Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2

Transkript

1 UŽIVATELSKÁ PŘÍRUČKA Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 Pro systém Ion Personal Genome Machine (PGM ) a Ion PGM čipy: Ion 314 čip Ion 316 čip Ion 318 čip Katalogové číslo Číslo publikace MAN Revize 1.0 Pouze pro výzkumné účely. Není určeno pro diagnostické účely.

2 Pouze pro výzkumné účely. Není určeno pro diagnostické účely Informace obsažené v tomto dokumentu se mohou změnit bez předchozího oznámení. OMEZENÍ ODPOVĚDNOSTI SPOLEČNOST LIFE TECHNOLOGIES VÝSLOVNĚ ODMÍTÁ VEŠKERÉ ZÁRUKY VE VZTAHU K TOMUTO DOKUMENTU, VYJÁDŘENÉ NEBO IMPLICITNÍ, VČETNĚ ALE NIKOLIV VÝHRADNĚ ZÁRUK PRODEJNOSTI NEBO VHODNOSTI PRO URČITÝ ÚČEL. ZA ŽÁDNÝCH OKOLNOSTÍ NENÍ SPOLEČNOST LIFE TECHNOLOGIES ZODPOVĚDNÁ, AŤ JIŽ NA ZÁKLADĚ SMLOUVY, OBČANSKÉHO PRÁVA, ZÁRUKY NEBO JINÉHO USTANOVENÍ NEBO NA JINÉM ZÁKLADĚ ZA SPECIÁLNÍ, VEDLEJŠÍ, NEPŘÍMÉ, TRESTNÍ, MNOHOČETNÉ NEBO NÁSLEDNÉ ŠKODY VZNIKLÉ VE SPOJENÍ S TÍMTO DOKUMENTEM, VČETNĚ ALE NIKOLIV VÝHRADNĚ V SOUVISLOSTI S JEHO POUŽÍVÁNÍM LICENCE Veškerá práva k systému Ion Personal Genome Machine (PGM ) a zde uvedené informace jsou vlastnictvím společnosti Life Technologies a/nebo jejích dceřiných společností. V souladu s podmínkami, jimiž se řídí používání těchto produktů a informací, uděluje vám společnost Life Technologies a její dceřiné společnosti nevýhradní a nepřenositelnou licenci k používání těchto produktů a informací pouze v souladu s pokyny uvedenými v návodech a dalších písemných materiálech poskytovaných společností Life Technologies a/nebo jejími dceřinými společnostmi. Souhlasíte s tím a přijímáte odpovědnost za to, že s výjimkami uvedenými v podmínkách používání těchto produktů vám nejsou na základě dodávky těchto produktů poskytována žádná další práva nebo licenční nároky k patentům či dalšímu intelektuálnímu vlastnictví, které je majetkem nebo k němuž má společnost Life Technologies platné licence. Omezená licence: Pouze pro výzkumné účely Pořízením tohoto výrobku jsou uživateli udělena omezená nepřenositelná práva k jeho použití s cílem provedení výzkumných experimentů pro výhradní potřeby uživatele. Nejsou udělena žádná práva k přeprodávání tohoto výrobku nebo jeho součástí. Výrobek je určen pouze pro interní výzkumné účely a nikoliv pro komerční účely jakéhokoliv druhu, včetně ale nikoliv výhradně kontroly jakosti a poskytování služeb na základě obchodního vztahu. Více informací k získání dodatečných práv poskytne Out Licensing, Life Technologies, 5791 Van Allen Way, Carlsbad, California 92008, outlicensing@lifetech.com. Licence pro omezené použití: č. 413 Upozornění pro kupujícího: Pouze pro výzkumné účely. Použití pro diagnostické účely vyžaduje získání samostatné licence od společnosti Roche. OBCHODNÍ ZNÁMKY Zde uvedené obchodní známky jsou vlastnictvím společnosti Life Technologies nebo svých příslušných majitelů. Rainin a Pipet-Lite jsou registrované obchodní známky společnosti Rainin Instrument, LLC. MAXYMum Recovery je registrovaná obchodní známka společnosti Axygen Scientific, Inc. Microsoft a Excel jsou registrované obchodní známky společnosti Microsoft Corporation. ELGA a PURELAB jsou registrované obchodní známky společnosti VWS (UK) Ltd Life Technologies Corporation. Všechna práva vyhrazena.

3 Obsah O této příručce... 5 Verze tohoto dokumentu... 5 Účel této příručky... 5 Všeobecné informace... 6 Popis... 6 Použitelnost souprav na přípravu knihoven... 6 Použitelnost souprav na přípravu templátů... 6 Použitelnost softwaru... 7 Postup práce... 7 Obsah soupravy a skladování... 8 Materiál a pomůcky... 9 Systém Ion PGM - Vyobrazení Před použitím systému Ion PGM Zadání plánovaného běhu Čistění a inicializace systému Ion PGM Dříve než začnete Čistění systému Ion PGM Inicializace sytému Ion PGM Sekvenační protokol Čip Ion 316 /Ion Volitelné: Příprava kontrolních fragmentů Ion Sphere Příprava obohacených templát-pozitivních ISP Annealing sekvenačního primeru Kontrola čipu Navázání sekvenační polymerázy na ISP Plnění čipu Výběr a spuštění naplánovaného běhu Sekvenační protokol Čip Ion Volitelné: Příprava kontrolních fragmentů Ion Sphere Příprava obohacených templát-pozitivních ISP Annealing sekvenačního primeru Kontrola čipu Navázání sekvenační polymerázy na ISP Plnění čipu Výběr a spuštění naplánovaného běhu Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 3

4 Příloha A. Knihovny s čárovými kódy Předinstalované sady čárových kódů...43 Volba sady čárových kódů pro sekvenační běh...43 Vlastní sady čárových kódů...44 Další operace se sadami čárových kódů...45 Příloha B. Řešení problémů Příloha C. Ruční úprava ph roztoku W Příloha D. Délka trvání sekvenačních běhů Příloha E. Bezpečnost Použití přístroje...59 Bezpečnostní pokyny...59 Bezpečná manipulace s chemikáliemi...59 Bezpečná manipulace s plynem...60 Biologické riziko...60 Příloha F. Dokumentace a technická podpora Získání bezpečnostního listu...62 Kde získat pomoc...62 Kontaktní údaje...62 Omezená záruka...62 Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 4

5 O této příručce DŮLEŽITÉ! Před použitím této soupravy spolu se systémem Ion Personal Genome Machine (PGM ) si přečtěte pokyny v Příloze E. Bezpečnost na straně 59 této příručky. Verze tohoto dokumentu Předchozí verze této příručky byla verze Ion PGM 200 Sequencing Kit User Guide (číslo publikace , Rev. F). Změny, v nichž se tato verze liší od verze předchozí, jsou uvedeny níže. Revize Datum Popis změn Podporuje novou soupravu Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 (Kat.č ) Podporuje novou soupravu Ion PGM Template OT2 200 Kit (Kat.č ) Zjednodušená příprava promývací láhve 2 již nepožaduje plyn nebo magnetické míchadlo (viz strana 18 a dále) Není nutné provádět oplach čipu po jeho kontrole isopropanolem (strany 25 a 35) Druhý běh může být spuštěn až po 27 hodinách po inicializaci Účel této příručky Uživatelská příručka Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 (číslo publikace MAN ) obsahuje návod a další informace k použití soupravy Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 (kat.č ) s čipy Ion 314, Ion 316 a Ion 318. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 5

6 1 Popis Všeobecné informace Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 (kat.č ) obsahuje reagencie a další materiál pro sekvenování inzertů o délce až ~200 bp pomocí čipů Ion 314, Ion 316 a Ion 318 na přístroji Ion PGM. Dále obsahuje pomůcky potřebné pro čistění a inicializaci přístroje. Souprava obsahuje reagencie a další materiál pro čtyři inicializace přístroje Ion PGM. Počet sekvenačních běhů je proměnlivý, v závislosti na typu běhu: Typ sekvenování Počet cyklů Počet běhů (na jednu soupravu) Maximální počet běhů na jednu inicializaci Čtení 200 bází 500 (125) 8* 2 Čtení 100 bází 260 (65) 12* 3 *Předpokládá maximální počet běhů na jednu inicializaci Po inicializaci by měl být první běh spuštěn do jedné hodiny a poslední do 27 hodin. Poznámka: Pro určité účely je možné zkrátit doby jednotlivých cyklů a délky čtení; viz Příloha D. Délka trvání sekvenování na straně 58. Použitelnost souprav na přípravu knihoven Soupravu Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 lze použít pro čtení v délce až 200 bází pro knihovny jakéhokoliv typu (např. fragmenty gdna, RNA nebo knihovny Ion AmpliSeq libraries). Použitelnost souprav na přípravu templátů Pro optimální výsledky doporučujeme použít následující soupravy pro přípravu templátů: Ion PGM Template OT2 200 Kit (Kat.č ) Ion OneTouch 200 Template Kit v2 DL (Kat.č ) Starší soupravy na přípravu templátů DŮLEŽITÉ! Následující soupravy pro přípravu templátů nejsou doporučeny při použití této soupravy a jejich použití může vést k neoptimálním výsledkům: Ion PGM 200 Xpress Template Kit (Kat.č ) Ion OneTouch 200 Template Kit v2 (Kat.č ) Ion OneTouch Template Kit (Kat.č ) Ion Xpress Template Kit (Kat.č ) Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 6

7 Použitelnost softwaru Tato sekvenační souprava je kompatibilní s verzí a vyšší softwaru Torrent Suite a Ion PGM System. Před použitím této soupravy software aktualizujte. Postup práce Systém Ion PGM provádí následující kroky: Zadání běhu Vyčistění systému Ion PGM Inicializace systému Ion PGM Čip Ion 316 / Ion 318 Typ čipu? Čip Ion 314 Sekvenační protokol: Čip Ion 316 /Ion 318 Sekvenační protokol: Čip Ion 314 Ano Re-Inicializace Ne před dalším během? Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 7

