ID-gelový systém. Dvojí populace erytrocytů příčiny problémy při stanovení interpretace nálezů. Reakce dvojí populace ery Srovnání s běžnými výsledky

Transkript

1 Dvojí populace erytrocytů příčiny problémy při stanovení interpretace nálezů Eliška Rýznarová LAB-MED Systems s.r.o Dvojí populace erytrocytů Je termín, se kterým se setkáváme v imunohematologických laboratořích nejčastěji v souvislosti s předtransfuzním vyšetřením a potřebou zajistit pacientovi kompatibilní krev. Ne všechny laboratorní techniky jsou však schopny rozlišit reakci dvojí populace ery Laboratorní metody testování a možnost detekce dvojí populace ery na sklíčku ve zkumavce na mikrotitračních deskách v gelovém systému metodou Capture - soustředěný terčík - méně soustředěný terčík - manuální testování náročné ID-gelový systém Pouze systém sloupcové gelové aglutinace umožňuje spolehlivě vizuálně rozlišit reakci dvojí populace ery. Příčinou dvojí populace ery může být: - chybný pracovní postup - přirozený jev Reakci dvojí populace ery (sediment + aglutinace v gelu) je nutno interpretovat jako pozitivní výsledek. Reakce dvojí populace ery Srovnání s běžnými výsledky sediment + aglutinace v gelu

2 Správná technika testování Předpokladem pro správné vyhodnocení výsledků testování je správné provedení testu. Správné pipetování ery je v úhlu 45 směrem ke stěně rozšířené části mikrozkumavky - důvodem je nutnost zachování vzduchové bubliny nad gelem Správné pipetování séra/plazmy je vertikálně bez doteku stěny mikrozkumavky tím je zajištěno smísení séra/plazmy s ery a průběh reakce mezi antigenem a protilátkou Chybné pipetování může vést k falešně negativnímu výsledku a způsobit HTR 10 Správné a chybné pipetování Správné pipetování: ery v úhlu 45 plazmu vertikálně 11 Dvojí populace ery - příčiny 1. Vzájemná kontaminace krevních vzorků 2. Po alogenní transfuzi krve 3. Po transplantaci KD, kmenových buněk 4. Po intrauterinní transfuzi 5. Fetomaternální a maternofetální inkluze 6. Slabé podskupiny A, B (zejména A 3 ) 7. Částečná ztráta antigenu jako důsledek leukémie 8. Získaný antigen B u krevní skupiny A 1 9. Polyaglutinabilita ery (T-Tn aktivace ery) 10. Mozaicismus Rh při myeloproliferativních nemocněních 11. Chimérizmus 12 Tenká vrstva ery na povrchu gelu Není pozitivitou, vyvolává obraz dvojí populace ery. Faktory, které způsobují částečné zadržování ery: 1. Vlákna fibrinu u čerstvých vzorků ne zcela řádně odebraných nebo nedostatečně zcentrifugovaných 2. Koagulační faktory - uvolněné do plazmy, zejména u starých vzorků 3. Vysoký počet leukocytů vytváří bariéru na povrchu gelu 4. Podpovrchové antigeny (kryptoantigeny), odhalené působením bakteriálních enzymů u ne zcela čerstvých diagnostických ery, mohou reagovat s protilátkami v séru vzorků 5. Přítomnost protilátek proti tzv. senescentním (stárnoucím) antigenům 13 Tenká vrstva ery na povrchu gelu Vlákna fibrinu zachycují část ery na povrchu gelu Příklad: vyšetření aglutininů a screening protilátek KS A (β + fibrin), protilátky pozitivní s ery I+, II++ 14 Chybný odběr vzorku fibrinová vlákna Část ery je zachycena fibrinovými vlákny Opakovat z nově odebraného krevního vzorku Vzájemná kontaminace vzorků Mezi krevními vzorky pacientů nebo dárců při použití stejné pastérky (typování antigenů na ery, zkouška kompatibility) Mezi diagnostickými ery při záměně kapátek (vyšetření aglutininů, protilátek) Testování je nutno opakovat ze správně odebraného vzorku a správnými diagnostiky 5% kontaminace vzorků (1 ml + 50µl) ještě negativní 10% kontaminace vzorků (1 ml + 100µl) již i zde pozitivní

