Úvod k biochemickému praktiku (kruh 3,9) Michal Koc

Úvod k biochemickému praktiku (kruh 3,9) Michal Koc

Vyučující za biochemii Ing. Michaela Šiklová, Ph.D (primárně kruh 3) RNDr, Michal Koc, Ph.d (primárně kruh 9) dveře č.211

literatura zápočty a zkouška organizace praktik pravidla bezpečné práce v laboratoři laboratorní vybavení práce s automatickou pipetou návody: viz. aplikace Výuka

Doporučená literatura biochemie BIOCHEMIE Murray R. K. a kol.: Harperova ilustrovaná biochemie (Galén 2013) ISBN 978-80-7262-907-7 Jan Koolman, Klaus-Heinrich Röhm: Barevný atlas biochemie, (Grada, Praha 2012), ISBN 978-80- 247-2977-0 Murray R. K. a kol.: Harperova biochemie (2002) ISBN 80-7319-013-3 Matouš Bohuslav et al: Základy lékařské chemie a biochemie (Galén 2010) ISBN 978-80-7262-702-8 František Duška, Jan Trnka: Biochemie v souvislostech - Díl I - Základy energetického metabolizmu (Karolinum 2006) ISBN 80-246-1116-3 Miroslav Ledvina, Alena Stoklasová, Jaroslav Cerman: Biochemie pro studující medicíny I. a II. díl (Karolinum 2004) ISBN 80-246-0851-0 Kodíček M.: Biochemické pojmy výkladový slovník (VŠCHT Praha 2004) ISBN 80-7080-551-X dostupné na http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/ Masopust J.: Patobiochemie buňky, dostupné na http://dotdiag.cz/img/prednasky/bunka.pdf Champe P. C.; Harvey R. A.: Lippincott s Illustrated Reviews - Biochemistry, ISBN 0-397-51091-8 Koolman J.; Röhm K.-H.: Color Atlas of Biochemistry, Thieme, Stuttgard, 1996, ISBN 3-13- 100371-5 Salway J. G.: Metabolism at a Glance, 2nd ed., Blackwell Science Ltd, 1999, ISBN 0-632-05274-0 Devlin T. M. et al.: Textbook of Biochemistry With Clinical Correlations, 4th ed., ISBN 0-471- 15451-2

Modul Buněčné základy medicíny Obsahuje 6 tematických kurzů Po každém kurzu se píše průběžný test Biochemie, Molekulární biologie, Histologie, Genetika, Imunologie Přednášky (P), semináře (S), cvičení (C) Za biochemii: Povinné: C, S (klinické detektivky) Nepovinné: P, S

zápočty a zkouška (kruh 3,9) Průběžný test (termíny zimní semestr) 7.11.2016 (8-9:30) struktura- Syllab. p. 12.12.2016 (8-9:30) energie- Syllab. p. 23.1.2017 (8-10) signály- Syllab. p. OPRAVNÝ souhrný test Nutnost přihlásit se přes SIS 6.2.2016 (9-11:30) (struktura, energie, signál)- Jonáš. p. - Další 2 pokusy (červen a září)

zápočty a zkouška (kruh 3,9) Průběžný test pouze 1 pokus Minimum 60%, nad 60% dostáváte body Max. 5 bodů za jeden test Ze 3 testů za semestr minimálně 6 bodů Body se dále přičítají k bodům u zkoušky! OPRAVNÝ souhrný test (celkem 3 pokusy) 6.2.2016 (9-11:30) (struktura, energie, signál)- Jonáš. p.

zápočty a zkouška (kruh 3,9) Zkouška (červen-září) písemný test ze všech šesti kurzů modulu. úspěšné složení zkoušky = minimálně 60 % bodů z otázek každého kurzu a současně minimálně 70% z celkového počtu bodů za celý test. K bodovému hodnocení celého testu budou připočteny body za testy průběžné.

organizace praktik pravidla bezpečné práce v laboratoři laboratorní vybavení práce s automatickou pipetou návody: viz. aplikace Výuka

