d stavebních bloků k polymerům života aneb prebiotická evoluce Vladimír Kopecký Jr. Fyzikální ústav niverzity Karlovy v Praze ddělení fyziky biomolekul http:// //atrey.karlin.mff.cuni.cz/~ofb/kopecky.html kopecky@karlov karlov.mff.cuni.czcz Evoluce jak ji známe entrální dogma molekulární biologie 1865 regor Mendel postuluje zákony genetiky 1940 jeden gen jeden enzym (eorge Beadle & Edward Tatum) 1958 Francis rick formuluje ústřední dogma molekulární biologie 1961 aminokyseliny specifikovány třípísmennými kodony (Sidney Brener & Francis rick & eorge amow) 1961 rozluštění prvního kódu (M. irenberg & H. H Matthaei) 1966 finální rozluštění genetického kódu R Transkripce D Replikace Translace??? Protein Počátky života Scénáře vzniku života Proteiny, nikoli nukleové kyseliny koacerváty semipermeabilní membrány, parin (1924) mikrosféry protenoidy (shluky aminokyselin), Fox ukleové kyseliny, nikoli proteiny genová hypotéza ribozymy,, koenzymy, možná afinita k protenoidům (1986) Koexistence proteinů a nukleových kyselin hypercykly teoretický model autoreplikujících se systémů, Eigen (1960) Úplně jiný základ anorganické jíly silikátové shluky, možnost katalýzy, airns-smith (1980) K translace Enzym K translace Vznik proteinů v živých organismech Enzym translace K Enzym translace K Enzym Vznik peptidů Vznik peptidů minokyseliny mohou začít vytvářet peptidy za aktivace v podmínkách horkých vodných roztoků za přítomnosti koloidního (Fe,i)S (Fe,i)S hydrolýza močoviny může být evolučním předchůdcem enzymu i- ureázy Podporuje chemoautotrofní vznik života s primitivním (Fe,i)S metabolismem Schéma -řízeného peptidového cyklu. ) aminokyselina, B) anhydrid -carboxy amonokyseliny, ) série -carboamoyl peptidů, D) série aminokyselin, tj. peptid, E) racemické deriváty hydantoinu, F) deriváty močoviny. Huber et al., Science 301 (2003) 938 940. 940. Karbonyl sulfid (S), jednoduchý sopečný plyn, katalyzuje reakce vedoucí ke vzniku polypeptidů ve vodných roztocích Reakce probíhá za pokojové teploty s výtěžností 80 % v řádu minut až hodin Přítomnost kovových iontů (ve formě metlosulfidů), oxidačních ( 2 ) a alkylačních (K 3 Fe() 6 ) činidel dramaticky urychluje reakci a zvyšuje její účinnost L. Leman et al., Science 306 (2004) 283 286. 286.
