Brno Klinika dětské onkologie, FN Brno

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti NUKLEOVÉ KYSELINY

Klonování gen a genové inženýrství

Bi5130 Základy práce s lidskou adna

Verze: 1.2 Datum poslední revize: Nastavení real-time PCR cykleru. Light Cycler 480 Instrument. (Roche) generi biotech

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Veronika Janů Šárka Kopelentová Petr Kučera. Oddělení alergologie a klinické imunologie FNKV Praha

Analýza DNA. Co zjišťujeme u DNA DNA. PCR polymerase chain reaction. Princip PCR PRINCIP METODY PCR

Syntéza a postranskripční úpravy RNA

Sekvenování nové generace. Radka Reifová

ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR. IV. Interkalační barviva a sondy

Optimalizace metody PCR pro její využití na vzorky KONTAMINOVANÝCH PITNÝCH VOD

TECHNIKY PCR. PCR - polymerase chain reaction -polymerázová řetězová reakce

NGS analýza dat. kroužek, Alena Musilová

Úloha protein-nekódujících transkriptů ve virulenci patogenních bakterií

Zdrojem je mrna. mrna. zpětná transkriptáza. jednořetězcová DNA. DNA polymeráza. cdna

Univerzita Palackého v Olomouci. Bakalářská práce

Základy molekulární biologie KBC/MBIOZ

Ivo Papoušek. Biologie 6, 2017/18

Determinanty lokalizace nukleosomů

Exprese genetické informace

DNA mikročip je mikročip složen z krátkých DNA sekvencí (oligonukleotidů)

Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii

Mendelova genetika v příkladech. Genetické markery

Aplikace molekulárně biologických postupů v časné detekci sepse

Izolace nukleových kyselin

MagPurix Blood DNA Extraction Kit 200

Transkript:

Metody studia exprese mrna Buněčné jádro a genová exprese 2007

Aktivita genu je primárn ě vyjád ř ena jeho transkripcí-prvním krokem vedoucím k syntéze kódovaného proteinu.

Cíle metod Ur č ení mno ž ství cílové mrna ur č ení druh ů mrna v daném biologickém vzorku templátem in vivo syntetizovaná mrna ur č ení stability mrna ur č ení translatovatelnosti mrna templátem in vitro syntetizovaná a značená RNA

Metody zaměřené na stanovení množství individuálních mrna Northern a Dot blot RT-PCR DNA microarrays a chips ribonuclease protection assays (RPA) in situ hybridization

princip Dot blot, Northern blot hybridizace znač ené próby (RNA nebo ssdna komplementární k targetu) se vzorkem o neznámém slož ení (totální RNA, polya RNA), který je či není před detekcí separován a pak přenesen a fixován na nylonovou membránu + výhody tradiční robustní metoda, nezávislost na jakýchkoli in vitro enzymatických reakcích, nevyžaduje kompletní znalost sekvence próby, možnost detekce několika splicingových variant, možnost detekce transkript ů více gen ů z jedné genové rodiny, možnost využití komerčních Northern blotů - nevýhody potřeba velkého počátečního množ ství RNA (chybí amplifikační krok), časov ě náročná, menší sensitivita, použití radioaktivního značení

RT-PCR princip amplifikace sekvence specifické pro target, kdy templátem je reverzn ě transkribovaná RNA (ve form ě cdna) typy standardní-umo žň uje zachytit p ř ítomnost specifické mrna ve vzorku semikvantitativní-odebírání frakcí, ředění RNA, různý počet cyklů kvantitativní-kompetitivní, Real Time

Reverzní transkripce Templát- 10ng-1µg totální RNA, nebo výrazn ě nižší množství polya RNA Enzym- reverzní transkriptáza -virového původu, ideáln ě bez RNAzové aktivity, relativn ě termostabilní, ale tepeln ě inaktivovatelná, málo citlivá k nejrůznějším inhibitorů m, AMV (Avian Myeloblastosis Virus), MuMLV (murine Moloney Leukemia Virus) Primery oligodt, ukotvené (anchored oligodt), upravené oligodt náhodné hexamery genov ě specifické primery PCR Enzym- Hot start DNA polymeráza (blokovaná protilátkou nebo chemickým crosslinkem) Primery- specifické pro mrna (na exon-intronovém p ř echodu)

princip Kompetitivní RT-PCR přidání známého množství kompetitoru k zkoumanému vzorku kompetitory-ideáln ě rezistentní vůči nukleázám, RNA, DNA, stejná sekvence rozeznávaná primery specifickými pro target, jiná velikost, stejná amplifikační účinnost + výhody absolutní kvantifikace, možnost standardizace - nevýhody náročnější příprava kompetitor ů, nutnost elektroforézy

