CMVIgAELA Test PKS medac Enzymatický imunologický test se systémem kontroly pipetování (SKP) na průkaz protilátek IgA proti cytomegaloviru (CMV) Český!!" 0123 VPT112/PKS.150202
VÝROBCE: medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg MARKETING: medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstrasse 6 D22880 Wedel Tel.: ++49410380060 Fax: ++4941038006359 DISTRIBÚTOR / ADRESA PRO PŘÍJEM OBJEDNÁVEK: ASCOMED, spol. s r.o. Pod Cihelnou 23 161 00 Praha 6 Tel.: ++4202333135 78, 79, 80 Fax: ++4202333135 82 asco@ascomed.cz www.ascomed.cz VPT112/PKS.150202
CMVIgAELA Test PKS medac Enzymatický imunologický test se systémem kontroly pipetování (SKP) na průkaz protilátek IgA proti cytomegaloviru (CMV) Katalogové číslo: 112/PKS POUZE PRO DIAGNOSTICKÉ POUŽITÍ IN VITRO ÚVOD Cytomegalovirus (CMV) patří do skupiny lidských patogenních herpetických vírů, které obsahují dvouprovazcový genom DNA. Pro tyhle viry je typické, že po proběhnutí primární infekce mohou zůstat latentně v organizmu. V důsledku toho může za určitých podmínek dojít k reaktivaci viru. Infekce cytomegalovirem probíhají u imunokempetentních osob obyčejně nenápadně. U imunosupresivních osob (např. pacienti po transplantaci, lidé infikovaní virem HIV, tumoroví pacienti nebo novorozenci) se však pozorují závažně symptomy nejrůznějšího druhu. CMV je jeden z nejčastějších patogenů u prenatálních infekci, které mohou způsobit celou řadu vážných poruch, mezi které patří také pozdější poruchy u dětí narozených bez symptomů. Specifické protilátky IgA proti CMV byli detekovaný v sérach pacientů po transplantaci orgánů a korelovali s nálezem specifických protilátek IgM proti CMV. Protilátky IgA proti CMV mohou být z toho důvodu považovaný za markry akutních infekcií. Kombinace detekce specifických protilátek IgA proti CMV společně s průkazem antigenu a průkazem specifických protilátek IgM proti CMV vedla u pacientů po transplantaci orgánů ke zvýšení specifity diagnózy infekce CMV. VPT112/PKS.150202 1
Kromě CMVIgAELA Test PKS medac katalogové číslo: 112/PKS, na 96 stanovení nabízíme také následující produkty: CMVIgGELA Test PKS medac katalogové číslo: 116/PKS na 5 x 96 stanovení CMVIgGELA Test PKS medac katalogové číslo: 115/PKS na 96 stanovení CMVIgMELA Test PKS medac katalogové číslo: 110/PKS na 96 stanovení CMVIgGELISA PKS medac katalogové číslo: 115/Q/PKS na 96 stanovení 2 VPT112/PKS.150202
Mikrotitrační deštička je pokryta kozím IgA. Frakce IgA ze vzorek séra se váže na mikrotitrační deštičku. Protilátky proti anticmviga se vážou na peroxidázou konjugované CMV IgAELA (AG=antigen, P=peroxidáza). Inkubace se substrátem TMB (*). Reakce se zastaví přidáním kyseliny sírové. Absorbce se odčítá fotometricky. Výhody testu! Žádné nespecifické reakce a žádné falešně pozitivní výsledky způsobené revmatoidními faktory.! Nedochází k blokování protilátek IgA vysokým titrem IgG.! Systém kontroly pipetování umožňuje vizuálně sledovat každý krok pipetování, při kterém dochází ke změnábarev.! Lámatelné proužkys mikrojamkami umožňují efektivní využití testu.! Testy lze automatizovat pro otevřené zařízení ELISA. VPT112/PKS.150202 3
