Univerzita Karlova v Praze. Přírodovědecká fakulta. Studijní obor: Speciální chemicko-biologické obory

Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní obor: Speciální chemicko-biologické obory Studijní program: Molekulární biologie a biochemie organismů Tereza Pavlištová Diferenciační potenciál polydendrocytů v patologických stavech centrálního nervového systému Differentiation potential of polydendrocytes in pathological states of central nervous system Bakalářská práce Vedoucí závěrečné práce: Ing. Miroslava Anděrová, CSc. Praha, 2015

Prohlášení: Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci zpracovala samostatně a že jsem uvedla všechny použité informační zdroje a literaturu. Tato práce ani její podstatná část nebyla předložena k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze, dne 14. 5. 2015 Podpis

Poděkování Ráda bych poděkovala vedoucí své bakalářské práce Ing. Miroslavě Anděrové, Csc. za její odborné rady a vstřícný přístup. Mé díky patří i rodičům za trpělivou pomoc při korektuře bakalářské práce a nakonec mým skvělým spolubydlícím za psychickou podporu a udržení dobré nálady.

Abstrakt NG2 buňky jinak nazývané polydendrocyty nebo prekurzory oligodendrocytů tvoří čtvrtý typ gliových buněk nacházejících se v centrální nervové soustavě (CNS). Na svém povrchu exprimují různé markery, podle kterých je lze identifikovat, mezi ně patří zejména NG2 chondroitin sulfát proteoglykan a receptory pro růstový faktor krevních destiček. Polydendrocyty vznikají jak ve dvou páteřních kanálcích, tak v mozku postupně z ventrální části předního mozku, telencefalonu a diencefalonu. Jejich populace je heterogenní, podle lokalizace v mozku se liší morfologicky, elektrofyziologickými vlastnostmi a rozdílnou diferenciací. V in vitro podmínkách jsou polydendrocyty schopny diferencovat v oligodendrocyty, protoplazmické astrocyty i neurony. V postnatálním mozku mohou NG2 glie diferencovat v astrocyty, ale většina populace zůstává v maturovaném stavu nebo se mění na oligodendrocyty. Při patologickém poškození CNS se polydendrocyty dostávají do aktivovaného, hypertrofovaného stavu a zvyšují svoji expresi NG2 proteoglykanu. Reakce těchto buněk je ovlivněna především prostředím a různými uvolněnými faktory při poranění například růstovými, morfogeny a cytokiny. V závislosti na typu poranění CNS se diferenciační potenciál NG2 glií mění; v ischemických podmínkách jsou schopny tvořit subpopulaci reaktivních astrocytů a nezralých neuronů, ale při demyelinizaci, zánětu, lézi nebo mechanickém poškození nemění svůj osud a diferencují pouze v oligodendrocyty. Odpověď polydendrocytů na patologické stavy tak zřejmě zahrnuje pouze zvýšení proliferace, spoluúčast na tvorbě gliální jizvy a v procesu remyelinizace.

Abstract NG2 cells also called polydendrocytes or oligodendrocyte progenitors comprise fourth type of glial cells in the brain. Ng2 glia express distinct markers on their cell surface, which can be used for their identification. Particularly, NG2 proteoglycan chondroitin sulphate and receptors for platelet-derived growth factor belong to the main markers. Polydendrocytes arise in two canals of spinal cord and also in the ventral part of frontal brain, telencephalon and diencephalon. Population of NG2 cells is heterogeneous because they differ morphologically, by their electrophysiological properties and distinct differentiation potential depending on localization in brain. In conditions in vitro, polydendrocytes can differentiate into oligodendrocytes, protoplasmic astrocytes or neurons. In early postnatal brain, NG2 glia give rise to astrocytes, but most of these cells remain in the mature state or change themselves to oligodendrocytes. Pathological states of the central nervous system cause an activation of polydendrocytes, they start to be hypertrophied and increase expression of NG2 proteoglycan. Reaction of these cells is influenced by environment and chemical factors, for example growth factors, morphogens and cytokines. Depending on the type of CNS disorder the differentiation potential of NG2 glia changes; under ischemic conditions they give rise to certain subpopulation of reactive astrocytes and immature neurons, while demyelinization inflammation, lesion or mechanical damage of tissue does not change their fate. Their main response to pathological stimuli comprises NG2 glia proliferation, glial scar formation and moreover, they participate in the process of remyelinization.

Seznam použitých zkratek AD Alzheimerova choroba (z angl. alzheimer's disease) ALS amyotropní laterární skleróza BDNF neurotrofní faktor (z angl. brain derived neurotrophic factor) bfgf bazický fibroblastový růstový faktor CD68 specifický mikrogliální/makrofágový marker CNS centrální nervová soustava DCX doublecortin, migrační/proliferační marker EGF epidermální růstový faktor (z angl. epidermal growth factor) GFAP gliální fibrilární acidický protein GS glutamin syntetáza Iba1 specifický marker mikroglií (z angl. ionized calcium-binding adaptor molecule 1) IL-1β interleukin 1β IL-6 interleukin 6 kda kilo Dalton, jednotka molekulové hmotnosti proteinů Ki-67 antigenní protilátka proti MKI67 genu, značící proliferaci MBP myelin bazický protein MCAo okluze střední mozkové arterie (z angl. middle cerebral artery occlusion) MCT1 monocarboxylátovový transportér 1 MHC II. hlavní histokompatibilní komplex II. třídy (z angl. major histocompatibility complex II.) MS roztroušená skleróza (z angl. multiple sclerosis) NeuN neuronální marker (z angl. neuron-specific nuclear protein) NG2 chondroitin sulfát proteoglykan, neuralní/gliální antigen 2 NGF nervový růstový faktor (z angl. neuronal growth factor) O4 pre-oligodendrocytický marker OPC oligodendrocytické prekurzory OX-42 monoklonální protilátka proti cd11-b PCNA proliferační marker (z angl. proliferating cell nuclear antigen) PDGF růstový faktor krevních destiček (z angl. platelet-derived growth factor) PLP myelinový proteolipidový protein (z angl. proteolipid protein promotor) Shh morfogen sonic hedgehog SVZ subventrikulární zóna TGF α transformující růstový faktor α (z angl. transforming growth factor α) TGF-β1 tranformující růstový faktor β1 (z angl. transforming growth factor β1)

Obsah 1 Úvod... 9 2 Vlastnosti polydendrocytů... 9 2.1 NG2 glie, prekurzory oligodendrocytů či polydendrocyty?... 9 2.2 Identifikace polydendrocytů... 10 2.3 Původ a vývoj... 11 2.3.1 Páteřní mícha... 11 2.3.2 Mozek...12 2.4 Morfologie... 13 2.5 Elektrofyziologické vlastnosti...14 2.6 Kontakt s neurony... 15 3 Diferenciace polydendrocytů...16 3.1 V in vitro podmínkách...16 3.2 V in vivo podmínkách...16 3.2.1 Prekurzory oligodendrocytů...16 3.2.2 Diferenciace v astrocyty... 17 3.2.3 Diferenciace v neurony... 18 3.2.4 Diferenciace v mikroglie...19 4 Reakce polydendrocytů na patologické stavy centrální nervové soustavy... 20 4.1 Ischemické poškození...21 4.1.1 Reakce NG2+ glií...21 4.1.2 Iba1+/NG2+ buňky... 23 4.1.3 Diferenciace v neuronální prekurzory... 23 4.1.4 Diferenciace v astrocyty... 24 4.2 Excitotoxické léze... 24 4.3 Alzheimerova choroba... 25 4.4 Roztroušená skleróza... 26 4.5 Amyotropní laterární skleróza... 29 4.6 Gliomy... 29 4.7 Mechanické poranění mozku... 30 5 Závěr... 30 6 Seznam použité literatury... 31