8 Obsah soupravy a skladování DŮLEŽITÉ! Nemíchejte součásti soupravy Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 se součástmi z předchozích sekvenačních souprav, jelikož jejich složení se změnilo. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 (Kat.č ) obsahuje následující součásti: Ion PGM Sequencing Supplies 200 v2 (kat. č ) - Doplňky Součást Barva Množství Objem Skladování Hadičky pro promývací láhve šedá 8 hadiček pro 250-mL láhve 4 hadičky pro 2-L láhve Hadičky pro láhve s reagenciemi modrá 16 hadiček Láhve na reagencie s popiskami (50 ml) 25 láhví Promývací láhev 1 s popiskou (250 ml) zelená 1 láhev Promývací láhev 2 s popiskou (2 L) zelená 1 láhev Promývací láhev 3 s popiskou (250 ml) zelená 1 láhev Ion PGM Sequencing Reagents 200 v2 (kat. č ) - Reagencie 15 C až 30 C Součást Barva Množství Objem Skladování Ion PGM Sequencing 200 v2 dgtp černá 1 zkumavka 100 µl Ion PGM Sequencing 200 v2 dctp modrá 1 zkumavka 100 µl Ion PGM Sequencing 200 v2 datp zelená 1 zkumavka 100 µl Ion PGM Sequencing 200 v2 dttp červená 1 zkumavka 100 µl Ion PGM Sequencing 200 v2 Polymeráza žlutá 1 zkumavka 36 µl Sekvenační primer bílá 1 zkumavka 144 µl Kontrolní částice Ion Sphere čirá 1 zkumavka 60 µl Ion PGM Sequencing Solutions 200 v2 (kat. č ) Sekvenační roztoky 30 C až 10 C Součást Barva Množství Objem Skladování Ion PGM Sequencing 200 v2 roztok W2 černá 4 láhve ml v každé Čistící tablety Ion PGM 4 tablety Annealingový pufr 1 láhev 25 ml Ion PGM Sequencing 200 v2 1X roztok 2 láhve 100 ml W3 každý 2 C až 8 C (chraňte roztok W2 před světlem) Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 8

9 Materiál a pomůcky Pro práci se soupravou Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 je zapotřebí běžné laboratorní vybavení a reagencie. Zkratka BDLV označuje Běžné Dodavatele Laboratorního Vybavení. Potřebný materiál a vybavení: Ion 318 Chip Kit nebo Ion 316 Chip Kit nebo Ion 314 Chip Kit Popis Dodavatel Kat. č. Množství Systém Ion Personal Genome Machine (PGM ) včetně příslušenství Life Technologies ks 8 ks 4 ks 8 ks 8 ks Life Technologies Torrent Server Life Technologies Purifikační systém na vodu Elga PURELAB Flex nebo purifikační systém na vodu Elga PURELAB Flex 3 Life Technologies nebo obdobný 18 MΩ systém Nádoba se stlačeným dusíkem (stupeň 4.8, % nebo lepší) nebo argonem (99.9% průmyslové kvality nebo lepší) Vícestupňový (dvoustupňový) plynový regulátor (výstup 0-50 PSI, 2 3 Bar) BDLV N/A N/A VWR International (volitelné) 1/8" x 1/4" redukce (pouze při použití zvláštní nádoby na promývání) McMaster 5779K699 1 na oplach Minifuga (Galaxy Mini centrifuga nebo obdobná) VWR International Mikrocentrifuga BDLV 1 NaOH (10 M), molecular biology grade BDLV N/A Různé P2, P20, P200, P1000 µl pipety a špičky s filtrem BDLV N/A 1 set Bariérové pipetovací špičky BDLV N/A Různé 5-mL a 25-mL sérologické pipety BDLV N/A Různé Rainin Pipet-Lite LTS L-20 (2 20 µl) Rainin L-20 1 Rainin Pipet-Lite LTS L-100 ( µl) Rainin L Rainin SR-L10F pipetovací špičky Rainin SR-L10F Rainin SR-L200F pipetovací špičky Rainin SR-L200F 0.2-mL MAXYMum Recovery tenkostěnné PCR zkumavky s plochým víčkem (ne polystyrenové zkumavky) Axygen PCR-02-L-C Různé 1.5-mL nebo 1.7-mL mikrozkumavky BDLV N/A Různé Odměrný válec (1 L nebo 2 L) BDLV N/A 1 Společnost Life Technologies ověřila použitelnost protokolu za použití shora uvedeného vybavení. Použití jiného vybavení může mít vliv na kvalitu výsledku. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 9

10 Popis Dodavatel Kat. č. Množství Skleněná láhev (1 L) BDLV N/A 15-mL kónické zkumavky BDLV N/A Nádoba na led a led N/A N/A Rozprašovač N/A 1 Vortex s gumovým nástavcem BDLV N/A 1 Termocykler s vyhřívaným víkem BDLV N/A 1 Volitelné vybavení Ion PGM centrifugační závěs na čipy Life Technologies Souprava Ion PGM Controls Kit2 Life Technologies Souprava Ion PGM Sequencing Sippers Kit3 Life Technologies Záložní zdroj (UPS)4 BDLV N/A 1 Pomůcky potřebné v případě úpravy ph roztoku W2 (viz Příloha C. Úprava ph roztoku W2) Orion 3-Star Plus ph metr s elektrodou a kalibračními pufry (nebo obdobný) Thermo Scientific Magnetický mixer (na 2-L láhve) BDLV N/A 1 Magnetické míchadlo (4 cm) BDLV N/A 1 1 N HCl BDLV N/A Různé 2 Není běžně zapotřebí, pouze pro řešení problémů. 3 Obsahuje dodatečné nasávací trubičky; není běžně zapotřebí. 4 V laboratořích, kde dochází k výpadkům elektrického proudu, doporučujeme použití záložního zdroje (uninterruptable power supply UPS) s výkonem 1500 W nebo vyšším. UPS o výkonu 1500 VA od společnosti APCC udrží systém Ion PGM System v provozu 11 minut. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 10

11 Systém Ion PGM TM - vyobrazení Držák čipu Zemnící destička Odpadní láhev Zkumavky s reagenciemi Promývací láhev 1 (W1) Promývací láhev 3 (W3) Promývací láhev 2 (W2) Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 11

12 Před použitím systému Ion PGM System Kontaminace nukleovými kyselinami DŮLEŽITÉ! Hlavním zdrojem kontaminace jsou DNA fragmenty z předchozích kroků zpracování vzorku. Do laboratoře, kde připravujete knihovny, nenoste vzorky po amplifikaci. DŮLEŽITÉ! K možné kontaminaci může dojít během přenosu dntp do zkumavek. Dbejte, aby nedošlo k vzájemné kontaminaci jednotlivých roztoků dntp. Pro všechny pipetovací kroky použijte špičky s filtrem. Po manipulaci s koncentrovanými roztoky dntp si vyměňte rukavice. Kontaminace CO2 DŮLEŽITÉ! V místnostech, kde pracujete s pufry, promývacími roztoky nebo vodou molekulárně biologické kvality pro systém Ion PGM nepoužívejte suchý led (pevný CO2). Vysoká vzdušná koncentrace sublimujícího CO2 může ovlivnit ph pufrů. Stabilita ph těchto pufrů je pro fungování systému Ion PGM kritická. Vibrace a umístění přístroje DŮLEŽITÉ! Systém Ion PGM umístěte na stůl, kde nedochází k vibracím nebo kde nejsou umístěny vibrující přístroje (mrazáky, pumpy a obdobné vybavení). Vibrace v průběhu sekvenování mohou mít negativní vliv na kvalitu výsledku. Statická elektřina Plyn DŮLEŽITÉ! Umístěte systém Ion PGM tak, že čelo přístroje je min cm a zkumavky s roztoky dntp jsou min cm od přední hrany stolu. Umístěte systém dále tak, aby byl alespoň 1 metr od zdrojů elektronického šumu, jako jsou mrazáky nebo mikrovlnné trouby. DŮLEŽITÉ! Aby nedošlo k poškození čipů vlivem statické elektřiny, vždy se před manipulací s čipem uzemněte tím, že se dotknete destičky umístěné hned vedle držáku čipu nebo v rotoru na čipy. Umístíte li čip na neuzemněný povrch jako např. pracovní stůl, může vlivem statické elektřiny dojít k jeho poškození. VÝSTRAHA! Systém používejte v dobře větraných místnostech, kde se objem vzduchu vymění alespoň 6 až 10krát za hodinu. Zvažte možnost monitorování ventilace, aby nedošlo k riziku udušení vlivem práce s inertními plyny a vyčerpání kyslíku a přijměte přiměřená opatření. Konzultujte umístění systému s odborníky. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 12

13 2 Zadání plánovaného běhu DŮLEŽITÉ! Ujistěte se, že software Torrent Suite a Ion PGM je aktualizován na verzi nebo vyšší, která je zapotřebí pro použití soupravy Ion PGM Sequencing 200 Kit v2. V rámci zadání běhu zvolte typ běhu (gdna, RNA, AmpliSeq, atd.), zadejte názvy souprav, počet cyklů, čárové kódy (jsou li používány) a referenční soubor. Toto zadání proveďte a uložte prostřednictvím aplikace Torrent Browser. Doporučujeme, abyste zadání běhu provedli pomocí aplikace Torrent Browser a poté jej zvolili na dotykové obrazovce sekvenátoru Ion PGM v rámci zadání běhu (viz Výběr a spuštění naplánovaného běhu). Poznámka: Více informací viz příručka Torrent Browser User Interface Guide, která je k dispozici na 1. Chcete li zadat běh, přihlaste se do Torrent Browseru pro Torrent Server, připojený k vašemu systému Ion PGM. 2. Zvolte záložku Plan (Plánování), zvolte Templates (Templáty), zvolte typ experimentu, který chcete provést (např. AmpliSeq ), poté zvolte jednu z možností: Plan Run (Plánování běhu) plánování běhu na základě existujícího templátu. Plan New Run (Plánování nového běhu) plánování nového běhu bez templátu. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 13