Real-Time RT-PCR princip detekce množství amplifikované DNA v reálném čase pomocí detekce nárůstu fluorescence Baseline ΔRn

Real-Time RT-PCR + - výhody rychlost, senzitivita a velké dynamické rozpě tí, možnost zpracování většího množství vzork ů najednou (při využití robota a ž 384 vzork ů), malé amplikony-možnost práce s částečn ě degradovanou RNA nevýhody relativn ě vysoká cena některých chemikálií, analýza maximáln ě několika target ů najednou, nutnost přesného pipetování, variabilita daná různou účinnosti PCR

Úskalí Random primers Gene-specific primers

Metody detekce Fluorescen č ní Interkala č ní č inidlo + - SYBR green I univerzální, senzitivní př ístup detekce veškerých (i nespecifických) dsdna nutnost (tm) analýzy Fluorescen č ní próby + - hydrolyzační =TaqMan hybridizační próby -Molecular Beacons, Scorpion probes detekce specifického amplikonu, možnost multiplexu PCR-detekce několika transkript ů najednou mírn ě nižší senzitivita, vyšší cena (genov ě specifické), komplikovanější design optimálního primer-probe setu,

Typy Real Time RT-PCR prób

Kvantifikace I Metoda standardní k ř ivky známé množství standardu (RNA, DNA) je seriáln ě ředěno-lze pak odvodit rovnici přiřazující určitou Ct k původnímu množství targetu Log10(množství targetu)=-směrnice(x)+m umožňuje i absolutní kvantifikaci, umožňuje kontrolu nad průběhem reakce a porovnání jednotlivých runů

Kvantifikace II Metoda ddct (komparativní) + - Porovnání Ct mezi targetem a kalibrátorem není nutné opakovat při každém experimentu nemožnost kontroly účinnosti reakce Směrnice by měla být < 0.1.

Affymetrix-GeneChip DNA chip syntéza a ž 1,3 miliónu oligonukleotid ů in situ N kolik olig reprezentuje jeden gen, další set olig ě obsahuje mismatch pro testování specificity hybridizace

Microarray Příprava microarray Komerční array Array printing PCR produkty cdna knihovna oligonukleotidy Příprava próby izolace RNA označení cdna/rna 2typy modifikovaných nukleotidů smíchání obou prób denaturace aplikace na array Hybridizace Detekce signálu Úprava dat, statistická analýza

Značení próby bez amplifikace: Microarrays přímé značení s Cy3, Cy5 modifikovaným dutp přímé značení s aminoallyl dutp (chemický coupling Cy3, Cy5) s amplifikací/postamplifikací: trankripce in vitro s biotin-utp (předchází cdna syntéza s oligodt-t7 primerem) TSA metoda (předchází cdna syntéza s fluorescein a biotin-dutp, protilátka s HRP navá e barvu) ž dendrimer technologie (3DNA Array 50 and 3DNA submicro )

Metody zaměřené na stanovení neznámých mrna Diferenciální display Subtraktivní hybridizace SAGE EST Nevýhoda-nutnost sekvenace

Diferenciální display Princip-porovnání PCR fragment ů vzniklých z cdna připravené z testovaného a kontrolního vzorku s využití anchored oligodt a náhodných dekamer ů jako primerů

Subtraktivní hybridizace Princip-označená cdna vzorku je zhybridizována s kontrolní mrna, pouze cdna molekuly, které nenašly hybridizačního partnera jsou izolovány na hydroxylapatitové kolon ě (nebo jinak) a identifikovány

SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) Anchoring enzyme-nlaiii, rozeznává sekvenci CATG, každých 256 bp Tagging enzyme- BsmFI, štěpí 14bp za rozeznávanou sekvencí

SAGE + Výhody Není potřeba znát předem analyzované sekvence-lze objevovat nové geny (metodou RAST-PCR) Kumulace dat-čím více kolonií otestováno, tím je analýza přesnější - Nevýhody Potřeba kolem 5μg polya RNA Časov ě a finančn ě náročné (10 000 sekvenačních reakcí atd.) Technické problémy-gen nemusí mít NlaIII místo, dochází k sekvenačním chybám, tag nemusí být dostatečn ě specifický pro 1 gen, tagy můžou být různ ě dlouhé, 1gen může mít i dva tagy- alternativní polyadenylační místo