7. Měření fluorescence při excitaci kontinuálním světlem ( steady-state )

7. Měření fluorescence při excitaci kontinuálním světlem ( steady-state )

Steady-state měření Excitujeme kontinuálním světlem, měříme intenzitu emise (počet emitovaných fotonů) Obvykle nedetekujeme všechny fotony intenzita se většinou udává v relativních jednotkách Pravděpodobnost, že po absorpci dojde k emisi fotonu Pravděpodobnost, že k emisi fotonu dojde na vybrané vlnové délce I F (λ ex, λ em ) = I 0 (1-10 -ε(λ ex) c l ) QY P(λ em )η(λ em ) I 0 ε(λ ex ) c l QY P(λ em )η(λ em ) Pro malé c I F závisí na vlastnostech zkoumané látky Pravděpodobnost, že dojde k pohlcení fotonu Pravděpodobnost, že vyzářený foton bude detekován I F závisí na koncentraci I F závisí na nastavení přístroje Pro přesné určení koncentrace potřebujeme srovnání se standardem

Fluorescenční parametr, který se mění v závislosti na zkoumané vlastnosti systému Určení např. vazebné konstanty z posunu spektra je v principu také možné, ale vyžaduje znalost kvantového výtěžku volné i navázané formy nebo kalibraci pomocí modelového systému Optimální použití Příklady Intenzita Měřené veličiny jsou úměrné množství fluoroforu Stanovení vazebné konstanty pro interakci dvou molekul Sledování kinetiky chemických reakcí Excitační spektrum Emisní spektrum Charakteristiky systému, které nezávisí na množství fluoroforu ph membránový potenciál polarita okolí... Pokud se posunuje spektrum, je vždy možné nalézt vlnovou délku, na které dochází ke změně intenzity, měření ale bývá náchylnější k artefaktům. Pomoci může kalibrace v isobestickém (excitace) nebo isoemisním (emise) bodě.

Měření intenzity při konstantních vlnových Titrační experimenty délkách excitace i emise - O N H 2 N N O - O - O - N N P O P O P O H 2 C O O O O O O O 2 N N O 2 -ATP +ATP Fluorescenční sonda TNP-ATP je citlivá na polaritu svého okolí - po navázání do hydrofobní vazebné kapsy v molekule proteinu se její kvantový výtěžek zvýší NO 2 No protein F = [ P] + * γ 1 [ P] T + [ E] T + K ( ) T 2 2 [ P] T + [ E] T + K P 4 [ P] T [ E] T Kompetitivní experiment - v přítomnosti ATP jsou některá vazebná místa obsazená a nemůže se do nich navázat TNP-ATP P F * = [ P] T 1 + 2 ( γ 1) [ P] T + [ E] T + K + [ A] P T K P K A [ P] T + [ E] T + K + [ A] P T 2 K P 4[ P] [ E] K A T T (pro K A >>K P )

Měření intenzity při konstantních vlnových délkách excitace i emise Měření kinetiky Sledování kinetiky tvorby komplexu mezi avidinem a DNA měřením tryptofanové fluorescence fluorescence intensity (rel.u.) 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 Photobleaching of GFP 476 nm 400 nm 280 nm 0.0 0 600 1200 1800 2400 3000 3600 time of illumination (s) Pohodlné je sledování kinetiky na škále sekund (a delší) Sledování kratších časů vyžaduje náročnější vybavení pro nastartování experimentu

Chemiluminiscence Reakce katalyzovaná enzymem luciferázou luciferin + ATP luciferin adenylát + PP i luciferin adenylát + O 2 oxyluciferin + AMP + CO 2 + hν Stanovení ATP nebo O 2 Jednodušší aparatura (není potřeba zdroj světla, není nutné odfiltrovat excitující světlo)

Stopped-flow časová škála ms Malé množství dvou roztoků je před měřením pomocí stlačeného vzduchu vstříknuto do komůrky, kde dojde k jejich rychlému promíchání, čímž je nastartována měřená reakce.

Nárůst chlorofylové fluorescence fluorescence O-J-I-P fotosyntéza t (ms)

Excitační a emisní spektra Závislost intenzity na vlnové délce excitace excitační spektrum (obvykle stejné jako absorpční spektrum) Závislost na vlnové délce emise emisní spektrum Synchronní spektrum Kompletní spektrum (3D, EEM) Charakteristiky spektra I, λ max (ν max ), FWHM Vlnové délky λči vlnočty ν? Počet fotonů detekovaných na vlnové délce λ (vlnočtu ν) je úměrný šířce detekovaného spektrálního pásu (bandpass) λ (nebo ν) F λ (λ F ) λ F =F ν (ν F ) ν F ν F musí být kladné a je tedy definováno jako 1/λ F - 1/(λ F + λ F ). Potom dostáváme Při měření spekter za F λ (λ F )λ F (λ F + λ F )=F ν (ν F ) použití mřížkového monochromátoru je Protože λ F <<λ F, můžeme psát konstantní λ, pro řadu teoretických výpočtů je F λ (λ F )λ F2 =F ν (ν F ) vhodnější škála vlnočtů, neboť ν ~ E Lakowicz Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2.ed., Kluwer/Plenum, 1999