Samosereplikující peptid 32-mer α-helix (coiled-coil) podobný leucinovému zipu autokatalyzuje ve vodném prostředí vznik svého obrazu složením 15- (nukleofilní fragment) ) a 17-meru (elektrofilní fragment) Samosereplikující peptid Elektrofilní fragment atakuje prostřednictvím thiobenzyl esteru SBn terminální SH amino skupinu nukleofilního fragmentu Vznikne cystein thioester intermediát,, který se přemění na termodynamicky favorizovanou peptidovou vazbu a spojí oba fragmenty Katalytická cesta může probíhat: ) prostřednictvím ternárního komplexu B), ) za vzniku binárních komplexů (nízká výtěžnost, problémy s agregací) D) přímou interakcí obou fragmentů, což je v porovnání s autokatalýzu proces s malou výtěžností D. H. Lee et al., ature 382 (1996) 525 528. 528. D. H. Lee et al., ature 382 (1996) 525 528. 528. hirální selektivita hirální selektivita Schématické znázornění chiroselektivních replikačních cyklů Homochirální peptidy T DD a T LL jsou produkovány autokatalýzou Heterochirální (T DL a T LD ) peptidy vznikají nekatalyzovanou kondenzací nukleofilního () a elektrofilního (E) peptidu Teplátem řízená ligace homochirálních fragmentů vede k aplifikaci homochirální produktů obecně. Sagatelian et al., ature 409 (2001) 797 801. Stupeň formování produktu v závislosti na čase Produkce homochirálních produktů (T LL a T DD ) plná kolečka,, a heterochirálních produktů (T LD a T DL ) prázdná kolečka,, je ukázána jako funkce času pro roztok obsahující 100 µm koncentraci L, D, E D a E L Spodní křivka (trojúhelníky, křížky, resp.) je kontrola v přítomnosti 3M ndhl. Sagatelian et al., ature 409 (2001) 797 801. hirální selektivita. Sagatelian et al., ature 409 (2001) 797 801. Peptidové nukleové kyseliny (P) Formování coiled-coil struktury a odpovídající HPL retenční časy Příkrá disproporce ukazuje, že vznik coiled- coil helikální struktury je přísně chiroselektivní Stejné mechanismy vedly ke vzniku homochirálního života na Zemi Kostra P je tvořena polymerem -(2 (2- aminoethyl)gylcinem (E) E může snadno nahradit nestabilní cukry P se váží na D formujíce dvoj- či trojšroubovice příbuzné Watson-rickově helixu P mohou být prekurzorem světa R P mají terapeutické využití v antisense strategii a genetické diagnostice K.. anesh and P. E. ielsen, urrent rg. hem.. 4 (2000) 931 943. 943.
Peptidové nukleové kyseliny (P) V P je oproti R nahrazena kostra z ribózy a fosfátu -(2-aminoethyl) glycinem (E) Báze nukleových kyselin jsou připojeny k E pomocí karboxylové skupiny Syntéza P musí probíhat odlišně od proteinů a nukleových kyselin (ale s podobnými stupni reakcí) Peptidové nukleové kyseliny (P) Reakce vedoucí ke vzniku kostry P, tj. k E V prvním kroku vzniká z H a H 4 kyselina 2,3- diaminopropionová a ethylendiamin (probíhá za teplot 80 100, v řádech desítek hod.). Jako boční produkt vzniká kyanogen. Ethylendiamin může dále reagovat standardní Steckerovou reakcí za vzniku E K. E. elson at al., Proc. atl. cad. Sci.. S 97 (2000) 3868 3871. 3871. K. E. elson at al., Proc. atl. cad. Sci.. 97 (2000) 3868 3871. 3871. Peptidové nukleové kyseliny (P) Předcházely proteiny vznik D? Vznik pyrimidin- 1 -karboxylové kyseliny z kyseliny hydantoinové a kyanoacetaldehydu Vznik purin- 9 -karboxylové kyseliny z H a glycinu K. E. elson at al., Proc. atl. cad. Sci.. 97 (2000) 3868 3871. 