14 3. V následujícím průvodci zadáním nastavte všechny potřebné parametry. Důležitá pole jsou popsána v tabulkách níže. Kompletní popis viz příručka Torrent Browser User Interface Guide. Název pole Aplikace Typ běhu Templát Popis Zvolte aplikaci, kterou chcete použít. Zvolte Forward. Zvolte Ion PGM Template OT2 200 Kit. Sekvenační kit Zvolte Ion PGM Sequencing 200 Kit v2. Flows (Cykly) Zadejte požadovaný počet cyklů (např. 500 cyklů pro čtení 200-bází). Viz Příloha D. Délka trvání sekvenování na straně 58. Barcode Set (Čárové kódy, volitelné) Monitor Reference Library (Referenční knihovna) BED files (BED soubory) Viz Příloha A. Knihovny s čárovými kódy na straně 43. Používáte-li čárové kódy s: DNA knihovnami: Zvolte IonXpress barcode set, který zahrnuje všechny čárové kódy v soupravách Ion Xpress Barcode Adapters RNA knihovnami připravenými pomocí soupravy Ion Total RNA-Seq Kit v2: Zvolte IonXpressRNA barcode set, který zahrnuje všech 16 čárových kódů soupravy Ion Xpress RNA BC01 16 (Kat.č ). Nepoužíváte-li čárové kódy s: DNA knihovnami: Nechte pole Barcode prázdné. RNA knihovnami připravenými pomocí soupravy Ion Total RNA-Seq Kit v2: Zvolte RNA_Barcode_None z rozbalovací nabídky. Tím je zajištěno, že výsledná sekvence je odpovídajícím způsobem zkrácena. Nastavte prahové hodnoty pro parametry Bead Loading, Usable Sequence a Key Signal. Během běhu jsou v Torrent Browseru v záložce Monitor na obrazovce Runs in Progress (Probíhající běhy) zobrazovány výstrahy, pokud tyto prahové hodnoty nejsou dodrženy. Zvolte referenční knihovnu na Torrent Server (pokud chcete). Zvolte odpovídající BED soubory na Torrent Server (pokud chcete). Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 14

15 Název pole Plugins (Pluginy) Project (Projekt) Popis Zvolte pluginy pro vaši aplikaci. Viz příručka k přípravě knihovny. Projekty umožňují seskupit vaše běhy. Zvolte nebo vytvořte projekt pro váš běh, pokud chcete. Běhy mohou být zařazeny do vícero projektů a opět kdykoliv vyřazeny. Export Je-li instalován Ion Reporter Uploader, můžete ho zapnout. Planned Run Name (Jméno běhu) Sample name (Název vzorku) Zadejte název běhu. Je-li Ion Reporter Uploader zapnut, zadejte název každého vzorku a zvolte odpovídající parametry pro pracovní postup (workflow), relation, relation role a set ID. Není-li Ion Reporter Uploader zapnut, zadejte název vzorku nebo vzorků oddělených čárkou. 4. Pokud jste všechny parametry nastavili, klikněte na Plan Run (Naplánovat běh). Plán se zobrazí na stránce Planned Runs (Naplánované běhy). Poznámka: Plán si poté můžete vybrat v momentě, kdy v systému Ion PGM spouštíte běh (viz Výběr a spuštění naplánovaného běhu na straně 31 nebo 40). Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 15

16 3 Čistění a inicializace systému Ion PGM Dříve než začnete Každý týden: Připravte zásobní 1 M roztok NaOH ředěním 10 M roztoku pomocí 18 M Ω vody. Každý den: Připravte 100 mm roztok NaOH ředěním 1 M roztoku pomocí 18 M Ω vody. Na inicializaci je zapotřebí 500 μl 100 mm NaOH. Čistění systému Ion PGM Potřebné pomůcky Kdy čistit 18 MΩ voda (např. Elga PURELAB Flex systém na ultračistou vodu) Čistící láhve a sběrné nádoby (dodávané se systémem Ion PGM ) Použitý čip (ponechte během čistění v přístroji čip) Použité nasávací trubičky (z předchozího běhu nebo dodané spolu s přístrojem) Rozprašovač Čistění roztokem chlóru: PGM čistící tableta (součástí soupravy) Čistění roztokem chlóru: 1 M NaOH Čistění roztokem chlóru: Skleněná láhev (1 L) Čistění roztokem chlóru: 0.22 μm nebo 0.45 μm vakuový filtrační systém a filtry Systém Ion PGM vyžaduje čistění pomocí 18 M Ω vody nebo roztokem chlóru při každé inicializaci. Čistění pomocí: Kdy čistit: 18 MΩ vody Denně je-li přístroj v provozu (není nutné o víkendech) Po 1000 cyklech (např. běh s čtením bází) Pokud uběhlo více než 27 hod ale méně než 48 hod od posledního čistění/inicializace a začátkem běhu Pokud jste použili čistění roztokem chlóru před týdnem a od té doby přístroj nepoužili Roztoku chlóru Každý týden pokud přístroj nebyl od posledního čistění roztokem chlóru použit (v takovém případě proveďte čistění před použitím pomocí 18 MΩ vody) Pokud byl přístroj ponechán i s reagenciemi déle než 48 hodin (např. přes víkend) Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 16

17 Před čistěním DŮLEŽITÉ! Pro všechny následující kroky použijte 18 MΩ vodu získanou přímo ze systému na ultračistou vodu. Nepoužívejte vodu, která byla uchována v jakékoliv nádobě. Odstraňte všechny láhve připevněné k systému Ion PGM System. Před čistěním neodstraňujte staré nasávací trubičky, při čistění je budete potřebovat. S přístrojem jsou dodávány láhve na čistění. Použili li jste dodávané promývací láhve tolikrát, kolikrát je to možné, můžete je použít na čistění. Ujistěte se, že v přístroji je vložen starý čip. Poznámka: Na čistění/inicializaci lze použít jiný typ čipu než na sekvenování. (Např. na čistění/inicializaci použijte čip Ion 314 a na sekvenování Ion 318.) Čistění pomocí 18 MΩ vody Viz část Kdy čistit na straně Vyprázdněte čistící láhve (dvě 250 ml láhve a jedna 2 L láhev) a každou láhev dvakrát vypláchněte pomocí ~100 ml čerstvé 18 MΩ vody. 2. Stiskněte Clean (Čistit) na dotykovém displeji a zvolte 18 MOhm water cleaning (Čistění vodou 18 MOhm). 3. Do 250 ml čistící láhve nalijte 250 ml 18 MΩ vody. 4. Opláchněte vnější povrch nasávacích trubiček v pozici W1 přístroje 18 MΩ vodou z rozprašovače a připojte láhev do pozice W1. 5. Postupujte podle pokynů na dotykovém displeji, do pozice W2 připevněte prázdnou 2 L čistící láhev a vyprázdněte 250 ml láhev v pozici W3. Pod nasávací trubičky umístěte misky na odpad (v pozici pro dntp). Stiskem Next (Dále) zahajte čistění. 6. Po skončení čistění odstraňte všechny láhve a nasávací trubičky z pozic W1, W2 a W3. (Nasávací trubičky pro reagencie misky na odpad ponechte na místě.) Stiskem Next (Dále) se vraťte do hlavní nabídky (Main Menu) a pokračujte inicializací. Čistění roztokem chlóru Viz část Kdy čistit na straně 16. Poznámka: Každý týden připravte zásobní 1 M roztok NaOH ředěním 10 M roztoku NaOH pomocí 18 MΩ vody. 1. Vyprázdněte čistící láhve (dvě 250 ml láhve a jedna 2 L láhev) a každou láhev dvakrát vypláchněte pomocí ~100 ml čerstvé 18 MΩ vody. 2. Naplňte skleněnou láhev 1 L 18 MΩ vody a přidejte PGM čistící tabletu (chloridová tableta). Vyčkejte, než se tableta úplně rozpustí (~10 min). 3. Jakmile se tableta rozpustila, přidejte 1 ml 1 M roztoku NaOH a profiltrujte roztok přes 0.22 μm nebo 0.45 μm filtr. Chloridový roztok použijte během 2 3 hodin. Po uplynutí této doby zbylý roztok vylijte. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 17

18 4. Stiskněte Clean (Čistit) na dotykovém displeji a zvolte Chlorite cleaning (Čistění roztokem chlóru). 5. Nalijte do 250 ml láhve 250 ml filtrovaného roztoku chlóru. 6. Opláchněte vnější povrch nasávacích trubiček v pozici W1 přístroje 18 MΩ vodou z rozprašovače a připojte láhev do pozice W1. 7. Postupujte podle pokynů na dotykovém displeji, do pozice W2 připevněte prázdnou 2 L čistící láhev a vyprázdněte 250 ml láhev v pozici W3. Pod nasávací trubičky umístěte misky na odpad (v pozici pro dntp). Stiskem Next (Dále) zahajte čistění. 8. Jakmile jste k tomu vyzváni, sejměte čistící láhev v pozici W1 (s roztokem chlóru), opláchněte vnější povrch nasávací trubičky 18 MΩ vodou z rozprašovače, připojte čistou 250 ml čistící láhev naplněnou 250 ml 18 MΩ vody. Poznámka: Druhá čistící láhev je jiná než láhev použitá na roztok chlóru. 9. Po skončení čistění odstraňte všechny láhve a nasávací trubičky z pozic W1, W2 a W3. (Nasávací trubičky pro reagencie misky na odpad ponechte na místě.) Stiskem Next (Dále) se vraťte do hlavní nabídky (Main Menu) a pokračujte inicializací. Inicializace sytému Ion PGM Potřebné pomůcky Inicializace trvá ~1 hodinu. V rámci inicializace nejprve připravte čistící láhve a láhve s reagenciemi jak je popsáno v této části. Součásti soupravy: Promývací láhve 1, 2 a 3 s nasávacími trubičkami Láhve na reagencie s nasávacími trubičkami Ion PGM Sequencing 200 v2 dgtp Ion PGM Sequencing 200 v2 dctp Ion PGM Sequencing 200 v2 datp Ion PGM Sequencing 200 v2 dttp Ion PGM Sequencing 200 v2 W2 roztok (chraňte před světlem) Ion PGM Sequencing 200 v2 1X W3 roztok Další pomůcky a vybavení Použitý čip (během inicializace ponechte čip v přístroji) 18 MΩ voda 100 mm NaOH (denně čerstvý) Led Sérologická pipeta 5 ml a 25 ml Pipetovací špičky s filtrem i bez a pipetmany Vortex Microcentrifuga Volitelné: Souprava Ion PGM Sequencing Sippers Kit (kat.č ) Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 18

