Program postgraduálního kurzu Pokroky v neurovědách 2013 Semináře začínají vždy v 9:00 hod. 28. února 2013 čtvrtek Moderní pohledy na neuroanatomii a její metodiky prof. MUDr. P. Petrovický, DrSc. a prof. MUDr. M. Grim, DrSc. Anatomický ústav 1. lékařské fakulty UK, U Nemocnice 3, Praha 2, Velká posluchárna Anatomického ústavu - přízemí tel.: 22496 5780 Koordinátor kursu: Prof. MUDr. J. Syka, DrSc. Ústav experimentální medicíny AV ČR, v.v.i., Vídeňská 1083, Praha 4 Krč. tel.: 24106 2700 Informace: I. Kolářová, tel. 24106 2218
1. Molekulárně biologické aspekty vývoje nervového systému Vývoj CNS a neurální lišty- úloha genů, struktura perif. nervů, Struktura autonomnmích nervů, Sensorické receptory Miloš Grim Anatomický ústav 1. LF UK v Praze čtvrtek 28. února 2013
olekulárně biologické aspekty vývoje nervového systému ervový systém vzniká ze tří neuroektodermových embryonálních základů: z mozkových váčků a neurální trubice se vyvíjí mozek a mícha, z neurální lišty vzniká periferní nervový systém. z neurogenních epidermových plakod vznikají smyslové buňky a neurony některých ganglií hlavových nervů ývoj nervového systému zahrnuje indukci, proliferaci, migraci, diferenciaci apoptosu buněk podobně jako v jiných orgánových systémech a k tomu avíc specifický proces integrace neuronů do okruhů propojených synapsemi eurulace ditelným projevem indukce neuroektodermu je vznik neurální ploténky. uňky neurální ploténky intensivně proliferují a ploténka se vchlipuje a ohlubuje v neurální rýhu. Její okraje jsou vyzdviženy a tvoří neurální valy, eré se k sobě postupně přibližují a uvolňují se ze spojení s ektodermem za niku neurální lišty, která je tvořena buňkami na přechodu valů do todermu. Spojením valů ve střední čáře se vytváří neurální trubice..
Nervový systém se vyvíjí z ektodermu. Neurogenesu řídí induktivní signály. Nervovou ploténku indukuje SHH z mesodermu chordy a BMP z přilehlého ektodermu. Determinace nervové trubice probíhá ve třech osách (dorsoventrální, mediolaterální a rostrokaudální). V dorsoventrální ose se uplatňuje SHH signalisace ze spodinové ploténky a BMP signalisace ze stropové ploténky. Mediolaterální determinace motoneuronů v míše je pod vlivem exprese LIM kódu. Determinace nervové trubice v rostrokaudální ose: Rhombencephalon je organisován v segmentových jednotkách (rhombomerách), jejichž identitu určuje exprese Hox genů. V mesencephalu a telencephalu byla identifikována tři signalizační centra (MMB-, mesencephalic-metencephalic border, P2/P3, ANRanterior neural ridge), která produkuji signální molekuly FGF-8, SHH a WNT-1, jejichž koncentrace podmiňuje expresi celé řady transkripčních faktorů, které determinují identitu struktur mesencephala a prosomer telencephala. Např. v expresní oblasti Gbx2 vzniká cerebellum, v expresní doméně OTX2 vzniká optické tectum, exprese FOXG1 je charakteristická pro oblast telencephala. Regionální diferenciace kortexu závisí na aferentních vstupech a vnitřnímu programu příslušných buněk.
Neurogenní diferenciaci navozují diferenciační faktory, např neurogenin a neurod. Mechanismus laterální inhibice rozhoduje o tom, zda půjde o neuron nebo gliovou buňku. Buď se zvýší hladina neurogeninu a bude se diferencovat neuron, nebo se jeho hladina sníží a bude se diferencovat glie. Glie: plasmatické asatrocyty (typ 1) se diferencuji jako prvé a secernují faktor, který stimuluje druhý typ prekurzorové buňky, ze které se diferencují fibrilární astrocyty (typ 2) a oligodendrocyty. Neurotrofní růstové faktory (NGF, BDNF, NT3, NT4) jsou syntetisovány v periferních tkáních a jejich tyrosin kinasové receptory (TrkA,. TrkB, TrkC, p75) jsou exprimovány na neuronech. Uplatňují se za vývoje při vytváření rovnováhy mezi počtem neuropnů a velikostí cílové struktury. V dospělosti udržují diferencovaný stav. Např. úroveň nocicepce je závislá na NGF/TrkA signalisaci. Proprioceptivní neurony vyžadují NT3/TrkC signalisaci.