3871. R obsahuje ribonukleotidy, D deoxyribonukleotidy potřeba tvorby deoxyribonukleotidů Tvorby se neúčastn astní R, ale pouze enzym ribonukleotid reduktáza (RR) kazuje se, že e RR je ve všech v organizmech vysoce konzervována na (podařilo se prokázat pro vzdálen lené třídy ) RR I a B) RR I) Proteiny musely být minimáln lně součást stí světa R a předchp edcházet vzniku D S. J. Freeland at al., Science 286 (1999) 690 692. 692. ukleové kyseliny Struktura nukleových kyselin 1953 objev struktury D (J. Watson,, F. rick obelova cena spolu s M. Wilkinsnem 1962, podíl patří i R. Franklinové) 1958 semikonzervativní replikace D (Messelson, Stahl) D a R jsou polymorfní molekuly Pravotočivá, B Levotočivá Z Vlásenková Triplex -kvadruplex 5'-konec H 2 syn H H 2 H H H - 2 P H 2 H - P H 2 H Směr řetězce H H 2 - P H 2 anti H - P - 3'-konec ukleové kyseliny Replikace D
Biochemické epochy světa Biochemické epochy R světa Časová škála událostí na ranné Zemi. dáno v y před současností. Vyznačení událostí je přibližné a R svět je třeba posunout hlouběji do minulosti.. F. Joyce, ature 418 (2002) 214 M. P. Robertson and. D. Ellington, ature 395 (1998) 223 225. 225. lternativní systémy k R lternativní systémy k R Změť molekul jež byly k dispozici pro tvorbu R světa. Rozdílné barvy udávají čtyři základní komponenty potřebné pro tvorbu R. Seznam možných analogů je udán pod základní složkou. nalogy lze prakticky libovolně kombinovat do funkčních celků, sic!. F. Joyce, ature 418 (2002) 214 Možní kandidáti na předchůdce R v ranné historii Země. a) threosová nukleová kyselina, b) peptidová nukleová kyselina, c) analog nukleové kyseliny odvozený od glycerolu, d) pyranosyl R. B značí nukleotidovou bázi.. F. Joyce, ature 418 (2002) 214 lternativní systémy k R První kroky k replikaci Vzhledem k nestabilitě ribosy je vhodné nahradit cukr za jiný,, např. pyranosu (6) či furanosu (5) T a jiné cukerné modifikace vykazují podobné hybridizační vlastnosti jako R či D a vytváří s nimi i heteroduplexy (viz. teploty tání udané v tabulce), většinou mají větší strukturní flexibilitu minerálně katalyzovaná polymerizace přímé kopírování oddělení vláken vlákna se oddělují a opakovaně se kopírují katalytická R kopíruje vlákna K.-. Schöning et al., Science 290 (2000) 1347 1351. 1351. L. E. rgel, Sci. m., o. 10 (1994) 53 61.
Kdo je rybozym? R molekula má klíčové postavení v centrálním dogmatu molekulární biologie R s katalytickou funkcí se nazývá ribozym Ribozymy vytvářely primitivní svět života Existovaly R organismy, ale evoluční stopy byly již zahlazeny vzpomínka na R svět ale zůstala Struktura vlásenkového ribozymu.. Důležité nukleotidy účastnící se sestřihu jsou zvýrazněny. (Protein je kokrystalizován.) o všechno umí R? R má stále informační, autokatalytickou a katalytickou funkci (na rozdíl od D) Syntézy telomer telomerová R Přenosu genetické informace mr Přenosu aminokyselin tr Syntézy bílkovin rr Hydrolýzy prekurzorů R Rase P Samosestřihu intronů J.. Doudna & T. R. zech, ature 418 (2002) 222 228. 228. J.. Doudna & T. R. zech, ature 418 (2002) 222 228. 