VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Ústav chemie a analýzy potravin Aplikovaná hmotnostní spektrometrie (MS)
VŠCHT PRAHA 2
A brief introdusction to mass spectrometry http://www.youtube.com/watch?v=nuih9-6fm6u VŠCHT PRAHA 3
VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE Ústav chemie a analýzy potravin Hmotnostní spektrometrie základní principy Poděkování: Doc. T. Čajkovi za zpracování podkladů
ÚVOD DO HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE 1912 záznam první hmotnostního spektra (Thomson) Během posledních desetiletí byla hmotností spektrometrie předmětem řady pokroků Spojení MS s GC a LC Rozvoj nových ionizačních technik Dostupnost relativně levných hmotnostních analyzátorů (kvadrupól, iontová past) Znovuobjevení průletových (TOF) hmotnostních analyzátoru
ÚVOD DO HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Technika Hmotnostní spektrometrie (mass spectrometry) nikoliv hmotnostní spektroskopie Instrumentace Hmotnostní spektrometr (mass spectrometer) nikoliv hmotnostní spektroskop
PRINCIP HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Instrumentální technika založená na separaci iontů ve vakuu, v plynné fázi, dle poměru hmotnosti a náboje (m/z) Analyzované molekuly jsou nejprve ionizovány za tvorby molekulárních iontů nebo (de)protonovaných molekul (dle typu ionizační techniky) Pokud tyto molekuly obsahuje dostatek vnitřní energie, podléhají další fragmentaci Veškeré vytvořené ionty jsou pak separovány pomocí hmotnostního spektrometru dle hodnot m/z
Relativní intenzi (%) PRINCIP HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Následně je získáno hmotností spektrum dané molekuly, tj. osa y relativní intenzita (%); osa x poměr hmotnosti a náboje (m/z) 100 Hlavní pík (Base peak) 109 Molekulární ion 220 222 220 185 224 109 Cl 50 0 Fragmenty Fragmenty 79 185 47 60 83 145 93 220 128 174 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 m/z 79 O O P O O Cl
ČÁSTI HMOTNOSTNÍHO SPEKTROMETRU Iontový zdroj Hmotnostní analyzátor Detektor GC-MS Převedení neutrálních molekul analytu na nabité částice ionizace http://www.unsolvedmysteries. oregonstate.edu/ms_05 LC-MS http://www.dnatube.com/video/7235/animationof--mass-spectrometry-explaning-its-principle Separace iontů v plynné fázi za vysokého vakua dle poměru hmotnosti a náboje (m/z) Detekce (registrace) iontů po jejich předchozí separaci dle m/z; stanovení intenzity jednotlivých iontů
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Ionizační techniky
ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) Princip Urychlení elektronů prostřednictvím elektrického pole Interakce daných energetických elektronů s neutrální molekulou (M) Po následné kolizi molekula ztrácí elektron a stává se částicí s lichým počtem elektronů a positivním nábojem (radikálkationt, M + ) M e M 2 Molekulární ion e
ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) Princip Pokud molekulární ion obsahuje dostatek vnitřní energie, dochází k jeho fragmentaci, což vede k tvorbě fragmentů M EE OE R N Může vznikat buď radikál (R ) a ion se sudým počtem elektronů (EE + ), nebo neutrální molekula (N) a nový radikálkationt (OE + ) s lichým počtem elektronů
ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) Ionizační energie Energie vyžadovaná pro ionizaci Rozsah hodnot: 0 ev až přes 100 ev Positivně nabité částice (tj. molekulární ionty) se začínají objevovat s nízkou intenzitou při 10 ev Vzrůst ionizačního potenciálu vede k tvorbě fragmentů
Ionizace ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) Ionizační energie Standardní hmotnostní spektra jsou získávána obvykle při 70 ev Je pozorována maximální intenzita iontů Hmotnostní spektra jsou opakovatelná a charakteristická nezávisle na použitém typu přístroje 0 10 20 70 Ionizační energie (ev)
ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) Výhody EI Identická spektra jsou získána bez ohledu na použitý typ hmotnostního spektrometru s EI zdrojem za předpokladu, že je použito stejné ionizační energie Vznik rozsáhlých knihoven spekter (např. NIST National Institute of Standard and Technology, Wiley) Seznam sloučenin Hmotnostní spektrum Informace o sloučenině
ELEKTRONOVÁ IONIZACE (EI) Použití EI Identifikace neznámé sloučeniny Stanovení molekulární struktury sloučeniny Konfirmace (potvrzení) identity cílového analytů na základě shodných poměrů iontů a shody s knihovnou spekter