Downloaded from: StudentConsult (on 11 January 2013 02:02 PM) Cell lineages in the developing central nervous system. (Based on Cameron R, Rakic P: Glial cell lineage in the cerebral cortex: a review and synthesis, Glia 4:124-127, 1991.)
Neuromery: projevem kraniokaudálního členění neurální trubice je vznik neuromer. V předním mozku je segmentace v prosomery pouze naznačena, kdežto v oblasti rhombencephala jsou neuromery patrné jako skutečné podjednotky, rhombomery 2005 Elsevier Figure 11-11 The hindbrain of a live 3-day chick embryo (left), showing segmentation (rhombomeres). On the right is a whole mount of a similar area stained for neurofilament protein, showing darkly stained immature neurons running along the rhombomere borders. (From Lumsden A: Mech Dev 121:1081-1088, 2004.)
Organizační centra mozku a jejich signální molekuly P2/P3 MMB ANR segmenty embryonálního mozku r1 r8 = rhombomery P1 P6 = prosomery SHH FGF- 8 WNT-1
Figure 11-9 Dorsal and ventral signaling in the early central nervous system. A, Signals from sonic hedgehog (Shh) (orange arrows) in the notochord induce the floor plate. B, In the dorsal part of the future neural tube, bone morphogenetic protein-4 (BMP-4) and BMP-7 (green arrows) from the ectoderm adjacent to the neural tube induce slug in the future neural crest and maintain Pax-3 and Pax-7 expression dorsally. Ventrally, Shh, now produced by the floor plate, induces motoneurons. C, Shh, produced by the floor plate, suppresses the Downloaded from: StudentConsult (on 11 January 2013 02:02 PM) expression of dorsal Pax genes (Pax-3 and Pax-7) in the ventral half of the neural tube. 2005 Elsevier
Indukce a epithelo-mesenchymová transformace buněk neurální lišty B.M. Carlson (1999) ISH mrna Slug HH 10
Kraniokaudální členění neurální trubice 2005 Elsevier
Downloaded from: StudentConsult (on 11 January 2013 02:02 PM) Figure 11-7 Experiments illustrating the influence of the notochord on development of the floor plate and exit sites of nerves from the spinal cord. A, Grafting an extra notochord near the neural tube induces a secondary floor plate. B, In the absence of a notochord, a very incomplete floor plate forms, and nerve fibers exit from multiple sites around the spinal cord. C, Slitting the neural plate on one side of the floor plate removes the wall of the neural tube from the influence of the notochord, allowing the disorganized exit of nerve fibers from that part of the spinal cord. (Modified from Hirano S, Fuse S, Sohal GS: Science 251:310-313, 1991.)
Přechodová zóna mezi CNS a PNS (Obersteiner - Redlichova zóna) Při výstupu nervových kořenů z CNS vybíhá neurothel arachnoidey do perineurální pochvy. Centrální myelin (z oligodendroglie) je nahrazován periferním myelinem ze Schwannových buněk, a to skokovou změnou vždy v místě Ranvierova zářezu. Tento přechod se obvykle nachází o něco periferněji, než je makroskopická hranice CNS. Centrální segment je krátký u spinálních nervů. Při výstupu hlavových nervů může být několik mm dlouhý, např. u n. VIII až 26 mm, ale u n. VII jen 1 mm. Až sem také dosahuje gliová hraniční membrána tvořená výběžky astrocytů. Bazální lamina gliové hraniční membrány přechází plynule do bazální laminy jednotlivých periferních nervových vláken. Z klinického hlediska je významné, že v úseku krytém centrální glií nerv neregeneruje, kdežto v periferním úseku krytém Schwannovými buňkami je regenerace možná.
J.H.Martin: Neuroanatomy,1996 Schéma somatotopické distribuce motoneuronů inervujících skupiny svalů horní končetiny a trupu. Transversální řez krční míchou.