19 DŮLEŽITÉ! Po inicializaci by měl být první běh spuštěn do jedné hodiny a poslední do 27 hodin. Dbejte, aby nedošlo ke kroskontaminaci jednotlivých roztoků dntp. Po sejmutí použitých nasávacích trubiček ze systému Ion PGM si vždy vyměňte rukavice, aby nedošlo ke kroskontaminaci nukleotidů. Po manipulaci s koncentrovanými roztoky dntp si vyměňte rukavice. Po provedení čtyř inicializací nepoužívejte promývací láhve 1, 2 a 3, nemusí dokonale těsnit. (Láhve můžete použít na čistění.) Láhve s reagenciemi a nasávací trubičky použijte pro každou inicializaci čerstvé. Ujistěte se, že software Torrent Suite a Ion PGM je aktualizován na verzi nebo vyšší. Před inicializací 1. Vyjměte roztoky dntp z mrazáku a nechte je roztát na ledu. 2. Zkontrolujte tlak dusíku nebo argonu v bombě. Je li nižší než 500 psi, vyměňte bombu. 3. Povšimněte si vylisované rysky na láhvi 2. Jsou li rysky dvě, dolní rysku si označte (dolní je ta správná). Označená ryska Příprava promývací láhve 2 DŮLEŽITÉ! Pro všechny následující kroky použijte 18 MΩ vodu získanou přímo ze systému na ultračistou vodu. Nepoužívejte vodu, která byla uchována v jakékoliv nádobě. 1. Vypláchněte promývací láhev 2 (2 L) třikrát pomocí 200 ml 18 M Ω vody. 2. Má li váš system na ultračistou vodu výpustní kohout, zasuňte jej ne hlouběji než do hrdla promývací láhve 2. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 19

20 3. Naplňte láhev po označenou rysku. Objem ~2 litry. 4. Nalijte celý obsah láhve Ion PGM Sequencing 200 v2 W2 roztok do láhve 2. Příprava promývacích lahví 1 a 3 Poznámka: Láhev od roztoku W2 nevyhazujte, později naskenujete její čárový kód. 5. Pipetujte 70 μl čerstvého 100 mm NaOH (ne 1 M NaOH) do promývací láhve Uzavřete láhev a promíchejte otočením pětkrát, okamžitě pokračujte dalšími kroky inicializace. DŮLEŽITÉ! Láhev 2 neuchovávejte. Poznámka: Promývací láhve 1 a 3 si označte, ať je nezaměníte. 1. Vypláchněte promývací láhev 1 a 3 třikrát pomocí 50 ml 18 M Ω vody. 2. Promývací láhev 1: Pipetujte 350 μl čerstvého 100 mm NaOH a láhev uzavřete. 3. Promývací láhev 3: Přidejte Ion PGM Sequencing 200 v2 1X W3 roztok po linku označující 50 ml na promývací láhvi 3 a láhev uzavřete. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 20

21 Zahájení inicializace DŮLEŽITÉ! Z portů pro dntp neodstraňujte staré nasávací trubičky, dokud k tomu nejste vyzváni. Nové nasávací trubičky nikde neodkládejte. DŮLEŽITÉ! Naplňte láhve co nejrychleji, aby nedošlo k tomu, že CO2 ze vzduchu sníží ph v promývací láhvi Ujistěte se, že v přístroji je stále vložen starý čip. 2. Na hlavní obrazovce stiskněte Initialize (Inicializace). 3. Na následující obrazovce zadejte nebo naskenujte čárový kód z láhve na roztok Ion PGM Sequencing 200 v2 W2 (viz krok 4 v části Příprava promývací láhve 2 na straně 20). Nebo můžete zvolit Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 z rozbalovací nabídky. DŮLEŽITÉ! Ujistěte se, že zadáváte čárový kód ze správné láhve nebo že volíte správný typ kitu, aby bylo ph náležitě upraveno. 4. Stiskněte Next (Dále) a ujistěte se, že čistící čip je v přístroji a nasávací trubičky pro láhev s reagenciemi a odpadní misky na místě. Stiskněte Next (Dále). 5. Systém ověří tlak plynu. Je li tlak dostatečný, stiskněte Next (Dále) pro zahájení inicializace. je li tlak nízký, stiskněte Yes (Ano) a systém znovu ověří tlak plynu. Je li tlak plynu stále nízký, kontaktujte technickou podporu. 6. Nasaďte si čisté rukavice a podle pokynů na obrazovce instalujte novou nasávací trubičku (dlouhá šedá) do víčka v pozici W2. Nové nasávací trubičky nikde neodkládejte. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 21

22 Poznámka: Trubičku připevňujte oběma rukama. Trubička se pouze nacvakne (viz níže). Příprava 50-mL zkumavek s roztoky dntp Připojení nasávacích trubiček a zkumavek 7. Okamžitě upevněte promývací láhev 2 do pozice W2 a dotáhněte víčko. Stiskněte Next (Dále). 8. Nasaďte si nové rukavice a instalujte nové nasávací trubičky (krátké šedé) do víček v pozicích W1 a W3. 9. Okamžitě upevněte připravené promývací láhve 1 a 3 dotáhněte víčka. Stiskněte Next (Dále). 10. Systém Ion PGM ověří těsnost láhví, naplní promývací láhev 1 a upraví ph roztoku W2. Tato procedura trvá ~30 minut. Poznámka: Není li promývací láhev těsně uzavřena anebo dojde k chybě během procesu automatické úpravy ph, postupujte podle pokynů v Příloze B. Řešení problémů. Pokud dojde k chybě v úpravě ph roztoku W2, postupujte podle pokynů v části Inicializace: chyby v úpravě ph na straně 50 v části Řešení problémů. DŮLEŽITÉ! Dbejte, aby nedošlo ke kroskontaminaci jednotlivých roztoků dntp. Ujistěte se, že jste zkumavky s dntp instalovali do správných pozic v systému Ion PGM. 1. Nechte zásobní roztoky dntp roztát, vortexujte je a krátce centrifugujte. Udržujte roztoky dntp celou dobu na ledu. 2. Pomocí nálepek (jsou součástí dodávky) označte zkumavky dgtp, dctp, datp a dttp. 3. Použijte čisté rukavice a pipetujte (použijte špičky s filtrem) 20 μl každého zásobního roztoku dntp do příslušné zkumavky. 1. Postupujte podle pokynů na obrazovce, sejměte použité nasávací trubičky z portů pro dntp a odstraňte misky na odpad. Nasaďte si nové rukavice. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 22

23 2. Vložte novou nasávací trubičku (modrá) do každého portu pro dntp. Nové nasávací trubičky nikde neodkládejte. 3. Připojte příslušnou zkumavku ke správnému dntp portu a pevně dotáhněte. Pořadí zkumavek je dgtp, dctp, datp a dttp (zleva doprava stojíte li čelem k přístroji). Poznámka: Systém Ion PGM ověří těsnost zkumavek a promývací láhve. Není li zkumavka nebo láhev dostatečně uzavřena, systém vás vyzve k nápravě. Pokud stále není dosaženo požadované těsnosti, zkumavku či láhev vyměňte. V případě přetrvávajících problémů kontaktujte technickou podporu. 4. Dokončete inicializaci podle pokynů na displeji. Systém Ion PGM naplní každou zkumavku 40 ml roztoku W2. Poznámka: Během inicializace můžete plánovat běhy nebo připravit ISP (viz dále). 5. Po skončení inicializace změří systém Ion PGM ph reagencií: Je li ph v pořádku, zobrazí se zelený nápis Passed. Zobrazí li se červený nápis, postupujte podle pokynů v Příloze B. Řešení problémů. 6. Stiskněte Next (Dále) a vraťte se do hlavní nabídky. 7. Pokračujte zvoleným sekvenačním protokolem podle typu vašeho čipu. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 23

24 4 Sekvenační protokol čipy Ion 316 /Ion 318 Pro práci s čipy Ion 316 nebo Ion 318 použijte zde uvedený protokol. Pro práci s čipem 314 viz strana 33. Potřebné pomůcky Součásti soupravy: Sekvenační primer Kontrolní částice (Control Ion Sphere Particles) Pufr pro annealing Polymeráza Ion PGM Sequencing 200 v2 Součásti soupravy Ion PGM Controls Kit (volitelné) Kontrolní fragmenty Ion Sphere Další pomůcky a vybavení Čip Ion 316 nebo Ion 318 Obohacené a templát pozitivní ISP Pipeta a špičky (Rainin SR L200F) Vortex MiniFuga Teplotní cykler s vyhřívaným víkem (programovaný na inkubaci při 95 C / 2 min a 37 C / 2 min) Čtečka čárových kódů (součást systému Ion PGM ) Dříve než začnete Nechte sekvenační primer roztát na ledu. Ujistěte se, že software Torrent Suite a Ion PGM je aktualizován na verzi nebo vyšší. DŮLEŽITÉ! Po inicializaci by měl být první běh spuštěn do jedné hodiny a poslední do 27 hodin. DŮLEŽITÉ! Částice ISP jsou špatně vidět. Aby nedošlo k jejich odsání, vložte centrifugační zkumavku do centrifugy vždy ve stejné orientaci, takže budete vždy vědět, kde se vytváří pelet, a supernatant odsávejte shora dolů. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 24