1 Úvod V centrální nervové soustavě savců se kromě astrocytů, oligodendrocytů a mikroglií nalézají také buňky, které se nazývají polydendrocyty. Tyto poměrně nově objevené buňky jsou také nazývány NG2 buňky, protože na svém povrchu exprimují antigen NG2 proteoglykan (chondroitin sulfát). Dalším specifickým povrchovým markerem těchto buněk je alfa-receptor pro růstový faktor krevních destiček (PDGFαR) (A. Nishiyama, Lin, Giese, Heldin, & Stallcup, 1996; Stallcup & Beasley, 1987). Polydendrocyty jsou jako jedny z mála buněk schopné se dělit i v dospělém mozku (Dawson, 2003) a v in vitro podmínkách vykazují tyto buňky multipotentní potenciál, neboť jsou schopny diferencovat do dalších buněčných typů. V centrálním nervovém systému (CNS) nebyla zatím za fyziologických podmínek prokázána diferenciace polydendrocytů v jiné buněčné typy než oligodendrocyty. Současný výzkum, který je zaměřen na regeneraci nervové tkáně v patologiích CNS, ukazuje, že polydendrocyty mohou diferencovat i v neurony nebo astrocyty. Úloha těchto buněk není stále plně objasněna, nicméně při mechanickém poškození mozku a demyelinizaci (Keirstead, Levine, & Blakemore, 1998; Komitova, Serwanski, Lu, & Nishiyama, 2011), ischemii (Claus et al., 2013; Honsa, Pivonkova, Dzamba, Filipova, & Anderova, 2012), Alzheimerově chorobě (Li et al., 2013; Nielsen et al., 2013) a dalších poškozeních se dynamicky proměňuje reakce a velikost populace polydendrocytů. V této práci jsou nejprve charakterizovány obecné vlastnosti těchto buněk, jejich identifikace a vývoj, poté shrnuty možnosti jejich diferenciace v in vitro podmínkách a in vivo ve zdravém mozku. V poslední části je popsána úloha polydendrocytů v různých patologických stavech, možnosti jejich reakce a diferenciace, a případné přispění k regeneraci poškozené tkáně. 2 Vlastnosti polydendrocytů 2.1 NG2 glie, prekurzory oligodendrocytů či polydendrocyty? Buňky CNS se obvykle rozdělují do dvou buněčných linií neuronální a gliové. Gliové buňky tvoří oligodendrocyty, astrocyty, mikroglie a polydendrocyty. Poslední jmenované buňky, polydendrocyty, byly objeveny přibližně před 20 lety (Stallcup & Beasley, 1987). Jejich výzkum se začal rozvíjet po nalezení buněk v nádoru mozku myši, kdy tyto buňky svými vlastnostmi neodpovídaly neuronům ani typickým gliovým buňkám. Poté byly v myším postnatálním optickém nervu za použití nejprve toxinu tetanu a později antigenu NG2 identifikovány jako buňky tvořící společný prekurzor oligodendrocytů a astrocytů 2. typu (Stallcup & Beasley, 1987). Polydendrocyty neexprimují markery typické pro astrocyty ani mikroglie, např. gliální fibrilární acidický protein (GFAP), glutamin syntetázu (GS) 9

ani monoklonální protilátku OX-42 rozeznávající cd11-b α podjednotku mikrogliálního komplementového receptoru 3. Od astrocytů i mikroglií se liší také morfologicky. To potvrzuje, že tvoří novou, prozatím ne plně objasněnou, linii buněk v CNS (J M Levine & Card, 1987; Reynolds & Hardy, 1997). c Obrázek 1: (a) Polydendrocyty obarvené pomocí antigenů NG2 a PDGF (Rα) v měřítku 50 μm, (b) Porovnání obarveného NG2 proteoglykanu a (c) PDGFRα v měřítku 10 μm (Rivers et al., 2008) Označení NG2 glie je odvozeno z podobnosti jak neuronům (N) tak gliím (G) protoplazmickým astrocytům 2. typu. V literatuře se setkáváme i s termínem prekurzory oligodendrocytů (OPC), který poukazuje na schopnost polydendrocytů diferencovat v oligodendrocyty. Název polydendrocyty byl použit z důvodu jednotnosti označení všech buněk, které na svém povrchu exprimují NG2+ proteoglykan a poukazuje na vysoký počet jejich rozvětvených výběžků (Watanabe, Toyama, & Nishiyama, 2002). Polydendrocyty jsou také nazývány GluR-buňky, protože exprimují pouze glutamátové receptory a nikoliv glutamátové transportéry jako astrocyty (Matthias et al., 2003). 2.2 Identifikace polydendrocytů K první identifikaci in vitro se používala A2B5 monoklonální protilátka, kterou váží všechny NG2 pozitivní buňky, a která označuje gangliosidy u nezralých oligodendrocytů (Stallcup & Beasley, 1987). A2B5 není ovšem exprimována pouze na polydendrocytech, nýbrž i na jiných buněčných typech, a pro použití in vivo tedy není tak spolehlivá (Chang, Nishiyama, Peterson, Prineas, & Trapp, 2000). Proto bylo nutné nalézt jiné markery, které budou specifické pouze pro polydendrocyty. Přibližně polovina NG2 glií také exprimuje antigen 04, který se vyskytuje především u O-2A prekurzorů oligodendrocytů (Reynolds & Hardy, 1997). Jeho lokalizace je snadno zaznamenatelná v šedé hmotě mozkové, ale selhává v bílé hmotě, protože se překrývá s identifikací oligodendrocytů (Dawson, 2003). NG2 glie na svém povrchu exprimují receptory PDGFRα, na které se váže PDGF, který lze využít jako marker (Hart, Richardson, Heldin, Westermark, & Raff, 1989). Tento protein může tvořit 3 izoformy - homodimery AA/BB nebo heterodimer AB. V CNS převažuje 10

