VLIV ETANOLU NA EXPRESI MOLEKUL ÚČASTNÍCÍCH SE TRANSPORTU NETRANSFERINOVÉHO ŽELEZA U LIDSKÉ HEPATOCELULÁRNÍ LINIE HEP-G2

Posterová sdělení SBORNÍK ABSTRAKT 1 VLIV ETANOLU NA EXPRESI MOLEKUL ÚČASTNÍCÍCH SE TRANSPORTU NETRANSFERINOVÉHO ŽELEZA U LIDSKÉ HEPATOCELULÁRNÍ LINIE HEP-G2 Balušíková K, Neubauerová J, Dostalíková-Čimburová M, Kovář J Ústav biochemie, buněčné a molekulární biologie Oddělení buněčné a molekulární biologie, 3. lékařská fakulta, Univerzita Karlova, Ruská 87, Praha 10, 100 00 Úvod: Známými molekulami účastnícími se transportu netransferinového železa u hepatocytů jsou DMT1 (divalent metal transporter 1) membránový importér železa, Dcytb (duodenal cytochrom b-like) membránová ferrireduktáza, ferroportin membránový exportér železa a ceruloplasmin cytoplazmatická ferroxidáza. Vzhledem ke skutečnosti, že u osob s chronickou konzumací alkoholu velmi často dochází ke zvýšené akumulaci železa v játrech, sledovali jsme, jak expresi transportních molekul ovlivňuje přítomnost etanolu popřípadě acetaldehydu v mediu, neboť stejně jako konzumace alkoholu, tak i akumulace železa v játrech může mít za následek rozvoj alkoholického jaterního onemocnění (ALD), přičemž mechanismus absorpce železa v játrech u ALD není dosud plně objasněn. Metodika: Jako model jaterních buněk jsme použili hepatocelulární linii HEP-G2. Buněčné linie jsme kultivovali v mediu založeném na RPMI-1640 mediu při 37 C ve vlhčené atmosféře s 5% CO2. Do media jsme přidávali etanol a acetaldehyd o výsledné koncentraci 2% etanolu respektive 0,02% acetaldehydu v mediu. Změny exprese na úrovni mrna jsme sledovali metodou Real-Time PCR, na úrovni proteinů pomocí western blot analýzy a průtokové cytometrie. Výsledky a závěr: Ukázali jsme, že přítomnost etanolu v mediu má za následek dramatické změny v expresi molekuly Dcytb na úrovni mrna jak po 24 h, tak při dlouhodobé kultivaci s etanolem. Exprese ferrireduktázy Dcytb byla po 24 h 2,7krát a při dlouhodobé kultivaci s etanolem téměř až třicetkrát zvýšená. Stejně tak, vlivem acetaldehydu, vzrůstá exprese Dcytb téměř dvakrát. Tato skutečnost by potvrzovala fakt, že molekula Dcytb je indukovatelná hypoxií s tím, že jak etanol, tak acetaldehyd mohou hypoxii v buňce navozovat. Nicméně, na úrovni proteinů jsme žádné změny v expresi nezaznamenali, což ukazuje na přítomnost dalších regulačních mechanismů genové exprese, které by mohla vyvolávat právě hypoxie. Tato práce vznikla za podpory výzkumného záměru 3. LF UK: VZ MSM0021620814. 1

2. MODULACE HEMOXYGENÁZY-1 A NITRIC OXIDE SYNTHÁZY-2 U HEPATOTOXICITNÍCH A HEPATOPROTEKTIVNÍCH POTKANÍCH MODELŮ: KOMPARATIVNÍ STUDIE S RESVERATROLEM A SILYMARINEM Černý D 1, Hořínek A 2, Martínek J 4, Lekic N. 1, Muchová L 3, Farghali H 1 1 Farmakologický ústav 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze 2 III. interní klinika - klinika endokrinologie a metabolismu 1. LF a VFN 3 Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1. LF UK Praha 4 Ústav pro histologii a embryologii 1. LF a VFN Praha, Česká republika Úvod: Indukce hemoxygenázy, hlavní biosyntetické cesty vzniku oxidu uhelnatého, ať už nějakou endogenní látkou nebo xenobiotikem je většinou chápána jako příznivý proces pro cytoprotektivní účinek, totéž se týká i inducibilní nitric oxide syntházy, jejíž hlavním produktem je oxid dusnatý. Resveratrol, polyfenolický antioxidant, je potenciální hepatoprotektivní látka a silymarin je standardní hepatoprotektivní látka používaná v humánní medicíně. Metody: Samci potkanů kmene Wistar (n=4 v každé skupině) byly i.p. premedikováni hepatotoxickou kombinací látek (D-Galaktosamin (D-GalN) 400 mg/kg a lipopolysacharidy (LPS) 50 µg/kg). Jako hepatoprotektivum byl podán resveratrol (10 µg/kg) a sylimarin (50 mg/kg) rovněž i.p. Po 24-hodinové inkubaci byla zvířata v anestézii usmrcena pro odběr celkové krve a jater. Kromě standardních laboratorních metod jako je stanovení plazmatické ALT, AST, celkový bilirubin... byla provedena jaterní analýza exprese genů pro HO-1 a NOS-2 pomocí metod real-time PCR. Dále byla provedena imunohistochemická analýza apoptoticko/nekrotických markerů. Výsledky: Byla nalezena srovnatelná signifikantní zvýšení exprese mrna pro HO-1 a NOS-2 u skupiny D-GalN s LPS. Toto zvýšení bylo signifikantně inhibováno u skupiny s resveratrolovou premedikací. Podobně tomu bylo u nalezených parametrů jaterních testů (ALT, AST...). I imunohistochemický nález difůzních apoptoticko/nekrotických změn byl méně patrný u premedikovaných modelů. U silymarinové premedikace byl trend podobný jen né s tak ostrými signifikatními změnami. Závěr: Potenciální hepatoproteknivní efekt resveratrolu v dávce 10 µg/kg je srovnatelný s dávkou 50 mg/kg u silymarinu. Změny v HO-1 a NOS-2 expresi jsou ať už přímo či nepřímo spojeny se zmírněním toxických projevů na jaterní tkáni. Otázkou ovšem zůstává, zda tyto efekty jsou zprostředkovány právě těmito plynnými molekulami či nikoliv. Pochopení vzájemných regulatorních mechanismů mezi CO a NO systémy může přispět k cílené terapii jaterního poškození. Práce byla podpořena grantem IGA MZ NR/9379-3/2007 a výzkumným záměrem VZ MSM 0021620807. 3. 2

