Národní referenční laboratoř Strana 1 STANOVENÍ OBSAHU PROBIOTICKÝCH BAKTERIÍ RODU ENTEROCOCCUS 1 Rozsah a účel Postup slouží ke stanovení počtu probiotických bakterií v doplňkových látkách, premixech a krmivech. Postup stanovení nelze použít pro minerální krmiva, tj. krmiva doplňková, která jsou složena převážně z minerálních látek (s obsahem minimálně 40 % hrubého popela). 1 Používá se technika zalitím agarem se žlučí, eskulinem a azidem nebo roztěr na tento agar. Tato metoda není selektivní pro probiotické bakterie rodu Enterococcus, ale může být použita pro stanovení jejich počtu v aditivech, premixech a krmivech za předpokladu, že probiotické enterokoky (E. faecium) jsou přítomné v mnohem vyšších počtech, než jakékoli jiné enterokoky. 2 Kategorie vzorků krmiv: Doplňkové látky - obsahují okolo 10 10 CFU/g. Premixy - obsahují okolo 10 8 CFU/g. Krmné směsi, mouky a pelety - obsahují okolo 10 6 CFU/g. 2 Princip Vzorek se homogenizuje, připraví se výchozí suspenze, ředicí řada a plotny (Petriho misky) se inokulují roztěrem inokula na povrch ploten. Plotny se inkubují v aerobních podmínkách po dobu (24 ± 2) h při teplotě (37 ± 1) C. Narostlé kolonie se spočítají a vyjádří se jako kolonie tvořící jednotky (CFU) v g nebo kg krmiva. 3 Norma ČSN EN 15788 uvádí pouze roztěr inokula na povrch plotny. Vzhledem k tomu, že jsou bakterie rodu Enterococcus (E. faecium) fakultativně anaerobní, dochází k vyššímu nárůstu kolonií při inokulaci ploten zalitím. Proto jsou uvedeny obě možnosti inokulace. 3 Chemikálie Používají se chemikálie čistoty p. a. 1 Chlorid sodný, NaCl. 2 Chlorid draselný, KCl. 3 Hydrogenfosforečnan sodný, Na 2 HPO 4.
Národní referenční laboratoř Strana 2 4 Dihydrogenfosforečnan draselný, KH 2 PO 4. 5 Bakteriologický pepton. 6 Peptone 1 casein peptone 7 Pepton 2 meat peptone typ P. 8 Kvasniční extrakt. 9 Sušená hovězí žluč. 10 Eskulin. 11 Citronan železitoamonný. 12 Azid sodný. 13 Agar. 14 Voda (deionizovaná, demineralizovaná nebo destilovaná) odpovídající stupni 1 dle EN ISO 3696. 15 Základní ředicí roztok. Příprava: 8 g chloridu sodného (1), 0,2 g chloridu draselného (2), 1,15 g hydrogenfosforečnanu sodného (3) a 0,2 g dihydrogenfosforečnanu draselného (4) se rozpustí ve vodě (14), upraví se ph hydroxidem sodným (20) na hodnotu 7,3 ± 0,2 a doplní se do objemu 1000 ml. Takto připravený roztok se sterilizuje 15 min v autoklávu při teplotě (121 ± 1) C nebo 30 min v tlakovém hrnci. Před použitím se roztok vytemperuje na laboratorní teplotu. 16 Peptonová voda (pepton). Příprava: 1 g bakteriologického peptonu (5) a 8,5 g chloridu sodného (1) se rozpustí v asi 200 ml vody (14). ph se upraví hydroxidem sodným (20) na hodnotu 7,0 ± 0,2 a doplní se v 1000ml odměrné baňce po značku vodou (14). Takto připravený roztok se sterilizuje 15 min v autoklávu při teplotě (121 ± 1) C nebo 30 min v tlakovém hrnci. Před použitím se roztok vytemperuje na laboratorní teplotu. 17 Kultivační médium (agar se žlučí, azidem sodným a eskulinem). Příprava: 17 g casein peptonu (6), 3 g meat peptonu (7), 5 g kvasničního extraktu (8), 10 g žluče (9), 5 g chloridu sodného (1), 1 g eskulinu (10), 0,5 g citronanu železitoamonného (11), 25 g azidu sodného (12) a 13,5 g agaru (13) se rozpustí ve vodě (14), upraví se ph hydroxidem sodným (20) na hodnotu 7,1 ± 0,2 a doplní se do objemu 1000 ml. Takto připravený agar se sterilizuje 15 min v autoklávu při teplotě (121 ± 1) C nebo 30 min v tlakovém hrnci. Před použitím se agar vytemperuje na laboratorní teplotu, nalije na Petriho misky přibližně po (15 20) ml a nechá se přes noc ztuhnout. Misky se mohou skladovat v lednici 2 týdny při teplotě 4 C. Před použitím se musejí vytemperovat na laboratorní teplotu. 18 Denaturovaný 70% etanol.