homodimer PDGF-AA, který má na NG2+ glie mitogenní účinek a přímo stimuluje jejich proliferaci a diferenciaci (Pringle & Richardson, 1993; Pringle et al., 1989). Hlavním markerem, pomocí kterého se nyní identifikují polydendrocyty, je NG2 chondroitin sulfát (A. Nishiyama, Dahlin, Prince, Johnstone, & Stallcup, 1991). Povrchový NG2 proteoglykan se řadí do rodiny chondroitin sulfát proteoglykanů (CSPGs), je tvořen 300 kda jádrem glykoproteinu a dvěma nebo třemi chondroitin sulfátovými řetězci. Obsahuje velkou extracelulární doménu a krátký cytoplazmatický konec. Celková molekulová hmotnost celého proteinu činí asi 600 kda (A. Nishiyama et al., 1991). Jádro tohoto proteinu má na buňky jak pozitivní, tak i negativní vliv. Je schopno vázat PDGF-AA a bazický fibroblastový růstový faktor (bfgf), který ovlivňuje extracelulární doménovou lokalizaci a diferenciaci polydendrocytů. Navíc tyto látky působí inhibičně na růst neuronů, včetně axonů, nepodporují adhezi, a ani jejich případnou regeneraci in vitro (Dou & Levine, 1994) ani in vivo v patologiích CNS (Tan, Colletti, Rorai, Skene, & Levine, 2006). Avšak podle Yanga (Yang et al., 2006) toto negativní ovlivnění způsobuje právě samostatné jádro NG2 proteoglykanu, na který se později mohou navázat další látky způsobující blokaci růstu neuronů. Naopak NG2+ buňky vyskytující se v blízkosti neuronů mohou způsobit prodlužování a plasticitu axonů (Yang et al., 2006). Polydendrocyty nejsou jedinými buňkami, které jsou schopné exprimovat NG2 chondroitin sulfát. Lze ho nalézt také u buněk hladké svaloviny, chondroblastů a pericytů (Goretzki, Burg, Grako, & Stallcup, 1999). Exprese NG2, PDGFαR a A2B5 je po vývoji mozku a diferenciaci postupně utlumena, přibližně od 30. postnatálního dne (A. Nishiyama et al., 1996), což ztěžuje možnost určení osudu terminální diferenciace NG2 glií (Zhu, Bergles, & Nishiyama, 2008). 2.3 Původ a vývoj 2.3.1 Páteřní mícha Polydendrocyty vznikají ve ventrální zóně páteřní míchy ve dvou páteřních kanálcích. V 10. 12. dni embryogeneze se jako první rozlišitelné markery objevují transkripční regulátory Olig1 a Olig2, které jsou indukované pomocí morfogenu Sonic hedgehog (Shh), který kontroluje diferenciaci neuronů a oligodendrocytů v páteřní míše. S těmito transkripčními faktory je spojen také Sox10, který aktivuje geny sloužící k myelinizaci (Zhou, Wang, & Anderson, 2000). Přibližně v 16. dni embryonálního vývoje lze identifikovat PDGFαR+/NG2- buňky. V průběhu následujících dvou dní polydendrocyty migrují z přední ventrální oblasti z tzv. pmn a p3 domény a rovnoměrně se rozšiřují do ventrální i dorzální části páteřní míchy (A. Nishiyama et al., 1996; Pringle & Richardson, 1993). Zároveň 11

s vývojem v přední ventrikulární zóně se menší počet buněk vyvíjí i v zadní části ventrikulární zóny. Tato oblast tvoří další zdroj budoucích oligodendrocytů, které do celkové populace přispívají cca 10 15% (Kessaris et al., 2006). Exprese NG2 proteoglykanu se objevuje na konci embryonálního vývoje u PDGFαR-pozitivních buněk, kdy je tedy již možná současná identifikace pomocí PDGFαR a NG2+ (A. Nishiyama et al., 1996). Maximální exprese těchto buněčných markerů nastává v prvním týdnu postnatálního vývoje. Proliferace polydendrocytů pokračuje i po dvou týdnech a v tomto období také začíná pozvolna klesat exprese PDGFαR i NG2+ (A. Nishiyama et al., 1996). Obrázek 2: Průřez neurální trubicí, který zobrazuje domény, ze kterých se tvoří neuronální a gliové progenitory. Z ventrální p0, p1, p2 a p3 domény vznikají interneurony, z pmn domény motorneurony a oligodendrocyty (Rowitch & Kriegstein, 2010). 2.3.2 Mozek Primárním zdrojem prekurzorů oligodendrocytů v mozku jsou mediální ganglionické eminence a ventrální část předního mozku (Kessaris et al., 2006). Tam lze poprvé detekovat PDGFαR, a to již v 11. 12. dni embryonálního vývoje (Pringle & Richardson, 1993). Později se polydendrocyty vyvíjejí také v oblasti laterárních ganglionických eminencí a telencefalonu (Kessaris et al., 2006; Pringle & Richardson, 1993). Expresi Olig1 a Olig2 pod kontrolou morfogenního signálu Shh lze zaznamenat ve ventrikulární zóně středního a zadního mozku (Nery, Wichterle, & Fishell, 2001; Zhou et al., 2000). Stejně jako v páteřní míše existuje další centrum vývoje i v dorzální části, ovšem polydendrocyty zde vznikají pouze přechodně a v 15. dni embryogeneze již není možné je detekovat (Kessaris et al., 2006; Zhou et al., 2000). Zároveň je v 15. dni vývoje v předním mozku detekováno společně s PDGFαR také NG2 (A. Nishiyama et al., 1996). Polydendrocyty tedy nejspíše vznikají primárně ve ventrální zóně telencefalonu a diencefalonu, a později migrují. V prvních dnech postnatálního 12

života pak vykazují vysoký proliferační potenciál a velmi rychle se rozšiřují po celém mozku. (Menn et al., 2006; A. Nishiyama et al., 1996; Pringle & Richardson, 1993; Zhou et al., 2000). Obrázek 3: Vývoj polydendrocytů v mozku. Červeně označena první vlna vzniku ve ventrální části mozku, modře druhá vlna v dorzální části a telencefalonu, poslední zeleně označená lokace vzniku z ventrálního předního mozku (Kessaris et al., 2006). Vzhledem k jejich mitogennímu potenciálu existují místa, kde se tyto buňky v dospělosti preferenčně tvoří například v gyrus dentatus, hipokampu nebo v subventrikulární zóně (SVZ) postranních komor. Tato místa pak slouží jako zásobárna při poškození mozkové tkáně (Menn et al., 2006; J. Sypecka, Sarnowska, & Domanska-Janik, 2009). Míra proliferace se určuje pomocí začlenění bromodeoxyuridinu, jehož zvýšená hladina byla potvrzena právě u buněk osidlujících SVZ. Z výsledků studií lze usoudit, že polydendrocyty jsou cyklující buňky schopné proliferovat i v průběhu života v závislosti na jejich lokalizaci a stáří mozku. Maximální proliferace a diferenciace trvá pouze několik týdnů od narození a poté se postupně snižuje (Dawson, 2003; Kang, Fukaya, Yang, Rothstein, & Bergles, 2010). 2.4 Morfologie Polydendrocyty mají tělo pravidelného kruhového nebo oválného tvaru o průměru asi 5 10 μm, ze kterého vyrůstají výběžky. Primární výběžky vystupující z těla buněk jsou nejsilnější a nejdelší, a dále se pak bohatě rozvětvují v menší a užší sekundární a terciární výběžky. Pod elektronovým mikroskopem lze snadno rozeznat jádra polydendrocytů tvořená hustým heterochromatinem, které obklopuje tenká vrstva cytoplazmy s malým počtem organel. Antigenní NG2 barvení je nejvíce znatelné v cytosolu a buněčné membráně, což ukazuje lokalizaci NG2 proteoglykanu v polydendrocytech (Ong & Levine, 1999). Obvykle se vyskytují spíše jako jednotlivé buňky, pouze výjimečně tvoří páry a lze je identifikovat v páteřní míše i rovnoměrně rozložené v obou mozkových hmotách ve všech vrstvách neokortexu, hipokampu i mozečku (Ong & Levine, 1999). Vzhled buněk se liší podle jejich lokalizace v mozku. V bílé hmotě, kde osidlují především corpus callosum 13

