13 -NMR spektrometrie rezonance jader 13 nastává ve srovnání s 1 při cca čtvrtinové frekvenci, tj. pracovní frekvenci 100 Mz (v 1 ) odpovídá 25,15 Mz ( 13 ) a frekvenci 600 Mz (v 1 ) odpovídá 150,9 Mz ( 13 ) obvyklý rozsah chemického posunu: 5 220 ppm (vs. TMS) nejběžnější rozpouštědlo Dl 3 (signál: triplet, δ = 77 ppm) zastoupení 13 v normální izotopové směsi uhlíku: 1,1 % spinové interakce 13-13 se ve spektru neobjevují dochází ke spinovým interakcím 13-1, případně 13-19 F, 13-31 P hemický posun v uhlíkových NMR spektrech sp 3 uhlík sp 3 uhlík vázaný s elektronegativním atomem O R R R 3 l R 4 R δ (ppm) 8 30 15 55 20 60 40 80 35 80 Br 25 65 alkyny 65 90 alkeny 100 150 areny 110 175 karbonylové sloučeniny O O aldehydy, ketony kyseliny, estery, amidy, anhydridy 155 185 185 220 200 150 100 50 0 1
hemické posuny δ alkanů a cykloalkanů 4-2,5 ppm 8,4 15,9 15,4-2,8 ppm 23,1 13,0 24,8 3 25,4 24,5 26,3 27,1 3 28,1 31,7 Vliv substituce v uhlíkovém řetězci na chemický posun chemický posun 13,9 22,8 34,7 22,8 13,9 ε δ γ β α O 13,8 22,6 28,2 32,5 61,8 rozdíl 0,1 0,2 6,5 9,7 47,9 tabelovaná hodnota inkrementu z pro O 0 0 6 10 48 Výpočet chem. posunu konkrétního atomu : záporný inkrement v poloze γ δ γ β α δ = -2,5 + z α + z β + z γ + z δ + S + K S sterický příspěvek, K příspěvek konformace 2
Vliv halogenů na chemický posun 4 2,5 ppm F 75,4 l 24,9 l 2 54 l 3 77,5 l 4 96,5 Br 10,0 Br 2 21,4 Br 3 12,1 Br 4 28,5 I 20,7 I 2 54 I 3 140 I 4 293 Sterické efekty: vliv konfigurace dvojné vazby na chemický posun α-uhlíku 2-pentenová kyselina E-isomer Z-isomer OO α α 25,8 ppm 23,5 ppm OO Neekvivalence uhlíků u substituovaných amidů dimethylformamid O N anti 31,1 ppm syn 36,2 ppm 3
Spinová interakce 13-1 a její projev ve spektru jádro 13 interaguje s přímo připojenými protony multiplet multiplicita: n+1 13 13 13 13 methylový uhlík methylenový uhlík methinový uhlík kvarterní uhlík kvartet triplet dublet singlet Rušení spinové interakce 13-1 (protonový širokopásmový dekapling) současné ozáření vzorku rezonančními frekvencemi protonů označení spektra: 13 { 1 }-NMR důsledky dekaplingu: zjednodušení spektra (multiplet singlet) každému signálu ve spektru odpovídá jeden uhlík nebo skupina chemicky ekvivalentních uhlíků všechny signály (singlety) jsou dostatečně separovány zvýšení některých signálů potlačení šumu spektra 4
Vliv protonového dekaplingu na uhlíkové spektrum Spektra ethyl fenylacetátu 20 Mz a) 13 -NMR b) 13 { 1 }-NMR Vliv protonového dekaplingu na uhlíkové spektrum (a) (b) Spektra diethylftalátu v Dl 3 150,9 Mz a) 13 -NMR b) 13 { 1 }-NMR 5
Vliv protonového dekaplingu na uhlíkové spektrum Spektra cholesterolu v Dl 3 150,9 Mz a) 13 -NMR b) 13 { 1 }-NMR holesterol O 11 19 1 9 2 10 3 5 4 6 12 8 7 21 18 13 14 20 22 17 16 15 23 24 25 26 27 δ (ppm) Atom δ (ppm) Atom δ (ppm) Atom 11,9 18 28,4 12 40,0 16 18,9 21 32,1 2 42,4 13 19,5 19 32,3 7 43,2 4 21,3 11 32,3 8 50,4 9 22,6 26 36,0 20 56,4 17 22,8 27 36,4 22 56,9 14 24,1 23 36,7 10 71,0 3 24,4 15 37,7 1 120,9 6 28,1 25 39,7 24 141,7 5 6