TRIJODTYRONIN ZVYŠUJE PROPUSTNOST VNITŘNÍ MITOCHONDRIÁLNÍ MEMBRÁNY (MITOCHONDRIAL PERMEABILITY TRANSITION PORE) U POTKANŮ V PODMÍNKÁCH IN VITRO A IN VIVO Endlicher R, Křiváková P, Drahota Z, Červinková Z Lékařská fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze Úvod a cíle: Účinky hormonů štítné žlázy na buněčný metabolismus jsou známy řadu let. Dřívější studie ukázaly, že tyto hormony zvyšují syntézu komponent dýchacího řetězce kodovaných jak v jádře, tak i v mitochondriích. Trijodtyronin indukuje děje, které vedou ke změnám ve složení lipidů mitochondriálních membrán, zvyšuje aktivitu adenin nukleotidových translokáz a stimuluje buněčnou respiraci. V nedávné době se podařilo prokázat, že hypermetabolický stav indukovaný hypertyreózou má za následek oxidační poškození tkání. Dále je známo, že ROS indukují jev zvaný MPT - mitochondrial permeability transition (náhlé zvýšení propustnosti vnitřní mitochondriální membrány pro ionty a malé molekuly). V důsledku MPT dochází k uvolnění Ca2+, depolarizaci mitochondriální membrány a bobtnání (swelling) mitochondrií. Předmětem naší studie bylo sledovat vliv trijodtyroninu na MPT jak v podmínkách in vitro tak i v podmínkách in vivo. Materiál a metody: Míru bobtnání mitochondrií je možné hodnotit turbidimetricky. Mitochondrie jsme izolovali z potkaních jater, samců kmene Wistar metodou diferenční centrifugace. Pro měření bobtnání jsme použili suspenzi izolovaných mitochondrií v 1 ml swelling média (125 mm sacharóza, 65 mm KCl, 10 mm HEPES, ph 7,2). Změnu absorbance v průběhu 10-15 min jsme měřili pomocí spektrofotometru (Shimadzu UV 1601) při 520 nm. Mitochondrie byly v podmínkách in vitro vystaveny postupnému či současnému účinku trijodtyroninu v koncentracích (od 1,25 do 25 um) a extramitochondriálního Ca2+ v různých koncentracích (od 50 do 200 um Ca2+). V podmínkách in vivo byl potkanům aplikován trijodtyroninu v dávce 200 ug/kg tělesné hmotnosti intraperitoneálně. Po 24 hodinách po aplikaci trijodtyroninu byl u izolovaných mitochondrií sledován vliv různých faktorů (Ca2+, PO43-) na průběh bobtnání mitochondrií. Výsledky a závěr: Prokázali jsme, že trijodtyronin v podmínkách in vitro výrazně indukuje bobtnání mitochondrií, které je závislé na koncentraci trijodtyroninu v inkubačním médiu. Míra tohoto bobtnání mitochondrií je závislá na koncentraci Ca2+. Účinek trijodtyroninu je výrazně potencován působením Ca2+. S rostoucí koncentrací Ca2+ dochází k zvýšenému bobtnání trijodtyroninem ovlivněných mitochondrií (p<0,01 resp. p<0,001). Vliv trijodtyroninu na MPT byl patrný i v podmínkách in vivo. Mitochondrie izolované z potkanů, kterým byl aplikován trijodtyronin byly citlivější k působení Ca2+, PO43- než mitochondrie izolované z kontrolních potkanů. Podařilo se nám prokázat, že trijodtyronin jednoznačně ovlivňuje funkci MPTP. Cyklosporin A (specifický inhibitor MPTP) inhibuje bobtnání trijodtyroninem ovlivněných mitochondrií. Tento závěr je nepochybným důkazem, že trijodtyronin působí právě na tento MPTP. Tato práce byla podpořena granty MSM 0021620820 4. PROTIZÁNĚTLIVÉ LÁTKY MODULUJÍ ENDOTOXINEM INDUKOVANÉ POŠKOZENÍ JATER U POTKANŮ 3

Kolouchová G, Hiršová P, Brčáková E, Fuksa L, Cermanová J, Hroch M, Chládek J, Mokrý J, Martínková J, Mičuda S Ústav farmakologie, Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové Úvod: Endotoxinem indukované poškození jater je asociováno se změnou exprese a funkce hepatobiliárních transportních proteinů. Tyto změny jsou regulovány prozánětlivými cytokiny (uvolňovanými z Kupfferových buněk a leukocytů) a mohou být ovlivněny protizánětlivými látkami. Nicméně vliv těchto látek na profil cytokinů a jejich vztah k transportérům žlučových kyselin a léčiv není zatím detailně popsán. Cílem této studie bylo hodnocení potenciálního terapeutického významu protizánětlivých látek dexametazonu (Dex) a anakinry (Ana; antagonisty IL-1 receptoru) v terapii jaterního poškození během endotoxémie u potkanů. Metodika: Potkani kmene Wistar (n = 6, v každé skupině; 280 320 g) byli rozděleni do čtyř skupin: kontrolní skupina; LPS (lipopolysacharid podaný jednorázově i.p., 4 mg/kg); Dex-LPS (předléčba dexametazonem, 10 mg/kg i.p. hodinu před aplikací LPS); a skupina Ana-LPS (předléčba anakinrou, 10mg/kg i.p. každých 6 hodin). Vzorky krve a jater byly odebrány 12 hodin po aplikaci LPS. Plazmatické koncentrace cytokinů byly stanoveny pomocí Cytokine Quantibody Array kitu (RayBiotech). Změny exprese transportérů (Ntcp, Oatp1a4, Mdr1a/b, Mrp2, Mrp3, Mrp4 a Bsep) na úrovni mrna byly hodnoceny qrt-pcr. Výsledky: Oproti kontrole byly ve skupině LPS pozorovány zvýšené plazmatické koncentrace chemokinu MCP-1 (Monocyte Chemoattractant Protein-1), adhezní molekuly ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule-1), interfenonu gama (INF-gama), leptinu a