a molekulární vrstvy mozečku, mají hladké, oválnější a delší tělo a výběžky jsou prodloužené směrem k axonům. V šedé hmotě, zejména v mozkové kůře, polydendrocyty nepatrně mění svoji morfologii a začínají svým vzhledem připomínat spíše astrocyty. Zvětšují tělo, které má nepravidelný tvar a svoje výběžky prodlužují a rozvětvují do všech směrů (Dawson, 2003; A. Nishiyama et al., 1996). Obrázek 4: Vlevo: typická morfologie polydendrocytů v šedé kůře mozkové, polydendrocyty mají hvězdicovitý tvar. Vpravo: zobrazeno prodloužené tělo polydendrocytů s méně výběžky v bílé hmotě (corpus callosum) (Dawson, 2003) V případě patologického poškození mozku je typickou odpovědí aktivovaný a hypertrofovaný stav polydendrocytů. Projevuje se změnou morfologie, kdy buňky zvětšují tělo a zesilují výběžky. Zahrnuje také zvýšenou proliferaci a expresi NG2 a jeho přesun na buněčný povrch (Ong & Levine, 1999). 2.5 Elektrofyziologické vlastnosti Klidový membránový potenciál polydendrocytů dosahuje hodnot zhruba -77.2 ± 1.9 mv. In situ vykazují membránový odpor 120 MΩ, a membránovou kapacitanci 9.5 ± 0.8 pf (Honsa et al., 2012). Elektrofyziologické studie NG2 glií pomocí metody terčíkového zámku v konfiguraci celé buňky odhalily, že na svém povrchu exprimují několik typů K + napěťově závislých iontových kanálů tzv. komplexní profil. Obsahují napěťově řízené Na + kanály, přechodný K + a opožděný K + a Ca 2+ řízené K + kanály (Barres, Koroshetz, Chun, & Corey, 1990; Bergles, Roberts, Somogyi, & Jahr, 2000; De Biase, Nishiyama, & Bergles, 2010; Schools, Zhou, & Kimelberg, 2003). Expresí Na + kanálu připomínají neurony, ale liší se proudovou hustotou Na + a K + a jejich aktivační hranicí. Některé výzkumy také naznačují, že exprese K + kanálů může ovlivňovat diferenciaci a proliferaci polydendrocytů (Barres et al., 1990; Pivonkova, Benesova, Butenko, Chvatal, & Anderova, 2010; Xie et al., 2007). Většina polydendrocytů také exprimuje receptory glutamátové typu; AMPA a kainátové i NMDA a GABA receptory zejména v corpus callosum, tyto buňky jsou v kontaktu se synapsemi nemyelinizovaných neuronů. Receptory jsou schopné přijímat 14

glutamatergní a GABAergní signály a mohou sloužit k depolarizaci (Bergles et al., 2000; De Biase et al., 2010). Právě v corpus callosum se při akčním potenciálu uvolní z presynaptického zakončení měchýřky s glutamátem, který aktivuje receptory a může ovlivnit proliferaci, migraci i diferenciaci polydendrocytů (De Biase et al., 2010; Gallo et al., 1996; Chittajallu, Aguirre, & Gallo, 2004; Ziskin, Nishiyama, Rubio, Fukaya, & Bergles, 2007). NG2 glie se liší v elektrofyziologických vlastnostech v závislosti na oblasti mozku v bílé hmotě jsou pasivní proudy u NG2 glií minimální a mají vyšší vstupní odpor, membránový potenciál dosahuje hodnot ~-70mV. Buňky v šedé hmotě jsou hyperpolarizované jejich membránový potenciál dosahuje -85mV (Chittajallu et al., 2004). Tyto vlastnosti naznačují na možné subtypy polydendrocytů. 2.6 Kontakt s neurony NG2 imunoreaktivitu lze detekovat v těsné blízkosti neuronů. Signál je pozitivní mezi pre- a postsynaptickými strukturami v šedé hmotě, kam zasahují rozšiřující se výběžky NG2 glií (Komitova, Zhu, Serwanski, & Nishiyama, 2009; Ong & Levine, 1999). V bílé hmotě jsou téměř všechny polydendrocyty v kontaktu se synapsemi axonů a axolemmální membránou v Ranvierových zářezech (Bergles et al., 2000; Ong & Levine, 1999). Podle elektrofyziologických vlastností lze NG2 glie zařadit do dvou odlišných skupin, které se liší expresí napěťově řízených závislých Na + kanálů. Morfologicky se od sebe tyto dvě skupiny nijak neliší, ale buňky, které vykazují depolarizací aktivované a na tetrodoxin citlivé Na + proudy začínají postnatálně po týdnu od vývoje ztrácet markery určující oligodendrocytickou linii Olig2- a O4- (Káradóttir, Hamilton, Bakiri, & Attwell, 2008). Dalším rozdílem je jejich schopnost generovat akční potenciál a zároveň i přijmout inhibiční/excitační signál vedený neuronem. Většina z polydendrocytů s Na + kanály je schopna excitace přes napěťově řízené kanály a 20% z těchto buněk je schopno vytvořit akční potenciál (AP) (Ge, Zhou, Luo, Jan, & Jan, 2009). Tato vlastnost přetrvává pouze v neonatálním vývoji, protože tyto buňky mají vyšší membránovou rezistenci a nižší K + vodivost (De Biase et al., 2010). Navíc během vývoje rychle ztrácí AMPA i NMDA receptory, a proto přestávají být schopné tvořit AP. Později jsou schopné už jen přijímat signály od neuronů a to až do doby terminální diferenciace (De Biase et al., 2010; Ge et al., 2009; Chittajallu et al., 2004; Káradóttir et al., 2008). Ze spojení neuron-ng2 glie lze usuzovat, že polydendrocyty hrají určitou roli v synaptickém přenosu, podporují růst axonů a vedení a reagují na změny způsobené poškozením. 15

3 Diferenciace polydendrocytů 3.1 V in vitro podmínkách V konkrétních in vitro podmínkách, v závislosti na složení média, je možné přeměnit polydendrocyty v oligodendrocyty nebo astrocyty 2. typu. Růst v definovaném médiu bez séra s přidáním růstových faktorů PDGF a bfgf způsobí diferenciaci NG2 glií v oligodendrocyty společně s expresí GC a myelin bazického proteinu (MBP) (Kondo & Raff, 2000; J. M. Levine & Stallcup, 1987). Při použití média, které obsahuje sérum, jsou NG2 glie schopné přeměnit se na GFAP+ protoplazmické astrocyty (Stallcup & Beasley, 1987). Nicméně v tomto médiu s obsahem růstových faktorů PDGF a bfgf, se při správném poměru a době kultivace mohou z polydendrocytů stát multipotentní buňky. Polydendrocyty se v takovém případě diferencují v neurony nebo astrocyty a exprimují příslušné povrchové detekční markery. Jejich osud přeměny v oligodendrocyty tedy není nevratně daný a v in vitro podmínkách ho lze změnit (Belachew et al., 2003; Kondo & Raff, 2000). Tato teorie je vyvracena jinými výzkumy, protože při použití média pro neurální kmenové buňky nebyly detekovány žádné znaky, které by určovaly diferenciaci polydendrocytů v neurony (Zhu et al., 2008). 3.2 V in vivo podmínkách 3.2.1 Prekurzory oligodendrocytů V dospělém mozku lze nalézt stabilní populace nezralých oligodendrocytů, tzn. polydendrocytů, z nichž necelá polovina dál proliferuje a tvoří dospělé oligodendrocyty (Rivers et al., 2008). Protože v průběhu diferenciace dochází k utlumení exprese NG2, A2B5 a PDGFRα (A. Nishiyama et al., 1996), pro ověření hypotézy, že NG2 glie vykazují multipotentní potenciál in vivo, se nejčastěji používají značení přes různé linie transgenních myší. Ty poté exprimují různé fluorescenční detekční látky, které jsou pod kontrolou odlišných promotorů. Pomocí této metody je tedy potvrzeno, že z polydendrocytů mohou vzniknout myelinizující oligodendrocyty v obou mozkových hmotách a tato diferenciace je podmíněna přítomností Olig2 a Sox10 (Dimou, Simon, Kirchhoff, Takebayashi, & Götz, 2008; Kang et al., 2010; Zhu et al., 2008). 16