Lurai V, Laufer E: Neural Dev, 2007
Lim1+/+ Lmx1b +/+ Lim1 -/- Lmx1b -/- Mediolaterální specifikace motoneuronů - LIM kód Lurai V, Laufer E: Neural Dev, 2007
Rastislav Druga, Miloš Grim, Petr Dubový Anatomie centrálního nervového systému Koedice GALÉN - KAROLINUM; Praha 2011 ISBN Karolinum 978-80-246-1895-1 Sadler Thomas W. Langmanova lékařská embryologie, překlad 10. vydání Grada 2011 ISBN:978-80-247-2640-3
Antonin Střížek http://www.ad-astra.cz/data/pr_strizek.htm
2. Neurální lišta její vývoj, její deriváty W. His (1868)
Struktura této části přednášky: 1) Proč studovat neuralní lištu (NL) 2) Vznik a vývoj NL (indukce, epithelomesenchymová transformace, migrace, diferenciace buněk NL 3) Methody značení buněk NL 4) Typy buněk, které se z NL diferencují 5) Vývojové vady podmíněné defekty NL 6) Buňky NL v epidermis
Proč se věnovat studiu neurální lišty (NL) vznik NL umožnil vývoj a rozšíření obratlovců oproti strunatcům, u kterých není vytvořena, NL je významný embryonální orgán, který přispívá téměř ke všem orgánům těla jako 4. zárodečný list, NL je model pro studium embryonální indukce, determinace a diferenciace buněk, jejich epithelomesenchymové transformace a migrace, NL je model pro studium buněčné invasivity především vzniku metastás z karcinomů, klinický význam NL - její defektní vývoj podmiňuje řadu vrozených vad
Migrace buněk NL in vivo a in vitro
Molekulární mechanizmy diferenciace buněk NL Diferenciaci ovlivňují dvě kategorie molekul: a) signální molekuly (cytokiny, růstové faktory, hormony) b) transkripční (diferenciační) faktory Molekulární mechanizmy migrace buněk NL Migraci ovlivňují tři kategorie molekul: a) permisivní contact-guidance b) chemorepelentní molekuly c) parakrinní signální systémy migrace
Diferenciace buněk NL a jejich regionální identita Signální molekuly na trasách migrace buněk neurální lišty indukují expresi transkripčních faktorů a jim podřízených genů: nediferencované multipotentní buňky jsou postupně transformovány v sady bipotentních a unipotentních buněk s lokálně specifickou identitou
Signální molekuly působí mezi buňkami a indukují expresi transkripčních faktorů a jim podřízených genů. Vážou se na specifické receptory v cytoplazmatické membráně. Receptory mají nitrobuněčnou složku zajišťující přenos signálu do jádra, které odpovídá změnou genové exprese Transkripční faktory jsou proteiny, které působí v jádře jako regulátory genové exprese. Jejich společnou vlastností je schopnost vazby na specifické sekvence DNA - promotory a enhancery V embryu lokální signalizace určují, že určité typy buněk se diferencují na určitém místě a v určitém čase In vitro lze lokální embryonální signalizaci nahradit složením media - přidáním růstových faktorů a signálních molekul lze cíleně navodit proliferaci a určitou diferenciaci buněk
Epigenetic landscape was originally a metaphor for biological development. Its originator, Conrad Hal Waddington (1905-1975), said that cell fates were established in development much like a marble rolls down to the point of lowest local elevation.