4 úlohy / 4 týdny / 8 pracovních stolů - rozdělení kroužku do 8 pracovních skupin - 1. SPEKTROFOTOMETRIE - B1 2. CHROMATOGRAFIE - B2 3. TITRACE - B3 4. POTENCIOMETRIE - B4

automatická pipeta

Postup pipetování

Témata laboratorních úloh 1. SPEKTROFOTOMETRIE 2. CHROMATOGRAFIE 3. TITRACE 4. POTENCIOMETRIE

PRINCIP spektrofotometrie interakce mezi stanovovaným analytem a monochromatickým zářením část záření je absorbována stanovovanou látkou, zbývající záření je detekováno detektorem množství absorbovaného záření je přímo úměrné množství analyzované látky

spektrofotometr

Spektrofotometrie v praktickém cvičení Stanovení koncentrace kreatininu v moči analyzovaný vzorek: vlastní moč 1. bezbarvý kreatinin je převeden na barevný produkt chemickou reakcí 2. koncentrace kreatininu ve vzorku se zjišťuje z naměřené absorbance pomocí kalibrační křivky

Výpočty v praktiku příprava kalibračních roztoků ze zásobního standardního roztoku (ředění) naředění vzorku moči přepočet hmotnostní koncentrace na molární

Zjištění koncentrace: 1. Lambert-Beerův zákon 2. Kalibrační křivka 3. Výpočet pomocí hodnot (A, c) standardních vzorků

Zjištění koncentrace: Lambert-Beerův zákon A = l c x x nebo T = 10 - ( x l x c) A = absorbance (A = -log T) T = transmitance (T = 10 -A ) = molární absorpční ( extinkční ) koeficient l = tloušťka kyvety (v cm), c = molární koncentrace

3 a více standardů zpracovaných stejnou metodou Kalibrační křivka lineární kalibrační křivka A = x l x c y = kx + q

Příklady k procvičení 1) standard: A = 0,600, c = 15,0 mm vzorek: A = 0,200, c =? 2) standard: T = 0,30 vzorek: T = 0,60 Je c vz nižší nebo vyšší než c st? 3) c 1 = 0,1 mm c 2 = 0,01 mm Kolikrát byl vzorek naředěn? 4) vzorek o c = 0,2 mm byl naředěn 100x Jaká je jeho koncentrace po naředění?

Domácí úkol 1) A vz = 0,25 C vz =? A st = 0,40 C st = 4mg / L [2,5mg/L] 2) standard glukózy: C s = 1000mg/L, T = 0,49. neznámý vzorek: T = 0,55, C vz =? (v mg/l i mmol/l) MW = 180g/mol [839mg/L = 4,7mM ] 3) standard proteinů: T = 0,33; vzorek pacienta: T = 0,44 Porovnejte koncentraci proteinů ve vzorku pacienta se standardem. [4/3]

PRINCIP chromatografie Separace směsi různých látek je založena na rozdílné distribuci látek mezi dvě nemísitelné fáze: stacionární fáze (pevná nebo kapalná) mobilní fáze (kapalná nebo plynná) Mobilní fáze unáší jednotlivé vzorky skrz stacionární fázi rozdílnou rychlostí v závislosti na jejich afinitě k fázím.

Chromatografie v praktickém cvičení TLC lipofilních barviv = adsorpční planární kapalinová chromatografie mobilní fáze: toluen (nepolární) stacionární fáze: destička se silikagelem (polární) stadardy barviv porovnání R f neznámý vzorek: obsahuje 2 různá barviva

TLC chromatografie = úkol v praktiku

Demonstrace HPLC a GC HPLC = High Performance Liquid Chromatography (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) normální nebo reverzní fáze princip (vysokoúčinná, vysokotlaká chromatogr.) GC = Gas Chromatography (plynová chromatografie)

Vyhodnocení chromatogramu 1) planární chromatografie (př. TLC) Porovnání skvrn se standardy: R f = a /b R f = retardační faktor ( rate of flow ) a = vzdálenost start-střed skvrny b = vzdálenost start-čelo mobilní f. b a Obrázek převzat z http://sms.kaist.ac.kr/~jhkwak/gc/catofp/chromato/tlc/tlc.htm (listopad 2006)