Obrázek 5: Schéma diferenciace progenitorových buněk v oligodendrocyty (Schumacher et al., 2012) Diferenciace polydendrocytů v oligodendrocyty neprobíhá synchronně a má několik různých stupňů, které se odlišují podle toho, které markery jsou exprimovány. Více jak třetina NG2+ buněk diferencuje v první stupeň, kdy současně exprimuje NG2+ a preoligodendrocytický marker O4+. Poté se ztrácí exprese NG2 a buňky pozitivní na O4 začnou exprimovat GC a nakonec dozrávají v dospělé oligodendrocyty (Dawson, 2003; Kang et al., 2013; A. Nishiyama et al., 1996; Reynolds & Hardy, 1997). Navíc je také možné detekovat buňky s expresí NG2+/O4+/GC-, které zůstávají ve stádiu oligodendrocytických progenitorů, a dál nematurují (Reynolds & Hardy, 1997). Zbylé NG2 glie zůstávají v nediferencovaném stavu a později zřejmě mohou hrát roli v patologii CNS a regeneraci poškozené tkáně (Kang et al., 2013; Zhu et al., 2008). Rozsah diferenciace NG2 glií závisí na několika dalších faktorech, a to na okolním prostředí, uvolněných látkách a signálech určujících, zda se budou polydendrocyty diferencovat v oligodendrocyty nebo jiné buněčné typy (Levison, Young, & Goldman, 1999). Záleží také na lokalizaci polydendrocytů, podle několika prací ovlivňuje míru diferenciace odlišné environmentální prostředí bílé a šedé hmoty (Dimou et al., 2008; Kang et al., 2010). Procento buněk přeměněných v oligodendrocyty v šedé hmotě je v porovnání s bílou hmotou nižší a více buněk zůstává v nediferenciovaném stavu. Míra a rychlost diferenciace je ovlivněna rovněž věkem, kdy detekce ve starším mozku ukazuje na menší počet buněk diferencujících v oligodendrocyty (Dimou et al., 2008; Zhu et al., 2008). 3.2.2 Diferenciace v astrocyty Diferenciace polydendrocytů v protoplazmické astrocyty byla poprvé potvrzena v in vitro podmínkách (Hill & Nishiyama, 2014)*. K ověření diferenciace se opět používají transgenní myši pod kontrolou různých promotorů, přičemž výsledky studií provedené na toto téma nejsou zcela shodné. Při použití Cre rekombinázy se potvrzuje možnost 17 * sekundární citace, převzato z Raff MC, Miller RH, Noble M, 1983, Nature

vzniku protoplazmických astrocytů in vivo (Dimou et al., 2008; Zhu et al., 2008), kde NG2 glie diferencují v astrocyty, ovšem pouze v šedé hmotě ve ventrální části předního mozku především v hypotalamu a talamu. Tyto detekované NG2+/GFAP+ buňky vznikají prenatálně během vývoje, zatímco postnatálně nebyla potvrzena žádná přeměna v protoplazmické astrocyty. Při použití myelinového proteolipidového proteinu (PLP), který kontroluje MBP, se objevuje malá skupina pozitivních NG2 glií. Ty diferencující i postnatálně v postmitotické astrocyty a nacházejí se opět pouze v šedé hmotě (Dimou et al., 2008; Guo, Ma, McCauley, Bannerman, & Pleasure, 2009; Rivers et al., 2008; Zhu et al., 2011). Možná diferenciace v astrocyty je pravděpodobně způsobena spontánním utlumením transkripčního faktoru Olig2, který do té doby určuje osud NG2 glií jako budoucích oligodendrocytů. Z tohoto důvodu je možné ve ventrální části mozku pozorovat zároveň se vyskytující oligodendrocyty i astrocyty odvozené od NG2 glií. Taktéž opět platí závislost míry diferenciace na lokalizaci buněk v mozku a věku jedince (Zhu et al., 2011). V kontrastu s těmito výsledky jsou studie provedené výzkumnými skupinami (Huang et al., 2014; Kang et al., 2010; Rivers et al., 2008), které nenašly v bílé ani šedé hmotě žádné NG2+ buňky diferencující v astrocyty. Detekce GFAP neukázala žádné pozitivní barvení společně s NG2 antigeny. Dalším pokusem o identifikaci astrocytů odvozených od polydendrocytů bylo použití jiného astrocytického markeru, S100β podjednotky, která byla u malého počtu buněk detekována v corpus callosum a kůře. I přes pozitivní koexpresi ovšem nelze podle S100β podjednotky stanovit astrocytický fenotyp, protože může být exprimována na více buněčných typech. Navíc tyto NG2+/S100β pozitivní buňky zároveň exprimují i Sox10, který značí zařazení do linie oligodendrocytů (Honsa et al., 2012; Rivers et al., 2008). 3.2.3 Diferenciace v neurony V průběhu let se objevuje mnoho různých názorů na možnou diferenciaci polydendrocytů v neurony in vivo. Po důkazech in vitro se mnoho vědců snaží potvrdit či vyvrátit tuto domněnku a určit multipotentní potenciál NG2 glií. Nastává stejná situace jako u vzniku astrocytů a předkládané studie ukazují protikladné výsledky v závislosti na použité metodě výzkumu. 18

Při detekci pod kontrolním promotorem PLP jsou NG2 glie schopné dát vznik pyramidálním neuronům, především v oblasti piriformu, v menší míře v kortexu a dokonce interneuronům v hipokampu. Tato možnost diferenciace trvá zhruba do 3. týdne od narození a klesá s věkem (Guo et al., 2010; Rivers et al., 2008; Tamura et al., 2007). Podobné výsledky ukázal i Belachew a spoluautoři (Belachew et al., 2003), který identifikoval populaci glutamatergních neuronů v oblasti hipokampu a gyrus dentatus, které byly dokonce schopny vést akční potenciál. Tyto buňky exprimují NG2+ a NeuN+ marker a v polovině případů i marker nezralých neuronů doublecortin (DCX). Vysvětlením tohoto vzniku neuronů by mohla být možná fúze oligodendrocytů a neuronů, případně i migrace ze SVZ, kterou by potvrzovala exprese DCX migračního markeru (Guo et al., 2009). Obrázek 6: Vlevo: Na obrázku je zobrazena společná lokalizace NeuN (zeleně) a NG2 (červeně) markeru. Vpravo: Společná lokalizace NeuN (zeleně) a DCX (červeně) v neokortexu. Šipky označují NG2+ glie v blízkosti NeuN a DCX. Obrázky jsou v měřítku 20 μm (Tamura et al., 2007) Naopak při použití transgenní myši pod Cre promotorem nebyla za normálních fyziologických podmínek zjištěna žádná koexprese neuronálních markerů a NG2, a tedy ani vznik neuronů z polydendrocytů (Dimou et al., 2008; Honsa et al., 2012; Komitova et al., 2009; Zhu et al., 2011, 2008). Příčinou tohoto heterogenního diferenciačního chování polydendrocytů by mohlo být několik podskupin NG2 glií. Ty jsou rozlišitelné podle toho, zda například exprimují PLP promotor, mají různý proliferační potenciál či vlastnosti a reagují jinak na extracelulární prostředí (Guo et al., 2009; Káradóttir et al., 2008; Rivers et al., 2008; Tamura et al., 2007). 3.2.4 Diferenciace v mikroglie Identifikace mikrogliálních markerů, především OX-42 nebo Iba1+ zároveň s NG2 gliemi je negativní. Předpokládá se tudíž, že za normálních podmínek polydendrocyty v mozku v mikroglie nediferencují (Gao et al., 2010; Tamura et al., 2007). 19

