Základy světelné mikroskopie

Transkript

1 Základy světelné mikroskopie

2 Kotrba, Babůrek, Knejzlík: Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, zvětšuje max max cca 0,2 mm stovky nm až desetiny nm rozlišovací mez = nejmenší vzdálenost mezi dvěma body, které daná soustava rozliší jako dva body

3 MIKROSKOP Část mechanicka : i)stativ ii)nosič tubusu iii)makrometrický šroub iv)mikrometrický šroub Část osvětlovací : i)zrcadlo ii) clona iii) kondenzor iv)filtr v) stolek Část optická : i)okulár Huygensův [hajchenzův] okulár H 4x,10x Periplanatický okulár-p10x 20x ii)objektiv geometrické zvětšení NA 6 0, , , ,3 v)světelný zdroj

4 Optická soustava (světelného) mikroskopu Optický interval mikroskopu ( D ) Vzdálenost zadního ohniska objektivu (F) od předního ohniska okuláru (F1). Celkové zvětšení = zvětšení objektivu zvětšení okuláru by mělo ležet uvnitř intervalu užitečného zvětšení. kondenzor clona Zaostření světla do roviny objektu Užitečné zvětšení (Abbé): interval 500 A 1000 A Volba okuláru: Spodní mez 500 A: umožní oku využít potenciál objektivu Překročená horní mez 1500 A: prázdné zvětšení (s použitím více zvětšujících okulárů 20x, 25x) - větší zvětšení neumožňuje rozlišení dalších podrobností, nepřináší o objektu žádné další informace, obraz objektu je méně ostrý zdroj světla

5 Okuláry = optická soustava, která zvětšuje obraz vytvořený objektivem -zvětšení 5-25 ; většinou dvě ploskovypuklé čočky oko -čočka očnicová (frontální) blíže k oku -čočka sběrná (kolektivní) blíže k objektu Umístění ohniskové roviny, kde se tvoří obraz z objektivu -kruhová clona mezi čočkami V ohniskové rovině mohou být -clona zorného pole -měřítko

6 Číslo zorného pole okuláru umožňuje zjistit velikost předmětového pole (P), jehož obraz pozorujeme určitým okulárem Okulár 10x CWHK10X-T/18L -u školního mikroskopu P = [mm] číslo zorného pole okuláru Mobj. kt P = průměr předmětového pole 18 = číslo zorného pole okuláru (údaj na okuláru) Mobj = zvětšení použitého objektivu kt = zvětšovací faktor tubusu (u Olympusu = 1) Číslo zorného pole okuláru

7 Charakteristiky objektivů 10 : zvětšení (obvykle )

8 /0.45 NUMERICKÁ APERTURA (A) A = n sina reálné a = 140º sin70º = 0,939 n(vzduch) 1 A = 0,94 Kotrba, Babůrek, Knejzlík: Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, Rozlišovací mez (a) / rozlišovací schopnost (R a ) = 1/a a = 0,61 l / A zlepšení rozlišení : kratší l nebo zvýšení A

9 Zvýšení A zvýšením n v A = n sina Kotrba, Babůrek, Knejzlík: Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, sina/sinb = n(2)/n(1) Voda n = 1,33 (vodní obj.: A 1,25) Imerzní olej n = 1,4 1,5 (imerzní obj.: A 1,4) Sklo n = 1,5 1,9 opticky homogenní prostředí

10 170 /0,17 předepsaná délka tubusu/ doporučená tlouštka krycího skla (v mm) -Pracovní vzdálenost -Hloubka ostrosti (max. vzdálenost dvou ostře zobrazených rovin kolmých na optickou osu) -Světelnost objektivu (intenzita osvětlení zorného pole; úměrná A 2 )

11 Plan Apo Optické vady čoček Vada barevná (chromatická): čočka má pro každou složku polychromatického světla jiné ohnisko (index lomu je fcí l) barevná vada velikosti nebo polohy obrazu KOREKCE - soustavy čoček Achromáty korigovány pro žlutou a zelenou Apochromáty korigovány pro na takřka celé spektrum

12 Kondenzor = převrácený objektiv soustava čoček s krátkou ohniskovou vzdáleností (průměr čoček větší, barevná a kulová vada neodstraněna) A(kondenzoru) = 1,2 1,3 (podobně jako imerzní obj.) přesvětleno sníží kvalitu obrazu správně a sina Kotrba, Babůrek, Knejzlík: Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, Apertura (NA) kondenzoru má být shodná s aperturou objektivu (pankratický kondenzor plynulá změna apertury od 0,16 do 1,4 v souhlase s použitým objektivem) - možná úprava na hodnotu shodnou s objektivem (snížení) pomocí irisové clony

13 Clony u kondenzoru regulace množství světla, přicházejícího do mikroskopu: polní clona blíže zdroje světla irisová (aperturní) clona pod kondenzorem Cloněním ovlivňujeme: - kontrast - hloubku ostrosti - rozlišení podrobností -jas Jednotlivé parametry nelze nastavit nezávisle Aperturní clona kondenzoru Kontrast Hloubka ostrosti Rozlišení Jas zcela otevřená malý malá velké velký zcela zacloněná velký velká malé malý

14 Zvětšení mikroskopu ( M ) D. 250 M = f1. f2 D = optická délka tubusu (tj. vzdálenost zadního ohniska objektivu od předního ohniska okuláru; tzv. optický interval) 250 = normální zraková délka (250 mm) f1 = ohnisková vzdálenost objektivu (v mm) f2 = ohnisková vzdálenost okuláru (v mm) V praxi: celkové zvětšení mikroskopu: M = zvětšení okuláru. zvětšení objektivu

