ÚSTAV FYZIKÁLNÍ BIOLOGIE JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH ZPRÁVA O UKONČENÍ PROJEKTU Projekt Název projektu: Impact of host ecology on metabolic capacity of Sodalis allied symbiotic bacteria inferred from comparative genome analysis Průběh řešení projektu: V průběhu řešení projektu byly splněny cíle stanovené v původním návrhu. Vzhledem k negativním výsledkům kvantitavních analýz v počáteční fázi zpracování vzorků a nedostatku dalšího materiálu pro druh Craterina malbae (Diptera, Hippoboscidae), byl pro projekt dodatečně zvolen příbuzný druh hostitele Melophagus ovinus (Diptera, Hippoboscidae). Oproti předloženému návrhu se projekt zaměřil na studium evoluce metabolických drah thiaminu u bakterie Sodalis melophagi v rámci komplexního symbiotického společenstva krevsajícího hostitele M. ovinus, které představuje analogii modelovému organismu mouchy tse-tse, Glossina sp. (Diptera, Glossinidae), a s ním asociovaných symbiontů, Wigglesworthia glossinidia a Sodalis glossinidius (Chen, 1999, Toh, 2006). V úvodní části projektu byl ze symbiotického orgánu hostitele M. ovinus izolován kvalitní DNA templát vyhovující podmínkám navržené sekvenční strategie a byla vytvořena pair-end knihovna s délkou insertu v rozmezí 150-250bp. Knihovna byla sekvenována v rozsahu 100bp úseků na platformě Illumina a byla získána hrubá genomická data v podobě 80 mil. pair-end sekvencí. Tyto sekvence představovaly metagenom bakterialní komunity zahrnující tři bakteriální linie asociavané s hostitelem, t.j. rody Arsenophonus, Sodalis a Bartonella. Část dat pocházela z genomu samotného hostitele M. ovinus a genomu jím přenášeného parazita Trypanosoma melophagium.
Hlavním cílem projektu bylo popsání evolučních změn v genomu bakterií podmíněných odlišnými podmínkami symbiotického vztahu, mimojiné složením konkrétního společenstva, a to na příkladu biosyntézy thiaminu významné z hlediska životní strategie hmyzích hostitelů. Komparativní analýza byla zaměřena na bakterie Sodalis glossinidus a Sodalis melophagi, které jsou součástí výše popsaných endosymbiotických komunit hematofágů. Pro rekonstrukce metabolických drah a odhalení případné komplementace mezi jednotlivými symbionty byla hrubá data ze získaného metagenomu dále analyzována, filtrována a byly sestaveny jednotlivé drafty genomových sekvencí bakterií Sodalis, Arsenophonus a Bartonella. Následné analýzy draftů genomových sekvencí poukázaly na role bakterií Arsenophonus a Sodalis v symbiotickém vztahu s M. ovinus, především syntézu vitaminů skupiny B zahrnujících thiamin, které není schopen hematofágní hostitel syntetizovat ani je nepřijímá v potravě. Naopak, analýzy složení genomu Bartonella neprokázaly bližší metabolické závislosti bakteriií k hostiteli. Genomový draft vykazuje vysokou shodu s genomem B. shoenbuchensis (Engel et al, 2010), patogení linie izolované z krve skotu. M.ovnus je tak pravděpodobně pouze vektorem bakterií Bartonella. Případná komplementace metabolických drah syntézy thiaminu byla proto detailně posuzována pouze pro genomy Sodalis melophagi a Arsenophonus melophagi. Vzhledem ke komplexnosti získaných dat bylo dodatečným cílem projektu zavedení S. melophagi, izolavané z hemolymfy dospělých jedinců M. ovinus, do buněčné a bezbuněčné kultury, ze které je možné získat DNA/RNA témplát výhradně pro S. melophagi pro opětovné sekvenování a zvýšení kvality sestavované genomové sekvence nebo případné sekvenovaní transkriptomu. Dosažené výsledky: Souhrným výsledkem projektu jsou anotované drafty genomových sekvencí Arsenophonus melophagi, Sodalis melophagi a Bartonella melophagi v podobě několika desítek kontigů, které poskytují informace o evoluci symbiotických vztahů těchto bakterií. Geny pro thiaminové dráhy jsou v datech pro jednotlivé genomy lokalizovány vždy na jednom kontigu. Genom S. melophagi obsahuje kompletní set kódujících biosyntézu thiaminu zahrnující 13