interleukinů 6 a 10 (IL-6, IL-10) na 256 %, 312 %, 799 %, 991 % a 275 % a 789 %. Předléčba dexametazonem vedla k inhibici produkce prozánětlivých interleukinů a ke zvýšení plazmatických hladin ICAM-1, MCP-1, IL-10, leptinu, tkáňového inhibitoru metaloproteináz TIMP-1 (Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1) a L-selektinu na 419 %, 385 %, 1419 %, 1355 %, 213 % a 221 % v porovnání s kontrolou. Anakinra snížila tvorbu IL-1beta a INF-gama na 7 % a 84 % oproti kontrole. Předléčba dexamethasonem a anakirnou vedla ke zmírnění LPS indukované down-regulace Ntcp z 5 % na 22 % a 9 %, Bsep z 25 % na 64 % a 26 %, Oatp1a4 z 2 % na 17 % a 3 %, Mrp2 z 2 % na 16 % a 2 %. Dexametazon i anakinra indukovaly expresi Mrp4 transportního proteinu na 150 % a 163 % v porovnání s kontrolou. Závěr: Získané profily cytokinů poukazují na významný vliv mononukleárních leukocytů na vývoj endotoxinem indukovaného jaterního poškození. Tyto změny byly pozitivně ovlivněny zejména kortikoidní terapií. Selektivní inhibice IL-1 měla pouze omezený vliv na koncentraci sledovaných cytokinů. Tyto poznatky jsou podpořeny také výraznými změnami v expresi hlavních transportních proteinů pro léčiva a žlučové kyseliny po podání dexametazonu a minimálními změnami v případě inhibice IL-1 receptoru. Tato studie vznikla za podpory grantu MSM OC09072. 5. 4

ZMĚNY EXPRESE TRANSKRIPTŮ SE VZTAHEM K FUNKCI MITOCHONDRIÍ BĚHEM JATERNÍ REGENERACE PO PARCIÁLNÍ HEPATEKTOMII Rychtrmoc D 1,2, Libra A 2, Pospíšilová M 1, Bunček M 2, Červinková Z 1 1Ústav fyziologie, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze 2Generi Biotech s.r.o., Hradec Králové Úvod: Na našem pracovišti se zabýváme otázkou role mitochondrií při regeneraci jater již několik let. Dosud jsme aktivitu mitochondrií studovali pomocí biochemických ukazatelů a vysokoúčinné respirometrie. Nově provádíme analýzy genové exprese pomocí DNA čipů. Zaměřili jsme se tedy na expresi transkriptů se vztahem k mitochondriím v různých intervalech po parciální hepatektomii. Materiál a metodika: 10 potkaních samců kmene Wistar o hmotnosti 200 230 g bylo rozděleno do skupin po 2 (operovaní) resp. 4 (kontrolní). U 6 z nich byla provedena 2/3 hepatektomie (PH) dle Higginse a Andersona s délkou přežívání 1, 7 a 14 dní. Vzorky regenerující jaterní tkáně jsme odebrali do tekutého dusíku. Standardní fenol-chloroformovou extrakcí jsme získali celkovou RNA, a z ní, pro analýzu na DNA čipech, dsrna přímo značenou fluorescenčními barvami Cy 3 a Cy 5, podle protokolů v Amino Allyl MessageAmp II arna Amplification Kit (Ambion Inc.). Provedli jsme dvoubarevně značené hybridizace vzorků vždy proti intaktní kontrole na celogenomové čipy s oligonukleotidovými sondami (29K Rat Array, Microarrays Inc.). Bioinformatické zpracování výsledků bylo provedeno v prostředí jazyka R, s pomocí aplikací Bioconductor a MeV. Výsledky: Pro intervaly 1, 7 a 14 dní po PH jsme stanovili pořadí vždy 1000 transkriptů s nejvíce změněnou expresí oproti intaktním kontrolám. Změny za touto empirickou hranicí lze již při citlivosti použité metody považovat za nevýznamné. V těchto datech jsme vyhledali transkripty se vztahem ke struktuře a funkci mitochondrií. Bylo to celkem 105 transkriptů, z nichž 73 bylo zastoupeno jen v jednom intervalu. Výsledky prezentujeme formou tabulky s uvedením: symbolu transkriptu, intervalů, v nichž byly zaznamenány a příslušných hodnot změn exprese a popisu funkce transkriptu. Závěr: Zjistili jsme změny exprese genů se vztahem k úloze mitochondrií v procesu regenerace jater. Získané výsledky doplníme o data z dalších intervalů a poté použijeme jako východiska pro další experimenty. Dedikace: Tato práce byla podpořena grantem MSM 0021620820 a grantem Lékařské fakulty UK v Hradci Králové s podporou firmy ROCHE č. 84024. 6. NOVÉ PŘÍSTUPY K MOLEKULÁRNĚ GENETICKÉ ANALÝZE U PACIENTŮ S DEFICITEM ORNITHIN TRANSKARBAMYLÁZY Lukšan O (1), Hřebíček M (2), Jirsa M (1), Dvořáková L (2) (1) IKEM, Praha; (2) Ústav dědičných metabolických poruch 1.LFUK a VFN, Praha Úvod: Ornithin transkarbamyláza (OTC) je jaterní enzym katalyzující syntézu citrulinu z ornithinu a karbamoylfosfátu. Deficit OTC je nejčastějším dědičným onemocněním 5

ze skupiny poruch močovinového cyklu. Fenotypové spektrum zahrnuje hyperamonemické koma s úmrtím v novorozeneckém věku i akutní a chronické projevy nastupující později. Onemocnění je považováno za gonosomálně recesivní, příznaky však bývají přítomné i u heterozygotních žen. Za hlavní příčinu ovlivňující fenotyp u dívek bývá uváděno zešikmení X-inaktivace. Pacienti a metody: Na pracovišti ÚDMP bylo vyšetřeno 28 probandů, jejichž biochemická vyšetření podporovala diagnózu deficitu OTC. Vedle mutační analýzy genu OTC sekvenováním bylo zavedeno vyšetření heterozygotních delecí či duplikací metodou MLPA. K identifikaci začátku transkripce OTC byla použita technika RACE. Aktivita regulačních oblastí genu byla studována duální luciferázovou esejí. Výsledky: U 20 probandů byly nalezeny patogenní mutace v kódujicí oblasti genu a v přilehlých intronických oblastech. U jedné pacientky byla technikou MLPA charakterizována delece 3 exonů. U 8 probandů nebyla kauzativní mutace nalezena. V jedné rodině byla nalezena bodová záměna c.