CHEMICKÁ IONIZACE (CI) Úvod Měkká ionizační technika (ve srovnání s EI) Vhodná pro méně těkavé nebo termálně labilní molekuly, které neposkytují molekulární iont při elektronové ionizaci
CHEMICKÁ IONIZACE (CI) Proces Vhodný reakční plyn je zaváděn do iontového zdroje, přičemž koncentrace reakčního plynu značně převyšuje množství analytů (např. 10 4 :1) Reakční plyn podléhá v iontovém zdroji obvyklé ionizaci jako v EI
POZITIVNÍ CHEMICKÁ IONIZACE (PCI) Princip Do iontového zdroje je dodáván reakční plyn (např. methan) o relativně vysokém tlaku (0,1 100 Pa) Reakční plyn podléhá elektronové ionizaci (EI) a dochází k tvorbě nadbytku reakčních iontů CH e CH 2 4 4 Reakční ion e
POZITIVNÍ CHEMICKÁ IONIZACE (PCI) Princip Molekuly vzorku jsou následně ionizovány reakčními ionty prostřednictvím přenosu protonu a vznikají protonované molekuly [M+H] + CH CH CH 4 5 3 4 CH Reakční ion M CH [ M H] CH 5 4 Protonovaná molekula Může rovněž docházet k tvorbě aduktů [M+C 2 H 5 ] + a [M+C 3 H 5 ] +
POZITIVNÍ CHEMICKÁ IONIZACE (PCI) Protonované molekuly mají obvykle nízkou vnitřní energii a jsou méně náchylné k fragmentaci ve srovnání s molekulovými ionty produkovanými za podmínek elektronové ionizace (EI) Za daných podmínek je možné získat jednoznačnou informaci o molekulové hmotnosti sloučeniny
NEGATIVNÍ CHEMICKÁ IONIZACE (NCI) Princip Základní mechanismus shodný s detektorem elektronového záchytu (ECD): Nízkoenergetické elektrony jsou zachyceny elektronegativní molekulou (ABC) vzorku Vzniká molekulární aniont, který může dále podléhat fragmentaci v závislosti na své struktuře ABC e ABC ABC e AC B ABC e AB C e Reakční plyny: methan (ion [H] ), amoniak (ionty [NH 2 ], [H] )
NEGATIVNÍ CHEMICKÁ IONIZACE (NCI) Výhody NCI vs. EI a PCI Možnost až 100-násobného zlepšení citlivosti Vyšší stupeň selektivity pouze limitovaný počet analytů, např. obsahující atom halogenu, nitro skupinu, nebo aromatický kruh, je schopen efektivního záchytu elektronu
Abundance Abundance Abundance VLIV IONIZAČNÍCH TECHNIK NA HMOTNOSTNÍ SPEKTRUM V GC MS EI PCI NCI 79 79 152 150 20 000 32 000 264 400 000 12 000 149 4 000 107 51 119 182 264 236 0 100 200 300 Hmotnostní rozsah 24 000 16 000 45 8 000 0 115 238 [M+H] + 300 100 200 300 Hmotnostní rozsah Hmotnostní spektra pesticidu captan (MW = 299) 200 000 0 35 70 182 100 200 300 Hmotnostní rozsah V případě PCI a NCI použit methan jako reakční plyn
IONIZACE ELEKTROSPREJEM (ESI) http://www.youtube.com/watch?v=_pprsnghh5m Zdroj: bbs.instrument.com.cn/shtml/20080910/1473107/
IONIZACE ELEKTROSPREJEM (ESI) Princip Analyt rozpuštěný ve vhodném rozpouštědle je přiváděn kovovou kapilárou (průtok mobilní fáze 1 µl/min 1 ml/min), na kterou je vloženo vysoké napětí (2,5 4 kv) Dochází ke tvorbě násobně nabitých kapiček na výstupu z kapiláry za pomoci zmlžovacího plynu (obvykle dusík) Zmlžující plyn Přívod vzorku Kovová kapilára Násobně nabité kapičky + + + + + + + + + + + + + + + + Molekuly analytu
IONIZACE ELEKTROSPREJEM (ESI) Princip Za pomoci sušícího plynu (horký proud dusíku) dochází k odpařování rozpouštědla a ke zmenšení velikosti nabitých kapiček zvýšení hustoty povrchového náboje Při dosažení kritické hodnoty dochází ke Coulombické explozi Násobně Odpaření rozpouštědla Sušící plyn + + + + + + + + + + + + + + Coulombická explose nabité kapičky Ionty analytu + + + + + + + + + + + + + + + Hmotnostní analyzátor + +
IONIZACE ELEKTROSPREJEM (ESI) Princip Coulombická explose rozpad na menší kapičky s rozdělením původních nábojů a opakováním daného procesu až k uvolnění (de)protonovaných molekul Vstup (de)protonovaných molekul do hmotnostního analyzátoru Násobně nabité kapičky Ionty analytu + + + + + + + + + + + + + + + Hmotnostní analyzátor + +
IONIZACE ELEKTROSPREJEM (ESI) Charakterizace Velmi měkká ionizační technika (minimum fragmentů) Obvykle vzniká (de)protonovaná molekula: Pozitivní mód: [M+H] + Negativní mód: [M H] A dále (minoritní) adukty a klastery s molekulárním iontem (např.): Pozitivní mód: [M+Na] +, [M+K] +, [M+NH 4 ] +, [2M+Na] +, [2M+K] +, [2M+NH 4 ] +, [2M+H] + Negativní mód: [M+Cl], [M+EtO], [2M+Cl], [2M+EtO], [2M H]
CHEMICKÁ IONIZACE ZA ATMOSFÉRICKÉHO TLAKU (APCI) Úvod Ionizační technika podobná CI v GC MS GC CI-MS vyžaduje vakuum; LC APCI-MS probíhá za atmosférického tlaku (průtok mobilní fáze 2 µl/min 2 ml/min)