228. Viděl někdo rybozym? Thomas ech (obelova cena 1989) objevil samosestřižnost intronů u prvoka Tetrahymena termophyla v roce 1982 skupiny I je sestřih katalyzován TP skupiny je sestřih veden přes 2-2 hydroxylovou skupinu R katalyzovaný samosestřih skupiny provádí např tzv. hammerhead ribozym Evoluce ribozymů polymeráz In vitro evoluce ribozymu R polymerázy. a) ribozym katalyzuje templátem řízené připojení 3 -konce 3 R primeru k 5 -konci 5 ribozymu, b) katalyzuje připojení ppp na 3 -konec 3 R primeru (urychlení ~10 9 ), c) katalyzuje připojení 14 TP k externímu R templátu. J.. Doudna & T. R. zech, ature 418 (2002) 222 228. 228.. F. Joyce, ature 418 (2002) 214 Evoluce ribozymů polymeráz Ribozymy lze vyvíjet uměle in vitro Předchozí fáze jsou známy pro ribozym ligázu třídy I Fáze a) je ~120-mer,, pracující rychlostí 100 reakcí/min Fáze c) je ~200-mer,, který připojí 14 nukleotidů za 24 hod., s přesností 97 % Přesnost kopírování musí být lepší než 1/délka sekvence,, tj. pro 100-mer 99%, pro 40-mer 97,5% - takové ribozymi nejsou dosud známy Pouze malá část variant R má katalytickou funkci! Pro R o délce 100 nukleotidů vychází 4 100 možných sekvencí seskupení všech takových R má hmotnost ca. 10 13 větší než Země Pro R o délce 40 nukleotidů vychází hmotnost ca. 40 kg. F. Joyce, ature 418 (2002) 214 Metabolické funkce Hypotetická cesta R-katalyzované syntézy R a) aldolová kondenzace glyceraldehydu a glykolaldehydu vedoucí k riose b) přenos karbamoylu z karbamoyl fosfátu na aspartát a cyklizace formující pyrimidin c) pentamerizace H za vniku purinu d) vytvoření nukleosidu e) fosforylace (minerální zdroj) nukleosidu na nukleotid f) aktivace nukleotidu TP g) připojení nukleotidu na 3 -konec 3 R primeru h) prodlužování R (DP je recyklováno v kroku e). F. Joyce, ature 418 (2002) 214
Metabolické funkce Jak se staví protein Hypotetická cesta R-katalyzované syntézy proteinů a) aktivace aminokyseliny formování aminoacyl-nukleotid nukleotid anhydridu b) přenos aktivované aminokyseliny na 2 2 (3 )- konec tr (aminokyselina může snadno migrovat mezi oběma pozicemi) c) přenospeptidu vedoucí k formování dipeptidu.. Dvě aminoacyl-tr jsou blízko u sebe vázány na komplementárním tmplátu d) postupné opakovaní cyklu vede k formování polypeptidu. F. Joyce, ature 418 (2002) 214 Pravděpodobnost inkorporace chybné aminokyseliny je 10-4 na kodon Protein o velikosti 40 kda je syntetizován za ca. 10 sekund K čemu je dobrá tr Standardní sada 20 aminokyselin? 21 aminokyselinou je selenocystein (přítomna od rchae po savce) 22 aminokyselinou je pyrrolysine (z r. 2002 výskyt v rchae a Eubacteria) polární hydrofobní nabité aromatické První pozice Fenylalanin Leucin Izoleucin Metionin Valin Serin Prolin Treonin lanin Tyrosin STP Histidin lutamin sparagin Lysin Kys. asparag. Kys. glutam. ystein STP Tryptofan rginin Serin rginin lycin Třetí pozice Je genetický kód univerzální? Standardní kód je velmi rozšířený, ale ne zcela univerzální! enetický kód mitochondrií a některých nálevníků se liší (objev na základě sekvenačních studií D v roce 1981) V nálevnících specifikují kodony a kyselinu glutamovou a nikoliv Stop Mitochondrie Standardní kód Savčí Pekařské kvasinky eurospora crassa Drosophila Prvoci Rostliny Stop Ile Leu rg rg Trp Met Stop Trp Met Thr? Trp? Trp Met Ser Trp Trp