4 Reakce polydendrocytů na patologické stavy centrální nervové soustavy Mnoho studií potvrdilo diferenciaci polydendrocytů v oligodendrocyty, astrocyty i neurony in vitro. Přestože in vivo byla většina těchto možností, kromě oligodendrocytů, poměrně spolehlivě vyvrácena, stále zde zůstává možnost změněné diferenciace polydendrocytů v důsledku patologických podmínek. V poškozené tkáni se v závislosti na lokalizaci v mozku dynamicky mění mikroenvironmentální prostředí, které se skládá z aktivních látek, které ovlivňují všechny přítomné buňky. Při poranění se uvolňují látky jako cytokiny, mitogeny, trofické a jiné růstové faktory a tyto endogenní signály mohou na polydendrocyty působit přímo či nepřímo a ovlivnit tak jejich diferenciaci. Dále také podporují nebo inhibují vývoj, obnovení nebo schopnost proliferace buněk (J. Sypecka et al., 2009). Jedním z klíčových faktorů by mohl být neurotrofní faktor BDNF, který indukuje proliferaci a maturaci. NG2+ buňky začnou být na jeho hladinu citlivé jak v mechanickém (demyelinizačním), tak zánětlivém poškození. Při zvýšené hladině BDNF v gliogenním modelu páteřní míchy polydendrocyty ukazují zpomalený vývoj vedoucí k terminální diferenciaci v myelinizující oligodendrocyty. V hipokampu představujícím neurogenní model jsou hladiny BDNF dvojnásobné, což vede ke stejnému efektu. Naopak v poškozené mozkové tkáni hipokampu je hladina aktivních látek, včetně BDNF, výrazně snížena, čímž se zvýší proliferace polydendrocytů, oligodendrocytů, produkce MBP, a sníží se apoptóza buněk (Joanna Sypecka, Sarnowska, Gadomska-Szabłowska, Lukomska, & Domanska-Janik, 2013; VonDran, Singh, Honeywell, & Dreyfus, 2012). Osud buněk v patologicky poškozené tkáni určuje také transkripční faktor Olig2. Při akutním zranění i při zánětu se v poškozené tkáni přesune Olig2 z jádra do cytoplazmy, což způsobí diferenciaci polydendrocytů na astrocyty (NG2+/GFAP+), které jsou schopné dále proliferovat. Tento stav nastane zhruba u poloviny buněk, a to těch, které jsou schopné se za normálního stavu přeměnit na oligodendrocyty. Astrocytů odvozených od NG2 glií je asi 20% a přežijí zhruba týden, proto lze odvodit, že diferenciace je pouze přechodná (Zhao, Raha-Chowdhury, Fawcett, & Watts, 2009). Mechanické poškození nebo zánět způsobí aktivaci imunitní odpovědi v mozku, do prostředí se začnou vylučovat cytokiny, interleukiny, chemokiny a další látky produkované imunitními buňkami. V reakci na ně se aktivují mikroglie, které exprimují MHC II. a produkují další interleukiny. V některých případech poškození mozku může dojít k narušení hematoencefalické bariéry v mozku, čímž se poruší homeostáza, která je klíčová pro správnou funkci všech buněk. Počet polydendrocytů zůstává konstantní, ovšem buňky se dostanou do hypertrofovaného stavu, který je charakteristický zvýšenou expresí NG2 20

proteoglykanu. Reakce polydendrocytů nastává dříve než aktivace makrofágů a odpovídá na látky produkované pouze krvinkami, na sérum ani při použití imunoglobulinů polydendrocyty nereagují. Hladina testovaných pro a proti-zánětlivých látek (IL-6, IL-8, IL- 1β, TNF-α a TGF-β1 ) se zvyšuje při neurozánětlivém poškození a má na polydendrocyty různý účinek. Působení IL-6 a IL-1β zastavuje proliferaci a diferenciaci NG2 glií. TGF-α ani EGF (epidermální růstový faktor) nezvyšují produkci NG2 proteoglykanu a nezpůsobují aktivaci NG2 glií a naopak TGF-β1 zvyšuje expresi NG2 proteoglykanu. Dále byly také testovány diferenciační faktory PDGF-AB a bfgf, přičemž pouze PDGF je schopen způsobit aktivaci polydendrocytů (Bu, Akhtar, & Nishiyama, 2001; Rhodes, Raivich, & Fawcett, 2006; Wennstrom, Janelidze, Bay-richter, Minthon, & Brundin, 2014; Xiang, Zhu, Jiang, & He, 2015). 4.1 Ischemické poškození U cévní mozkové příhody dochází k ucpání nebo poškození cévy v mozku krevní sraženinou a následné postižení se týká bílé i šedé mozkové hmoty a bazálních ganglií. V bílé hmotě nastává apoptóza či nekróza oligodendrocytů, astrocytů i neuronů způsobená nedostatkem kyslíku, glukózy a následnou glutamátovou excitotoxicitou (uvolnění glutamátu do extracelulárního prostoru). Na gliových buňkách v centru poškození lze po 30 minutách od ischemie pozorovat narůstající buněčný otok a tvorbu vakuol. Později nastává nekróza u nervových vláken. Cytotoxický edém se po 6 hodinách začne pomalu snižovat a tento proces pokračuje až 24 hodin (Pantoni, Garcia, & Gutierrez, 1996). Během 3 až 7 dní se vytvoří ischemická léze a vzniká astroglióza (Honsa et al., 2012). Na okrajích ischemické léze se hromadí GFAP pozitivní buňky se zvýšenou reaktivitou, cytotoxické lymfocyty a makrofágy (Claus et al., 2013) a dojde k aktivaci mikrogliálních buněk identifikovatelných pomocí Iba1+, které postupně překonají ohraničení ischemické léze a dostanou se přímo do jejího centra (Aya-ay et al., 2005; Claus et al., 2013). Obrázek 7: Buněčné rozložení v ischemickém mozku po 7 dnech. Zeleně obarvené buňky značí CD68+ mikroglie, hnědě jsou zbarveny NG2 glie v periinfarktní oblasti tvořící demarkační zónu. Modré astrocyty tvoří gliální jizvu (Claus et al., 2013) 21