Excitační a emisní spektra SA DHSA Sledování metabolizace SA na DHSA jaterními buňkami Fluorescence intenzity (rel.u.) 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 t = 0 t = 1 h 0.0 350 400 450 500 550 600 650 Emission wavelength (nm)

Určení acidobazické rovnovážné konstanty pk A z posunů spektra 22500 těžiště emisního spektra (cm -1 ) 22000 21500 21000 20500 20000 19500 0 2 4 6 8 10 12 ph

Stanovení kvantového výtěžku QY = N N em A I F (λ ex, λ em ) = I 0 (1-10 -ε(λ ex) c l ) QY P(λ em )η(λ em ) I 0 ε(λ ex ) c l QY P(λ em )η(λ em ) Pro určení kvantového výtěžku musíme proměřit celé emisní spektrum Jelikož nedetekujeme všechny fotony (η), musíme provést srovnání se standardem o známém QY QY = QY S I I S A S A I... integrální intenzita A... absorbance n... index lomu rozpouštědla n n 2 2 S n n 0 DET QY < 1, pro fosforescenci QY << 1 Měření pomocí srovnání se standardem (integrace přes celé emisní spektrum!) nebo pomocí určení příspěvku nezářivých přechodů v mikrokalorimetru. Intenzita z bodového zdroje v prostředí o indexu lomu n pozorovaná v prostředí o indexu lomu n 0 je modifikovaná faktorem (n/n 0 ) 2.

Poměrové měření Poměr intenzit fluorescence na dvou vlnových délkách nese informace o tvaru spektra, ale nevyžaduje změření celého spektra S výhodou využíváno ve fluorescenční mikroskopii Absorpční a emisní spektra fluoresceinu

3D spektra Kompletní informace o fluorescenčních charakteristikách látky Měření je časově náročné a bývá prováděno s nižším rozlišením Snazší identifikace většího množství peaků emise (nm) 650 600 550 500 450 benz-cdse 0 20.00 40.00 60.00 80.00 100.0 120.0 140.0 160.0 180.0 200.0 220.0 240.0 260.0 280.0 300.0 320.0 340.0 360.0 380.0 400.0 400 350 300 200 250 300 350 400 450 500 550 600 excitace (nm)

Artefakty ve steady-state spektrech Excitace kontinuálním světlem I při měření spektra 1 fluoroforu pozorujeme více peaků. Jsou to především: Rayleighův rozptyl a jeho druhá harmonická Ramanův rozptyl Signál pozadí vlnová délka emise 800 750 700 650 600 550 500 450 400 350 300 350 400 450 500 550 600 650 700 vlnová délka excitace 0 100.0 200.0 300.0 400.0 500.0 600.0 700.0 800.0 900.0 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 S 1 S 0 v 2 v 1 v 0 Lakowicz Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2.ed., Kluwer/Plenum, 1999

1.řád Rayleighův rozptyl 1.řád Ramanův rozptyl 2.řád 2.řád 3.řád

Je třeba provést spektrální korekce na emisní spektrum zdroje (v excitačním spektru), na spektrální citlivost detektoru, popř. použitý filtr (v emisním spektru), na signál pozadí (nečistoty, Ramanův rozptyl) Efekt vnitřního filtru Lakowicz Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2.ed., Kluwer/Plenum, 1999

Zobrazování Možnost zobrazovat objekty v měřítcích od nm po tisíce km Selektivní zvýraznění určité části objektu Funkční zobrazování Treumer F et al., Br J Ophthalmol 2010;94:48-53 Zobrazení cévního řečiště na sítnici pomocí fluoresceinu Měření ph pomocí poměrového měření

Zobrazování Monitorování fluorescence chlorofylu v planktonu v Arabském moři (modrá - vysoká intenzita fluorescence planktonu ve stresových podmínkách) fluorescence www.ioccg.org/gallery/terra/asia.html fotosyntéza

Shrnutí Steady-state - buzení kontinuálním světlem Intenzita při pevných vlnových délkách excitace a emise - titrační experimenty, kinetika Spektrální závislosti - excitační, emisní, synchronní, kompletní (3D, EEM) spektrum Artefakty ve steady-state spektrech (Rayleighův rozptyl a jeho druhá harmonická, Ramanův rozptyl, signál pozadí) Zobrazování (selektivní zvýraznění, funkční zobr.)