15 Optické filtry matné skleněné filtry různé hustoty- rovnoměrně osvětlené zorné pole o vhodné světelnosti světle modrý filtr - žárovkové světlo- denní žlutozelený filtr použití s achromáty -propouští jen světlo těch vlnový délek (červené, modré), pro kterou jsou objektivy korigovány filtry pro fluorescenci excitační a bariérové, dichroické (jiná barva pro odražené a propuštěné světlo) polarizační polarizace světla

16 Úlohy

17 Co dnes (ne)uvidíme Struktura/Organela Buněčná stěna Cytoplasmatická membrána Jádro a jadérko Endoplasmatické retikulum Golgiho aparát Lyzosom, peroxisom Vakuola Mitochondrie Chloroplast (chromoplast, leukoplast) Ribosom Mikrotubulus Střední filamenta Aktinová mikrofilamenta Inkluze SM (procházející světlo) ano ne (tlouštka 5 nm) ano (lépe barvení) ne ne ne ano (nepřímo i přímo) ano (lépe barvení) ano ne (rozměr nm) ne (síla 25 nm) ne (síla 10 nm) ne (síla 7 nm) ano

18 Fixace a barvení Fixace zastaví metabolické děje v buňce buď jejich zpomalením nebo denaturací enzymů a zachová morfologii a topologii biologických struktur. Fyzikální metody: Teplo (mikrovlnná trouba) Zmražení (tekutý dusík 170 o C) Chemické metody: Imerzní (ponoření do fixační tekutiny) Perfuzní (nástřik cév) precipitují proteiny (chlorid rtuťnatý, kyselina pikrová, kyselina trichloroctová ) denaturují a síťují proteiny kovalentní modifikací (formaldehyd, glutaraldehyd vazba na NH 2 skupiny) fixační směsi FAA (65% ethanol, 5% k. octová, 1% formaldehyd) Bouinův roztok (kyselina pikrová, formaldehyd, kyselina octová, voda) Zenkerův roztok (formaldehyd, dvojchroman draselný, chlorid rtuťnatý, voda) roztoky glutaraldehydu a formaldehydu EM glutaraldehyd + oxid osmičelý

19 BARVENÍ většina barviv nabité molekuly s afinitou k různým buněčným strukturám nebo se selektivní rozpustností bazofilní (objekty kyselé povahy - nesou záporný náboj např. DNA, RNA,glykosaminoglykany) -barvíme bazickými barvivy (toluidinová a methylenová modř, hematoxylin) acidofilní eosinofilní (objekty bazické povahy - nesou kladný náboj obecně cytoplasma, některé granuly) -barvíme kyselými barvivy (oranž G, eosin, kyselý fuchsin) Vitální barvení: neutrální červeň (kyselé prostředí vakuoly, lysozomu => červená) Janusova zeleň (oxidovaná [mitochondrie] zelená, redukovaná - leukoforma) Sudan III Řada fluorochromů, Ab-fluorochom

20 Úloha : Pozorování buněčných stěn, jader, jadérek, mitochondrií, vakuol a cytoplasmy Epidermis dužnaté suknice cibule kuchyňské (nativní prep.) barvení - neutrální červeň (vitální) Lugolův roztok, rhodamin B methylenová modř (po fixaci ethanolem) Lugolův roztok methylenová modř Vymětalová V.: Laboratorní cvičení z biologie, VŠCHT Praha, 2001.

21 Úloha : Pozorování a drůz šťavelanů vápenatého + 5% H 2 SO 4. buňky suché suknice cibule kuchyňské CaSO 4. ½ H 2 O Vymětalová V.: Laboratorní cvičení z biologie, VŠCHT Praha, 2001.

22 Úloha 1: Mikroskopování škrobových zrn brambor brambor / iod kukuřice

23 Úloha 5: Pozorování chromo- a leukoplastů bobule papriky roční Vymětalová V.: Laboratorní cvičení z biologie, VŠCHT Praha, mrkev obecná amyloplasty/ Lugolův roztok plod růže šípkové Vymětalová V.: Laboratorní cvičení z biologie, VŠCHT Praha, 2001.

24 Úloha : Mikroskopování prvoků

25 Euglena gracilis

26 Úloha : Mitóza v primárním meristému rostlin ve světelném mikroskopu materiál: apikální meristem kořínků čočku jedlé nebo cibule kuchyňské 1. Fixace (Farmer: 70% ethanol, 25% k. octová) 2. Macerace (50% ethanol, 18% HCl) 3. Vymytí macerační tekutiny 4. Roztlak v 1% nigrosinu v 45% k. octové (tzv. acetonigrosin, váže se na chromatin) cibule kuchyňská čočka jedlá

27 Úloha : Pozorování preparátu kvasinek a plísni

28 Úloha : Plasmolýza a stanovení osmotické hodnoty buněk Semipermeabilní cytoplasmatická membrána umožňuje přechod molekul vody z nebo do kompartmentu tak, aby a H2O (nebo konc. rozpůštěných, tzv. osmoticky aktivních látek) uvnitř a vně kompartmentu byly shodné (rovnováha) Prostředí: izotonické hypotonické a H2O vně = a H2O uvnitř a H2O vně > a H2O uvnitř hypertonické a H2O vně < a H2O uvnitř izotonické plasmolýza smrštění protoplastu hypertonické nepřímý průkaz cytoplasmatické membrány Mnium affine Elodea canadensis Allium sp.