-366a>g v oblasti promotoru, která u nosičů segregovala s fenotypem. Byly nalezeny 3 alternativní počátky traskripce OTC 95, 119 a 169 bp před iniciačním kodonem. Na základě homologie s potkaním genem OTC pak byla nalezena kandidátní promotorová oblast a potenciální enhancer. Luciferázovou esejí bylo potvrzeno, že obě oblasti regulují expresi genu. Srovnáním aktivity normální a mutované varianty samotného promotoru nebyl v expresi luciferázy zaznamenán rozdíl. Při interakci promotoru s enhancerem se však projevilo snížení exprese luciferázy v případě variace c.-366a>g o cca 50%. Závěr: Práce potvrzuje, že vedle klasických mutací v OTC mohou chorobu vyvolat i variace v regulačních oblastech genu. Výsledky nasvědčují, že mutace c.-366a>g může mít vliv na interakci promotoru s enhancerem. 7. VZTAH MEZI VÝSKYTEM METABOLICKÉHO SYNDROMU A ZVÝŠENÝCH HLADIN TRANSAMINÁZ U POPULACE VOJENSKÝCH PROFESIONÁLŮ AČR Fajfrová J, Šafka V, Pavlík V, Hlúbik P Fakulta vojenského zdravotnictví UO Úvod: Nealkoholická steatóza jater (Nonalcoholic fatty liver disease - NAFLD) je v současnosti považována za nejčastější chronického onemocnění jater, které může vést až k jaterní cirhóze, k jaternímu selhání i k hepatocelulárnímu karcinomu. V posledních letech je NAFLD rovněž diskutována v souvislosti s metabolickým syndromem. Cílem naší práce bylo analyzovat data z preventivních prohlídek vojáků z povolání se zaměřením na výskyt zvýšené aktivity transamináz a jednotlivých složek metabolického syndromu. Metodika: Hodnotili jsme 4.231 mužů a 517 žen s průměrným věkem 37,6 ± 7,5 resp. 36,7 ± 7,2 let. Sledované parametry byly BMI, obvod pasu, ALT, GMT, glykémie, celkový cholesterol, HDL cholesterol, triglyceridy. Výsledky: Zvýšená aktivita ALT byla nalezena u 20 % mužů a u 2 % žen. Zvýšenou aktivitu GMT mělo 17 % mužů a 3 % žen. 56 % mužů mělo nadváhu a 12 % obezitu. Nadváha u žen byla z 25 % a obezita v 6 %. Vojáci, kteří měli zvýšenou aktivitu ALT měli z 62 % nadváhu a ve 23 % obezitu. U žen byl nález obdobný: 42 % mělo nadváhu a 25 % obezitu. Dvacet procent vojáků a 42 % vojákyň se zvýšenou 6

aktivitou ALT mělo zároveň i zvýšenou glykémii nalačno a až 50 % mužů a 25 % žen mělo hypertriglyceridemii. V našem souboru rizikové faktory pro zvýšení ALT byly u mužů BMI > 30 kg/m2 (OR 5,6; 95% CI 4,3-7,2), obvod pasu >102cm (OR 3,9; 95% CI 3,2-4,8), hypertriglyceridemie (OR 2,5; 95% CI 2,1-2,9), porucha glykémie nalačno (OR 2,1; 95% CI 1,7-2,6). Při současném výskytu BMI > 30 kg/m2 a glykémie nalačno nad 5,6 mmol/l (OR 11,3; 95% CI 7,3-17,5). U žen se jednalo o porucha glykémie nalačno (OR 14,2; 95% CI 2,6-77,2), BMI > 30 kg/m2 (OR 9,5; 95% CI 2-44,5) a sníženou hladinu HDL cholesterolu (OR 4,0; 95% CI 1,2-13). Při kombinaci více faktorů: obvod pasu > 88 cm a glykémie nalačno nad 5,6 mmol/l (OR 22,6; 95% CI 4,7-109,4) a BMI > 30 kg/m2 spolu s glykémie nalačno nad 5,6 mmol/l (OR 68,2; 95% CI 11-424,2). Závěr: Populace vojenských profesionálů je velice výběrová, reprezentovaná především mladými jedinci bez závažnějších zdravotních potíží. Proto je velmi alarmující nález zvýšených hladin transamináz u pětiny vojenské populace, ale také vysoký podíl jedinců s nadváhou a obezitou, kdy prakticky jen třetina vojáků z povolání má normální tělesnou hmotnost. Na základě získaných údajů jsme si ověřili významný vztah mezi aktivitou transamináz a složkami metabolického syndromu. Se vrůstajícím výskytem obezity a diabetu v populaci musíme předpokládat i častější výskyt nealkoholické steatózy jater, kdy její prevalence se celosvětově zvyšuje. Proto by se na diagnózu NAFLD mělo pomýšlet vždy při náhodném zjištění zvýšených aktivit transamináz, po vyloučení jiných příčin jaterního postižení, zejména pokud jsou spojeny s výskytem dalších metabolických onemocnění jako jsou diabetes, obezita anebo dislipidemie. Včasné odhalení NAFLD a zahájení léčby a režimových opatření je zásadní pro vlastní průběh onemocnění. Podpořeno výzkumným záměrem MO OFVZ0000502 8. INHIBICE GLUTATHIONREDUKTASY DŮLEŽITÝ MECHANISMUS ACETAMINOFENOVÉ TOXICITY Roušar T (1,2), Kučera O (1), Pařík P (3), Žáková P (2), Křiváková P (1) & Červinková Z (1) (1)Ústav fyziologie, LF v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze, Hradec Králové; (2) Katedra biologických a biochemických věd, FCHT, Univerzita Pardubice, Pardubice; (3) Ústav organické chemie a technologie, FCHT, Univerzita Pardubice, Pardubice. Tomas.Rousar@upce.cz Úvod: Předávkování acetaminofenem (APAP) patří k nejčastějším příčinám akutního jaterního selhání. Vlastní příčina tohoto jevu není stále i přes intenzivní studium zcela poznána. Celkem byly definovány dvě možné teorie, žádná z nich ale mechanismus APAP toxicity nevysvětluje beze zbytku. Cíl: V naší práci jsme se zaměřili na testování hypotézy, zda námi dříve popsaná inhibice glutathionreduktasy v hepatocytech inkubovaných s acetaminofenem in vitro má přímou souvislost s hepatotoxickým působením APAP, resp. zda může být tento enzym inhibován produktem acetaminofenového metabolismu. Metody: Enzymovou inhibici jsme testovali ve vzorcích hepatocytární glutathionreduktasy (GR) získané z lyzátů hepatocytů, které byly izolovány dvoustupňovou kolagenasovou perfúzí z potkaních samců kmene Wistar. Aktivita GR 7