PRINCIP odměrné analýzy K analyzované látce se pomocí byrety postupně přidává roztok o známé koncentraci, a to tak dlouho, dokud není dosaženo stechiometrického poměru reagujících látek (= bod ekvivalence) bod ekvivalence = reagující látky jsou ve stechiometrickém poměru daném chemickou rovnicí popisující probíhající reakci

Metoda založená na chemické reakci mezi analyzovanou látkou a tzv. odměrným roztokem titrace = zjištění přesné koncentrace vzorku byreta s odměrným roztokem titrační baňka s naředěným analyzovaným vzorkem

Titrace v praktickém cvičení Stanovení acidity žaludeční šťávy reaguje HCl ze žaludeční šťávy odměrný roztok: NaOH neutralizační titrace (= alkalimetrie) indikátor: fenolftalein (bezbarvý fialový) z konc. HCl se vypočítá ph žaludeční šťávy zjišťuje se ph před a po stimulaci (= na lačno a po jídle )

Výpočty v praktiku výpočet látkového množství NaOH spotřebovaného při titraci zjištění látkového množství HCl v celém objemu vzorku výpočet hodnot BAO a MAO výpočet ph žaludeční šťávy z látkového množství HCl a celkového objemu odebrané žaludeční šťávy (před a po stimulaci)

PRINCIP potenciometrie elektrochemická metoda založená na měření napětí elektrochemického článku za bezproudého stavu dvě elektrody: indikační (měřící) elektroda referentní (srovnávací) elektroda

Potenciometrie v praktickém cvičení Měření ph fosfátového pufru roztoky fosfátového pufru o různém složení stanovení ph pomocí ph-metru (= upravený potenciometr) kalibrace přístroje pomocí standardů skleněná kombinovaná elektroda ( dvojče )

Skleněná kombinovaná elektroda plnicí otvor vnější refeferentní elektroda stínění přívod k vnější ref.elektrodě vnitřní vodič přívod k vnitřní ref.elektrodě solný můstek (keramická frita) skleněná membrána vnitřní referentní elektroda

PUFRY (tlumivé, ústojné roztoky, nárazníky) = systémy schopné vyrovnávat výkyvy ph: po přidání silné kyseliny nebo báze změní své ph jen nepatrně používají se k udržování stabilní hodnoty ph složení pufrů: konjugovaný pár: kyselina / zásada * slabá kyselina + její sůl * slabá zásada + její sůl * 2 různé soli vícesytné kyseliny * amfoterní látky (např. proteiny)

Henderson-Hasselbalchova rovnice ph = pk a + log (c s / c a ) (pro kyselý pufr ) poh = pk b + log (c s / c b ) (pro bazický pufr) ph = 14 - poh pk = disociační konstanta slabé kyseliny (pk a ) nebo báze (pk b ) c s = aktuální koncentrace soli v pufru c a = aktuální koncentrace slabé kyseliny v pufru c b = aktuální koncentrace slabé báze v pufru c = c x V c = koncentrace před smícháním složek pufru V = objem jednotlivé složky (kys., báze nebo soli)

Výpočty v praktiku výpočet ph všech připravených roztoků ph = pk(h 2 PO 4- ) + log c(hpo 2-4 ) / c(h 2 PO 4- ) ph = pk a + log n(hpo 2-4 ) / n(h 2 PO 4- ) ph = pk a + log (c s x V s ) / (c a x V a ) c = n/v n = n = c x V s = HPO 4 2- a = H 2 PO 4 - (V = objem pufru, v němž jsou přítomna látková množství n s a n a ) výpočet změny ph pufrů po přidání kyseliny

Domácí úkol 1) spotřeba odměrného roztoku: 23,8 ml NaOH, (f = 0,9685; C = 0,1M), vzorek = 10ml H 2 SO 4 ; C =? [0,12M] 2) spotřeba odměrného roztoku: 10ml KMnO 4 (0,1M), vzorek: 20ml FeSO 4 ; C =? (mol/ L, % ), MW = 152g [0,25M = 3,8% ] 3) H 3 PO 4 Na 2 HPO 4 vzorek: 20ml H 3 PO 4 (C = 0,3M ), odměrný roztok: 0,2M NaOH V =? [60ml]