Molekulární mechanizmy migrace buněk NL Permisivní contact-guidance + chemorepelentní molekuly fibronektin Parakrinní signální systémy migrace: tenascin Scatter factor /c-met receptor, Pax3 Steel factor (stem cell factor) /c-kit receptor Chemokin SDF-1 / CXCR4 receptor HNK-1
Neurální lišta a periferní nervový systém HNK-1
Deriváty neurální lišty (na hlavě také ektomesenchym) Ectomesenchym: osteoblasty, fibroblasty, chondroblasty, hladké svalové buňky, tukové buňky, odontoblasty
Migrace buněk hlavové neurální lišty z prosencephala a mesencephala do okolí oka a čichové plakody, z rhombencephala do žaberních oblouků po obvodu faryngu R1, 3 a 5 - převážně apoptóza R2 1. žaberní oblouk R4 2. žaberní oblouk, R6 3. žab. oblouk R7 4. žab. oblouk srdeční neurální lišta ze 4. 8. rhombomery do výtokového traktu srdce identita buněk neurální lišty ED4 kuře N. LeDouarin (1999) v jednotlivých rhombomerách je podmíněna expresí Hox genů
Buňky z hlavové neurální lišty část senzit. ganglií V., VII., IX., X. parasymp. ganglia a jejich satelitní buňky Schwannovy buňky, glomus caroticum parafolikulární C buňky (kalcitonin), melanocty, ektomesenchym skelet, chrupavky a vazivo v obličejové části hlavy, odontoblasty, hlavový leptomeninx, část střední a zevní vrstvy oční koule, m. ciliaris, vazivové stroma thymu, štítné žlázy, příštítných tělísek, slinných žláz a slzné žlázy, stěna cév žaberních oblouků (bez endotelu), hladké svalové buňky, tukové buňky srdeční neurální lišta výtokový trakt srdce, velké cévy z oblouku aorty
Vývojové vady z defektů neurální lišty CHARGE syndrom (Coloboma iridis, Heart defects, Atresia choanae, Retardation of development, Genital hypoplasia in males, Ear anomalies) DiGeorgeův syndrom (hypofunkce příštítných žláz a štítné žlázy, hypoplasie thymu, defekty septace aorty a truncus pulmonalis anomálie zubů albinismus Waardenburgův syndrom (Pax3 mutace defekty pigmentace, defekty konč. svalů, rozštěp patra, kardiovaskulární defekty, hypertelorismus) Hirschsprungova choroba Piebaldism
Pax3 mutace u myši (splotch mutace) ED 13.5 Sp1H/+ Sp1H/ Sp1H
Piebaldism (defekty pigmentace, sterilita, anemie) mutace KIT genu a podobná mutace Kit genu u myši
Buňky neurální lišty v končetině Do základu končetiny migrují: buňky neurální lišty angiogenní buňky myogenní buňky
Znázornění buněk neurální lišty v embryonálních chimérách bílé leghornky a japonské křepelky QCPN
ED 3 ED 17
Q/C ED 17
C/Q ED 17
Znázornění buněk neurální lišty u savců pomocí reportérového genu lacz (E. coli) transgenní myš Wnt1/lacZ trvalá exprese reportérového genu lacz s využitím cre-lox systému: transgenní myš Wnt1-cre/R26R průkaz exprese reporterového genu lacz indigogenní metoda (Xgal) při ph 7.5 imunohistochemicky (Bgal) (rabbit anti-e. coli β-galaktosidase; Chemicon)
Průkaz buněk neurální lišty sledováním exprese genu Wnt1 pomocí reporterového genu lacz Wnt1-lacZ ED 9.5 Xgal Bgal
Cre-lox systém: trvalá exprese reportérového genu v buňkách neurální lišty myš Wnt1-cre / + myš R26R / + loxp Cre-rekombináza Wnt1 promotor (specifický pro neurální lištu) STOP β-gal R26R promotor (ubikvitérní) Wnt1-cre / R26R myš loxp loxp STOP R26R promotor β-gal Cre-rekombináza rozpozná loxp a vystřihne označený STOP loxp β-gal β-galaktozidáza je exprimována konstitutivně
Exprese reportérového genu LacZ v buňkách neurální lišty embrya Wnt1-cre/R26R myší mutanty Xgal Xgal ED 9.5 Xgal Xgal Vlasové folikuly, ED 17.5
ED13, X gal ED13, B gal
Jiang et al., Dev Biol 241:106, 2002
Vývoj zubu u myši Xgal (Wnt1-cre/R26R) (Chai et al. Development 127:1671, 2000) Z NL pochází mesenchym dentální papily: odontoblasty, vazivo pulpy, cementoblasty, periodontium Bgal