byla detekována spektrofotometricky jako úbytek absorbance NADPH při λ = 340 nm. Konjugát acetaminofenu a glutathionu (APAP-SG) byl připraven organickou syntézou a jeho čistota byla ověřena pomocí kolonové a tenkovrstvé chromatografie. Výsledky: Při testování možné inhibice GR jsme prokázali, že GR může být skutečně v přítomnosti konjugátu glutathionu a acetaminofenu inhibována. Inhibice byla testována u řady koncentrací APAP-SG; u 0,74 mm APAP-SG byla prokázána inhibice o 28 %, pro 2,9 mm APAP-SG o 52 % oproti kontrolním hodnotám. Závěr: Naše hypotéza, že GR je inhibována metabolitem acetaminofenu, byla potvrzena našimi výsledky. Toto zjištění mění zcela dosud platné závěry, neboť konjugát APAP-SG byl považován za detoxikační produkt, který hepatocyty produkují, aby byly chráněny před toxickými účinky APAP. Náš nález tedy vede ke zcela novým souvislostem, které i mohou vysvětlit dosud sporné nálezy uvedené v některých publikovaných pracích. Poděkování: Tato práce byla podpořena granty MSM0021627502, MSM0021620820 a GAUK 90/2006. 9. FATÁLNÍ POŠKOZENÍ JATER AMIODARONEM KASUISTIKA Škodová M, Fejfar T, Týčová V, Hůlek P, Jirkovský V II. interní klinika, Fingerlandův ústav patologie Fakultní nemocnice Hradec Králové Amiodaron vyvolává toxické poškození plic, rohovky, štítné žlázy, periferních nervů a jater. U 15-50% pacientů užívajících amiodaron se hepatotoxicita obvykle projeví vzestupem transamináz, vyvine se za déle než l rok od začátku užívání, ale může se projevit i po l měsíci. Spektrum toxicity je široké,od izolovaného asymptomatického zvýšení transamináz až po prudké smrtelné jaterní poškození. Výskyt a vážnost vedlejších účinků je ve vzájemném vztahu s koncentrací v séru a dávkování se má udržovat mezi 210 600 mg denně. Jaterní histologie vykazuje obraz podobný akutní alkoholové hepatitidě s fibrózou a občas s výraznou duktální proliferací. 72 letý nemocný se od 47 let léčil pro ischemickou chorobu srdeční, ve 64 letech podstoupil revaskularizační operaci. V 68 letech pro opakované paroxysmy fibrilace síní, subjektivně nepříjemně vnímané, byla zahájena terapie Cordaronem. Užíval Cordaron trvale 4 roky od dávky 100 mg až do 600 mg denně. Transaminázy a TSH byly před zahájením Cordaronu v normě a byly kontrolovány 1 x za ½ roku,uz jater byl po 1 roce užívání - játra byla normální velikosti, přiměřené echogenity. Po 3,5 letém užívání vzestup transamináz ALT 3,67, AST 3, 68, kontrolní UZ prokázal hepatomegalii s obrazem steatofibrózy až incip. mikronodulární přestavby. Následně pro zhoršení stavu rychlý nárůst ascitu, otoky DK, jaterní biopsie prokázala těžkou periportální až septální fibrózu s malouzlovou jaterní cirhózou a mikrovakuolární steatosou, perisinusoidální fibrózou, Malloryho hyalinem a satelitozou kolem ballonově změněných hepatocytů. Současně HRTC plic prokázalo susp. intersticiální poškození plic amiodaronem a byl nález na rohovce. Nemocný po měsíci zemřel pod obrazem dekompensace jaterní cirhózy. Závěr: 4leté trvalé užívání amiodaronu vedlo k poškození jater, přesto že nemocný měl kardiologem pravidelně sledované jaterní testy a UZ jater. 8

10. AKTIVITA PARAOXONÁZY V SÉRE PACIENTOV S CHRONICKÝMI OCHORENIAMI PEČENE Turecký L, Kupčová V, Szántová M, Uhlíková E Ústav lek.chémie, biochémie a klinickej biochémie LFUK a III.interná klinika LFUK, Lekárska fakulta Bratislava, Slovensko Úvod: Paraoxonáza (PON) je enzým, ktorý sa v krvnom sére viaže na HDL lipoproteíny a ktorého fyziologickou funkciou je ochrana LDL lipoproteínov pred oxidačnými modifikáciami. V pečeni sa viaže PON na membrány endoplazmatického retikula. Možno predpokladať, že PON bude v hepatocytoch zohrávať hepatoprotektívnu antioxidačnú úlohu, keďže práve hepatálne mikrozómy sú spojené s produkciou reaktívnych voľných radikálov. Pečeň je zároveň miestom syntézy PON a niektorí autori sa domnievajú, že aktivita PON by mohla slúžiť ako parameter pre posudzovanie funkcie pečene. Úlohou našej štúdie bolo sledovať vzťah medzi sérovou aktivitou paraoxonázy a funkciou pečene. Metódy: Vyšetrovaný súbor tvorilo 161 pacientov s chronickými ochoreniami pečene (60 pacientov s cirhózou pečene, 52 pacientov s chronickou hepatitídou typu B a C a 49 pacientov s alkoholovou steatózou pečene). Pre monitorovanie funkcie pečene sme použili plazmatické hladiny albumínu, prealbumínu, transferínu a cholínesterázy. Pri stanovení aktivity paraoxonázy sme používali ako substrát paraoxon. Výsledky: Výsledky