Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253

Transkript

1 Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 7 Vlastnosti solventů (rozpouštědel) Přehled organických rozpouštědel Tabulka níže shrnuje velký počet solventů v pořadí stoupající polarity. Mnohé z nich nejsou vhodné jako mobilní fáze z důvodů uvedených dříve. Z tabulky je patrné, proč některá rozpouštědla nejsou vhodná, např. kvůli vysoké absorpce UV záření nebo třeba vysoké viskozitě. Některé solventy jsou užívány v malých množstvích jako aditiva mobilní fáze pro určité aplikace: přídavek aminů vede ke posunu ph do zásadité oblasti, naopak přídavek kyselin sníží ph do kyselé oblasti. Tabulka uvádí následující vlastnosti solventů: Eluční síla: ε 0 je parametr uvádející eluční schopnost solventu pokud je použit jako mobilní fáze v kombinaci se silikagelem jako stacionární fází. Představuje adsorpční energii elučního činidla vztaženou na jednotku plochy absorbentu. Tabulka solventů seřazená podle tohoto parametru se často nazývá elutropická řada. [Často tabulky shrnují ε 0 hodnoty na alumině jako adsorbentu a jsou vyšší než na silikagelu: ε 0 (Al 2 O 3 ) = 1.3 ε 0 (SiO 2 )]. Viskozita: ž je uváděna v mpa a při 20 C. Solventy s vyšší viskozitou naž voda ž = 1.0 jsou méně vhodné pro HPLC, protože jejich použití vede k vysokým tlakům na koloně. Index lomu: jak plyne ze zkratky, n 20 D, je uváděn při C.

2 UV hrana (cutoff): Je to vlnová délka, při které je absorbance solventu rovna 1.0 v 1 cm kyvetě a při aplikaci vzduchu jako referenční hodnotě (10% transmitance). Data prezentovaná v tabulce jsou platná jen pro velmi čistá rozpouštědla. Solventy horší čistoty mají hodnoty vyšší. Bod varu: Příliš nízký bod varu je nevýhodný. Dochází k tvorbě bublin v HPLC systému. Také může díky vysoké těkavosti dojít ke ztrátě solventu při jeho odplyňování zejména proudem helia. Dipólový charakter: π* je měřítkem schopnosti rozpouštědla interagovat s analytem dipólovými interakcemi a polarizačními silami. Kyselost: α je měřítkem schopnosti solventu chovat se jako donor vodíku k bazickým analytům (akceptorům). Zásaditost: β je měřítkem schopnosti solventu chovat se jako akceptor vodíkové vazby vůči kyselým analytům (donorům). Poznámka: π*, α a β jsou relativní čísla a jsou normalizovány tak, že jejich součet je roven Tyto tzv. solvatochromní parametry jsou velmi užitečné při popisu a srovnání jednotlivých rozpouštědel. Solventy s nízkou polaritou, fluoroalkany tetrachlormetan, neinteragují s analyty dipólovými ani vodíkovými interakcemi a z toho důvodu u nich uvedené parametry nejsou definovány.

3 Selektivita solventů Nejúčinnější způsob ovlivnění separace je změna separační selektivity. Toho lze dosáhnout aplikací jiného separačního modu (např. normální vs reverzní fáze) použitím jiné stacionární fáze (např. oktadecyl- vs fenyl- silikagel) nebo využitím odlišné mobilní fáze. V tom druhém případě je nejvhodnější zvolit solvent maximálně odlišný od původního dle výše specifikované tabulky, a níže uvedeného diagramu, kde jsou graficky prezentovány solvatochromní vlastnosti rozpouštědel.

4 Trojúhelník v diagramu dole představuje ukazujíce vzájemné rozdíly jednotlivých solventů vzhledem k jejich parametrům π*, α a β. Často je selektivita solventů nastavena mícháním dvou čistých solventů A a B, je třeba připomenout, že tyto solventy musí být vzájemně mísitelné. Dále, pokud jde o ladění selektivity v normálním modu, nemá velký smysl zaměnit diethyl ether terc-butyl methyl etherem, protože oba solventy jsou prakticky na stejném místě v trojúhelníku. Podobně, není smysluplné snažit se zkoušet několik různých alifatických alkoholů v modu reverzní chromatografie. Benzen a jeho deriváty jsou jen výjimečně používány v roli mobilní fáze z toho důvodu, že neumožňují UV detekci. Mísitelnost solventů Obrázek níže poskytuje informace o mísitelnosti běžných HPLC solventů při laboratorní teplotě. Mísitelnost je závislá na teplotě. Navíc, mnoho rozpouštědel je vzájemně omezeně mísitelných, tedy jsou mísitelné jen v jistých poměrech. Tato skutečnost v obrázku znázorněna není, protože je lepší míchat solventy vzájemně neomezeně mísitelné.