3 2. Po alogenní transfuzi krve Reakce dvojí populace ery je umělá a dočasná. Po transfuzi AB0/D neshodných ery cílená transfuze 0 Rh- krve z vitální indikace způsobená administrativní nebo laboratorní chybou Prověřte historii klinického obrazu a terapii, opakujte vyšetření AB0/D, učiňte potřebná opatření (HTR) Po transfuzi neshodných ery v ostatních antigenních systémech reakce dvojí populace ery je patrná i na ID-Kartách při fenotypizaci. Fenotypizaci lze opakovat po separaci vlastních ery od transfundovaných 19 Transfuze krve 0 Rh- z vitální indikace Příklad: Pacient 0 Rh+, CcD.ee, K- Dárce krve 0 Rh -,ccddee K- ctl negativní 20 Transfuze krve další příklad AB0/Rh pacient 0 Rh + krev dárce 0 Rh - 21 Transfuze krve další příklad fenotypizace Rh pacient ccee krev dárce ccee 22 PAT a autokontrola u pacienta s protilátkou po nedávné transfuzi Vytvořená aloprotilátka se váže pouze na ery transfundované, stále kolující v organismu Vlastní ery poskytují reakci negativní 23 Separace vlastních ery od transfundovaných Metodou jednoduché centrifugace v zatavených mikrohematokritových trubičkách Princip: Nově se tvořící autologní ery pacienta retikulocyty - mají nižší hmotnost než ery transfundované. Koncentrují se v horníčásti trubičky, kterou seřízneme, ery uvolníme a použijeme k typizaci antigenů. Expresivita antigenů na retikulocytech nemusí být tak silná jako na vyzrálých ery. Separace je úspěšnější: - u pacientů s normální nebo vyšší tvorbou retikulocytů - u pacientů, kteří jsou 3 a více dní po trasfuzi Viz AABB Technical Manual, 11TH edition, 1993, str Po transplantaci KD, kmenových buněk Transplantace KD: Autologní převod vlastní KD, odebrané před zahájením přípravného režimu. Lze u pacienta bez infiltrace základním onemocněním nebo v kvalitní remisi. Syngenní od jednovaječného dvojčete Alogenní příbuzenská nebo nepříbuzenská Transplantace kmenových buněk: Autologní kmenové buňky z periferní krve opakovanými cytaferézami před transplantací (zde nemusí maligní b. být) Placentární krev po porodu z pupečníkové žíly, obsahuje dostatek kmenových b. a funkčně nezralé lymfocyty s významným velkým podílem naivních lymfocytů T se slabou reaktivitou GVHD (štěpu proti hostiteli). Banky mražených PK. Fetální jaterní buňky souhlas ženy po potratu (hematopoéza v játrech od 5. týdne) 25 AB0, event. RhD inkompatibilní TKD Z praktického důvodu se obvykle ke shodě AB0 při TKD nepřihlíží, neboť by se vyloučila z dárcovství většina HLA shodných sourozenců nebo HLA vhodných dárců. Řeší předtransplantační příprava pacienta. RhD+ příjemce může být transplantován od dárce RhD-. 26 TKD - Velká neshoda - ABO major DKD přináší nové antigeny (např. dárce A, pac. 0) U příjemce jsou přítomny přirozené aglutininy anti-a nebo anti-b. Transfuze u transplantovaných pacientů: 1. Přípravky erytrocytové: shodné s původní AB0 KS příjemce dokud je prokazována a trvá pozitivita PAT nebo trvá průkaz inkompatibilní AB0 protilátky 2. Přípravky s plazmou: stejné KS AB0 jako dárce KD, od dne transplantace 27 3

4 TKD - Malá neshoda - ABO minor DKD přináší nové protilátky (např. dárce 0, pac. A) Transfuze u transplantovaných pacientů: 1. Přípravky erytrocytové: AB0 KS jako dárce s minimálním obsahem inkompatibilních protilátek anti-a nebo anti-b, dokud jsou detekovány ery s původní KS pacienta 2. Přípravky s plazmou: AB0 skupina shodná s původní KS příjemce až do vymizení ery původní KS TKD - Kombinovaná neshoda DKD přináší nové antigeny i nové protilátky (např. dárce A s anti-b, příjemce B s anti-a) Transfuze u transplantovaných pacientů: 1. Přípravky erytrocytové: Krevní skupiny 0 s minimálním obsahem inkompatibilních protilátek anti-a nebo anti-b, dokud jsou detekovány ery původní KS pacienta 2. Přípravky s plazmou: Krevní skupiny AB až do vymizení ery původní KS příjemce TKD RhD+ příjemce a RhD- štěp RhD+ příjemce může být transplantován RhD- KD (nehrozí tvorba anti-d protilátky) Transfuze u transplantovaných pacientů: Podávat RhD- ery a trombocyty Stav po transplantaci KD či kmenových b. Současně s objevováním se antigenů dárcovských mizí vlastní antigeny pacienta. Prvním průkazem přijetí dřeně je zjištění populace ery antigenně odlišných - tzv. dvojí populace ery. Imunologické změny lze zachytit 14 dní po transplantaci, obvykle později. V konečné fázi po přijetí se všechny antigenní systémy mění v dárcovské (př. svoji KS A na 0). Tento jev je pokládán za příznivý. U leukémie svědčí o remisi choroby. 31 Dvojí populace ery u orgánové transplantace Není vyloučena. Pokud je transplantace AB0, event. RhD kompatibilní ale nestejnoskupinová a dojde k tvorbě AB0 (nebo D) imunních protilátek u příjemce. Jedná se v podstatě o reakci štěpu proti hostiteli. Například: pacient KS B, s aglutininem anti-a štěp KS 0, pokud dojde k reakci štěpu proti hostiteli, pak imunokompetentní buňky štěpu tvoří anti-a a anti-b Od 2. týdne a na konci 3. týdne se sleduje případná tvorba imunních protilátek v AB0 (popř.d) NAT a PAT. Transfuze: do 48 hod po transplantaci se dodržuje KS příjemce následující dny kompatibilní s příjemcem i štěpem Po intrauterinní transfuzi 5. Fetomaternální a maternofetální inkluze Dvojí populaci ery můžeme v těchto případech sledovat podle situace. V krvi plodu, novorozence v souvislosti s intrauterinní transfuzi V krvi matky v případě fetomaternální inkluze V pupečníkové krvi v případě maternofetální inkluze 33 Příklad maternofetální inkluze Pupečníková krev Novorozenec O Rh+, matka A Rh + Srovnání výsledků z krve pupečníkové a venózní tentýž případ maternofetální inkluze z nového venózního vzorku novorozenec O Rh+ matka A Rh + 6. Slabé podskupiny A, B (A 3,A x ) Pacient KS A x Rh+ (s anti-a neg., s anti-ab pos.) po transfuzi 2 krví A 1 Rh+ (s anti-a a anti-ab pos.) 34 venózní krev téměř bez inkluzí mateřské krve, pouze stopy s anti-ab