OBSAH SOURAVY Katalogové číslo: 112/PKS 1. Mikrotitrační deštička: 1 držák s 12 proužky a 8 jamkami (s desikantem v aluminiovém vakuovém balení), lámatelné proužky, dno tvaru písmena U, pokrytá kozími protilátkami proti IgA, BSA, a indikátorem ph, hotová k použití. 2. Negativní kontrola: 2 lahvičky s obsahem 0.75 ml, lidské sérum, modré zbarvení, hotová k použití, obsahuje fenol, ProClin 300 a gentamycin sulfát. 3. Pozitivní kontrola: 2 lahvičky s obsahem 0.75 ml, lidské sérum, hotová k použití, obsahuje fenol, ProClin 300 a gentamycin sulfát. 4. Promývací pufr: 1 lahvička s obsahem 100 ml, PBS/Tween (10x), ph 7.2 7.4,obsahuje ProClin 300. 5. Roztok na ředění vzorek: 1 lahvička s obsahem 110 ml, PBS/Tween/BSA, ph 7.2 7.4, hotový k použití, obsahuje ProClin 300. 6. CMVIgAELA (enzymem označený antigen): 2 lahvičky každá s obsahem 5.0 ml, lyofilizovaný, zbarvený žlutě, obsahuje FKS, konjugovaný HRP. 7. Substrát TMB: 1 lahvička s obsahem 10 ml, hotová k použití. 8. Roztok na zastavení reakce: 2 lahvičky s obsahem 14 ml, 0.5 M kyselina sírová (H 2 SO 4 ), hotový k použití. 1. SKLADOVÁNÍ A STABILITA MATERIÁL/REAGENT STAV SKLADOVÁNÍ STABILITA Zkušební souprava neotevřená 2...8 C do uplynutí expirace Mikrotitrační deštička otevřená 2...8 C v 6 týdnů sáčku s desikantem Kontroly otevřené 2...8 C 6 týdnů Promývací pufr zředěný 2...8 C 6 týdnů Roztok na ředění vzorek otevřený 2...8 C 6 týdnů CMVIgAELA rozpuštěný 2...8 C 5 dní 18 C* 6 týdnů Substrát TMB otevřený 2...8 C 6 týdnů Roztok na zastavení otevřený 2...8 C do uplynutí expirace reakce * Alikvotní části po rozmražení už znovu nezmrazujte! Reagenty nepoužívejte po uplynutí jejich expirace. 4 VPT112/PKS.150202
2. DALŠÍ POŽADOVANÉ REAGENTY A MATERIÁLY 2.1. Aqua ad iniectabilia (H 2 O bidest.). Použití jenom deionizované vody může negativně ovlivnit výsledek testu. 2.2. Mikropipety s odpovídajícími objemy. 2.3. Čisté skleněné banky nebo banky z umělé hmoty na ředění promývacího pufru. 2.4. Vhodné zařízení na mytí mikrotitračních deštiček (např. multikanálová pipeta nebo promývačka na ELISY). 2.5. Inkubátor pro 37 o C. 2.6. Fotometr na mikrotitrační deštičky s filtry na 450 nm a 620650 nm. 3. PŘÍPRAVA REGENTŮ Před zahájením testu je nutno ponechat všechny komponenty při pokojové teplotě, aby nedocházelo ke kondenzaci. Stanovte požadovaný počet mikrotitračních jamek. 3.1. Mikrotitrační deštička Aluminiový sáček se musí spolu s desikantem po každém otevření opět pevně uzavřít. Skladování a životnost nepoužitých mikrotitračních jamek je uvedená v tabulce číslo 1. Pokyn: Jamky mikrotitrační deštičky mají slabě zelený odstín. Rovněž se objevující zelenohnědé skvrny v jamkách jsou způsobené zpracováním deštičky a nemají negativní vliv na provedení a výsledek testu. 3.2. Promývací pufr Zmíchejte jednu objemovou část koncentrátu promývacího pufru (10 x) s devíti částmi aqua ad iniectabilia (např. 50 ml koncentrátu pufru (10 x) s 450 ml aqua ad iniectabilia). Na 8 jamek budete potřebovat 10 ml zředěného roztoku promývacího pufru. Krystaly v promývacím pufru (10 x) se musí rozpustit zahřáním (max. na 37 C) nebo promícháním při pokojové teplotě. VPT112/PKS.150202 5
3.3. CMVIgAELA Lyofilizát zřeďte s 5,0 ml Roztoku na ředění vzorků. Uzavřená lahvička se musí lehce potřást, aby se částice z uzávěru dostali do roztoku. Po rozpuštění je CMVIgAELA zbarvený žlutě a hotový k použití. Nemíchejte reagenty z různých šarží nebo od různých výrobců. Platné a reprodukovatelné výsledky obdržíte pouze tehdy, když přesně dodržíte pracovní postup testu a použijete příslušné reagenty ze zkušební soupravy. 4. VZORKY 4.1. Test je vhodný pro vzorky séra. 4.2. Před testem není potřebné provádět žádnou úpravu séra např. deaktivaci. Testované vzorky séra však nesmí být kontaminované mikroorganismami ani nesmí obsahovat červené krvinky. 4.3. Séra rozřeďte v poměru 1 : 100 Roztokem na ředění vzorek. Pro určení titru se vzorky mohou dále libovolně ředit. 5.A. PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU 5.1. Otevřete obal mikrotitrační deštičky a vyberte požadovaný počet mikrotitračních proužků (viz 3.1.). Mikrotitrační deštičky jsou připraveny k použití a nemusí se promývat. 