25 Volitelné: Příprava kontrolních fragmentů Ion Sphere Pokud systém instalujte, nebo řešíte problémy spojené s jeho provozem: 1. Vortexujte kontrolní fragmenty Ion Sphere ze soupravy Ion PGM Controls Kit (kat.č ) a centrifugujte je2 sec předtím, než odeberete alikvot. 2. Pipetujte 5 μl kontrolních fragmentů Ion Sphere do 0.2 ml nepolystyrenové PCR zkumavky se 100 μl pufru na annealing. 3. Pokračujte krokem Annealing sekvenačního primeru. Příprava obohacených templát-pozitivních ISP 1. Vortexujte kontrolní fragmenty Ion Sphere ze soupravy Ion PGM Controls Kit (kat.č ) a centrifugujte je 2 sec předtím, než odeberete alikvot. 2. Pipetujte 5 μl kontrolních fragmentů Ion Sphere do 0.2 ml nepolystyrenové PCR zkumavky se 100 μl pufru na annealing. 3. V závislosti na používané soupravě: Ion PGM Template OT2 200 Kit (kat.č ) Pokračujte krokem Annealing sekvenačního primeru. Ion OneTouch 200 Template Kit v2 DL (Kat.č ) Přidejte 100 μl pufru na annealing. Annealing sekvenačního primeru 1. Promíchejte obsah zkumavky pipetováním. Centrifugujte 2 min / 15,500 g. 2. Opatrně odeberte supernatant, aniž porušíte pelet, ponechte ve zkumavce 15 μl (množství odhadněte srovnáním s jinou zkumavkou, kde napipetujete 15 μl tekutiny). 3. Přidejte 12 μl sekvenačního primeru a ověřte, že celkový objem je 27 μl (podle potřeby přidejte pufr na annealing). 4. Pipetováním rozpusťte pelet. 5. Navolte v teplotním cykleru program 95 C / 2 min a následně 37 C / 2 min (víko musí být vyhříváno). 6. Vložte zkumavku do teplotního cykleru a spusťte program. Po skončení programu může zkumavka zůstat v cykleru při pokojové teplotě, zatímco kontrolujete čip. Kontrola čipu Kontrola čipu je proces, kterým ověříte funkčnost čipu před tím, než do něj pipetujete vzorek. DŮLEŽITÉ! Aby nedošlo k poškození čipu vlivem elektrostatické elektřiny, nepokládejte jej na stůl ani nikam jinam. Pokládejte čip výhradně na uzemňovací destičku systému Ion PGM nebo do speciálního adaptéru centrifugy. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 25

26 DŮLEŽITÉ! Aby nedošlo k poškození čipu vlivem elektrostatické elektřiny, nepoužívejte při manipulaci s čipem (vkládání a vyjímaní z přístroje) rukavice. 1. Vyjměte nový čip z obalu a označte si jej. Obal čipu uchovejte, budete potřebovat na něm uvedený čárový kód. 2. Položte čip na zemnící destičku systému Ion PGM nebo do adaptéru centrifugy. 3. V hlavní nabídce stiskněte Run (Spustit) a postupujte podle pokynů na obrazovce budete provedeni procesem přípravy systému Ion PGM pro kontrolu nového čipu. Poznámka: Jste li vyzváni k vložení čistícího čipu, můžete použít čip použitý pro inicializaci. 4. Jakmile jste k tomu vyzváni, uzemněte sebe sama dotykem zemnící destičky na přístroji (umístěné vedle držáku na čip) a namísto starého čipu vložte nový. Při manipulaci s čipy nepoužívejte rukavice. Zavřete kryt čipu. 5. Jakmile jste k tomu vyzváni, naskenujte čárový kód z obalu čipu, případně stiskněte Change a zadejte čárový kód ručně. Poznámka: Bez naskenování čárového kódu nelze čip spustit. 6. Stiskněte Chip Check (Kontrola čipu) na displeji. 7. Během počátečních kroků kontroly čipu pohledově zkontrolujte, že v čipu nedochází k úniku tekutin. Pokud ano, stiskněte Abort (Zrušit). Postupujte podle pokynů v části Příloha B. Řešení problémů. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 26

27 DŮLEŽITÉ! Držák čipu může být poškozen, pokud jste jeho povrch otírali. Pozorujete li únik kapalin, kontaktujte technickou podporu (viz Kontaktní údaje na straně 62). 8. Je li kontrola čipu hotová: Pokud je kontrola úspěšná, stiskněte Next (Dále). Pokud je kontrola neúspěšná, otevřete držák čipu, znovu usaďte čip do držáku, uzavřete držák a stiskněte Calibrate (Kalibrovat), čímž proces zopakujete. Pokud je kontrola úspěšná, stiskněte Next (Dále). Pokud je kontrola opět neúspěšná, stiskněte Main Menu (Hlavní nabídka) a opakujte experiment s novým čipem. Viz též Příloha B. Řešení problémů. Poznámka: Pro výměnu poškozených čipů kontaktujte technickou podporu Life Technologies. 9. Po úspěšné kontrole čip vyjměte a položte na zemnící destičku. Do držáku vložte použitý čip a držák zavřete. 10. Vyprázdněte úplně láhev na odpad (viz pokyny na displeji). DŮLEŽITÉ! Před každým během musíte láhev na odpad vždy úplně vyprázdnit opět vrátit na místo. 11. Ihned pokračujte následujícími kroky. Navázání sekvenační polymerázy na ISP 1. Po annealingu sekvenačního primeru vyjměte ISP z termocykleru a pipetujte k nim 3 μl polymerázy Ion PGM Sequencing 200 v2. Celkový objem bude 30 μl. 2. Promíchejte vzorek pipetováním. 3. Inkubujte vzorek při pokojové teplotě 5 min. Plnění čipu Poznámka: Video, zobrazující plnění čipu, je k vidění na: v části Programs & Events > Training. Čip Ion 316 : Čip Ion 318 : Plnící port Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 27

28 Alternativní metoda plnění čipu pomocí držáku Ion PGM Weighted Chip Bucket Tato metoda vyžaduje méně kroků. Více informací viz brožura Ion PGM Chip Loading with the Ion PGM Weighted Chip Bucket User Bulletin (číslo publikace MAN ), která je ke stažení na ioncommunity.lifetechnologies.com. Tato metoda vyžaduje použití držáku (Ion PGM Weighted Chip Bucket, kat.č ), který lze objednat u společnosti Life Technologies. Odstranění kapaliny z čipu 1. Nakloňte čip v úhlu 45º tak, aby plnící port byl dole. 2. Vložte pipetovací špičku pevně do portu a nasajte co nejvíce tekutiny (tekutinu vyhoďte). DŮLEŽITÉ! Adaptér centrifugy musí být v následujících krocích vyvážen pomocí použitého čipu (stejného typu a orientace). Použitý čip si označte, aby nemohlo dojít k záměně. 3. Vložte čip horní stranou dolů do adaptéru centrifugy a závěs s adaptérem do centrifugy MiniFuga v orientaci nápis na čipu směrem dovnitř, viz obrázek níže. 4. Centrifugujte 5 sec, abyste čip úplně vyprázdnili. Vyjměte čip ze závěsu a otřete závěs do sucha. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 28

29 Plnění vzorku do čipu DŮLEŽITÉ! Plníte li čip, musí pipetman svírat s čipem úhel 90º. Zatlačte špičku pevně do plnícího portu a tlačte jemně špičkou do čipu. Adaptér centrifugy 1. Vložte čip zpět do adaptéru centrifugy a adaptér umístěte na rovný stůl. 2. Po inkubaci s polymerázou nasajte celý objem vzorku (~30 μl) do pipetovací špičky (Rainin SR L200F) a vložte špičku do portu čipu. 3. Otáčejte kroužkem pro nastavení objemu na pipetě směrem k nižším hodnotám objemu (viz obrázek níže), čímž pomalu vytlačíte ISP rychlostí asi ~1 μl za sec do čipu. Aby nedošlo k tomu, že se do čipu dostanou bubliny, ponechte malý objem vzorku (~0.5 μl) v pipetovací špičce. 4. Odsajte zbytkovou tekutinu z druhého portu čipu. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 29

30 5. Vložte čip do MiniFugy v orientaci nápis na čipu směrem dovnitř. 6. Centrifugujte 30 sec a vyjměte čip z centrifugy. 7. Promíchejte vzorek v čipu: a. Nastavte pipetu na 30 μl. b. Nakloňte čip v úhlu 45º tak, že plnící port je dole a vložte do tohoto portu pipetovací špičku. c. Aniž špičku vyjmete, pomalu třikrát nasajte a znovu vytlačte vzorek. Pipetujte pomalu, aby se nevytvořily bubliny. 8. Vložte čip do MiniFugy v orientaci nápis na čipu směrem dovnitř a centrifugujte 30 sec. 9. Opakujte krok 7 ještě jednou a centrifugujte 30 sec (vložte čip do MiniFugy v orientaci nápis na čipu směrem dovnitř). 10. Nakloňte čip v úhlu 45º a z plnícího portu otáčením kolečka pipety pro nastavení objemu odsajte všechnu tekutinu (tekutinu vyhoďte). 11. Zůstane li v čipu tekutina, centrifugujte čip 5 sec (v orientaci nápis na čipu směrem dovnitř) a odstraňte tekutinu. 12. Zůstane li v čipu tekutina, poklepejte čipem několikrát opatrně o stůl a odstraňte tekutinu. Čip neoplachujte. 13. Je li čip naplněn, stiskněte Next (Dále) na displeji a okamžitě pokračujte Výběrem a spuštěním naplánovaného běhu. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 30