APCI Princip Eluát je za pomoci zmlžovacího plynu (dusík) převeden ve formu par Na výbojovou elektrodu (corona discharge needle) je vloženo vysoké napětí (3 4 kv) dochází ke koronovému výboji (analogie s vláknem v GC CI- MS) ionizace molekul zmlžovacího plynu (tvorba N 2 + = primární reakční ionty) Následuje ionizace molekul mobilní fáze primárními ionty tvorba sekundárních reakčních iontů Dochází k opakovaným srážkám sekundární reakční iontů s analytem přenos protonu a tvorba iontu analytu
APCI Zdroj: bbs.instrument.com.cn/shtml/20080910/1473107/
APCI Charakterizace Velmi měkká ionizační technika (minimum fragmentů) Tvorba iontů: Pozitivní mód: [M+H] +, [M] +, [M+Na] +, [M+K] +, [M+NH 4 ] +, [M+H+R] + (R = MeCN, MeOH, H 2 O) [2M+H] +, [2M+Na] + [3M+H] +, [3M+Na] + Negativní mód: [M H], [M], [M+X] (X = halogen)
Molekulová hmotnost APLIKAČNÍ ROZSAH IONIZAČNÍCH TECHNIK VE SPOJENÍ S GC A LC 100000 LC MS ESI 10000 1000 GC MS EI, CI LC MS APPI 100 10 Nepolární Polarita analytu LC MS APCI Velmi polární
DESORPČNÍ IONIZACE ELEKTROSPREJEM Princip DESI Nabité kapičky (ESI) a ionty rozpouštědla dopadají na povrh analyzovaného vzorku na izolované ploše Desorbované ionty jsou vzorkovány pomocí hmotnostního spektrometru Rozpouštědlo N 2 Kapilára (rozpouštědlo) Kapilára (plyn) Zdroj vysokého napětí V Desorbované ionty Vzorek Transfer iontů Vstup MS Kapičky Povrch
DESORPČNÍ IONIZACE ELEKTROSPREJEM (DESI) Zdroj: www.aocs.org
PŘÍMÁ ANALÝZA V REÁLNÉM ČASE (DART) Princip Z reakčního plynu (helium, neon, dusík) vznikají prostřednictvím elektrického výboje ionty, elektrony a excitované (metastabilní) atomy a molekuly Ionty jsou zachyceny na elektrodě a s analyty interagují výhradně excitované částice reakčního plynu Možnost přímé analýzy pevných, kapalných a plynných vzorků
DART Přehled generovaných iontů přímá analýza Positivní mód: [M+H] +, [M] +, [M H 2 O+H] + Negativní mód: [M H] +, [M] Přehled generovaných iontů použití dopantu Positivní mód (vodný roztok amoniaku): [M+NH 4 ] + Negativní mód (dichlormethan): [M+Cl]
DART Realizace Ponoření tyčinky do jamky se vzorkem Přenesení tyčinky mezi iontový zdroj a vstup MS Záznam spektra Zdroj: T. Cajka, L. Vaclavik, K. Riddellova, J. Hajslova, LC GC Europe 21(5) (2008) 250 256
DART Kyselina linolenová Kyselina linolová Kyselina olejová Analýza olivového oleje OOO OOL LL LLO L 296 298 300 302 m/z 840 860 880 900 920 940 m/z 200 400 600 800 m/z 1000 Zdroj: JEOL (Europe), Zaventem, Belgie
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Hmotnostní analyzátory
ČÁSTI HMOTNOSTNÍHO SPEKTROMETRU Iontový zdroj Převedení neutrálních molekul analytu na nabité částice ionizace Hmotnostní analyzátor Separace iontů v plynné fázi za vysokého vakua dle poměru hmotnosti a náboje (m/z) Detektor Detekce (registrace) iontů po jejich předchozí separaci dle m/z; stanovení intenzity jednotlivých iontů
PARAMETRY HMOTNOSTNÍCH ANALYZÁTORŮ Hmotnostní rozsah (mass range) Hmotnostní rozlišení / rozlišovací schopnost (mass resolution / mass resolving power) Přesnost hmoty (mass accuracy) Spektrální akviziční rychlost (spectral acquisition rate) Akviziční mód (acquisition mode) Citlivost (sensitivity) Lineární dynamický rozsah (linear dynamic range) Dostupnost tandemové MS (tandem MS) Všestrannost (versatility) Cena (cost)
HMOTNOSTNÍ ROZSAH (Mass range) Rozsah m/z, v rámci kterého dokáže hmotnostní analyzátor separovat a následně detekovat/zaznamenat ionty Spojení GC MS Těkavost/termolabilita analytů do značné míry diktuje horní hmotnostní limit většina hmotnostních spektrometru ve spojení s GC pracuje do m/z 1 000 Spojení LC MS Hmotnostní rozsah je možno zvýšit až o několik řádů (např. až do m/z 30 000)
ROZLIŠOVACÍ SCHOPNOST Definice dle šířky jednoho píku Poměr hmotnosti iontu (m) a šířky daného iontu ( m) v polovině jeho výšky Full Width at Half Maximum (FWHM) Definice dle překryvu dvou píků Poměr hmotnosti iontu m 1 a rozdílu iontů m 1 a m 2 ; oba píky musí být stejně vysoké a úvodí mezi těmito píky je 10 %. 10% Valley definition
PŘESNOST HMOTY (Mass accuracy) Odchylka mezi změřenou, experimentálně zjištěnou hmotou (accurate mass) a teoretickou, vypočítanou hmotou (exact mass) iontu vyjádřená jako chybová hodnota (error value) v mda nebo ppm 3 m m ( mda ) exp. teor. 10 m exp. m teor. ( ppm ) 10 m teor. 6
SPEKTRÁLNÍ AKVIZIČNÍ RYCHLOST (Spectral acquisition rate) Doba potřebná pro záznam hmotnostního spektra nebo vybraného iontu (iontů) Scannovací přístroje používají především: scans/s, s/scan, s/dekada, cyklus/s Nescannovací přístroje: spektra/s Maximální akviziční rychlost představuje kritický parametr při detekci velmi úzkých píků generovaných během rychlé chromatografické separace