5 Solventy plně mísitelné se všemi ostatními rozpouštědly (od hexanu po vodu) jsou aceton, ledová kyselina octová, absolutní ethanol, isopropanol a tetrahydrofuran. Pufry Pufry jsou užívány např. v modu iontově-výměnné chromatografie a často také v chromatografii na reverzní (obrácené) fázi. Pokud mají být děleny iontové nebo ionizovatelné látky, je velmi často, i když ne vždy, třeba provádět chromatografii při dané hodnotě ph, která je nastavena pufrem. Tímto způsoben může být také řízen stav analytu, tedy zajištěno v jaké formě je analyt chromatografován, tedy zda v nedisociované nebo disociované. Vybrané ph musí být alespoň o 2 jednotky ph odlišné, než je hodnota pk a analytu, jedině pak je velká většina látky jen v jedné formě.

6 Kyselé analyty: Pufry mající hodnotu ph o dvě jednotky nižší než pk a analytu zajistí kompletní potlačení disociace kyselého solutu. Pufry s hodnotou ph o dvě jednotky vyšší naopak úplnou disociaci kyselého analytu. Zásadité analyty: Pufry s ph o dvě jednotky vyšší hodnotou než pk a zásaditého analytu zabezpečí kompletní potlačení protonizace analytu, pufry s hodnotou ph o dvě jednotky nižší než pk a analytu zabezpečí kompletní protonizaci analytu. Pokud se jedná o iontovou sílu pufru je vhodné začít s asi 25 mmol -1 roztoky. Příliš nízká koncentrace pufru vede k nedostatečné schopnosti pufru udržovat stálou hodnotu ph mobilní fáze. Vysoká iontová síla (např. 100 m mol -1 ) může vést k potížím s rozpustností v organických solventech. Je vhodné si předem zkontrolovat mísitelnost pufru s organickým rozpouštědlem v plném rozsahu předpokládaných poměrů. Roztoky pufrů musí být před užitím jako mobilní fáze pro HPLC filtrovány! Pufry jsou náchylné k bakteriálnímu růstu, proto může být vhodné preventivně přidat 0.1% azid sodný. Pufr nesmí zůstat v HPLC instrumentu a v koloně v době, kdy neprobíhá dělení. Musí být nahrazen nejprve vodou a pak, pokud jde o chromatografii v reverzním modu, 100% organickým rozpouštědlem. Pokud je tento postup nepohodlný, bylo by to zdlouhavé provádět každý den, je třeba čerpadlo nevypínat a v době, kdy se neměří jen snížit průtok. Pufry plní svou funkci, tj. udržují stabilní ph, jen v blízkém okolí, asi ± 1, jejich hodnoty pk a. Table níže shrnuje některé běžné pufry včetně jejich pk a hodnot. Hodnota ph je jednoznačně definována ve vodném prostředí a může být počítána na základě znalosti složení soli a kyselin, respektive báze. Pokud je přidáno také organické rozpouštědlo, je situace obecně složitější. Potíže s definováním a měřením ph v těchto směsných prostředí může být často obejita tak, že je ph změřeno ve vodném prostředí před přídavkem organického aditiva a následně po jeho přídavku již měřeno není. Je třeba zde zdůraznit, že problematika definování ph ve směsných organicko-vodných mobilních fázích je poměrně složitá a nesmí být obecně přehlížena nebo podceňována.

7 Pufry bývají připravovány také z komerčních koncentrátů, kdy správným ředěním je dosažena uvedená hodnota ph. Pokud není možno koncentrát pufru koupit nebo to z nějakého důvodu není vhodné, je nejlepší postup přípravy pufru založen na vážení příslušných chemikálií, kdy jsou potřebná množství nalezena v tabulkách nebo jsou vypočítána a následně je přidána voda a nastaven objem. Pro kombinaci s optickým rozptylovým detektorem, pro LC-MS a pro preparativní separace je vhodné volit těkavé pufry, ty jsou prezentovány v tabulce níže. Těkavost kyselin, zásad a solí byla studována Petritisem a kol. 1 Pufry vhodné pro ESI-MS publikoval García. 2 1 K. Petritis et al., LC GC Eur., 15, 98 (2002). 2 M/C. García, J. Chromatogr. B, 825, 111 (2005).

8 Trvanlivost pufrů Je dobré připravit si jen tolik pufru, kolik bude spotřebováno v krátké době. Trvanlivost vodných pufrů bez organických aditiv je velmi krátká. Voda z přístroje na ultračistou vodu 3 dny Vodné roztoky (nepufrované) 3 dny Pufry 3 dny Vodné roztoky s méně než 15% organického rozpouštědla 1 měsíc Vodné roztoky s více než 15% organického rozpouštědla 3 měsíce Organická rozpouštědla 3 měsíce Je třeba si dále uvědomit, že při míchání vodných roztoků s organickými solventy často dochází k objemové kontrakci, proto není možné připravovat směsné roztoky tak, že by jeden roztok byl odměřena a druhý byl k němu přilit a objem nastaven doplněním po rysku.