31 Výběr a spuštění naplánovaného běhu Zvolte naplánovaný běh nebo nastavte parametry běhu ručně Zvolte naplánovaný běh (Planned Run) na displeji (viz Zadání běhu na straně 13). Případně můžete provést nastavení běhu na následující obrazovce. 1. Stiskněte tlačítko Browse (Procházet) vedle pole Planned Run (Naplánovaný běh) a zvolte název vytvořeného běhu, poté stiskněte Next (Dále). 2. Parametry běhu se načtou. Ověřte, že načtené parametry jsou v pořádku. Podle potřeby proveďte požadované změny. Poznámka: Nelze li nastavit počet cyklů, je možné, že na disku není dost místa na uložení výsledků. Stiskněte Data Mngt (Správa dat) (též v nabídce Tools Nástroje) a vymažte staré běhy. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 31

32 Spuštění běhu 1. Poté co jste zvolili naplánovaný běh, stiskněte Next (Dále) a ověřte nastavení běhu. Stiskem OK nastavení potvrdíte, stiskem Cancel se vrátíte na obrazovku, kde můžete nastavení změnit. 2. Jste li k tomu vyzváni, vložte čip do držáku a stiskněte Next (Dále). 3. Na počátku běhu pohledově zkontrolujte, že v čipu nedochází k úniku tekutin (než zavřete kryt čipu). Přístroj vypláchne volné ISP z čipu a započne s jeho kalibrací. 4. Po skončení kalibrace (~1 min) se na displeji objeví informace o tom, zda kalibrace proběhla úspěšně: Pokud ano, stiskněte Next (Dále) a pokračujte v sekvenování. Pokud ne, stiskněte Abort (Zrušit), znovu usaďte čip v držáku a stiskněte Calibrate (Kalibrovat). Pokud se kalibrace opět nezdaří, i přesto pokračujte v sekvenování a po skončení běhu kontaktujte technickou podporu. Viz též Příloha B. Řešení problémů. 5. Běh se spustí automaticky po 90 sec, případně stiskem Next (Dále) spustíte běh ihned. DŮLEŽITÉ! Během běhu se nedotýkejte přístroje a připojených láhví, může to mít vliv na kvalitu výsledku. 6. Po skončení běhu se na displeji zobrazí hlavní nabídka. Můžete provést další běh nebo provést čistění/inicializaci (podle potřeby). Poznámka: Viz část Kdy čistit na straně 16. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 32

33 5 Sekvenační protokol čip Ion 314 Potřebné pomůcky Pro práci s čipem Ion 314 použijte zde uvedený protokol. Pro práci s čipy 316 a 318 viz strana 24. Součásti soupravy: Sekvenační primer Kontrolní částice (Control Ion Sphere Particles) Pufr pro annealing Polymeráza Ion PGM Sequencing 200 v2 Součásti soupravy Ion PGM Controls Kit (volitelné) Kontrolní fragmenty Ion Sphere Další pomůcky a vybavení Čip Ion 314 Obohacené a templát pozitivní ISP 0.2 ml PCR zkumavka (nepolystyrenová) Pipeta a špičky (Rainin SR L200F) Vortex MiniFuga Teplotní cykler s vyhřívaným víkem (programovaný na inkubaci při 95 C / 2 min a 37 C / 2 min) Čtečka čárových kódů (součást systému Ion PGM ) Dříve než začnete Nechte sekvenační primer roztát na ledu. Ujistěte se, že software Torrent Suite a Ion PGM je aktualizován na verzi nebo vyšší. DŮLEŽITÉ! Po inicializaci by měl být první běh spuštěn do jedné hodiny a poslední do 27 hodin. DŮLEŽITÉ! Částice ISP jsou špatně vidět. Aby nedošlo k jejich odsání, vložte centrifugační zkumavku do centrifugy vždy ve stejné orientaci, takže budete vždy vědět, kde se vytváří pelet, a supernatant odsávejte shora dolů. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 33

34 Volitelné: Příprava kontrolních fragmentů Ion Sphere Pokud systém instalujte, nebo řešíte problémy spojené s jeho provozem: 1. Vortexujte kontrolní fragmenty Ion Sphere ze soupravy Ion PGM Controls Kit (kat.č ) a centrifugujte je2 sec předtím, než odeberete alikvot. 2. Pipetujte 5 μl kontrolních fragmentů Ion Sphere do 0.2 ml nepolystyrenové PCR zkumavky se 100 μl pufru na annealing. 3. Pokračujte krokem Annealing sekvenačního primeru. Příprava obohacených templát-pozitivních ISP Poznámka: Pro čip Ion 314 se používá pouze poloviční objem připravených obohacených templát pozitivních ISP. 1. Pipetujte polovinu objemu připravených obohacených templát pozitivních ISP do nové 0.2 ml PCR zkumavky (nepolystyrenové) a uchovejte v 2 8 C max. 1 týden. Můžete je použít pro falší sekvenační běh. 2. Vortexujte kontrolní fragmenty Ion Sphere ze soupravy Ion PGM Controls Kit (kat.č ) a centrifugujte je 2 sec předtím, než odeberete alikvot. 3. Přidejte 5 μl kontrolních fragmentů Ion Sphere přímo do polovičního objemu obohacených templát pozitivních ISP v 0.2 ml PCR zkumavce (nepolystyrenové). 4. V závislosti na používané soupravě: Ion PGM Template OT2 200 Kit (Kat.č ) Pokračujte krokem Annealing sekvenačního primeru. Ion OneTouch 200 Template Kit v2 DL (Kat.č ) Přidejte 100 μl pufru na annealing. Annealing sekvenačního primeru 1. Promíchejte obsah zkumavky pipetováním. Centrifugujte 2 min / 15,500 g. 2. Opatrně odeberte supernatant, aniž porušíte pelet, ponechte ve zkumavce 3 μl (množství odhadněte srovnáním s jinou zkumavkou, kde napipetujete 3 μl tekutiny). 3. Přidejte 3 μl sekvenačního primeru a ověřte, že celkový objem je 6 μl (podle potřeby přidejte pufr na annealing). 4. Pipetováním rozpusťte pelet. 5. Navolte v teplotním cykleru program 95 C / 2 min a následně 37 C / 2 min (víko musí být vyhříváno). 6. Vložte zkumavku do teplotního cykleru a spusťte program. Po skončení programu může zkumavka zůstat v cykleru při pokojové teplotě, zatímco kontrolujete čip. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 34

35 Kontrola čipu Kontrola čipu je proces, kterým ověříte funkčnost čipu před tím, než do něj pipetujete vzorek. DŮLEŽITÉ! Aby nedošlo k poškození čipu vlivem elektrostatické elektřiny, nepokládejte jej na stůl ani nikam jinam. Pokládejte čip výhradně na uzemňovací destičku systému Ion PGM nebo do speciálního adaptéru centrifugy. DŮLEŽITÉ! Aby nedošlo k poškození čipu vlivem elektrostatické elektřiny, nepoužívejte při manipulaci s čipem (vkládání a vyjímaní z přístroje) rukavice. 1. Vyjměte nový čip z obalu a označte si jej. Obal čipu uchovejte, budete potřebovat na něm uvedený čárový kód. 2. Položte čip na zemnící destičku systému Ion PGM nebo do adaptéru centrifugy. 3. V hlavní nabídce stiskněte Run (Spustit) a postupujte podle pokynů na obrazovce budete provedeni procesem přípravy systému Ion PGM pro kontrolu nového čipu. Poznámka: Jste li vyzváni k vložení čistícího čipu, můžete použít čip použitý pro inicializaci. 4. Jakmile jste k tomu vyzváni, uzemněte sebe sama dotykem zemnící destičky na přístroji (umístěné vedle držáku na čip) a namísto starého čipu vložte nový. Při manipulaci s čipy nepoužívejte rukavice. Zavřete kryt čipu. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 35

36 5. Jakmile jste k tomu vyzváni, naskenujte čárový kód z obalu čipu, případně stiskněte Change a zadejte čárový kód ručně. Poznámka: Bez naskenování čárového kódu nelze čip spustit. 6. Stiskněte Chip Check (Kontrola čipu) na displeji. 7. Během počátečních kroků kontroly čipu pohledově zkontrolujte, že v čipu nedochází k úniku tekutin. Pokud ano, stiskněte Abort (Zrušit). Postupujte podle pokynů v části Příloha B. Řešení problémů. DŮLEŽITÉ! Držák čipu může být poškozen, pokud jste jeho povrch otírali. Pozorujete li únik kapalin, kontaktujte technickou podporu (viz Kontaktní údaje na straně 62). 8. Je li kontrola čipu hotová: Pokud je kontrola úspěšná, stiskněte Next (Dále). Pokud je kontrola neúspěšná, otevřete držák čipu, znovu usaďte čip do držáku, uzavřete držák a stiskněte Calibrate (Kalibrovat), čímž proces zopakujete. Pokud je kontrola úspěšná, stiskněte Next (Dále). Pokud je kontrola opět neúspěšná, stiskněte Main Menu (Hlavní nabídka) a opakujte experiment s novým čipem. Viz též Příloha B. Řešení problémů. Poznámka: Pro výměnu poškozených čipů kontaktujte technickou podporu Life Technologies. 9. Po úspěšné kontrole čip vyjměte a položte na zemnící destičku. Do držáku vložte použitý čip a držák zavřete. 10. Vyprázdněte úplně láhev na odpad (viz pokyny na displeji). DŮLEŽITÉ! Před každým během musíte láhev na odpad vždy úplně vyprázdnit opět vrátit na místo. 11. Ihned pokračujte následujícími kroky. Navázání sekvenační polymerázy na ISP 1. Po annealingu sekvenačního primeru vyjměte ISP z termocykleru a pipetujte k nim 1 μl polymerázy Ion PGM Sequencing 200 v2. Celkový objem bude 7 μl. 2. Promíchejte vzorek pipetováním. 3. Inkubujte vzorek při pokojové teplotě 5 min. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 36