Některé vlastnosti uhlíkových spekter ( 13 i 13 { 1 }) odlišné od protonových spekter záznam spektra je třeba vícekrát (mnohokrát) opakovat (akumulace spekter) velikost jednotlivých signálů není zcela úměrná počtu chemicky ekvivalentních atomů uhlíku kvantitativní analýza je problematičtější atomy uhlíku, které nemají vázaný žádný atom vodíku (kvarterní uhlíky, uhlíky karbonylové skupiny s výjimkou formylové skupiny), poskytují menší signál ve spektru 13 { 1 }-NMR zpravidla velikost signálů klesá v řadě > > >> Příklad 13 { 1 } spektra: 2,2-dimethylbutan chemicky ekvivalentní uhlíky: methylové skupiny (signál b) kvarterní uhlík: velmi malý signál (signál c) 7
Příklad 13 { 1 } spektra: cyklohexanon chemicky ekvivalentní uhlíky: dvojice methylenových skupin sousedící s =O (signál c) další dvojice methylenových skupin (signál b) karbonylová skupina: velmi malý signál (d) Příklad 13 { 1 } spektra: toluen chemicky ekvivalentní uhlíky: dvojice skupin v poloze ortho (signál d) dvojice skupin v poloze meta (signál c) další uhlíky: uhlík skupiny (signál a) uhlík skupiny v poloze para (signál b) kvarterní uhlík v poloze ipso (signál e) 8
Technika DEPT = Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer spolu se spektrem 13 { 1 } umožňuje rozlišení uhlíků skupin,, a uhlíků bez připojených atomů vodíku tři subspektra: DEPT-45 pozitivní signál skupin,, DEPT-90 pozitivní signál skupin DEPT-135 pozitivní signál skupin a negativní signál skupin Kvartérní uhlík a uhlík karbonylové skupiny neposkytuje žádný signál. O 4 3 2 1 O 5 6 1 9
Spektra isopentylacetátu: přehled signálů O 4 3 2 1 O 5 6 hem. posun ve spektru 13 { 1 } 21 ppm 22,5 25 37 63 162 1 DEPT-45 pozitivní pozitivní pozitivní pozitivní pozitivní žádný Signál ve spektru DEPT-90 žádný žádný pozitivní žádný žádný žádný DEPT-135 pozitivní pozitivní pozitivní negativní negativní žádný Přiřazení (5) (1) (2) (3) (4) =O (6) 31 P-NMR spektrometrie rezonance jader 31 P nastává při cca dvou-pětinové frekvenci ve srovnání s 1 tj. pracovní frekvenci 100 Mz (v 1 ) odpovídá 40,48 Mz citlivost ve srovnání s 13 -NMR je cca 400 krát větší (P je monoizotopický) měření je pomalé (dlouhý relaxační čas T 1 ) rozsah chem. posunu je cca 200 až +500 ppm (vs. 3 PO 4 ) pro sloučeniny P V pouze cca 40 až +20 ppm rozpouštědla: voda, Dl 3 pro nepolární sloučeniny referenční látka: 85 % 3 PO 4 (rezonanční frekvence je závislá na p), ( O) 3 PO, bílý fosfor rozpuštěný v S 2 (pro nepolární sloučeniny P), případně fosfatidylcholin (při analýze fosfolipidů) 10
31 P-NMR spin jádra 31 P je ±1/2 spinová interakce 31 P- 31 P nastává u sloučenin s více atomy P v molekule a s vazbou P P nebo P P u vícenásobně fosforylovaných organických látek (atomy P jsou odděleny několika vazbami, např. P O O P) k této spinové interakci nedochází spinová interakce 31 P- 1 nastává v molekulách alkylfosfinů P 2 R, PR 2, PR 3, u esterů kyseliny fosforité a fosforečné typu (RO) 3 P resp. (RO) 3 PO, interakce s protony fosfátové skupiny O PO(O) 2 je závislá na rozpouštědle a p spinová interakce 31 P- 13 je slabá Aplikace NMR spektrometrie Obecný přehled aplikací identifikace organických (i anorganických) sloučenin kvantitativní analýza stanovení enantiomerní čistoty stanovení absolutní konfigurace chirálních sloučenin stanovení rovnovážných konstant (např. disociační konstanty) stanovení tautomerního zastoupení studium struktury polymerů studium mechanismů reakcí organických sloučenin 11