AKVIZIČNÍ MÓD (Acquisition mode) Výběr akvizičního módu dovoluje použití různých módů sběru hmotnostních spekter Full scan monitoring vybraného hmotnostního rozsahu (např. m/z 50 550) Monitoring vybraných iontů (selected ion monitoring, SIM) monitoring pouze vybraných iontů nebo pouze jednoho iontu (např. m/z 109, 149, 220)
CITLIVOST (Sensitivity) Citlivost přístroje je obvykle charakterizována výrobcem daného přístroje jako minimální poměr S/N při dané koncentraci referenční sloučeniny GC MS: např. oktafluoronaftalen, hexachlorbenzen (HCB) LC MS: reserpin
LINEÁRNÍ DYNAMICKÝ ROZSAH (Linear dynamic range) Rozmezí koncentrací, ve kterém se mění definovatelným způsobem odezva detektoru se změnou koncentrace analytu Běžné scanovací přístroje: 5 6 řádů Např. 5 řádů: 0,1 1 10 100 1000 10000) Nescanovací přístroje (TOF): 4 řády Úzký dynamický rozsah může vést ke komplikacím, především v případě, kdy jsou analyzovány vzorky se značně proměnnými koncentracemi cílových analytů
DOSTUPNOST TANDEMOVÉ MS (Tandem MS) Metoda zahrnující alespoň dva stupně hmotnostní analýzy: buď ve spojení s disociačním procesem nebo chemickou reakcí, která způsobí změnu v hmotě nebo náboji daného iontu MS/MS metody zahrnují aktivaci vybraného iontu (prekurzor) obvykle kolizí s inertním plynem vhodným k navození fragmentace za vzniku produktových, dceřinných, iontů
TANDEMOVÁ MS Přístupy v MS/MS V prostoru (in space) každý krok MS/MS postupu vyžaduje specifické instrumentální součásti Trojitý kvadrupól (QqQ) Kvadrupól/průletový analyzátor (Q-TOF) V čase (in time) provedení sekvence událostí v analyzátoru umožňující zachytávat ionty Iontová past
MÓDY TANDEMOVÉ MS Scan produktových iontů Scan iontů prekurzoru Scan neutrálních ztrát Monitoring jedné iontové reakce Monitoring více iontových reakcí Scan MS n
Intenzita MÓDY TANDEMOVÉ MS Scan MS n : selektivita vs. citlivost Signál S/N Šum 1 2 3 4 Stupeň MS Zdroj: R.G. Cooks, K.L. Busch, J. Chem. Educ. 59(11) (1982) 926 933
MÓDY TANDEMOVÉ MS heptachlor v rybím oleji ECD 10 µg.kg 1 SIM Zdroj: K. Patel et al., J. Chromatogr. A 1068 (2005) 289. MS/MS 10 µg.kg 1 10 µg.kg 1 +
VŠESTRANNOST (Versatility) Možnost použití alternativních ionizačních technik GC MS: EI, PCI, NCI LC MS: ESI, APCI, APPI Rozšíření rozsahu aplikací
HMOTNOSTNÍ ANALYZÁTORY Separaci iontů dle m/z zle provést na základě různých fyzikálních principů Kvadrupól, iontová past různá stabilita oscilací iontů v dvoj- nebo trojrozměrné kombinaci stejnosměrného a vysokofrekvenčního střídavého napětí Průletové (TOF) různá doba letu iontů v oblasti bez pole Sektor zakřivení dráhy letu iontů v magnetickém nebo elektrickém poli FT-ICR různé absorpce energie při cykloidálním pohybu iontů v kombinovaném magnetickém a elektrickém poli
KVADRUPÓL Zdroj: www.qmg700.com/quadinfo/
KVADRUPÓL Princip Ionty jsou přivedeny do středy osy kvadrupólu, kde začnou oscilovat (kmitat) Pro určitý poměr stejnosměrného a vysokofrekvenčního střídavého napětí jsou oscilace stabilní pouze pro ion s určitou hodnotou m/z tento ion dosáhne detektoru; ostatní jsou zachyceny na tyčích kvadrupólu (využití: SIM) Plynulou změnou hodnot stejnosměrného napětí a amplitudy střídavého napětí (poměr je konstantní!) se k detektoru dostávají postupně všechny ionty (využití: Full scan)
KVADRUPÓL Režimy Full scan monitoring vybraného hmotnostního rozsahu (např. m/z 50 550 na detekci iontu o určité hodnotě m/z je využito pouze 1/500 z celkového času) Monitoring vybraných iontů (selected ion monitoring, SIM) monitoring pouze vybraných iontů nebo pouze jednoho iontu (obvykle 1 20 iontů) Poznámka: Čím menší počet monitorovaných iontů, tím lepší citlivost (za cenu ztráty spektrálních informací) použití módu SIM převážně v (ultra)stopové analýze
SEKTOR Princip (magnetický analyzátor s jednoduchou fokusací iontů) Při průchodu magnetickým polem dochází k většímu zakřivení dráhy iontů s nižší hodnotou m/z (m/z) 1 (m/z) 2 (m/z) 3 (m/z) 1 < (m/z) 2 < (m/z) 3
SEKTOR Princip (magnetický analyzátor s dvojí fokusací iontů) K magnetické fokusaci (zaostření) iontů ještě přistupuje elektrostatická fokusace Dochází k výraznému zvýšení rozlišovací schopnosti >10 000 (10% valley)
PRŮLETOVÝ ANALYZÁTOR (TOF) Schéma (1) (2) Letová trubice Iontový zdroj (3) Reflektron Detektor (4)