Srdeční neurální lišta oblast 4. 8. rhombomery z NL pochází výtokový trakt srdce a velké cévy z oblouku aorty Wnt1-cre/R26R transgenní myš, Xgal, 7. 9. týden Jiang et al.: Development 127:1607, 2000
Fate Maps of Neural Crest and Mesoderm in the Mammalian Eye P. J. Gage, W. Rhoades, S. K. Prucka and T. Hjalt, Invest Ophthalm & Vis Sci. 46:4200 8, 2005
Merkel cells are derived from the neural crest: Bgal K8 they express beta-galactosidase, the neural crest cell marker, in compound transgenic Wnt1-cre/R26R mice and K8, the MCs marker Xgal / K8 Bgal/K8 Szeder V, Grim M, Halata Z, Sieber-Blum M: Dev Biol 253: 258, 2003
3. Buňky neurální lišty v epidermis (melanocyty, Merkelovy buňky)
Merkelova buňka: velká, světlá buňka, která spolu s nervovým zakončením tvoří pomalu se adaptující mechanoreceptor v kůži a ektodermové sliznici obratlovců Merkelovy buňky u člověka představují 3.6-5.7% buněk bazální vrstvy epidermis (Fradette et al., 2003)
F. S. Merkel: Tastzellen v kůži savců a ptáků (1875)
Merkelova buňka je receptivní jednotkou mechanického podnětu, kontakt s axonem je místem synaptického přenosu Halata Z, Grim M, Bauman K: Anat Rec 271A: 225, 2003
Hmatové (sinusové) chlupy - whiskers
sea-lion
The follicle of sinus hair (whisker) contains the largest known accumulation of Merkel cells CK8/H
ED 10 ED 13 ED 13 Bgal +/ H
Pigmentové buňky v epidermis c-kit-positive melanoblasts c-kit / hem E.M.J.Peters (2002)
NCCs in hair follicles from the back skin Wnt1-cre/ R26R Xgal / CK8 Xgal / nucl. red c-kit Xgal
4. Kmenové buňky neurální lišty ve vlasových folikulech myši
Kmenové buňky neurální lišty ve vlasových folikulech myši Math1 LacZ/+ Bgal + K8 Bgal/H Wnt1cre/R26R Bgal/ H
The follicle of sinus hair (whisker) blood sinus, innervation, bulge
Dissection of the bulge from adult whisker follicle Xgal + NCCs emigrated 4 days after explantation
Bulge explant-derived NCCs express nestin and Sox10 (day 5 in culture) Anti-nestin Ab + DAPI Anti-Sox10 Ab + DAPI
Bulge explant-derived NCCs are pluripotent (2 weeks in culture) Smooth muscle cells Neurons Schwann cells SCIP Ab; anti-s-100 Xgal Melanocyte progenitors anti-sma anti-ß-iii tubulin DAPI Xgal MelEM Xgal
Targeted differentiation into chondrocytes (enccs cultured in presence of BMP-2 ) Anti-collagen type II Ab (red), DAPI (blue), Xgal (black) black
Bulge-derived NCCs undergo self-renewal (determined by serial cloning) Primary clone 6h 48 h 18 h 72 h 5-day-old secondary clone ß-III tubulin Xgal anti-sma Xgal cells from 2-weeks secondary clones
Morphology of EPI-NCSC implants in the lesioned spinal cord Nestin GAD67 RIP
Sieber-Blum M, Schnell L, Grim M, Yao Fei Hu, Schneider R, Schwab ME: Characterization of Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Grafts in the Lesioned Spinal Cord. Molecular and Cellular Neuroscience (accepted February 2006) EPI-NCSC získané z vlasových folikulů byly transplantovány do mechanicky poškozené míchy u dospělé myši a jejich osud byl sledován 3. týden 6. měsíc po transplantaci. Bylo zjištěno, že jsou integrovány, přežívají, neproliferují, netvoří tumor a diferencují se v GABAergní neurony a oligodendrocyty (exprimují neuron-specifický beta III-tubulin, marker GABAergních neuronů glutamate decarboxylase-67, marker oligodendrocytů RIP a basický myelinový protein. Mohou se tedy uplatnit při náhradě lokálních neuronů a při remyelinizaci.
5. Kmenové buňky neurální lišty ve vlasových folikulech u člověka
Růstový cyklus vlasu. Růstová fáze, anagen (2-6 let), začíná regenerací dolního segmentu folikulu. Tvoří se nová cibulka, dermální papila se zvětšuje, buňky v cibulce tvoří kořenové pochvy a v nich nový vlas. Involuce folikulu, katagen (1-2 týdny), je krátká fáze zástavy růstu vlasu. Nové fázi růstu předchází poměrně dlouhé klidové období, telogen (2-6 týdnů), dokud není folikul aktivován k novému růstovému cyklu.
