MUTACE A REPARACE DNA. Lekce 6 kurzu GENETIKA Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc.

Transkript

1 MUTACE A REPARACE DNA Lekce 6 kurzu GENETIKA Doc. RNDr. Jindřich Bříza, CSc.

2 MUTACEse dělína: i) genomové změna počtu chromozómů ii) chromozómové změna struktury chromozómů iii) genové změny DNA v rámci jednoho genu -somatické m. vznikají v somatických buňkách a postihují jen část těla organismus jeví mozaicismus (chimérismus) -gametické m. vznikají v buňkách zárodečných linií nebo v gametách a jsou přenášeny do následných generací -dominantní m. x recesivní m. většina mutací je recesivních a ztrátových, ale mohou vznikat i nové znaky -forward m. mutace od standardního k mutovanému typu - zpětná (back) m. mutace od mutovaného ke standardnímu typu

3

4

5 -letální m. působí smrt jedince ve stádiu zygoty nebo ve stádiích před rozmnožováním -semiletální m. působí snížení životaschopnosti -neutrální m. beze změny na vitalitu -supervitální m. zvyšují životaschopnost jedinců -spontánní m. vznikají z vnitřních známých příčin, nikoliv zásahem z vnějšku -m. indukované fyzikálními, chemickými nebo biologickými faktory -morfologické m. vyvolávají (nápadné) změny fenotypu (u mikroorganismů je jejich spektrum velmi omezené, např. mutace petite u kvasinek, vzhled bakteriálních kolonií rouhg x smooth) -nutriční m. m. vedoucí ke změně prototrofie na auxotrofii (neschopnost syntetizovat si veškeré potřebné látky k životu, ty pak musejí být dodávány v médiu)

6

7

8 -podmíněné m. mutace projevující se ve fenotypu jen za určitých podmínek prostředí (např. podmíněně letální jsou u E. coli teplotně senzitivní mutace ty dovolují růst organismu jen za určité nižší, permisivní, teploty, zatímco za obvyklé, tj. vyšší, restriktivní, teploty nikoliv) -teplotně citlivý není gen, ale jeho produkt, tj. bílkovina -podmíněná m. bez letálního efektu siamská kočka, králík himalájský

9 Mutace indukované biologickými faktory -podmíněné transpozicemi genetických mobilních elementů nebo integracemi retrovirů a T-DNA -somaklonální variabilita genetické a epigenetické změny v rostlinných buněčných a tkáňových kulturách Typy genových mutací i) substituce (záměna) bází ii) inzerce (vložení) nebo delece (ztráta) bází iii) expanze trinukleotidových repetic

10 i) substituce bází tranzice -Pu za Pu, Py za Py transverze - Pu za Py a naopak, má dramatičtější důsledky než tranzice jak z hlediska genetického (viz degenerace gen. kódu) tak chemického (struktura Pu x Py)

11 m. měnící smysl (missense m.) záměnou vznikne triplet kódující jinou AK m. beze smyslu (nonsense m.) -záměnou vznikne stop kodon tiché m. (silent m.) -záměnou vznikne triplet kódující stejnou AK (mezi tiché m. řadíme také záměny bází v intronech a v spacerové DNA)

12 ii) inzerce a delece bází -molekulární analýzy ukázaly, že tento typ m. je častější než záměny bází -dojde k tzv. posunovým mutacím (frameshift m.), tj. k posunu čtecího rámce -pokud dojde ke změně počtu, který je násobkem tří, dochází k tzv. in-frame inzercím nebo delecím, jejímž důsledkem je pouze ztráta nebo získání AK v kódovaném polypeptidu -pokud dojde ke změně počtu, který není násobkem tří, dojde při posunu čtecího rámce ke změnám ve všech tripletech od místa mutace záměny AK a vznik předčasného stop kodonu velmi časté iii) expanze trinukleotidových repetic (expanding trinucleotide repeats) -nový typ mutací objevený v r dochází ke zvyšování počtu trinukleotidových přirozeně se vyskytujících repetic

13 -v současné době je minimálně třináct chorob a pět fragilních míst spojováno s těmito expanzemi

14

15 Spontánní mutace -vyvolány vnitřními příčinami nikoliv přítomností mutagenu i) tautomérní přesmyky bází -soudilo se, že jsou hlavní příčinou špatného párování během replikace DNA, ukázalo se ale, že k tvorbě mutací zřejmě nevedou

16

17

18 ii) kolísavé párování bází (non-watson-crick base pairing) -dochází k němu díky značné flexibilitě molekuly DNA (tzv. wobble párování) -většina chybného párování během replikace DNA padá na vrub právě wobble párování

19 iii) deaminace bází -deaminací cytozinu vznikne uracil rozpoznáno uracil DNA glykosylázou odstraněn a nahrazen C -deaminací minoritní báze 5-metylcytozinu (páruje se s G) vznikne tymin, který se při replikace bude párovat s A záměnová m. (tranzice) -deaminací adeninu vznikne hypoxantin párující se s cytozinem rozpoznán specifickou glykosylázou a nahrazen A