PRŮLETOVÝ ANALYZÁTOR (TOF) Hlavní faktory pozitivně ovlivňující rozlišovací schopnost Použití gradientu elektrického pole ortogonálně (kolmo) na paprsek iontů prostorové zaostření Použití reflektronu zaostření kinetické energie iontů Ionty prochází dvakrát letovou trubicí než dosáhnou detektor zvýšení efektivní letové délky
Citlivost PRŮLETOVÝ ANALYZÁTOR (TOF) Hlavní výhody TOF analyzátorů Vysoká účinnost analyzátoru během sběru spekter přes široký hmotnostní rozsah TOF 25 % vs. kvadrupól 0,1 % Dostupnost spektrálních informací i na velmi nízkých koncentračních hladinách s možností identifikace na základě srovnání naměřených spekter s knihovnou spekter Kvadrupól Iontová past TOF 0 Hmotnostní rozsah 50 0
PRŮLETOVÝ ANALYZÁTOR (TOF) Hlavní výhody TOF analyzátorů Všechny ionty jsou zaznamenávaný souběžně Nedochází ke změnám poměrů iontů napříč píkem během akvizice hmotnostního spektra Není pozorována spektrální asymetrie (spectral skew) obvyklá u scanovacích přístrojů použití dekonvoluce spektrální rozlišení částečně koeluovaných chromatografických píků Kolik píků je vidět? TIC (20 s)
PRŮLETOVÝ ANALYZÁTOR (TOF) Příklad: Spektrální dekonvoluce 2 koeluovaných sloučenin; analýza těkavých látek lihovin TIC Dekonvoluované spektrum Dekonvoluované spektrum NIST spektrum NIST spektrum
PRŮLETOVÝ ANALYZÁTOR (TOF) Rozlišovací schop. Přesnost hmoty Akviziční rychlost Hm. rozsah Výrobce Účel Vysokorozlišovací TOF 7 000 FWHM 5 ppm 1 10 (20) spekter/s Do m/z 1 500 Waters-Micromass měření přesné hmoty konvenční a rychlá GC Vysokorychlostní TOF Jednotkové (1 000 FWHM) 1 500 spekter/s Do m/z 1 000 Leco konvenční až ultrarychlá GC, GC GC Akvizice plných hmotnostních spekter Absence spektrální asymetrie (dekonvoluce)
PRŮLETOVÝ ANALYZÁTOR (TOF) Vysokorozlišovací vysokorychlostní TOF Rozlišovací schop. Přesnost hmoty Akviziční rychlost Hm. rozsah Výrobce Účel 25 000 FWHM <1 ppm 1 200 spekter/s Do m/z 1 000 Leco měření přesné hmoty konvenční až ultra-rychlá GC, GC GC Akvizice plných hmotnostních spekter Absence spektrální asymetrie (dekonvoluce)
ORBITRAP (ORBITÁLNÍ PAST) Zdroj: www-lpg.obs.ujfgrenoble.fr/img/jpg/orbitrap.jpg
ORBITRAP (ORBITÁLNÍ PAST) Princip Pohybující se ionty jsou zachyceny do orbitu okolo elektrody ve tvaru hřídele pomocí elektrostatického pole Vnější elektrody ohraničují ionty, které obíhají okolo centrální elektrody a oscilují (kmitají) tam a zpět podél osy centrální elektrody Danou oscilaci je možno detekovat jako obraz proudu na elektrodě obklopující orbitrap Fourierova transformace je použita pro získání oscilačních frekvencí jednotlivých iontů o různých m/z
HYBRIDNÍ INSTRUMENTACE Hybridní instrumenty je možné získat spojením různých hmotnostních analyzátorů Trojitý kvadrupól (triple quadrupole, QqQ) Kvadrupól/lineární iontová past (quadrupole/linear ion trap, Q-LIT) Kvadrupól/průletový analyzátor (quadrupole/time-of-flight, Q-TOF) Sektor/průletový analyzátor (sector/time-of-flight) Průletový analyzátor/průletový analyzátor (timeof-flight/time-of-flight, TOF-TOF)
TROJITÝ KVADRUPÓL Kvadrupól (Q 1 ) Kvadrupól (Q 3 ) Kolizní cela Spektrum s pozaďovými ionty Q 1 dovoluje přechod pouze iontu 210 Kolizní cela rozštěpí ion 210 Q 3 monitoruje pouze charakteristické fragmenty 158 a 191 pocházející z iontu 210 Bez chemického pozadí
TROJITÝ KVADRUPÓL Trojitý kvadrupól se skládá ze dvou kvadrupólů (Q 1, Q 3 ) a kolizní cely, která je mezi Q 1 a Q 3 První kvadrupól (Q 1 ) slouží pro izolaci prekursorových iontů Druhý kvadrupól (obvykle oktapól) představuje kolizní celu, kde dochází k fragmentaci daných iontů za pomoci reakčního plynu (argon) Třetí kvadrupól (Q 3 ) slouží pro izolaci/scanovaní (záznam) produktových iontů
Relativní odezva TROJITÝ KVADRUPÓL Zvýšení selektivity Příklad: pesticid thiodicarb v dětské výživě (0,1 mg/kg) LC MS 1 Full Scan LC MS 1 SIM LC MS 2 MRM 100 8.61 9.30 100 8.59 9.29 100 9.72 9.41 0 8.37 9.15 8.70 8.85 9.72 9.00 10.00 S/N = 6:1 m/z 355 (full scan m/z 50 1000) 10.36 0 9.69 9.80 9.00 10.00 S/N = 9:1 m/z 355 10.21 0 9.00 10.00 Čas (min) S/N = 125:1 Přechod m/z 355>87,9
KVADRUPÓL/PRŮLETOVÝ ANALYZÁTOR (Q-TOF) Detektor (detekce všech produktových iontů) Iontový zdroj (různé ionty) Kvadrupól (výběr iontu) Kolizní cela (fragmentace) Reflektron