genů. Naopak genom A. melophagi kóduje pouze tři geny z této biosyntetické dráhy, tj. sufs, thii a thil, jejichž homology jsou rovněž obsaženy v genomu S. melophagi. V porovnání s produkcí thiaminu u modelového organismu Glossina sp. zajišťované komplementací metabolických drah symbiontů Sodalis glossinidius a Wigglesworthia glossinidia s neúplnými sety thiaminogeních genů (Belda, 2010), je zřejmě u hostitele Melophagus ovinus producenten thiaminu pouze symbiont Sodalis melophagi. Ačkoli se jedná o blízce příbuzné linie symbiontů Sodalis z příbuzných hostitelů (Chrudimský et al., submitted) se stejnou, úzce specializovanou potravní strategií, prodělaly genomy obou bakterií během evoluce symbiotického vztahu odlišné změny, patrně závislé na složení konkrétních symbiotických komunit. Kompletnost thiaminové biosyntézní dráhy u S. melophagi zároveň potvrzuje předpoklad z recentní studie genomu S. glossinidius o přítomnosti kompletního setu thiaminogeních genů u předka této bakterie (Belda, 2010). Tento fakt rovněž napovídá, že další linie bakterií Sodalis mohou vytvářet úzké symbiotické vztahy s jinými hematofágními hostiteli a hrát zde roli výhradního nutričního symbionta. Dalším dílčím výsledkem tohoto projektu je úspěšné zavedení čisté kultury Sodalis melophagi v naší laboratoři. Bakterie izolované z hemolymfy hostitele se nejprve podařilo kultivovat v axenických podmínkách na krevním agaru. V aerobním prostředí byli symbionti úspěšně zavedeni do buněčné kultury obsahující buňky Aedes albopictus linie C6/36. Čistou kulturu S. melophagi v tekutém médiu s přídavkem enzymaticky štěpených proteinů jako zdroje dusíku se podařilo získat z izolovaných kolonií v mikroaerofilní atmosféře při teplotě 27 C. Mikrobiologické a fylogenetické charakteristiky této nové bakteriální linie byly popsány v rámci níže uvedeného rukopisu a odeslány k publikaci. Tomáš Chrudimský, Filip Husník, Eva Nováková and Václav Hypša (submitted): Candidatus Sodalis melophagi sp. nov.: phylogenetically independent comparative model to the tsetse fly symbiont Sodalis glossinidius. Z čisté kultury byla izolavána DNA, která byla následně využita pro přípravu dodatečné Illumina mait-pair knihovny a genomové sekvenování. Výsledkem jsou hrubá data S. melophagi v podobě 40 mil. mait-pair sekvencí o délce 75bp a insertem v rozmezí 2000-5000bp vhodné pro skafoldování draftu genomické sekvence extrahované z metagenomu.
Stav čerpání finančních prostředků: Veškeré finanční prostředky byly vyčerpány na nákup laboratorního materiálu potřebného pro izolace a následné kultivace symbiontů Sodalis melophagi. Využitelnost dosažených výsledků a navazující práce: Výsledky projektu budou použity v řadě navazujících prací v rámci dlouhodobého výzkumu evoluce a fylogeneze symbiotických bakterií v naší laboratoři. V příštím roce očekáváme odeslání části výsledků k publikaci v rámci rozsáhlé genomové studie bakterií linie Sodalis. Důležitým výsledkem je také úspěšné zavedení čisté kultury Sodalis melophagi. Kultura bude v příštím roce využita pro transkriptomové analýzy. Genomová data Arsenophonus melophagi jsou nyní zpracovávána v podobě komparativní studie do formy rukopisu a rovněž budou dále využita při řešení projektu GAČR P505/10/1401 zaměřeného na molekulární evoluci celého bakteriálního rodu. V Českých Budějovicích dne 29. 12. 2011 RNDr. Eva Nováková (řešitel projektu)
Literatura: Belda E, Moya A, Bentley S, Silva F J. (2010). Mobile genetic element proliferation and gene inactivation impact over the genome structure and metabolic capabilities of Sodalis glossinidius, the secondary endosymbiont of tsetse flies. BMC Genomics 11,449. Engel P, Salzburger W, Liesch M, Chang C-C, Maruyama S, Lanz C, Clateau A, Lajus A, Médigue C, Schuster SC, Dehio C. (2010). Parallel evolution of a Type IV secretion system in radiating lineages of Bartonella. PLoS Genet 7(2): e1001296. Chrudimský T, Husník F, Nováková E, Hypša V. (Submitted). Candidatus Sodalis melophagi sp. nov.: phylogenetically independent comparative model to the tsetse fly symbiont Sodalis glossinidius.