Národní referenční laboratoř Strana 3 19 Kyselina iminodioctová. 20 Hydroxid sodný, NaOH, 1 mol/l Příprava: 10 g hydroxidu sodného se rozpustí ve vodě (14) a doplní se vodou do 250 ml. 4 Pro stanovení probiotických bakterií rodu Enterococcus lze použít komerčně dodávaný agar se žlučí, eskulinem a azidem, který se připravuje podle návodu výrobce. 4 Přístroje a pomůcky 1 Analytické váhy. 2 Váhy s přesností 0,01 g. 3 ph metr. 4 Magnetické míchadlo. 5 Přístroj pro sterilizaci teplem autokláv nebo tlakový hrnec. 6 Horkovzdušná sušárna. 7 Termostat s teplotou udržovanou na (37 ± 1) C. 8 Vodní lázeň. 9 Vortex. 10 Sterilní laboratorní sklo lahve s uzávěrem, odměrné baňky, Erlenmeyerovy baňky, zkumavky, Petriho misky. 11 Automatické pipety s nastavitelnými objemy (100 1000) µl a špičky bez filtru. 12 Jednorázové plastové nebo sterilní skleněné hokejky. 13 Latexové rukavice bezpudrové, obalový materiál, stojánky na zkumavky, odpadní nádoby. 5 Sterilizace a dekontaminace se provádí dle charakteru materiálu buď tepelně (1 h v sušárně při 115 C až 120 C; 15 min v autoklávu při 121 C ± 1 C) nebo chemicky (např. 70% etanolem, Savem apod.).
Národní referenční laboratoř Strana 4 5 Postup 5.1 Příprava výchozího ředění Vzorky se připravují ve třech opakováních. Podle tabulky č. 1 se do Erlenmeyerových baněk navažuje vzorek a přidává se základní ředicí roztok (15). Takto připravené vzorky se míchají 5 min na míchadle nastaveném na vysokou rychlost. Poté se nechají 30 min stát a nakonec se opět míchají 2 min na míchadle nastaveném na vysokou rychlost. Tímto postupem se získá základní ředění 10-1. Tabulka č. 1. Navážky vzorku a objemy základního ředicího roztoku (15). Druh krmiva Navážka Objem základního (g) ředícího roztoku (ml) Doplňková látka, premix 20 ± 0,1 180 ± 0,1 Doplňková látka ve formě mikrogranulí 2 ± 0,1 198 ± 0,1 Kompletní krmná směs 50 ± 0,5 450 ± 1 6 U vzorků s obsahem mědi nad 200 mg/kg je třeba použít chelatinizační činidla, např. kyselinu iminodioctovou (19). 5.2 Příprava ředicí řady Ředicí řada se přizpůsobuje předpokládanému obsahu bakterií rodu Enterococcus ve vzorku. Připraví se ředicí řada zkumavek s 9 ml peptonu (16). Z připraveného základního ředění se pipetuje 1 ml do první zkumavky (získá se ředění 10-2 ). Dobře se promíchá na vortexu. Tento postup se opakuje pro další zkumavky ředicí řady. Na každé ředění se použije nová sterilní špička. 5.3 Inokulace a inkubace Pro inokulaci se vybírají dvě po sobě jdoucí ředění, a to od každého ředění dvě plotny. Agar se žlučí, eskulinem a azidem (17) inokulace roztěrem Na zaschlý povrch Petriho misky se pipetuje 0,1 ml naředěné suspenze zvoleného ředění a sterilní hokejkou se suspenze rovnoměrně rozetře po celém povrchu. Plotny se nechají zaschnout. Plotny se inkubují 24 h v převrácené poloze v aerobních podmínkách v termostatu při (37 ± 1) C.
Národní referenční laboratoř Strana 5 Poznámka 7 Agar se žlučí, eskulinem a azidem (17) inokulace zalitím Do každé Petriho misky se pipetou přenese 1 ml vzorku vhodného ředění. Toto inokulum se zalije asi 15 ml agaru (13), který byl zchlazen na (48 ± 1) C. Promíchá se krouživým pohybem pětkrát doprava a pětkrát doleva a nechá se zatuhnout. 6 Počítání kolonií a vyjádření výsledku Pro výpočet se použijí misky obsahující ne více než 15 a méně než 150 kolonií ve dvou po sobě jdoucích ředěních. Kolonie jsou lesklé, bílé, okrouhlé, neprůsvitné, vypouklého profilu a okrouhlého tvaru o velikosti (1 2) mm v průměru, hydrolyzující eskulin, tzn., že vykazují tmavě hnědé až černé zbarvení agaru v okolí kolonií. Celkový počet mikroorganismů na g vzorku se vypočte podle vztahu součet všech kolonií spočítaných na vybraných plotnách, objem inokula aplikovaného na misku v ml, počet ploten použitých pro výpočet z prvního ředění, počet ploten použitých pro výpočet z druhého ředění, faktor prvního pro výpočet použitého ředění. Výsledek se vyjádří jako celkový počet mikroorganismů na g nebo kg vzorku jako číslo (1,0 9,9) násobené 10 x, kde x je příslušná mocnina 10. 7 Literatura 1 pren 15788, Animal feeding stuffs Isolation and enumeration of Enterococcus (E. faecium) spp., CEN, 2008 2 ČSN EN 15788, Krmiva Izolace a stanovení počtu bakterií rodu Enterococcus (E. faecium), Úřad pro technickou normalizaci, metrologii a státní zkušebnictví, 2010.