4.1.1 Reakce NG2+ glií V rozmezí 24 hodin až 3 dní mizí NG2+ buňky, oligodendrocyty a jejich prekurzory z centra léze (McIver et al., 2010; K Tanaka et al., 2001) a naopak v těsné blízkosti se objevuje více polydendrocytů (Claus et al., 2013; Honsa et al., 2012). Tyto buňky s největším diferenciačním potenciálem tvoří 2/3 všech buněk v periferní oblasti obklopující centrum ischemické léze (Honsa et al., 2012; K Tanaka et al., 2001). Do 7 dní je nekrotická tkáň oddělena astrocyty a neurony společně s NG2+ buňkami, které uvolní proteoglykan a zvýší jeho expresi. Tyto změny zabraňují, aby se funkční buňky dostaly do poškozené tkáně, izolují ji a mohou také případně pomoci při tvorbě gliální jizvy, protože NG2+ chondroitin sulfát blokuje růst axonů. Nejprve je tedy umožněna obnova ostatních buněčných typů a teprve později růst axonů (Claus et al., 2013; Fawcett & Asher, 1999; K Tanaka et al., 2001). Bariéra tvořená NG2+ buňkami vymizí, jakmile je kompletně dokončena astroglióza kolem ischemické léze (Claus et al., 2013). Změna nastává i v morfologii polydendrocytů, ač po 24 hodinách vykazují buňky pouze malé zvětšení. Od 3. dne po ischemii začnou zvětšovat svůj objem a snižovat počet výběžků (Honsa et al., 2012). Původně hvězdicovitý tvar s bohatým rozvětvením se mění na hypertrofovanou buňku se zesílenými a zkrácenými výběžky (K Tanaka et al., 2001). Pomocí detekce buněčných proliferačních markerů Ki-67 a PCNA se potvrzuje, že NG2+ nejvíce proliferují v časovém úseku do 2 týdnů od MCAo, a to především v corpus callosum (Honsa et al., 2012; Kassis et al., 2014). Předpokládá se, že tato zvýšená proliferace a následná diferenciace by mohla vést k opravě a remyelinizaci poškozené tkáně, která je ovšem závislá na mnoha dalších faktorech a nemusí být vždy úspěšná (Kortaro Tanaka et al., 2003). Obrázek 8: Řez mozkem po ischemii s obarvenými polydendrocyty. Vlevo rozmístění po 24 hodinách, vpravo konkrétní lokalizace léze a zvětšená populace po 14 dnech (Kortaro Tanaka et al., 2003) 22

4.1.2 Iba1+/NG2+ buňky Jak již bylo zmíněno výše, do 24 hodin nastává apoptóza všech buněk v ischemickém centru tedy i mikroglií a polydendrocytů. Ovšem již po 3 dnech lze detekovat koexpresi Iba1+ a NG2+ v centru léze a do 7 dní se tyto buňky objevují i na okrajích (Claus et al., 2013; Matsumoto et al., 2008; McIver et al., 2010). Rozložení Iba1+ buněk odpovídá nejprve lokalizaci NG2+ chondroitin sulfátu, později nastává převaha především Iba1+ buněk a makrofágů, zatímco imunoreaktivita NG2+ buněk obklopujících nekrotickou část tkáně klesá (Claus et al., 2013). Uvnitř ischemického centra se nacházejí 2 různé typy buněk, které jsou Iba1 pozitivní (Matsumoto et al., 2008). Třetinu z nich tvoří Iba1+, které nevykazují žádnou NG2 imunoreaktivitu. Druhé 2/3 tvoří Iba1+/NG2+ buňky, které jsou zároveň pozitivní na mikrogliální marker OX-42 a především na Ki-67 značící proliferaci. Většina z nich také obsahuje velké množství fagozomů a slouží tedy pravděpodobně jako makrofágy. Funkce buněk bez fagozomů není jasná, zřejmě se bude týkat regenerace poškozené tkáně (Matsumoto et al., 2008). Především není jasné, odkud pocházejí buňky v centru léze, která je izolovaná astrogliózou a navíc původní buňky spáchaly apoptózu (Matsumoto et al., 2008). Objevení těchto nových buněk při ischemickém poranění by se dalo vysvětlit několika způsoby. Mimo ischemické centrum se dělí již osidlující polydendrocyty (Honsa et al., 2012; Ohta et al., 2003) a možná dále migrují z oblastí, ze kterých primárně pocházejí, tedy SVZ a gyrus dentatus. Schopnost progenitorových buněk NG2+ glií migrovat je ovšem značně omezená a v těchto místech primárního osídlení nebyly nalezeny žádné markery potvrzující migraci a aktivaci buněk (Kortaro Tanaka et al., 2003). To tak nejspíše vylučuje možnost, že by polydendrocyty mohly při poškození migrovat (Claus et al., 2013; Honsa et al., 2012). Druhou a pravděpodobnější alternativou by mohla být přechodná exprese NG2+ u jiných buněk, například u makrofágů/monocytů Iba1+ (Anderova et al., 2011). Iba1+/NG2+ buňky mají pravděpodobně jinou doménu proteoglykanu, protože protein se chová jako transmembránový místo extracelulární (Matsumoto et al., 2008), což potvrzuje, že tyto buňky nejsou klasické NG2 glie. 4.1.3 Diferenciace v neuronální prekurzory Nalezení neuronálního markeru DCX nebo NeuN společně s NG2 by mohlo vést k potvrzení rozmanitého diferenciačního potenciálu polydendrocytů. V žádném z výše jmenovaných výzkumů nedošlo k překrytí a koexpresi těchto markerů, pouze v jednom z případů se objevily buňky DCX+/NG2+. DCX slouží jako marker nově vytvořených buněk a přetrvává asi 14 dní od jejich vzniku, nemusí však nutně znamenat pouze tvorbu neuronů, v tomto případě zřejmě dojde k diferenciaci i v reaktivní astrocyty. Jejich počet nepřevyšuje 5%, a přežijí pouze měsíc od ischemie. Tvorba těchto nových by mohla být indukována pomocí změn v mikroenvironmentálním prostředí, protože při ischemickém 23

poškození se uvolňují různé faktory včetně růstových, které poté ovlivňují diferenciaci polydendrocytů (Honsa et al., 2012). 4.1.4 Diferenciace v astrocyty Vzhledem k mnoha předchozím výzkumům, při kterých se ukázalo, že NG2 glie mohou diferencovat v astrocyty in vitro, se objevila snaha o potvrzení této hypotézy také in vivo při ischemickém poškození a pokus o společnou identifikaci GFAP a NG2+ buněk (Honsa et al., 2012; Sizonenko, Camm, Dayer, & Kiss, 2008). V řádu dní se nepotvrdilo společné pozitivní barvení těchto dvou markerů. Po týdnu od ischemie bylo asi 17% buněk NG2+/GFAP+ a nacházely se jak na okrajích, tak v centru léze (Honsa et al., 2012). V případě, že v centru došlo po delší době k poklesu Iba1+/NG2+, narostl počet buněk vykazujících pouze GFAP+ (Matsumoto et al., 2008). Z toho lze usuzovat, že se tyto 2 typy buněk nějakým způsobem ovlivňují v proliferaci, možná tvoří prekurzory pro GFAP+, neboť nekrotické jádro je v té době již ohraničeno astrogliózou a tudíž není jasné, odkud by jinak tyto buňky pocházely (Honsa et al., 2012; Matsumoto et al., 2008). Diferenciační potenciál polydendrocytů je také závislý na stáří použitého modelu (myši). V postnatální nebo mladé myši mají polydendrocyty multipotentní potenciál (Honsa et al., 2012). Výzkum srovnávající mozek mladé a staré myši po ischemii navíc prokázal vyšší schopnost aktivace polydendrocytů a regeneraci u mladších myší (Ohta et al., 2003). Je jisté, že polydendrocyty hrají podstatnou roli v reparaci poškozené tkáně ischemickou poruchou. Do budoucna je nutné vyjasnit, jak přesně fungují, co spouští jejich proliferaci, jaké buněčné typy z nich mohou vznikat a jaké signalizační dráhy jejich diferenciaci ovlivňují (K Tanaka et al., 2001). 4.2 Excitotoxické léze Dalším modelem poranění mozkové tkáně je použití kainátové kyseliny, která se aplikuje do hippokampu a funguje jako excitotoxin. Kainátová kyselina vytvoří v mozku léze a způsobí excitotoxické poškození, degeneraci a smrt pyramidových neuronů v CA1/CA3 oblasti a smrt oligodendrocytů. Různá vývojová stádia oligodendrocytů jsou rozdílně citlivá na koncentraci kainátové kyseliny, nejméně citlivé jsou právě NG2+ pozitivní buňky, které jsou prekurzory oligodendrocytů. Ovšem nízká koncentrace excitotoxické látky by mohla způsobit jejich aktivaci (Bu et al., 2001; McDonald, Levine, & Qu, 1998; Ong & Levine, 1999). Po 2 dnech od aplikace kainátu vykazují NG2 silnější zbarvení. Začnou typicky měnit svou morfologii a zvětšují svůj objem. Vytvářejí více nových výběžků, která jsou kratší a tlustší. Vnitřní stavba buňky se také proměňuje buňky mají více cytoplazmy 24