KVADRUPÓL/PRŮLETOVÝ ANALYZÁTOR (Q-TOF) Pokud zaměníme poslední kvadrupól (Q 3 ) průletovým analyzátorem (TOF), získáváme Q- TOF Kombinuje jednoduchost kvadrupólového analyzátoru s vysokou účinností TOF analyzátoru Detekce produktových iontů je realizována přes celý hmotnostní rozsah (jako u jednoduchého TOF analyzátoru) s vysokou účinností (10 100 ) ve srovnání s QqQ za stejných podmínek Systém Q-TOF disponuje vysokou rozlišovací schopností (10 000 FWHM), což umožňuje měřené přesné hmoty produktových iontů
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Detektory
ČÁSTI HMOTNOSTNÍHO SPEKTROMETRU Iontový zdroj Převedení neutrálních molekul analytu na nabité částice ionizace Hmotnostní analyzátor Separace iontů v plynné fázi za vysokého vakua dle poměru hmotnosti a náboje (m/z) Detektor Detekce (registrace) iontů po jejich předchozí separaci dle m/z; stanovení intenzity jednotlivých iontů
DETEKTORY Princip 1: postupná detekce příletu všech iontů jedním článkem Elektronový násobič (electron multiplier), fotonásobič (photon multiplier) Princip II: současná detekce příletu všech iontů podél plochy Mikrokanálková destička (microchannel plate, MCP) Princip III: ionty prochází blízko svých oscilací a pouze slabý proud je vytvořen v okruhu elektrod Detektory (kovové plochy) pro FTICR a orbitrap
ELEKTRONOVÝ NÁSOBIČ Zdroj: www.analyticalwest.com Zdroj: www.chem.agilent.com
MIKROKANÁLKOVÁ DESTIČKA Zdroj: www.rmjordan.com
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Interpretace EI-MS spekter
ÚVOD Praktický přístup pro ionizaci termálně stabilních a relativně těkavých organických sloučenin představuje elektronová ionizace (EI) EI spektrum v řadě případů představuje fingerprint cílového analytu Ze získaného spektra je často možné stanovit strukturu organické sloučeniny na základě: Molekulární hmotnosti Elementárního složení Specifických fragmentů
STANOVENÍ MOLEKULÁRNÍ HMOTNOSTI Nízkorozlišovací měření Poskytuje informace o nominální hmotě analytu Elementární složení může být stanoveno na základě profilu isotopů (isotopic pattern) 100 43 73 60 O 26 284 50 129 83 284 29 185 115 241 143 171 199 227 15 255 0 40 80 120 160 200 240 280 (mainlib) Octadecanoic acid OH 13 285 286 0 283 284 285 286 (mainlib) Octadecanoic acid O OH C 18 H 36 O 2
STANOVENÍ MOLEKULÁRNÍ HMOTNOSTI Vysokorozlišovací měření Stanovení přesné hmoty molekulárního iontu na základě které je rovněž možné odvodit elementární složení 403.1162 404.1210
ELEMENTÁRNÍ SLOŽENÍ Z PŘESNÉ HMOTY Nominální hmota může mít řadu kombinací elementárního složení, přesná hmota může odpovídat pouze jednomu složení Příklad: Nominální hmota Přesná hmota El. složení 70 70,0054 C 3 H 2 O 2 70,0293 C 3 H 4 NO 70,0419 C 4 H 6 O 70,0532 C 3 H 6 N 2 70,0657 C 4 H 8 N 70,0783 C 5 H 10
ELEMENTÁRNÍ SLOŽENÍ Z PŘESNÉ HMOTY S rostoucím počtem atomů v molekule roste počet možných kombinací elementárního složení užitečnost přesné hmoty pro jednoznačnou identifikaci elementárního složení proto získává na důležitosti s rostoucí hmotou molekuly Nominální hmota Počet možných elementární složení 40 4 70 11 100 23
FRAGMENTAČNÍ REAKCE SPECIFICKÝCH TŘÍD SLOUČENIN Uhlovodíky (lineární alkany, rozvětvené alkany, alkeny, aromatické uhlovodíky) Alkoholy (alifatické alkoholy, aromatické alkoholy) Ethery (alifatické ethery, aromatické ethery) Aldehydy a ketony Karboxylové kyseliny Estery Sloučeniny s halogenem
UHLOVODÍKY Lineární alkany Nízká intenzita molekulárního iontu Ionizace na C C -vazbě; fragmenty separovány o 14 jednotek Série iontů C n H 2n+1 : m/z 29, 43, 57, 71, 85,
71 u C 5 H 11 + 71 85 M + 142 99 113 m/z 71 m/z 85 C 43 u 3 H 7 C H 4 9 + 57 u + C 2 H 5 29 u m/z 113 C m/z 57 4 H + 8 + 56 u + 100 m/z 99 43 57 Dekan 50 27 29 41 71 31 36 53 99 142 63 77 113 126 0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 (mainlib) Decane 85 M +
UHLOVODÍKY Rozvětvené alkany Rozvětvení snižuje intenzitu molekulárního iontu Preferováno štěpení v místě větvení 100 50 43 57 71 85 29 77 99 113 127 141 155 168 198 0 21 31 41 51 61 71 81 91 101 111 121 131 141 151 161 171 181 191 201 (mainlib) 100 Tetradecane 43 57 u 113 u 57 50 71 85 m/z 85 m/z 141 Tetradekan 5-Methyltridekan 29 22 78 99 112 140 126 154 168 183 198 0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 (mainlib) Tridecane, 5-methyl- M + M +
UHLOVODÍKY Alkeny Ionizace je iniciována v místě dvojné vazby Intenzita molekulárního iontu je vyšší než odpovídajícímu alkanu Dvojná vazba je pohyblivá, což vede k tvorbě různých izomerů alkenů Série iontů C n H 2n 1 : m/z 27, 41, 55, 69,