našej štúdie ukázali signifikantný pokles aktivity PON v sére pacientov s chronickými ochoreniami pečene (kontroly 185 U/l, steatóza pečene 160 U/l, chronické hepatitídy 99 U/l a cirhóza pečene 52 U/l). Ostatné funkčné parametre (cholínesteráza: 5200 U/l, 6500 U/l, 4800 U/l, 2200 U/l, prealbumín: 360 mg/l, 340 mg/l, 280 mg/l, 120 mg/l, albumín: 42 g/l, 39 g/l, 35 g/l, 27 g/l). Pri sledovaní vzťahu medzi aktivitou PON a štandardnými parametrami pre hodnotenie funkcie pečene sa ukázala signifikantná korelácia. Diskusia/Závery: Signifikantný pokles aktivity sérovej paraoxonázy u pacientov s chronickými ochoreniami pečene bol vo vzťahu ku stupňu hepatálnej dysfunkcie. Pokles aktivity PON by mohol súvisieť aj s patogenézou hepatálnej fibrogenézy, pretože je známe, že oxidačný stres zohráva dôležitú úlohu pri iniciácii a udržiavaní novotvorby väziva v pečeni. Zároveň sa ukázalo, že aktivita PON by mohla doplniť paletu laboratórnych ukazovateľov pre hodnotenie funkcie pečene. Práca vznikla v rámci riešenia grantového projektu VEGA 1/4268/07 11. AKTIVITA PARAOXONÁZY V SÉRE A OXIDAČNÝ STRES U PACIENTOV S DIABETES MELLITUS TYP II Uhlíková E, Kupčová V, Mojto V, Turecký L Ústav lek.chémie, biochémie a klinickej biochémie LFUK a III.interná klinika LFUK, 9

Lekárska fakulta Bratislava, Slovensko Úvod: Pojem nealkoholová tuková choroba pečene (non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD) zahŕňa širokú škálu patologických zmien od zvýšeného obsahu tuku v hepatocytoch, cez poškodenie pečene spojené so zápalovou reakciou a fibrózou až po kryptogénnu cirhózu a jej komplikácie. Predpokladá sa, že oxidačný stres zohráva jednu z kľúčových úloh v patogenéze NASH. V literatúre je viacero informácii nasvedčujúcich tomu, že steatóza pečene u diabetikov 2.typu je dôležitým prekurzorom pri rozvoji fibrózy a hepatálneho poškodenia u týchto pacientov. Paraoxonáza (PON) je enzým nachádzajúci sa vo viacerých tkanivách, avšak predominantne v pečeni. Presná fyziologická úloha PON nie je celkom jasná, ale predpokladá sa, že by mohla zohrávať dôležitú protektívnu úlohu pri oxidačnom strese. Úlohou našej štúdie bolo sledovať zmeny aktivity PON vo vzťahu k oxidačnému stresu u pacientov s diabetom 2.typu. Metódy: vyšetrovaný súbor tvorilo 58 pacientov s diabetom 2.typu. Aktivitu PON sme stanovovali pomocou paraoxonu ako substrátu. Aktivitu lipoperoxidácie u pacientov s DM sme sledovali pomocou vyšetrenia hladiny konjugovaných diénov a MDA v plazme. Výsledky: Výsledky našej štúdie ukázali pokles aktivity PON v sére pacientov s DM v porovnaní s kontrolným súborom (135 U/l vs. 182 U/l). Po rozdelení pacientov s diabetom na skupinu pacientov s chronickými komplikáciami DM a skupinu bez komplikácií sa ukázala signifikantne vyššia aktivita PON u pacientov bez komplikácií (155 U/l vs. 101 U/l). Hladiny MDA boli u diabetikov signifikantne vyššie ako v kontrolnom súbore (10 nmol/l vs. 6 nmol/l). Podobne aj koncentrácia konjugovaných dienov bola v precipitovanej LDL frakcii vyššia u diabetikov ako u kontrol (86,4 umol/l vs. 56,4 umol/l). Zistili sme signifikantnú koreláciu medzi aktivitou PON a hladinou konjugovaných dienov v precipitovanej frakcii LDL (P>0,001). Diskusia/Závery: Výsledky našej štúdie ukazujú, že PON by mohla zohrávať dôležitú úlohu v antioxidačnom systéme. Je možné, že pokles aktivity PON u pacientov s diabetom by mohol byť jedným z faktorov podieľajúcim sa na zvýšení oxidačného stresu v pečeni a indukcii NASH u týchto pacientov. Práca vznikla v rámci riešenia grantového projektu VEGA 1/4268/07 12. NÁTRIURETICKÝ PEPTID TYPU B (BNP): MOŽNOSTI UŽITÍ V PREDIKCI RIZIKA ČASNÉHO ÚMRTÍ U NEMOCNÝCH PODSTUPUJÍCÍCH TIPS Fejfar T1, Šafka V1, Hůlek P1, Jirkovský V1, Solař M2, Pudil R2, Žaloudková E3, Wasylivová V1, Vaňásek T1, Fendrichová M1 (1)II. interní klinika, (2)I. interní klinika, (3) Ústav klinické biochemie a diagnostiky Fakultní nemocnice Univerzity Karlovy v Hradci Králové Úvod:Stanovení prognózy nemocných s dekompenzovanou jaterní cirhózou je 10

obtížné. Prognóza je jistě ovlivněna i závažností oběhových změn asociovaných se syndromem portální hypertenze. Cíl:Stanovení NT-proBNP jako možného ukazatele rizika úmrtí u nemocných léčených transjugulární intrahepatální portosystémovou spojkou (TIPS) a porovnat výpovědní hodnotu s Childovou-Pughovou(Ch-P)klasifikací a Na-MELD skóre. Soubor nemocných:od června 2005 do července 2008 bylo vyšetřeno a dále sledováno 55 nemocných podstupujících TIPS. Soubor tvořilo 16 žen (29%) a 39 mužů (71%) průměrného věku 55,5 let. Etiologie jaterního byla v 59 % alkoholová.tips byl ve všech případech indikován elektivně-u 40 nemocných pro refrakterní ascites(72 %), u 12 (21%) nemocných pro recidivující krvácení z jícnových varixů a u 3 (7 %) pro jaterní hydrotorax. Dle Ch-P klasifikace 8 nemocných patřilo do skupiny A, 32 do skupiny B a 15 do skupiny C. Kalkulace MELD skóre byla provedena dle platných doporučení OPTN (průměr.14 bodů <7;25 > ) a natriem