Vznik a vývoj genetického kódu Znázornění biochemických drah syntéz aminokyselin minoacyl-tr synthetasy (aarss)) se podílí na připojení aminokyselin na tr (dělí se na I bíle a třídu - šedě) Vývoj kódu je závislý na Biosyntetické dráze aminokyseliny Relativním obsahu v kodonu Příslušnosti k třídě aarss První kód obsahoval la, ly, Ser, sp, lu,, (Val) důležité při tvorbě β-sheetu L. Klipcan and M. Safro,, J. Theor. Biol.. 228 (2004) 389 396. 396. Vznik a vývoj genetického kódu minkys. Třída, kodon,, kodon,,, kodon o. reakcí ly, 1 la, 1 Prům.. 3,2 Pro, 3 rg I, 8 sp 1 sn 1 Thr, R 5 Ser 3 Prům.. 3,8 His 10 Lys +I R 9 lu I R 1 ln I R 2 Phe Y 10 Tyr I Y 10 Trp I 13 Ile I, Y 5 Prům.. 7,3 Leu I R, 8 Val I 4 Met I 7 ys I Y 2 L. Klipcan and M. Safro,, J. Theor. Biol.. 228 (2004) 389 396. 396. Prvotní kód obsahoval pouze sekvenci a aminokyseliny důležité při fixaci amoniaku Šipky označují biosyntetické dráhy F T značí průměrnou přenosovou energii, tj. míru hydrofobicity B. K. Davis, Prog. Biophys.. Mol. Biol.. 72 (1999) 157 243. B. K. Davis, Prog. Biophys.. Mol. Biol.. 72 (1999) 157 243. B. K. Davis, Prog. Biophys.. Mol. Biol.. 72 (1999) 157 243. Prvotní kód byl postupně doplňován v závislosti na složitosti syntézy a potřebných vlastnostech Přibyly basické aminokyseliny Jako poslední byly doplněny aminokyseliny s aromatickým postranním řetězcem Šipky označují biosyntetické dráhy F T značí průměrnou přenosovou energii, tj. míru hydrofobicity B. K. Davis, Prog. Biophys.. Mol. Biol.. 72 (1999) 157 243.
D jak ji neznáme Modifikace genetického kódu a aminokyselin Expandovaný genetický kód tr kódující jistou sekvenci je přiřazena nová aminokyselina Inkorporují se modifikace pro biotechnologie v bakteriích i eukaryotech (např. o-methylo methyl- Tyr,, p-benzoylp benzoyl-phe,, p-iodop iodo-tyr) Modifikovaný genetický kód Ke kódu jsou přiřazeny nové vzájemně komplementární báze Počet písmen se tak rozšíří a dále je možno pokračovat via expandovaný genetický kód epřirozené párování x-y x y a x-s, x a v důsledku stérického bránění nerozpoznávaná spojení x-t x T a s-ts B. K.Davis Davis, Prog. Biophys.. Mol. Biol.. 72 (1999) 157 243. I. Hirao et al. ature Biotech.. 20 (2002) 177 182. 182. J. W. hin et al.. Science 301 (2003) 964 967. 967. D jak ji neznáme Je kód zvolen optimálně? D jak ji neznáme Expandovaná D a základě teorie informace (donor = 1, akceptor = 0, purin = 0, pyrimidin = 1) lze ukázat, že volba T T a je optimální s ohledem na informační šum áhrada za T je v D nezbytná přechází v deaminací,, tato změna je nerozlišitelná Tedy R musela předcházet D H 2 H cytosine H H uracil Modifikované báze vznikají přidáním jednoho aromatického kruhu navíc Báze si zachovávají své vlastnosti Expandovaná D je mnohem stabilnější než D klasická Hybrid i čistá forma expandované D je plně funkční eexistuje žádné známé omezení na užití expandované D D. Bradley,, Science 297 (2002) 1789 1791. 1791. H. Liu et al.. Science 302 (2003) 868 871. 871. D jak ji neznáme Jak skladovat D? D (1700 bp) ) o určité sekvenci je schopna spontánního složení do oktameru s průměrem 22 nm W. Shih et al. ature 427 (2004) 618 621. 621. Život jak ho neznáme Je život opravdu tak jednoduchý fenomén? Průměrný protein má 200 aminokyselin Počet všech kombinací aminokyselin je 20 200, tj. zhruba 10 260 Vesmír má 10 80 částic Rychlá chemický reakce trvá 1 femtosekundu (10-15 s) Počet všech myslitelných párových srážek od velkého třesku je 10 80 10 80 10 33 = = 10 193 Vesmír by potřeboval 10 67 životů aby stvořil všechny kombinace tohoto proteinu Vesmír se neopakuje je nergodický