UHLOVODÍKY Alkeny 100 41 55 56 70 100 50 [C 4 H 7 ] + 1-Decen 100 [C 4 H 8 ] + 55 56 57 50 [C 4 H 9 ] + 51 52 53 54 58 0 0 51 54 57 60 (mainlib) 1-Decene 55 56 52 53 54 Dekan 57 [C 4 H 9 ] + 58 59 52 55 58 61 (mainlib) Decane 1-Decen 69 50 29 83 M + 97 27 111 140 63 77 91 125 0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 (mainlib) 1-Decene 100 43 57 Dekan 50 29 41 71 85 M + 31 50 63 73 77 87 99 113 126 142 0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 (mainlib) Decane
UHLOVODÍKY Aromatické uhlovodíky Fragmentace benzenového kruhu vyžaduje vysokou aktivační energii Molekulární ion je o vysoké intenzitě a ionty související s benzenovým kruhem (m/z 39, 51, 63 a 77) jsou o nízké intenzitě -Štěpení benzylové vazby v ionizovaných alkylovaných benzenech generuje strukturně diagnostický ion m/z 91 (tropyliový ion) Následná eliminace C 2 H 2 z tropyliového iontu vede ke tvorbě dalšího charakteristického iontu m/z 65 V přítomnosti delších alkylových skupin je pozorována série: m/z 91, 105, 119, Pokud alkylový řetězec 3C ion m/z 92
100 50 UHLOVODÍKY Aromatické uhlovodíky [C 5 H 5 ] + [C 7 H 7 ] + 148 15 29 41 65 45 51 57 69 78 105 82 87 119 128 134 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 (mainlib) Benzene, pentyl- 91 [C 6 H 6 -CH 2 + H] + 92 Pentylbenzen M + 100 91 [C 7 H 7 ] + Ethylbenzen 50 [C M + 5 H 5 ] + 106 15 27 39 51 63 65 74 77 86 89 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 (mainlib) Ethylbenzene
ALKOHOLY Alifatické alkoholy Ionizace je iniciována na atomu kyslíku OH skupiny Molekulární ion je obvykle o velmi nízké intenzitě v případě primárních a sekundárních alkoholů a zcela chybí u terciárních alkoholů Dominují reakce -štěpením rezonančně stabilizovaný ion [RCH=OH] + je hlavním produktem série iontů: m/z 31, 45, 59, Primární alkoholy: m/z 31 (CH 2 = + OH) diagnostický ion; ztráta H 2 O; ztráta molekuly alkenu nápadné ionty [M 18] +, [M 46] +, [M 74] +,
ALKOHOLY 100 31 41 43 27 50 29 42 OH 12 15 26 28 39 55 17 19 33 74 M + 38 40 45 57 59 71 73 0 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 (mainlib) 1-Butanol 100 Alifatické alkoholy OCH 3 41 OCH 3 (H 2 O + 2 CH 2 =CH 2 ) [M 74] + 56 [M 46] + H 2 O [M 18] + 70 84 OH 50 29 31 39 [M 18] + 15 19 45 M + 62 73 77 91 97 101 112 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 (mainlib) 1-Octanol 56 (H 2 O + CH 2 =CH 2 ) H 2 O Butanol Oktanol
ALKOHOLY Aromatické alkoholy Vysoká intenzita molekulárního iontu Nesubstituované benzylalkoholy produkují charakteristický benzylový ion m/z 91 -štěpením U benzylalkoholů pozorován McLaffertyho přesmyk zahrnující fenylový kruh Ztráta H 2 O je pozorována především u orthosubstituovaných benzylalkoholů
ALKOHOLY 100 Benzylalkohol 2-Methylbenzylalkohol CHO H 2 O [M 29] + [M 18] + 79 M + 100 104 108 HO 50 51 39 65 27 43 0 20 40 60 80 100 120 (mainlib) Benzyl Alcohol [C 50 7 H 7 ] + [C 7 H 7 ] + 91 HO 39 51 65 79 91 M + 122 15 27 0 10 30 50 70 90 110 130 (mainlib) Benzenemethanol, 2-methyl-
SLOUČENINY S HALOGENEM F, Cl, Br, I Cl, Br: unikátní isotopický profil F, I: odvození z nižšího poměru [M+1] / [M], který je dán skutečností, že F a I jsou monoisotopické Alifatické chloridy: přítomnost molekulárního iontu pouze u monochloridů; s rostoucím počtem Cl atomů se snižuje intenzita molekulárního iontu Cl, F: ztráta HX
100 Propylfluorid 29 100 Propylchlorid 42 HCl [M 36] + 50 33 47 59 15 19 62 0 10 20 30 40 50 60 70 (mainlib) n-propyl fluoride 100 50 Propylbromid 27 43 HF [M 20] + 122 15 55 71 79 93 107 0 10 30 50 70 90 110 130 (mainlib) Propane, 1-bromo- 42 Br [M 79] + F Br M + M + 50 29 15 49 63 73 78 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 (mainlib) n-propyl chloride 100 50 Propyljodid 27 43 I [M 127] + 127 15 141 155 0 10 40 70 100 130 160 (mainlib) Propane, 1-iodo- I C 3 H 7 [M 43] + Cl M + M + 170
KNIHOVNY SPEKTER Hledání v knihovně spekter pomocí počítače představuje velmi užitečný nástroj Výsledky jsou získány během několika sekund ve srovnání s hodinami při použití manuálního vyhledávaní operátorem
KNIHOVNY SPEKTER NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library (často jen označována jako NIST) poslední verze NIST 08 (cena ~80 tis. Kč) Wiley Registry of Mass Spectral Data poslední verze Wiley 8 th Wiley 8 th /NIST 08 kombinace obou předchozích knihoven (cena ~190 tis. Kč) Mass Spectra of Flavors and Fragances of Natural and Synthetic Compounds Mass Spectral Library of Drugs, Poisons, Pesticides, Pollutants and Their Metabolites