37 Plnění čipu Poznámka: Video, zobrazující plnění čipu, je k vidění na: v části Programs & Events > Training. Plnící port Alternativní metoda plnění čipu pomocí držáku Ion PGM Weighted Chip Bucket Odstranění kapaliny z čipu Tato metoda vyžaduje méně kroků. Více informací viz brožura Ion PGM Chip Loading with the Ion PGM Weighted Chip Bucket User Bulletin (číslo publikace MAN ), která je ke stažení na ioncommunity.lifetechnologies.com. Tato metoda vyžaduje použití držáku (Ion PGM Weighted Chip Bucket, kat.č ), který lze objednat u společnosti Life Technologies. 1. Nakloňte čip v úhlu 45º tak, aby plnící port byl dole. 2. Vložte pipetovací špičku pevně do portu a nasajte co nejvíce tekutiny (tekutinu vyhoďte). DŮLEŽITÉ! Adaptér centrifugy musí být v následujících krocích vyvážen pomocí použitého čipu (stejného typu a orientace). Použitý čip si označte, aby nemohlo dojít k záměně. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 37

38 3. Vložte čip horní stranou dolů do adaptéru centrifugy a závěs s adaptérem do centrifugy MiniFuga v orientaci nápis na čipu směrem dovnitř, viz obrázek níže. 4. Centrifugujte 5 sec, abyste čip úplně vyprázdnili. Vyjměte čip ze závěsu a otřete závěs do sucha. Plnění vzorku do čipu DŮLEŽITÉ! Plníte li čip, musí pipetman svírat s čipem úhel 90º. Zatlačte špičku pevně do plnícího portu a tlačte jemně špičkou do čipu. Adaptér centrifugy 1. Vložte čip zpět do adaptéru centrifugy a adaptér umístěte na rovný stůl. 2. Po inkubaci s polymerázou nasajte celý objem vzorku (~7 μl) do pipetovací špičky (Rainin SR L200F) a vložte špičku do portu čipu. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 38

39 3. Otáčejte kroužkem pro nastavení objemu na pipetě směrem k nižším hodnotám objemu (viz obrázek níže), čímž pomalu vytlačíte ISP rychlostí asi ~1 μl za sec do čipu. Aby nedošlo k tomu, že se do čipu dostanou bubliny, ponechte malý objem vzorku (~0.5 μl) v pipetovací špičce. 4. Odsajte zbytkovou tekutinu z druhého portu čipu. 5. Vložte čip do MiniFugy v orientaci nápis na čipu směrem dovnitř. 6. Centrifugujte 30 sec a vyjměte čip z centrifugy. 7. Promíchejte vzorek v čipu: a. Nastavte pipetu na 5 μl. b. Nakloňte čip v úhlu 45º tak, že plnící port je dole a vložte do tohoto portu pipetovací špičku. c. Aniž špičku vyjmete, pomalu třikrát nasajte a znovu vytlačte vzorek. Pipetujte pomalu, aby se nevytvořily bubliny. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 39

40 8. Vložte čip do MiniFugy v orientaci nápis na čipu směrem dovnitř a centrifugujte 30 sec. 9. Opakujte krok 7 ještě jednou a centrifugujte 30 sec (vložte čip do MiniFugy v orientaci nápis na čipu směrem dovnitř). 10. Nakloňte čip v úhlu 45º a z plnícího portu otáčením kolečka pipety pro nastavení objemu odsajte všechnu tekutinu (tekutinu vyhoďte). 11. Zůstane li v čipu tekutina, centrifugujte čip 5 sec (v orientaci nápis na čipu směrem dovnitř) a odstraňte tekutinu. 12. Zůstane li v čipu tekutina, poklepejte čipem několikrát opatrně o stůl a odstraňte tekutinu. Čip neoplachujte. Poznámka: Z čipu Ion 314 nelze odstranit veškerou tekutinu. odstraňte co nejvíce tekutiny postupem popsaným výše a pokračujte spuštěním běhu. 13. Okamžitě pokračujte Výběrem a spuštěním naplánovaného běhu. Výběr a spuštění naplánovaného běhu Zvolte naplánovaný běh nebo nastavte parametry běhu ručně Zvolte naplánovaný běh (Planned Run) na displeji (viz Zadání běhu na straně 13). Případně můžete provést nastavení běhu na následující obrazovce. 1. Stiskněte tlačítko Browse (Procházet) vedle pole Planned Run (Naplánovaný běh) a zvolte název vytvořeného běhu, poté stiskněte Next (Dále). Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 40

41 2. Parametry běhu se načtou. Ověřte, že načtené parametry jsou v pořádku. Podle potřeby proveďte požadované změny. Poznámka: Nelze li nastavit počet cyklů, je možné, že na disku není dost místa na uložení výsledků. Stiskněte Data Mngt (Správa dat) (též v nabídce Tools Nástroje) a vymažte staré běhy. Spuštění běhu 1. Poté co jste zvolili naplánovaný běh, stiskněte Next (Dále) a ověřte nastavení běhu. Stiskem OK nastavení potvrdíte, stiskem Cancel se vrátíte na obrazovku, kde můžete nastavení změnit. 2. Jste li k tomu vyzváni, vložte čip do držáku a stiskněte Next (Dále). 3. Na počátku běhu pohledově zkontrolujte, že v čipu nedochází k úniku tekutin (než zavřete kryt čipu). Přístroj vypláchne volné ISP z čipu a započne s jeho kalibrací. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 41

42 4. Po skončení kalibrace (~1 min) se na displeji objeví informace o tom, zda kalibrace proběhla úspěšně: Pokud ano, stiskněte Next (Dále) a pokračujte v sekvenování. Pokud ne, stiskněte Abort (Zrušit), znovu usaďte čip v držáku a stiskněte Calibrate (Kalibrovat). Pokud se kalibrace opět nezdaří, i přesto pokračujte v sekvenování a po skončení běhu kontaktujte technickou podporu. Viz též Příloha B. Řešení problémů. 5. Běh se spustí automaticky po 90 sec, případně stiskem Next (Dále) spustíte běh ihned. DŮLEŽITÉ! Během běhu se nedotýkejte přístroje a připojených láhví, může to mít vliv na kvalitu výsledku. 6. Po skončení běhu se na displeji zobrazí hlavní nabídka. Můžete provést další běh nebo provést čistění/inicializaci (podle potřeby). Poznámka: Viz část Kdy čistit na straně 16. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 42

43 A Příloha A Knihovny s čárovými kódy V této příloze je popsáno jak vybrat a vytvořit sady čárových kódů v systému Ion PGM pro sekvenování knihovny s čárovými kódy. Předinstalované sady čárových kódů Součástí programu Torrent Suite jsou předinstalované sady čárových kódů IonXpress a IonXpressRNA. Pokud plánujete nebo provádíte běh, zvolte příslušnou sady čárových kódů pro vaši knihovnu takto: DNA knihovny: Zvolte sadu IonXpress, jejíž součástí jsou všechny čárové kódy souprav Ion Xpress Barcode Adapters RNA knihovny připravené pomocí soupravy Ion Total RNA Seq v2: Zvolte sadu IonXpressRNA, jejíž součástí je 16 čárových kódů soupravy Ion Xpress RNA BC01 16 (kat.č ). Pokud čárové kódy nepoužíváte: DNA knihovny: Ponechte pole Barcode (Čárový kód) prázdné RNA knihovny připravené pomocí soupravy Ion Total RNA Seq v2: Zvolte z rozbalovací nabídky RNA_Barcode_None. Tím je zajištěno, že výsledné sekvence jsou odpovídajícím způsobem kráceny, pokud RNA knihovna neobsahuje čárové kódy. DŮLEŽITÉ! Předinstalované sady čárových kódů neupravujte ani nemažte. Volba sady čárových kódů pro sekvenační běh Chcete li zvolit sadu čárových kódů: Doporučeno: Při plánování běhu zvolte sadu čárových kódů v programu Torrent Browser. Viz Zadání běhu na straně 13. Volitelně: Při zadávání běhu zvolte sadu čárových kódů na dotykovém displeji systému Ion PGM. Viz Zvolte naplánovaný běh nebo nastavte parametry běhu ručně na straně 31 nebo 40, podle používaného čipu. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 43

44 Volba čárového kódu Vlastní sady čárových kódů Můžete vytvořit vlastní sady čárových kódů jako soubory csv (commaseparated value), poté je nahrajte na Torrent Server, abyste je mohli použít pro sekvenační běhy. Pro přístup na Torrent Server musíte mít uživatelské jméno a heslo. Více informací o práci s vlastními sadami čárových kódů viz příručka Torrent Browser User Interface Guide. Vytvoření a přidání vlastní sady čárových kódů na Torrent Server 1. Vytvořte textový soubor typu.csv se zadáním vlastní sady čárových kódů. V.csv souboru může být až 384 čárových kódů. 2. Chcete li přidat vlastní sadu čárových kódů na Torrent Server, otevřete Torrent Browser a klikněte na Settings (Nastavení) v pravé části okna, poté zvolte References (Odkazy. 3. Vyberte možnost DNA Barcodes (DNA čárové kódy). 4. Klikněte na Add new DNA Barcodes (Přidat nové DNA čárové kódy). 5. Klikněte na odkaz Download the example file, čímž stáhnete soubor, který byl vytvořen jako příklad, do Vašeho počítače. 6. Ve vašem počítači stažený.csv soubor upravte nebo použijte Microsoft Excel, Notepad nebo obdobný software pro vytvoření vlastního souboru stejného formátu, kde je sekvence každého čárového kódu na samostatné řádce. V seznamu čárových kódů může být až 384 čárových kódů. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 44