5.2. Jamku A1 nechte prázdnou (viz 6.A.) pro určení pozadí. Do jamek na deštičce napipetujte 50 µl zředěných vzorek, negativní kontrolu a pozitivní kontrolu napipetujte dvakrát. Po napipetování se vzorky (neutrální nebo bázické kapaliny) v jamkách zbarví do modra. Když se roztok v některé jamce nezbarví, znamená to, že do ni nebyl napipetován vzorek nebo kontroly. V případě potřeby se může mikrotitrační deštička před zpracováním ponechat ve vlhké komoře maximálně 30 minut při pokojové teplotě nebo při 2 8 C maximálně po dobu 60 minut. 6 VPT112/PKS.150202
5.3. Inkubujte deštičku 60 minut (± 2 minuty) při 37 o C (± 1 o C) ve vlhké komoře nebo pod folií. 5.4. Rozpusťte CMVIgAELA (viz 3.3). 5.5. Po inkubaci promyjte každou mikrotitrační jamku třikrát 200 µl promývacího pufru. Po dobu promývaní dbejte na to, aby se jamky pořádně naplnili. Po promytí vyklepete mikrotitrační deštičku na filtračním papíru. Jamky nenechte vyschnout! Pokračujte v práci okamžitě! 5.6. Do každé jamky napipetujte (kromě A1) CMVIgAELA (zbarvený žlutě). Při manuálním zpracování testu se pipetuje do každé jamky 50 µl konjugátu. Upozornění: Při práci na automatizovaných přístrojích je potřebné naprogramovat 60 µl pro každou jamku, protože je třeba počítat s vysokým vyparováním v inkubační komoře automatů. 5.7. Znovu inkubovat 60 minut (± 2 minuty) při 37 o C (± 1 o C) ve vlhké komoře nebo pod krycí folií. 5.8. Po inkubaci promyjte mikrotitrační jamky jako v bodě (viz 5.5). 5.9. Do všech jamek (včetně A1) přidejte 50 µl substrátu TMB a inkubujte 30 minut (± 2 minuty) při teplotě 37 C (± 1 o C) ve vlhké komoře nebo pod krycí folií. Pozitivní vzorky se zbarví do modra. 5.10.Přidáním 100 µl pufru na zastavení reakce do každé jamky (včetně A1) se reakce zastaví. Modré zbarvení vzorek se změní na žluté. Před fotometrickým měřením vyčistěte ze spodu mikrotitrační deštičku a zkontrolujte, zdali v jamkách nejsou žádné bublinky vzduchu. Odečtení je nutno provádět během 15 minut po přidání roztoku na zastavení reakce. VPT112/PKS.150202 7
5.B. TABULKA ZNÁZORŇUJÍCÍ PRACOVNÍ POSTUP PŘI TESTU Prázdná jamka (A1) Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky Negativní kontrola Pozitivní kontrola Vzorky 50 µl 50 µl 50 µl Inkubujte 60 minut při teplotě 37 C, 3 x promyjte 200 µl promývacího pufru. CMVIgAELA 50/60 µl *) 50/60 µl *) 50/60 µl *) Inkubujte 60 minut při teplotě 37 C, 3 x promyjte 200 µl promývacího pufru. Substrát TMB 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Inkubujte ve tmě 30 minut při teplotě 37 C. Roztok na zastavení 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl reakce Fotometrické odečtení optické density při 450 nm (ref. vln. Délka 620 650 nm). *) manuální/automatický postup (viz 5.6) 6.A. HODNOCENÍ TESTU (VALIDITA) * Fotometrické vyhodnocení se provází při vlnové délce 450 nm (referenční vlnová délka 620 650 nm). * Od všech hodnot OD odečtěte OD pozadí (A1 jamka). * Střední hodnota OD negativní kontroly musí být < 0,100. Střední hodnota OD pozitivní kontroly musí být > 0,600. * Cutoff = Střední hodnota OD negativní kontroly + 0,140 * Šedá zóna = cutoff ± 10 %. 8 VPT112/PKS.150202