Počet NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library Zdroj EI spekter Poslední verze (NIST 08) obsahuje 191 tis. spekter Hmota (u) Zdroj: http://www.sisweb.com/software/ms/nist.htm http://www.nist.gov/srd/nist1a.htm
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Interpretace API-MS spekter
ÚVOD Hmotnostní spektra získaná technikou LC API-MS (ale i GC CI-MS) jsou generována měkkými ionizačními technikami Není pozorována tak silná fragmentace jako v případě EI Vznikají ionty se sudým počtem elektronu, EE +, oproti elektronové ionizaci, kde vznikají ionty s lichým počtem elektronů (OE + )
ÚVOD Tvrdé ionizační techniky (EI) OE EE OE R N Měkké ionizační techniky (API, CI) EE EE OE N R Přednostně vznikají ionty se sudým počtem elektronů (EE + ) Ionty s lichým počtem elektronů pouze výjimečně (polyaromáty, organokovy)
ESI HMOTNOSTNÍ SPEKTRA Příklad: 3-Acetyldeoxynivalenol Elementární složení: C 17 H 22 O 7 M r = 338 Ionizace: ESI + mobilní fáze: MeOH : 5 mm mravenčan amonný (HCOONH 4 ) [M+H] + [M+NH 4 ] + 17 [M+Na] + 22 [M+K] + [M+HCOONH 4 +H] + 38 100 63 0 [M+H] + 356.1728 339.1462 340.1457 [M+NH 4 ] + [M+Na] + 361.1280 [M+K] + 377.1018 402.1548 362.1295 378.1064 [M+HCOONH 4 +H] + 300 340 380 420 460 m/z
ESI HMOTNOSTNÍ SPEKTRA [M H] [M+Cl] Příklad: Alternariol Elementární složení: C 14 H 10 O 5 M r = 258 Ionizace: ESI mobilní fáze: MeOH : 5 mm mravenčan amonný (HCOONH 4 ) 36 257.0453 100 [M H] [M+HCOO] 46 [M+HCOONH 4 H] 63 0 293.0235 303.0505 320.0770 [M+Cl] [M+HCOO] [M+HCOONH 4 H] [2M H] 515.0969 [2M+Cl] 551.0746 [2M+HCOO] 561.1035 m/z 300 400 500 600
ESI-MS vs. EI-MS Příklad: Aflatoxin B 1 Elementární složení: C 17 H 12 O 6 M r = 312 ESI-MS EI-MS 100 313.0747 [M+H] + 100 O O [M] + 312 0 [M+NH 4 ] + 330.1027 335.0532 376.0785 [M+Na] + [M+HCOONH 4 +H] + [2M+Na] + [2M+NH 4 ] + 647.1136 642.1572 m/z 300 400 500 600 50 O O O O 41 63 89 128 185 228 256 284 0 20 70 120 170 220 270 320 (mainlib) Cyclopenta[c]furo[3',2':4,5]furo[2,3-h][1]benzopyran-1,11-d
HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIE Metody pro indentifikaci a/nebo kvantifikace analytů
METODY PRO IDENTIFIKACI A/NEBO KVANTIFIKACI ANALYTŮ Softwarové aplikace umožňující rychlé vyhodnocování dat získaných instrumentálními technikami ( zvýšení efektivity) Jinými slovy: Co člověk vyhodnocuje hodiny, udělá počítač během sekund V případě metod pro identifikaci je součástí rovněž hledání v knihovně spekter V případě metod pro kvantifikaci nemusí být bezpodmínečně nutné hledání v knihovně spekter
UKÁZKA METODY PRO IDENTIFIKACI ANALYTŮ (ChromaTOF)
UKÁZKA METODY PRO IDENTIFIKACI ANALYTŮ (ChromaTOF)
UKÁZKA METODY PRO KVANTIFIKACI ANALYTŮ (ChromaTOF)
UKÁZKA METODY PRO KVANTIFIKACI ANALYTŮ (MassLynx/QuanLynx) Tvorba a úprava metody Zpracování vzorků Prohlížení výsledků
UKÁZKA METODY PRO KVANTIFIKACI ANALYTŮ (MassLynx/QuanLynx) Hlavní parametry (1) Název sloučeniny Kvantifikační ion Hmotnostní okno Vyhodnocení dle výšky nebo plochy Retenční čas Rozsah retenčního času Použití vnitřního standardu
UKÁZKA METODY PRO KVANTIFIKACI ANALYTŮ (MassLynx/QuanLynx) Hlavní parametry (2) Typ proložení kalibrační křivky Počátek kalibrační křivky Transformace Jednotky
UKÁZKA METODY PRO KVANTIFIKACI ANALYTŮ (MassLynx/QuanLynx) Hlavní parametry (3) Použití vyhlazování Typ vyhlazování Parametry pro automatickou detekci a integraci píku
UKÁZKA METODY PRO KVANTIFIKACI ANALYTŮ (MassLynx/QuanLynx) Kvantifikační tabulka Název souboru Typ (analyt/standard/blank) Koncentrace standardu Retenční čas Plocha / výška analytu Plocha / výška vnitřního standardu Koncentrace Kalibrace Rozložení reziduí Korelační koeficient Typ kalibrační křivky Chromatogram Chromatogram analytu Chromatogram vnitřního standardu
UKÁZKA METODY PRO KVANTIFIKACI ANALYTŮ (ChemStation)
UKÁZKA METODY PRO KVANTIFIKACI ANALYTŮ (ChemStation) Hlavní parametry (1) Název sloučeniny Retenční čas Rozsah retenčního času Kvantifikační a další ionty Vyhodnocení dle výšky nebo plochy Typ kalibrace
UKÁZKA METODY PRO KVANTIFIKACI ANALYTŮ (ChemStation) Hlavní parametry (2) Koncentrace a odezvy standardů
UKÁZKA METODY PRO KVANTIFIKACI ANALYTŮ (ChemStation) Hlavní parametry (3) Kalibrační křivka
UKÁZKA METODY PRO KVANTIFIKACI ANALYTŮ (ChemStation)
Tutorial: http://www.youtube.com/watch?v=bih065_y1i4&list=tljznmnzuf RLUBifeADUb7vDSFmd6-JT4f