Kvantitativní analýza metodou NMR integrální intenzita signálu je přímo úměrná obsahu složky, které tento signál přísluší v 1 -NMR je velikost signálu rovněž přímo úměrná počtu atomů vodíku v příslušné skupině molekuly detegované látky možnost použití metody vnitřního standardu (IS) pro kvantifikaci analytu: m analyt NIS Manalyt A = mis Nanalyt MIS A analyt IS A integrální intenzity signálů analytu a vnitřního standardu M molární hmotnosti analytu a vnitřního standardu N počty atomů ve skupinách molekul analytu a vnitřního standardu, které příslušejí signálům analytu a vnitřního standardu Kvantitativní analýza vícesložkové směsi (složkou směsi je i rozpouštědlo a referenční látka TMS) složky 1, 2, 3 n molární zlomky složek 1 n jsou x 1 x n signály ve spektru a, b, c z velikosti signálů A a, A b, A c, A z počet složek (n) = počet změřených a rozpoznaných signálů Řešení soustavy rovnic: k. A a = N 1a. x 1 + N 2a. x 2 + N 3a. x 3 + N na. x n k. A b = N 1b. x 1 + N 2b. x 2 + N 3b. x 3 + N nb. x n k. A c = N 1c. x 1 + N 2c. x 2 + N 3c. x 3 + N nc. x n... k. A z = N 1z. x 1 + N 2z. x 2 + N 3z. x 3 + N nz. x n N 1a počet atomů ve skupině atomů molekuly složky 1, které přísluší signál a k koeficient vyjadřující citlivost přístroje výpočet lze provést pro k = 1, pokud molární zlomky x 1 až x n nahradíme relativními hodnotami y 1 až y n, které jsou úměrné počtu molekul složek 1 až n v efektivním objemu vzorku 12
Příklad: dvousložková směs ethanol-voda O + 2 O A O = 2 y 2O + y EtO A 2 = 2 y EtO O 1 -NMR spektrum vzorku vodky 1152 = 2 y 2O + y EtO 203 = 2 y EtO y EtO =101,5 y 2O = 525,25 m EtO /m 2O = (y EtO /y 2O ). (M EtO /M 2O ) = = (101,5/525,25). (46,07/18,015) = = 0,49394 w EtO = m EtO / (m EtO + m 2O ) = = 0,49394. m 2O / (0,49394.m 2O + m 2O ) = = 0,49394/1,49394 = 0,3306 p EtO = 33,06 % (m/m) φ EtO = 39,75 % (V/V) Spojení L-NMR méně užívaná technika (ve srovnání s L-MS nebo L-FTIR), především kvůli horším detekčním limitům lavní problémy: pro NMR měření je potřebná relativně velká průtočná cela (60-250 µl) zhoršuje se chromatografické rozlišení pro přípravu mobilní fáze je třeba použít deuterovaná rozpouštědla mez detekce nízkomolekulárních látek (M r < 400) při použití 1 -NMR nebo 19 F-NMR je cca 10 µg; při zastaveném toku nebo při detekci off-line cca 200 ng (dlouhá akumulace spektra) 13
Aplikace NMR spektrometrie v analýze potravin NMR spektrometrie s nízkým rozlišením pro stanovení makrosložek (voda, tuk) Stanovení vody chemický posun vody 4,8 (vs. TMS) při nízkém rozlišení se NMR signál vody v kapalném stavu projeví jako relativně ostrý pík na širokém pásu pozadí vodíků tuhé fáze kalibrace: použití řady vzorků stejné matrice s odstupňovaným obsahem vody stanoveným referenční metodou u vzorků obsahujících lipidy se obsah vody zjišťuje z výsledků diferenčního měření původního vzorku a vzorku vzorku po přídavku bezvodé soli, která tvoří krystalický hydrát (např. přídavek Na 2 SO 4 ) Stanovení tuku a tuhého podílu tuku Stanovení tuku stejný princip jako u stanovení vody vzorek po temperaci při 60 a zmrazení se měří při různých teplotách 10 60 Stanovení tuhého podílu tuku (solid fat content) měření 10 µs a 70 µs po radiofrekvenčním pulzu první signál odpovídá celkovému tuku (tuhá i kapalná fáze) druhý signál odpovídá kapalné fázi tuku (odezva protonů tuhé fáze rychle mizí) 14