korigované MELD skóre (Na-MELD, průměr 19 bodů <7;29 >). Odběry na stanovení pro-bnp, ANP i běžná laboratorní stanovení byla proveden za standardních podmínek ráno před výkonem a 20 hodin po výkonu. Statistické zpracování bylo provedeno v programu Statistica (7.0) a NCSS (verze 6.0). Výsledky:U všech nemocných došlo po TIPS k významnému (p<0.0005) vzestupu NT-proBNP, v průměru z 58 <3;378> na 212 <7;1441> pmol/l. Průměrná doba sledování byla 14,3 měsíce <0,1;38,8 >. Během sledování zemřelo 22 nemocných, 4 nemocní podstoupili OLTx. Při hodnocení přežívání dle Kaplan-Meiera s ohledem k Ch-P klasifikaci se rozdíl blížil statistické významnosti pro podskupiny A a C. Statistické významnosti se blížil rozdíl v přežití nemocných rozdělených dle hodnoty lnnt-probnp před výkonem (nad a pod 4), a při rozdělení dle hodnoty rozdílu NTproBNP před a po výkonu >100 (deltant-probnp). V tříměsíčním horizontu pro podskupiny s cut-off lnnt-probnp>4 a deltant-probnp>100 dosahoval rozdíl v přežívání statistické významnosti (p<0,05), se senzitivitou 68% a specificitou 80% (АUC 0,69). Středně silná prediktivní síla pro 3 měsíční přežívání byla prokázána i u Na-MELD skóre (AUC 0,76, senzitivita 63%, specificita 80% pro cut-off 23) Coxova regresní analýza nevykazovala statisticky významnou predikci dlouhodobého přežívání pro žádný ze sledovaných a kalkulovaných parametrů (Ch-P, MELD, Na- MELD, hodnoty bilirubinu, kreatininu,albuminu,trombocytů,inr,nt-probnp,lnntprobnp). Závěr: V multivariantní analýze v našem souboru nemocných žádný ze sledovaných parametrů signifikantně nepredikoval riziko úmrtí v dlouhodobém horizontu. Vyšší hodnota NT-proBNP před výkonem je asociována s vyšším rizikem úmrtí v prvních třech měsících po TIPS a prediktivní síla je srovnatelná s prediktivní sílou standardního Na-MELD skóre. Práce byla uveřejněna s podporou VZ MZO 00179906 a IGA MZČR NR8419-4 13. ÚČINEK THIOACETAMIDU NA POTKANÍ JÁTRA V PODMÍNKÁCH IN VITRO A IN VIVO 1 Křiváková P, 1 Kučera O, 1 Roušar T, 1 Lotková H, 1 Endlicher R, 2 Gunčová I, 1 Červinková Z 1 Ústav fyziologie, 2 Ústav histologie a embryologie, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Univerzita Karlova v Praze 11

Úvod a cíle: Thioacetamid (TAA) je hepatotoxin a hepatokancerogen. Po jednorázovém podání navozuje centrilobulární nekrózu s následnou regenerační odpovědí jater. Detailní mechanizmus účinku TAA není zcela objasněn. Zdá se, že energetický metabolizmus hraje velmi významnou roli při reparačních procesech. Zkoumali jsme účinek TAA v podmínkách in vitro a po jednorázovém podání v podmínkách in vivo. Metody: Hepatocyty jsme izolovali ze samců potkanů kmene Wistar metodou dvoustupňové perfúze pomocí kolagenázy. Buňky byly kultivovány na Petriho miskách potažených kolagenem a 24 hodin inkubovány s TAA (5 100 mm). Měřili jsme únik LDH do média, syntézu urey a albuminu, obsah intracelulárního GSH, GSSG a hodnotili mitochondriální respiraci (Oxygraf Oroboros-2k). Potkanům byl jednorázově i.p. podán TAA v dávce 100 mg/kg. K usmrcení došlo 24, 48 a 72 hodiny po podání TAA. V séru jsme měřili aktivitu ALT, AST, obsah celkového cholesterolu, TAG a bilirubinu. Část jater byla odebrána na histologické vyšetření (H+E, BrdU). V jaterním homogenátu jsme stanovovali koncentraci malondialdehydu a IL-6. Hodnotili jsme respiraci izolovaných mitochondrií. Výsledky a závěry: V podmínkách in vitro dochází vlivem účinku TAA k úniku LDH (od 30 mm TAA, p<0,05), ke snížení syntézy urey (od 20 mm TAA, p<0,001) a albuminu (od 10 mm TAA p<0,001), k poklesu intracelulárního GSH (od 5 mm, p<0,001) a ke snížení mitochondriální respirace (od 50 mm, p<0,05). Naše výsledky ukazují, že TAA více inhibuje aktivitu NADH-dependentních dehydrogenáz (70 mm TAA 25%) než aktivitu sukcinátdehydrogenázy (70 mm 45%). V podmínkách in vivo thioacetamid po 24 hodinách navodil centrilobulární nekrózu s kulatobuněčným infiltrátem s výraznou příměsí eozinofilů. Po 48 hodinách již byly patrny známky regenerace. Mitochondriální respirace aktivovaná NADH-dependentními dehydrogenázami byla snížená jen po 24 hodinách (70%) a aktivita sukcinátdehydrogenázy nebyla TAA ovlivněna vůbec. V souvislosti s těmito nálezy může být zajímavé ovlivnění substrátové specifity v regenerujících játrech. Tato práce byla podpořena granty MSM 0021620820 a GAČR 305/09/P145 14. VLIV RESVERATROLU NA EXPRESI TRANSPORTNÍCH PROTEINŮ V JÁTRECH A LEDVINÁCH U POTKANŮ S BILIÁRNÍ CIRHÓZOU Brčáková E, Fuksa L, Cermanová J, Kolouchová G, Hiršová P, Hroch M, Chládek J, Mokrý J, Martínková J, Mičuda S Ústav farmakologie LF UK, Šimkova 870, Hradec Králové, 500 38 Úvod: Obstrukční cholestáza je klinický syndrom způsobený poškozením toku a sekrece žluče ve žlučovodech, který vede k jaterní a systémové kumulaci potenciálně toxických látek (žlučových kyselin a bilirubinu). Spontánní anticholestatickou odpovědí hepatocytů je změna exprese některých transportních proteinů s cílem omezit kumulaci endo- a xenobiotik. Jelikož působení těchto anticholestatických mechanismů není dostačující pro zamezení progradujícího poškození jater, existuje velká snaha nalézt léčiva, která by podpořila tyto kompenzační děje. Cílem této studie bylo prozkoumat potenciálně terapeutický efekt resveratrolu, látky s protizánětlivým a antioxidačním účinkem, na expresi transportních proteinů (P-gp, Mrp2 a Oatp1a4) u potkanů s biliární cirhózou (navozenou dlouhodobým podvazem 12