5 7. Částečná ztráta antigenu jako důsledek leukémie Pacient s CML KS B Rh s částečnou ztrátou antigenu B Získaný antigen B u krevní skupiny A1 Pacienti A 1 se falešně jeví jako AB. Lze pozorovat dvojí populaci ery. Možný výskyt získaného antigenu B je u pacientů: s CA tlustého střeva u pacientů s infekcí, kdy se deacetylačním účinkem bakteriálních enzymů mění imunodominantní cukr KS A acetyl-galaktosamin na galaktosamin - základní strukturu galaktosy, která je charakteristická pro KS B 38 Získaný antigen B a vliv ph na jeho detekci Běžně akceptované ph pro reakci antigenu a protilátky je okolo 7 Při ph monoklonálních diagnostik okolo 7 reaguje získaný antigen B pozitivně a pacient A 1 se jeví jako AB Při ph 6,0 tzv. získaný antigen B nereaguje Pro detekci antigenu B AB0 systému je nutné používat anti-b, které nedetekuje získaný antigen B ID-Karty nedetekují získaný antigen B Poznámka: ph pod 7 (ph 6,5) zvyšuje reaktivitu anti-m a snižuje reaktivitu pro Rh, Fy, Jk a MNS systémy Polyaglutinabilita ery (T-Tn aktivace) - Je stav, kdy jsou ery narušeny takovým způsobem, že jsou aglutinovány velkou většinou liských sér AB0 kompatibilních - Může vést k nesprávnému stanovení skupinových systémů na ery - Transformace T a Tk je způsobena aktivitou bakteriálních enzymů a je přechodného charakteru (staré vzorky, chybný transport) - Transformace Tn bývá spojena s některými hematologickými poruchami a má trvalejší charakter 40 Polyaglutinabilita ery (1) 1. Je kvantitativně proměnný jev, závisí na stupni transformace 2. Charakteristickým rysem může být tzv. aglutinace smíšeného pole pozorovaná na ID-Kartách jako dvojí populace ery 3. Lze pozorovat rozdílné výsledky 4. Poměr aglutinovaných a neaglutinovaných ery může být proměnlivý při vyšetření téže osoby, ale odebrané v jiném časovém úseku 41 Polyaglutinabilita ery (2) Vzorek ery, vykazující polyaglutinabilitu při reakci se sérem dospělých osob nemusí vždy poskytnout také falešně pozitivní reakce při vyšetření KS s monoklonálními reagenty lidského původu Sérum pupečníkové krve obvykle nereaguje aglutinací s polyaglutinabilními ery 42 Polyaglutinabilita ery (3) Další faktory, které se podílí na zjišťovaných rozdílech v reakci transformovaných ery: stárnutí ery stupeň zředění normálního lidského séra přítomnost a působení organických rozpouštědel, která se používají při výrobě diagnostik k určení KS 43 Typy transformace ery Příklad: polyaglutinabilita ery z důvodu bakteriální kontaminace ID-Diluentu 2 T způsobena aktivitou bakteriálních enzymů, je charakteru přechodného. Pozorována snížená reaktivita antigenu H u osob KS 0 a antigenu A u KS A. Při práci na analyzátoru Techno byla pozorována dvojí Enzymy poškozují receptory T na T transformovaných ery. populace ery v denní kontrole kvality při testování Tk - způsobena aktivitou bakteriálních enzymů, je charakteru kontrolní plazmy s protilátkou: anti-fy a a ery Fy (a-,b+) přechodného. anti-d a ery D- Enzymy aktivují receptory Tk na Tk transformovaných ery. Tn spojena s některými poruchami hematologickými a má Jako příčina byla zjištěna kontaminace ID-Diluentu 2. trvalejší charakter. Erytrocyty, které byly transformovány působením Cad je dědičného charakteru. Tyto ery mají současně silně bakteriálních enzymů vykazovaly pozitivní reakci. Zbývající exprimovaný antigen Sd a. K silné aglutinaci s většinou erytrocyty vytvářely sediment na dně mikrozkumavek. normálních lidských sér dochází proto, že ve většině sér je Po dekontaminaci analyzátoru správné výsledky. přítomna protilátka anti-sd a která se může uplatnit vždy jen s ery se silnou expresí antigenu Sd a. Citlivost ery se může lišit (stáří, složení dilučního roztoku atp.). Th transformace S tímto jevem se můžeme setkat i při manuálním testování. VA transformace (může být s depresí antigenu H)