45 Soubor.csv uložte. Poznámka: V rámci sekvenačního běhu lze použít méně než 384 čárových kódů; systém Ion PGM automaticky detekuje a vybere používané čárové kódy ze zvolené sady. 7. Vraťte se do Torrent Browseru, zadejte název pro vytvořenou sadu čárových kódů a klikněte na Browse (Procházet), poté vyberte vytvořený.csv soubor. 8. Klikněte na Upload & Save (Nahrát a uložit). Jméno sady čárových kódů se zobrazí v panelu Barcode (Čárové kódy). Další operace se sadami čárových kódů Zobrazení sady čárových kódů 1. Chcete li zobrazit sadu čárových kódů, zvolte v Torrent Browseru záložku References (Odkazy). 2. V části Barcodes (Čárové kódy) zvolte příslušnou sadu, zobrazí se seznam čárových kódů z dané sady. Vymazání vlastní sady čárových kódů z Torrent Serveru 1. Chcete li zobrazit sadu čárových kódů, zvolte v Torrent Browseru záložku References (Odkazy). 2. V části Barcodes (Čárové kódy) zvolte sadu, kterou chcete smazat. 3. Klikněte na + Delete Barcode Set (Smazat sadu čárových kódů), poté klikněte na Yes (Ano), čímž smazání potvrdíte. Přidání čárového kódu do vlastní sady čárových kódů 1. Otevřete Torrent Browser a zvolte záložku References (Odkazy). 2. V části Barcodes (Čárové kódy) zvolte sadu, kterou chcete upravit. 3. Klikněte na + Add Barcode (Přidat čárový kód). Zobrazí se okno pro zadání nového čárového kódu: Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 45

46 4. Vyplňte jednotlivá pole a klikněte na Save Barcode (Uložit čárový kód). Úprava nebo smazání čárového kódu z vlastní sady čárových kódů 1. Otevřete Torrent Browser a klikněte na Settings (Nastavení) v pravé části okna, poté zvolte References (Odkazy. 2. V záložce Barcodes (Čárové kódy) zvolte název sady čárových kódů, kterou chcete upravit. 3. V části Action (Krok) zvolte. Pro úpravu čárového kódu upravte čárový kód přímo v okně a klikněte na Save Barcode (Uložit čárový kód). Pro vymazání čárového kódu ze sady zvolte Delete Barcode (Smazat čárový kód), poté potvrďte smazání kliknutím na Yes (Ano). Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 46

47 B Příloha B Řešení problémů Kontrola čipu Problém Možná příčina Doporučené kroky Kontrola čipu se nezdařila Držák není zavřený Čip není správně usazen Lůžko pro čip je znečistěno Čip je poškozen 1. Otevřete držák, vyjměte čip a zkontrolujte, že mimo flow celu čipu nedochází ke kondenzaci vlhkosti: Kondenzace 1. Zdá-li se čip být poškozen, vyměňte ho. 2. Zkontrolujte, zda je lůžko na čip čisté. Vypláchněte nečistoty 18 MΩ vodou a opatrně vysušte dotykem papírového ručníku. Lůžko nikdy nevytírejte, můžete jej poškodit. 3. Zavřete držák a opakujte kontrolu čipu. 4. Je-li kontrola úspěšná, klikněte na Next (Dále). Pokud je neúspěšná, použijte nový čip, naskenujte jeho čárový kód a proveďte novou kontrolu čipu. 5. Je-li kontrola čipu i nadále neúspěšná, Kontaktujte technickou podporu. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 47

48 Kalibrace čipu (před plněním vzorku) Problém Možná příčina Doporučené kroky Netěsnost neznámého původu Čip netěsní Držák čipu není správně zavřený Problém s držákem nebo lůžkem čipu 1. Stiskněte Main Menu (Hlavní nabídka). 2. Otevřete držák čipu, vyjměte čip a opatrně vysušte lůžko čipu dotykem papírového ručníku. Lůžko čipu nikdy nevytírejte, můžete jej poškodit. 3. Vypláchněte lůžko pomocí 18 MΩ vody a odstraňte většinu vody dotykem papírového ručníku. 4. Opakujte oplach a vysušte do sucha. 5. Položte papírový ručník na zemnící destičku a navlhčete 18 MΩ vodou. Otřete o ručník čip, abyste odstranili soli z kontaktů čipu. 6. Odstraňte ručník, vysušte zemnící destičku a položte na ni čip. Na čipu nesmí být kondenzace vlhkosti: Kondenzace 7. Podle potřeby použijte nový čip. (Poznámka: Nový čip lze k sekvenování použít po skončení inicializace.) 8. Stiskem Run spusťte experiment znovu. 9. Na výzvu instalujte nový čip a uzavřete držák. 10. Pokud čip opět netěsní, vyčistěte lůžko jako předešle. Kontaktujte technickou podporu. Chybová hláška: Calibration FAILED (Kalibrace se nezdařila) Čip není správně usazen v lůžku Čip je poškozen 1. Vyjměte čip a ujistěte se, že lůžko je suché a čisté. Pokud je to potřeba, vyčistěte lůžko podle pokynů v části Kontrola čipu se nezdařila a/nebo Netěsnost neznámého původu výše. Pokud netěsnost ani znečistění nepozorujete, usaďte čip zpět do lůžka. 2. Stiskněte Calibrate a opakujte kalibraci. 3. Je-li kalibrace úspěšná, klikněte na Next (Dále). Pokud je neúspěšná, restartujte experiment za použití nového čipu. 4. Při opakovaném problému i při použití nového čipu kontaktujte technickou podporu. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 48

49 Kalibrace čipu (s již naplněným vzorkem) Problém Možná příčina Doporučené kroky Netěsnost neznámého původu Čip netěsní Držák čipu není správně zavřený 1. Stiskněte Abort (Zrušit). 2. Otevřete držák čipu, vyjměte čip a opatrně vysušte lůžko čipu dotykem papírového ručníku. Lůžko čipu nikdy nevytírejte, můžete jej poškodit. 3. Vypláchněte lůžko pomocí 18 MΩ vody a odstraňte většinu vody dotykem papírového ručníku. 4. Opakujte oplach a vysušte do sucha. 5. Položte papírový ručník na zemnící destičku a navlhčete 18 MΩ vodou. Otřete o ručník čip, abyste odstranili soli z kontaktů čipu. 6. Odstraňte ručník, vysušte zemnící destičku a položte na ni čip. Na čipu nesmí být kondenzace vlhkosti: Kondenzace 7. Pozorujete-li kondenzaci, je čip poškozen a nelze jej použít. 8. Nepozorujete-li kondenzaci, opakujte kalibraci. 9. Je-li kalibrace úspěšná, stiskněte Next (Dále) a zahajte tak experiment. 10. Pokud čip opět netěsní, vyčistěte lůžko jako předešle. Kontaktujte technickou podporu. Chybová hláška: Calibration FAILED (Kalibrace se nezdařila) Čip není správně usazen v lůžku Čip je poškozen 1. Vyjměte čip a ujistěte se, že lůžko je suché a čisté. Pokud je to potřeba, vyčistěte lůžko podle pokynů v části Kontrola čipu se nezdařila a/nebo Netěsnost neznámého původu výše. Pokud netěsnost ani znečistění nepozorujete, usaďte čip zpět do lůžka. 2. Stiskněte Calibrate a opakujte kalibraci. 3. Je-li kalibrace úspěšná, klikněte na Next (Dále). Pokud je neúspěšná, můžete čip zkusit opakovaně usadit do lůžka a opakovat kalibraci. Pokud je kalibrace neúspěšná, stejně stiskněte Next (Dále) a spusťte experiment nějaká data ze vzorku můžete i tak získat. 4. Při opakovaném problému s kalibrací kontaktujte technickou podporu. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 49

50 Inicializace: Obecné problémy Problém Možná příčina Doporučené kroky Chybová hláška: Confirm instrument has gas pressure (Nedostatečný tlak plynu) Bomba s dusíkem/ argonem je zavřená nebo prázdná 1. Bomba musí mít tlak alespoň 500 PSI a 30 PSI na výstupu z regulačního ventilu. Všechny ventily mezi bombou a systémem Ion PGM musí být otevřené. 2. Je-li vše v pořádku, stiskem Yes znovu ověřte, že tlak plynu je dostatečný. Pokud se problém nevyřeší, kontaktujte technickou podporu. Láhev netěsní Těsnění láhve netěsní Láhev je poškozena 1. Dotáhněte láhve. 2. Podle potřeby láhve vyměňte. 3. Pokud se problém nevyřeší, kontaktujte technickou podporu. Inicializace: chyby v úpravě ph Problém Možná příčina Doporučené kroky Chybová hláška: Please insert a chip and press Start (Vložte čip a stiskněte Start) Přístroj nedetekoval čip v držáku 1. Otevřete držák a vyjměte čip. 2. Zkontrolujte, zda je lůžko na čip čisté. Vypláchněte nečistoty 18 MΩ vodou a opatrně vysušte dotykem papírového ručníku. Lůžko nikdy nevytírejte, můžete jej poškodit. 3. Zkontrolujte, že mimo flow celu čipu nedochází ke kondenzaci vlhkosti: Kondenzace 4. Pozorujete-li kondenzaci, je čip poškozen a nelze jej použít. (Poznámka: Nový čip lze k sekvenování použít po skončení inicializace.) 5. Uzavřete držák a stiskněte Start. 6. Není-li problém vyřešen ani při použití nového čipu, kontaktujte technickou podporu. Chybová hláška: Chip calibration failed (Kalibrace čipu se nezdařila) Čip není správně usazen v lůžku Čip je poškozen Volná hadička Postupujte podle pokynů v části Chybová hláška: Please insert a chip and press Start. Postupujte podle pokynů v části Chybová hláška. Wash 2 average not stable. Souprava Ion PGM Sequencing 200 Kit v2 - Uživatelská příručka 50