Aplikace NMR spektrometrie s vysokým rozlišením Stanovení podílu nenasycených mastných kyselin v tuku umožněno měřením poměru rezonančních signálů protonů skupiny = (δ = 5,3 ppm) a protonů methylenové skupiny (δ = 4,2 ppm) Stanovení složení mastných kyselin v tuku v 13 -NMR spektru tuku se měří signály methylenových skupin v různých pozicích při chemických posunech 24,8 ppm: signál v poloze 3 odpovídá počtu všech řetězců MK ve vzorku 25,7 ppm: signál v poloze 11 linolové kyseliny (tj. ve struktuře = = ) odpovídá podílu řetězců linolové kyseliny 27,3 ppm: signál sousedících se skupinou =, tj. signál uhlíků 8 a 11 v řetězci olejové kys. a 8 a 14 v řetězci linolové kys. odpovídá podílu řetězců nenasycených MK Použití 31 P-NMR diferencované stanovení jednotlivých sloučenin P stanovení sloučenin neobsahujících P po derivatizaci Stanovení fosfolipidů rozpuštění lecitinu nebo tuku ve směsi l 3 /MeO/ 2 O-EDTA nebo Et 3 N-DMF-guainidiniumchlorid měření: ref. látka= fosfatidylcholin (chem. posun proti 3 PO 4 je 0,84 ppm) 121,44 Mz 31 P-NMR spektrum lecitinu 15
Stanovení kyseliny fytové a jejích degradačních produktů OPO 3 2 2 O 3 PO 2 O 3 PO 5 6 2 O 3 PO 4 1 OPO 3 2 3 2 OPO 3 2 31 P-NMR spektrum kys. fytové obsahuje 4 signály s poměrem velikostí 1:2:2:1 pro kvantifikaci slouží signál fosfátové skupiny na 2 (0,5 ppm) je dobře oddělen od signálů IP-IP 5 a fosfátu Stanovení ATP a dalších makroergických fosfátů možnost detekce ATP a dalších sloučenin P v mase bez úpravy vzorku využití: rozlišení normálního masa, PSE masa, DFD masa 31 P-NMR spektra vepřového masa A normální, B maso se sklonem k PSE DFD maso PME frakce fosforečných monoesterů Pr kreatinfosfát GP glycerofosforylcholin Pi anorganický fosfát 16
Derivatizace - fosfitylace do molekul s reaktivním hydroxylem lze zavést atom P reakcí s 2- chlor-4,4,5,5-tetramethyldioxafosfolanem: O O R O + l P R O P + l O O produkt lze analyzovat metodou 31 P-NMR chem. posun látek se měří proti produktu reakce činidla s vodou možné aplikace stanovení glycerolu a parciálních esterů glycerolu v tucích stanovení fenolových látek v tucích Analýza izotopového složení: SNIF-NMR = Site-specific Natural Isotope Fractionation izotopové poměry (např. D/ 1 ), 13 / 12 ) v přírodních produktech nejsou zcela konstantní závisejí na původu vzorku (druh rostliny, biochemické, geografické a klimatické faktory) např. 4 rostliny (cukrová třtina, kukuřice) mají vyšší poměr 13 / 12 než 3 rostliny (cukrová řepa, hrozny) možnost určování původu potraviny, druhu použité suroviny 17
SNIF-NMR: určování původu alkoholických nápojů ze vzorku se oddestiluje ethanol ( 96 % EtO) provede se měření 2 -NMR určí se poměry signálů odpovídající výskytu deuteria v jednotlivých skupinách molekuly Monodeuterované molekuly ethanolu: typ I: D O (mol. zlomek 1/2) typii: DO (mol. zlomek 1/3) typ III: OD (mol. zlomek 1/6) Kritérium R = 3. (S II /S I ) = 2. [(D/) II /(D/) I ] S I je signál D v methylové skupině, S II je signál D v methylenové skupině Při náhodné distribuci izotopů v molekule EtO bude R=2; skutečné hodnoty R pro kvasný ethanol jsou 2,2 až 2,7 podle druhu suroviny: R 2,25 cukrová třtina, kukuřice R 2,5 pšenice, ječmen, jablka, hrozny R 2,7 cukrová řepa, brambory 18