6.B. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ * Vzorky s hodnotami OD nižšími než dolní meze šedé zóny se považují za NEGATIVNÍ. * Vzorky s hodnotami OD v oblasti šedé zóny se považují za HRANIČNÍ. Tyhle séra je potřebné opět zkontrolovat po 14 dnech společně s nověodebraným vzorkem, aby se zjistil pohyb titru. * Vzorky s hodnotami OD vyššími než horní mezi šedé zóny se považují za POZITIVNÍ. * Výsledky testu je třeba interpretovat vždycky společně s klinickým obrazem pacienta a dalšími diagnostickými parametry. * Bylo sledovaných 59 potenciálně křížově reaktivních sér. Žádné z nich nebylo reaktivní v testu IgA. * Velmi vysoké hodnoty lipidů mohou v jednotlivých případech výsledky zkreslit. Vysoké hodnoty hemoglobinu a bilirubinu neovlivňují výsledky testu. 7. CHARAKTERISTICKÉ VLASTNOSTI TESTU Při diagnostické evaluaci jsme zjistili následující charakteristické vlastnosti testu. 7.A. CITLIVOST A SPECIFITA Z celkově 300 sér od dárců krve bylo testem CMVIgAELA Test PKS medac 296 sér detekovaných jako negativní. Zbývající čtyři séra tři z nich hraniční a jedno slabě pozitivní v testu IgA ukazovali všechny vysoké titry CMVIgG, jedno sérum dokonce pozitivní CMVIgM. V jiném porovnávacím referenčním testu bylo z těch samých 300 sér 284 negativních, 2 hraniční a 14 pozitivní. VPT112/PKS.150202 9
7.B. CITLIVOST Z celkově 105 sér, které byli uvedeným referenčním testem určené jako CMVIgA pozitivní, detekoval test CMVIgAELA PKS medac 101 sér jako pozitivní, 2 jako hraniční a 2 jako negativní. To odpovědá relativní citlivosti 96,2%. 7.C. PŘESNOST Vzorky Variace intraassay (n = 24) Vzorky Variace interassay (n=11) střední OD S VK (%) střední OD S VK (%) NK 0,047 0,007 14 NK 0,044 0,005 12 SP 0,341 0,014 4 SP 0,276 0,034 12 PK 1,601 0,047 3 PK 1,391 0,119 9 Č. 1 0,047 0,009 12 Č. 1 0,052 0,008 16 Č. 2 0,223 0,010 5 Č. 2 0,201 0,020 10 Č. 3 2,473 0,052 2 Č. 3 2,184 0,187 9 NK = negativní kontrola; SP = slabě pozitivní kontrola (není obsáhnutá v soupravě); PK = pozitivní kontrola VŠEOBECNÉ RADY TÝKAJÍCI SE MANIPULACE * Aby jste předešli vzájemné kontaminaci jednotlivých reagentů, nezaměňujte lahvičky a jejich šroubové uzávěry. * Reagenty je potřebné ihned po použití uzavřít, aby nedošlo k jejich vyparování a mikrobiální kontaminaci. * Po skončení testu se musí reagenty uložit tak, jak je uvedené v pokynech, aby se zachovala jejich garantovaná životnost. * Abyste předešli záměně reagentů různých testovacích systémů nebo šarží, musí se všechny komponenty jednoho setu po použití skladovat spolu v původním balení (viz také 3.). INFORMACE TÝKAJÍCI SE BEZPEČNOSTI A OCHRANY ZDRAVÍ * Je nevyhnutné dodržovat místní předpisy týkající se bezpečnosti práce. * Reagenty lidského původu použité při výrobě tyhle soupravy byli testované a bylo zjištěno, že nejsou infikované HBsAg, HIV 1/2 a HCV. Přece důrazně doporučujeme, aby všechen zvířecí materiál byl při manipulaci považován za možný zdroj nákazy a podle toho se přijali příslušná bezpečnostní opatření. 10 VPT112/PKS.150202
RADY TÝKAJÍCÍ SE LIKVIDACIE Zbytky chemikálií a preparátů jsou všeobecně považované za speciální odpad. Likvidace tohoto druhu odpadu se řídí národními a regionálními zákony a předpisy. Obraťte se na orgány místní správy nebo na organizace zabývající se odpady, které vám podají informace, jak tyhle nebezpečné odpady likvidovat. VPT112/PKS.150202 11
LITERATURA Braun, W., Hehr, B., Rabenau, H., Doerr, H. W.: Serologische Diagnostik der Zytomegalie bei immunsupprimierten Patienten. AIDS Forschung (AIFO), sešit 11, 634638, (1987). Braun, W., Weber, B., Moell, U., Hamann, A. and Doerr, H. W.: Immunoglobulin A a M patterns to human cytomegalovirus during recurrent infection in patients with AIDS using a modified Western blot. J. Virological Methods, č. 43, 6567, (1993). Delacroix, D. L.: The human immunoglobulin A system, its vascular cempartment. Thesis European Medical Press, (1985). Doerr, H. W., Rentschler, M., Schleifer, G.: Serologic detection of active infections with human herpes viruses (CMV, EBV, HSV, VZV): diagnostic potential of IgA class and IgG subclassspecific antibodies. Infection č. 15, 9398, (1987). Engelhard, D., Weinberg, M., Or, R., Shaked, O., Naparstek, E., Haikin, H., Slavin, S., Sarov, I.: Immunoglobulins A, G a M to cytomegalovirus during recurrent infection of recipients of allogenic bone marrow transplantation. Journal Infect. Disease, č. 163, 628630, (1991). Levy, E., Margalith, M., Sarov, B., Sarov, I., Rinaldo, C. R., Detels, R., Phair, J., Kaslow, R., Ginzburg H. and Saah, A. J.: Cytomegalovirus IgG and IgA serum antibodies in a study of HIV infection and HIV related diseases in hemosexual men. J. Med. Virol., č. 35, 174179, (1991). Linde, G. A., Hammarström, L., Persson, M. A. et. al., Virusspecific antibody activity of different subclasses of immunoglobulins G a A in cytomegalovirus infections. Infect. Immun., Nr. 42, 237244, (1983). Merlino, C., Angeretti, A., Segoloni, G. P., Giacchino, F., Rossetti, M. and Negro Ponzi, A.: CMVspecific polymeric and monemeric IgA antibodies in serum of renal transplant patients. Panminerva Med., sv. 33, č. 4, 173179, (1991). Nielsen, L. N., Sorensen, I., Andersen, H.K.: Kinetics of specific immunoglobulins M, E, A and G in congenital primary and secondary cytomegalovirus infection studied by antibodycaptured enzymelinked immunosorbent assay. J. Clin. Microbiol., č. 26, 654661, (1988). 12 VPT112/PKS.150202
Porath, A., Hanuka, N., Keynam, A. and Sarov, I.: Virusspecific IgG, IgM a IgA antibodies in cytomegalovirus mononucleosis patients as determined by immunoblotting technique. J. Med. Virol., č. 22, 223 230, (1987). Rautenberg, P., Fischer, L., Tönnies, R., Franke, D.: Evaluation of a novel immunoglobulin A capture enzyme immunoassay for diagnosis of cytemegalovirus infection in renal and heart transplant recipients. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 16, 653659, (1997). Sarov I., SinqueiraLinhares, M., Chardonnet, Y., Levy, E., Aymard, M., Bosshard, S., Nord, E., Revillard, J.P.: Detection of specific IgA antibodies in serum of kidney transplant patients with recurrent cytomegalovirus infection. Intervirology, č. 15, 228234, (1981). Sarov, I., Haikin, H.: Human cytomegalovirus specific IgA antibodies detected by immunoperoxidase assay in serum of patients with cytomegalovirus infections. J. Virological Methods, č. 6, 161169, (1983). Strand, O. A., Hoddewick, G. M.: The diagnostic significance of specific serum IgA detection in cytemegalovirus infections. Arch. Virol., č. 82, 173180, (1984). Tönnies, R., Flik, J., Franke, D., Metzger, C., Daiminger, A., Bäder, U. and Enders, G.: Comparison of three methods used to differentiate between primary and recurrent or longterm human cytemegalovirus infections in pregnant women. Poster presented at the 6th International Cytomegalovirus Workshop, Orange Beach, AL, USA, (1997). Torfason, E.G., Källänder C. and Halonen, P.: Solidphase radioimmunoassay of serum IgG, IgM a IgA antibody to cytemegalovirus. J. Med. Virol., č. 7, 8596, (1981). Weber, B., Hamann, A., Ritt, B., Rabenau, H., Braun, W., and Doerr, H.W.: Comparison of shell viral culture and serology for the diagnosis of human cytomegalovirus infection in neonates and immunocompremised subjects. Clin. Investig. č. 70, 503507, (1992). Weber, B., Klinghardt, U., Lux, A., Braun, W., Rabenau H. and Doerr, H. W.: Detection of neutralizing antibodies against human cytomegalovirus: influence of strain variation. J. Med. Virol., č. 40, 2834, (1993). VPT112/PKS.150202 13