žlučovodu), společně s detailní kinetickou studií azitromycinu (AZT), specifického substrátu těchto transportérů. Metodika: Potkani kmene Wistar (n = 6, v každé skupině; 280 320 g) byli rozděleni do tří skupin: BDO (podvaz žlučovodu trvající 28 dní); BDO-R (potkani s podvazem žlučovodu a terapií resveratrolem; 10 mg/kg/den, p.o.); kontrolní skupina (shamoperace). Následně byla provedena in vivo kinetická studie (240 min), na jejímž úvodu byl všem jedincům podán bolus AZT (20 mg/kg). Změny exprese transportérů na úrovni mrna a proteinu byly hodnoceny qrt-pcr a Western blotem. Verifikace cholestatického poškození jater byla provedena kompletní biochemickou a histologickou analýzou. Výsledky: Cholestáza vedla k významnému poklesu exprese jaterních transportérů na úrovni mrna i proteinu Mrp2 na 42 % a 31 % a Oatp1a4 na 39 % a 31 %. Exprese P-gp byla zvýšena u BDO zvířat na 344 % na úrovni mrna a 1013 % na úrovni proteinu. Tyto změny byly asociovány se snížením biliární exkrece AZT na 51 %. Terapie resveratrolem vedla k další redukci transportu léčiva do žluče na 18 %. Renální exkrece AZT nebyla cholestázou ovlivněna, nicméně byla pozorována tendence ke sníženému vylučování AZT do moče u zvířat léčených resveratrolem. Terapie resveratrolem vedla k restituci všech změn exprese transportérů pro AZT indukovaných cholestázou v játrech a ledvinách. Na úrovni mrna bylo v játrech pozorováno zvýšení exprese Mrp2 na 164 %, Oatp1a4 na 127 % a snížení exprese P-gp na 68 %. Množství Mrp2 a Oat1a4 proteinu se zvýšilo na 43 % a 72 % a množství P-gp snížilo na 184 % u BDO-R v porovnání s BDO. V ledvinách byla exprese Mrp2 snížena na 116 % a 130 % a exprese P-gp na 92 % a 89 % na úrovni mrna i proteinu u BDO-R. Závěr: Z výsledků studie vyplývá, že navzdory pozitivnímu působení resveratrolu na cholestázou indukované změny hlavních transportních proteinů pro AZT v játrech a ledvinách může resveratrol inhibovat biliární a eventuálně i renální exkreci AZT blokádou jeho kanalikulární exkrece. Tato studie vznikla za podpory grantu MSM 0021620820. 15. PRO-HEPCIDIN U PACIENTŮ S JATERNÍM ONEMOCNĚNÍM Dostalíková-Čimburová M1, Krátká K2, Stránský J2, Půtová I2, Cieslarová B2, Hejda V3, Horák J2 1 Oddělení buněčné a molekulární biologie a Centrum pro výzkum diabetu, metabolismu a výživy 3.LF UK, Praha 2 I. Interní klinika, FNKV, Praha 3 I. Interní klinika, Odd. gastroenterologie a hepatologie, FN Plzeň Úvod: Hepcidin je považován za klíčový regulátor metabolismu železa. Reaguje na množství železa v organismu - snižuje jeho resorpci ve střevě a zadržuje železo v makrofágovém systému, čímž způsobí pokles železa v plasmě, z dlouhodobého hlediska zabraňuje jeho akumulaci v organismu. Hladiny hepcidinu se zvyšují i při zánětu (zde je jeho exprese ovlivněna zánětlivými cytokiny). Důležitou roli hraje i při anemii a hypoxii. Mechanismus účinku je dán vazbou na ferroportin (exportér železa 13

z buněk). U některých jaterních onemocnění byla pozorována akumulace železa, role hepcidinu u těchto stavů je nejasná. Cílem studie bylo zjistit sérové hladiny prohepcidinu u pacientů s jaterním onemocněním. Pacienti a metodika: U pacientů s jaterním onemocněním (hemochromatóza, PCT, hepatitida B a C, alkoholické jaterní postižení, kontrolní skupina) byly stanoveny parametry metabolismu železa (sérové železo, saturace transferinu, sérový ferritin), krevní obraz a jaterní testy. Pomocí PCR-RFLP byly analyzovány mutace v HFE genu (C282Y, H63D, S65C) jedná se o gen zodpovědný za hemochromatózu typ I. Hladiny sérového pro-hepcidinu bylo stanoveny metodou ELISA. Výsledky a závěr: Při porovnání hladin pro-hepcidinu mezi jednotlivými skupinami pacientů byla zjištěna statisticky významně nižší hladina pro-hepcidinu u pacientů s alkoholickým postižením jater ve srovnání s kontrolami (86.82 ng/ml vs. 102.7 ng/ml, p=0.0039). Překvapivě nebyla tato skutečnost zjištěna u pacientů s hemochromatózou a porphyria cutanea tarda (kteří sloužili jako příklad pacientů s akumulací železa a díky přítomnosti mutací v HFE genu s poruchou regulace metabolismu železa), ačkoliv tito pacienti měli zvýšené sérové železo (31.05 μmol/l), saturaci transferinu (66.55%), sérový ferritin (619.6 μg/l). Při rozdělení všech pacientů podle HFE genotypů nebyly rovněž zjištěny statisticky významné rozdíly v hladinách pro-hepcidinu u příslušných jedinců. U pacientů byla nalezena korelace mezi hladinou pro-hepcidinu a hematokritem (r=0.4494, p<0.0001) a hemoglobinem (r=0.4491, p<0.0001). Projekt je podpořen výzkumným záměrem 3. LF UK: MSM0021620814 14