6 před dekontaminací po dekontaminaci analyzátor Techno před a po dekontaminaci PAT před dekontaminací PAT po dekontaminací PAT - analyzátor Techno před a po dekontaminaci Poznámka Při práci na ID-Kartách s polyklonálními diagn. se ery ředí ID-Diluentem 1 (bromelinem). V případě polyaglutinability ery nebo výskytu protilátek proti enzymům mohou vznikat nejasné výsledky. V těchto případech je nutno opakovat typování antigenů na ery na ID-Kartách s monoklonálními diagnostiky, kde se ery ředí ID-Diluentem 2 (LISS). 10. Mozaicismus Mozaicismus představuje dvě nebo více buněčných linií s odlišným genotypem v jednom organismu. Všechny buněčné linie ale pochází z původně jedné zygoty (vzniká splynutím pohlavních buněk při oplození). Mozaicizmus Somatický: vzniká díky mutaci v somatické (tělesné) buňce a nepřenáší se na potomstvo Germinální: vzniká díky mutaci v germinální (zárodečné) buněčné linii a může se přenášet na potomstvo

7 Mozaicizmus Rh při myeloproliferativních onemocněních Myoeloproliferativní choroby, mezi které patří především polycytémie se vyznačují poruchou pluripotentní kmenové buňky a abnormální proliferací erytrocytové, granulocytové a megakaryocytové řady. Primární polycytémie polycythaemia vera zvýšený objem cirkulující krve zvýšená viskozita krve Hb nad 170g/l, htk nad 0,55 l/l, počet ery nad 6,0 x 10 na 12/l (normální hodnoty: Hb g/l, htk 0,36-0,46 l/l, počet ery 3,8-5,5 x 10 na 12/l) 55 Mozaicismus Rh. u polycythaemia vera KS B Rh+ fenotyp CcD.ee zvýšená viskozita mozaicizmus: s anti-d s anti-c 56 Mozaicismus pac. S.M. (1) A1 CCDee + B ccddee 57 Mozaicismus pac. S.M. (2) A1 CCDee + B ccddee Ṃozaicismus pac. S.M (3) A 1 CCDee s anti-a 1 pozitivní s anti-h negativní + B ccddee s anti-a 1 negativní s anti-h negativní 11. Chimérismus Podstatou chimérismu je přítomnost dvou nebo více buněčných linií v jednom organismu, které ale pochází z více původních jedinců Radiační chimérismus Představuje přítomnost dvojí populace buněk po TKD a vzniká jako důsledek intenzivní chemoterapie a ozáření před TKD Dlouhodobý chimérismus je provázen nebezpečným druhotným onemocněním, vyvolaným reakcí štěpu proti hostiteli (GVHD), kterou zahajují T- lymfocyty KD dárce Chimérismus AB0 Rh pacient KS 0 Rh+ dárce KD KS B Rh+ Chimérismus Rh pacient: C w cee K- dárce KD: C w cee, K- Klinicky se rozlišuje reakce štěpu proti hostiteli: - akutní reakce s orgánovým poškozením - chronická reakce s imunitní nedostatečností poznámka: polyklonální anti-c reaguje též s antigenem Cw 63 7

8 Chimérismus arteficiální Závěrem Pouze metoda sloupcové gelové aglutinace dokáže odhalit a rozlišit reakci dvojí populace ery a umožní snadný výběr kompatibilní krve k transfuzi. KS A Rh+ s β a KS O Rhbez alfa 1 a 2 a zeslabená β Protilátky: NAT negativní

9 Děkuji za pozornost