a nepravidelné mitochondrie. Svým vzhledem se polydendrocyty liší od astrocytů s tlustšími výběžky i od mikroglií s tenkými a pokroucenými výběžky (Ong & Levine, 1999). V místech nekrózy neuronů je do týdne od aplikace patrné také zvýšení počtu gliových buněk, především NG2+ glií, které vykazují i vyšší imunoreaktivitu. Tento nárůst trvá 14 dní a lze ho pozorovat jen v oblasti ztráty neuronů především v bílé hmotě okolo axonů degenerujících neuronů. Po té poklesne imunoreaktivita ve stratum pyramidale na téměř stejnou úroveň jako před poškozením mozku (Bu et al., 2001; Ong & Levine, 1999). Naopak současná detekce GFAP+ a NG2 neodhalila na buňkách jejich koexpresi. Ve stratum pyramidale se nejprve objevují aktivované astrocyty, které jsou obklopeny imunoreaktivními NG2+ strukturami. Po přibližně 14 dnech od vytvoření léze se astrocyty a polydendrocyty oddělují a tvoří samostatné populace. Lze předpokládat, že v tomto případě z NG2+ buněk nevznikají astrocyty, neboť na svém povrchu neexprimují NG2 proteoglykan (Bu et al., 2001). Zda mohou NG2+ buňky diferencovat do mikroglií zůstává stále nevyřešeno, neboť za normálních podmínek zatím nebyla potvrzena koexprese markerů typických pro NG2 glie a mikroglie. V pokusu za současné detekce NG2 a OX42, který slouží jako mikrogliální marker, se ukázalo, že po 1. dni byl nejprve počet všech značených buněk redukován. Po 14 dnech se objevují 2 odlišné typy buněk, 1. typ exprimuje OX42, ale je NG2 negativní, druhý buněčný typ mění svou morfologii na podobnou makrofágům, má velké, kruhové tělo a krátké výběžky. Uvnitř buněčného těla zároveň exprimuje oba markery OX42+ a NG2+, které ovšem do 90 dní zmizí. Nelze tak potvrdit diferenciaci polydendrocytů v mikroglie ani při patologických poškozeních (Bu et al., 2001). 4.3 Alzheimerova choroba Alzheimerova choroba (AD) je neurodegenerativní onemocnění způsobující progresivní demenci. Poškození mozku je charakterizováno hromaděním a ukládáním amyloid-β-peptidu 1-42 do plaků a tvorbou nerozpustných neurofibrilárních shluků z hyperfosforylovaného tau proteinu. AD postupem času způsobuje především snížení kognitivních funkcí, což zahrnuje zhoršující se ztrátu paměti, artikulaci, vnímání prostoru a motorické funkce, deprese, nespavost a dokonce i halucinace (Mckhann, Drachman, & Folstein, 1984). Poškození se netýká pouze šedé hmoty mozkové, ale i bílé hmoty mozkové, kde nastává především ztráta myelinu a axonů. Tvorba Aβ plaků ovlivňuje všechny buňky v mozku, neboť indukuje oxidativní stres a tvoří volné radikály. Ty jsou toxické pro neurony i endoteliální buňky (Desai et al., 2010; Nielsen, Ek, Orbjörn, Minthon, & Wennström, 2012; Xu et al., 2001) Cytotoxický efekt Aβ plaků také způsobuje apoptózu a nekrózu dospělých oligodendrocytů (Xu et al., 2001). 25

Ačkoliv při jiných neurodegenerativních onemocněních NG2 imunoreaktivita vždy stoupala, při AD lze prvotně zaznamenat výrazný pokles. Nelze však jednoznačně říci, zda je ztráta NG2 způsobena pouze nízkou expresí nebo smrtí polydendrocytů (Li et al., 2013; Nielsen et al., 2013). V průběhu choroby jsou polydendrocyty z počátku rozloženy rovnoměrně a netvoří shluky (Nielsen et al., 2013), později se začínají seskupovat v hipokampální oblasti a v pyramidálních a granulárních vrstvách v okolí Aβ plaků společně s aktivovanými mikrogliemi a astrocyty, a jejich imunoreaktivita se opět zvyšuje (Schefft, 2013). Tvorba plaků navíc způsobí aktivaci a přeměnu polydendrocytů, které jsou následně schopné odstraňovat Aβ plaky mikropinocytózou a degradovat je (Li et al., 2013). U pacientů s Alzheimerovou chorobou je možné nalézt aktivované NG2 glie, které mají menší počet výběžků, které jsou kratší a méně větvené. Zároveň vykazují jasný otok buněčného těla, což značí jejich aktivaci a navíc lze detekovat odlišný typ glií Iba1-/GFAP+, který obsahuje granulární sraženiny NG2 proteoglykanu (Nielsen et al., 2013). Žádné jiné buňky obsahující NG2+ neexprimují zároveň GFAP+, teoreticky by se tudíž mohly polydendrocyty později přeměnit v astrocyty, nebo se jedná o fagocytózu či přechodnou expresi NG2 proteinu (Li et al., 2013; Nielsen et al., 2013; Schefft, 2013). Tyto dva rozdílné fenotypy NG2 glií by také mohly potvrzovat heterogenitu polydendrocytů. 4.4 Roztroušená skleróza Roztroušená skleróza (MS) je neurodegenerativní onemocnění způsobené demyelinizací a zánětem. Autoimunitní odpověď namířenou proti CNS spouští kombinace environmentálních a genetických faktorů, přesná příčina není známa. V průběhu této nemoci se tvoří léze, ve kterých dochází k patologickým změnám tkáně a poškození všech typů buněk nacházejících se v mozku. Konečným stádiem této poruchy jsou vytvořené sklerotické plaky. Po poškození sice dochází k remyelinizaci, ale ta často selhává z několika důvodů, buď dojde k takovému porušení axonů, že již nejsou schopné obnovy, nebo k takovému nedostatku oligodendrocytů, které již případně nejsou schopny tvorby myelinu. Pro úspěšnou remyelinizaci jsou potřebné růstové faktory PDGF a bfgf, které indukují dělení progenitorů oligodendrocytů. S postupující poruchou však klesá jejich produkce, a tím možnost remyelinizace (Roth, Ramírez, Alarcón, & Von Bernhardi, 2005; VonDran et al., 2012). NG2+ buňky jsou přítomny ve všech tvořených typech lézí, jak v bílé, tak i v šedé hmotě. Obecně lze říci, že když se zvýší počet buněk v centru poškozené tkáně, dojde k účinnější remyelinizaci. Velikosti populace polydendrocytů se ovšem v různých studiích liší a liší se i podle typu vytvořené léze. 26