Isolation of human epidermal neural crest stem cells (hepi- NCSCs) from hair follicles Tissue source: skin biopsy from different body locations Epidermis with follicles after dispase treatment Primary culture cells after emigration from isolated follicle Sphere after readhesion
Coexpression of Sox10 and Nestin, Sox10 + Nestin Expression of Nanog Nanog + DAPI hepi-ncscs in tissue culture after emigration from back skin follicles
Differentiation of human epidermal neural crest stem cells fom hair follicles into neural crest progeny Folia Biol. (Praha) 56, 149-157, 2010 Schwann cells GFAP Neurons Beta III tubulin Smooth muscle cells Smooth muscle actin Schwann cells S100
Folia Biologica (Praha) 56, 149-157 (2010)
Poděkování spoluautorům publikací: M. Sieber-Blum, E. Krejčí, V. Szeder, Z. Halata, Yao Fei Hu za poskytnutí transgenních myší: A. P. McMahon, P. Soriano, H. Sucov, B. Fritzsch za poskytnutí protilátky α-math1 Ab J.E. Johnson za technickou pomoc: A. Kautská, E. Kluzáková, M. Pleschnerová, J. Ward za finanční podporu: MŠMT ČR - Výzkumný záměr 1111 00003-3, 0021620806 Centrum buněčné terapie a tkáňových náhrad LN-00A065, 1M 0021620803 (MG), R01 NS38500 (MSB), F05 NS11111 (VS)
Halata Z, Grim M, Christ B: Origin of spinal cord meninges, sheaths of peripheral nerves, and cutaneous receptors including Merkel cells. An experimental and ultrastructural study with avian chimeras. Anat Embryol 182: 529 537, 1990 Grim M, Halata Z, Franz T: Schwann cells are not required for guidance of motor nerves in the hindlimb in Splotch mutant mouse embryos. Anat Embryol 186: 311 318, 1992 Grim M, Christ B: Neural crest cell migration into the limb bud of avian embryos. In: Limb development and regeneration. JF Fallon, PF Goetinck, RO Kelley, DL Stocum (eds). J. WileyLiss, Inc. 1993, pp. 391-402 Grim M, Halata Z: Developmental origin of Merkel cells in birds. In: Merkel Cells, Merkel Cell Carcinoma and Neurobiology of the Skin. eds.: H Suzuki, T Ono, pp. 23-32 Excerpta Medica Internat. Congress Series 1187, Elsevier, 2000 Grim M, Halata Z: Developmental origin of avian Merkel cells Anat Embryol 202: 401-410, 2000 Grim M, Riedlbauchová L, Valášek P: Interaction of head mesoderm and cells of neural crest in the chick. In: Origin and Fate of Somites. Eds.:E.J.Sanders, J.W.Lash, C.P. Ordahl, IOS Press, 2001, NATO Sci. Ser. I. Vol. 329, pp. 48-55 Szeder V, Grim M, Halata Z, Sieber-Blum M: Neural Crest Origin of Mammalian Merkel Cells. Dev Biol 253: 258 263, 2003 Halata Z, Grim M, Baumann KI: Merkelova buňka: morfologie, vývojový původ, funkce. Čas Lék čes 142: 4 10, 2003 Halata Z, Grim M, Baumann KI: Friedrich Sigmund Merkel and his Merkel Cell, morphology, development and physiology review and new results. Anat Rec 271A: 225-239, 2003 Grim M, Halata Z, Szeder V and M Sieber-Blum: Merkel Cells are Postmitotic Cells of Neural Crest Origin. In: The Merkel Cell, eds. Baumann KI, Halata Z, Moll I, Springer, 2003 pp. 89 96 Sieber-Blum M and Grim M: The adult hair follicle cradle for pluripotent neural crest stem cells. Embryo Today 72: 162-172, 2004 Sieber-Blum M, Grim M, Hu YF, Szeder V: Pluripotent Neural Crest Stem Cells in the Adult Hair Follicle. Dev Dyn 231: 258 269, 2004 Sieber-Blum M, Schnell L, Grim M, Yao Fei Hu, Schneider R, Schwab ME: Characterization of Epidermal Neural Crest Stem Cell (EPI-NCSC) Grafts in the Lesioned Spinal Cord. Molecular and Cellular Neuroscience April 2006 Krejčí E, Grim M: Isolation and Characterization of Neural Crest Stem Cells from Adult Human Hair Follicles Folia Biologica (Praha) 56, (4): 149 157, 2010
Děkuji Vám za pozornost!