20 iv) depurinace -ztráta purinu z nukleotidu AP místo nemůže sloužit jako komplementární templát při replikaci DNA vkládá se náhodný nukleotid (nejčastěji adenin) chyba a při následné replikaci je zafixována -depurinace je poměrně častá záležitost (savčí buňka v kultuře ztratí takto denně cca 10 tis. purinů)

21 v) sklouzávání vlákna DNA při replikaci -dochází k tím k tvorbě inzercí nebo delecí několika nukleotidů a tím k posunovým mutacím

22

23 Mutace indukované chemickými faktory -faktor signifikantně zvyšující mutační rychlost se nazývá mutagen -první chemický mutagen objeven Auerbachovou (yperit, Drosophila, tajný vojenský výzkum publikováno až 1947) i) analogy bází -látky připomínající velmi svojí strukturou standardní báze, takže mohou být inkorporovány do replikované molekuly DNA -5-bromouracil (5BU) je analog tyminu a také se normálně páruje s A, avšak někdy se nesprávně páruje s G, což nakonec vede k tranzici (T.A 5BU.A 5BU.G C.G)

24

25 -2-aminopurin (2AP) je analog adeninu páruje se s T, avšak výjimečně také s C v konečném důsledku tranzice (T.A T.2AP C.2AP C.G) ii) kyselina dusitá způsobuje deaminaci bází, především cytosinu iii) hydroxylamin hydroxyluje cytosin na hydroxylaminocytosin, který se páruje s adeninem (tranzice CG TA)

26

27 iv) interkalační látky -svoji strukturou a velikostí připomínají dvojice bází vmezeřují je do molekuly DNA narušení 3D struktury DNA jednonukleotidové inzerce nebo delece

28 v) oxidativní reakce -látky způsobující poškození DNA prostřednictvím reaktivní formy kyslíku (peroxid vodíku, hydroxylový a superoxidový radikál) vznikají v buňce během normálního aerobního metabolismu (nebo je jejich vznik indukován ionizujícím zářením) -např. z guaninu vznikne 8-oxy-7,8-dihydrodeoxyguanin, který se často nesprávně páruje s A transverze G.C T.A

29 vi) alkylační látky -jsou to elektrofilní látky mají afinitu k DNA, která má negativní náboj (každý nukleotid má negativní náboj na fosfátu a parciální negativní náboje na bázi) -alkylační látky reagují s těmito místy a zanechávají na nich alkyl skupiny (alkylace DNA) -na bázích jsou nejvíce náchylné k alkylacím N 7 guaninu a N 3 adeninu destabilizace vznik apurinního místa mutace -alkylovány mohou být rovněž všechny atomy N a O podílející se na tvorbě vodíkových můstků nesprávné párování takové báze mutace -dělí se na monofunkční (EMS etylmetansulfonát, MMS metylmetansulfonát, ENU etylnitrosomočovina, MNNG metylnitronitrosoguanidin) a bifunkční (ty způsobují také hodně chromozómových mutací zlomů = klastogenní účinek; sirný a dusíkatý yperit)

30

31

32 vii) aflatoxin B1 -silný kancerogen produkovaný plísněmi rodu Aspergillus (aflatoxiny jsou akutně toxické, kancerogenní, mutagenní a teratogenní) -váže se na guanin v pozici N 7 destabilizace vazby báze-cukr vznik AP místa mutace -potraviny choulostivé na výskyt aflatoxinů jsou arašídy, para ořechy, chilli, koření, sušené ovoce (např. fíky), sója, kukuřice -viz též

33 Mutace indukované zářením -poprvé popsán mutagenní účinek záření (X paprsků) v r H. Müllerem -X záření, gama záření, kosmické záření (ionizační záření) x UV záření i) UV záření -má nízkou energii proniká jen nepatrně a nezpůsobuje ionizaci, nicméně je vysoce mutagenní -způsobuje tvorbu pyrimidinových dimerů (nejčastěji T-T, méně často C-C nebo C-T) v rámci jednoho vlákna DNA vytvořením cyklobutanového kruhu změna 3D struktury DNA inhibice replikace a transkripce) nebo 6-4 fotoproduktu -nejsilnější mutagenní účinek má UV 260 nm (DNA nejsilněji absorbuje záření stejné vlnové délky)

34 ii) ionizující záření -vysoká energie vysoce pronikavé -způsobuje tvorbu volných radikálů a reaktivních iontů, které napadají DNA a vedou nejčastěji k dvouřetězcovým zlomům (ionizační záření je klastogen = mutagen způsobující zlomy) nepřímý účinek záření -přímý účinek zásah přímo molekuly DNA a její poškození (zlomení)

35 Reverze -reverzní m. je změna vedoucí od mutovaného ke standardnímu fenotypu -pravá reverze změna DNA na původní sekvenci -supresorová m. genetická změna potlačující efekt jiné (forward) mutace

36 -intragenová suprese druhá mutace v rámci téhož genu -intergenová suprese obnovení fenotypu je dosaženo zavedením druhé mutace do jiného genu (obr.17-10)

37

38 REPARACE DNA i) přímá reparace ii) nepřímá reparace (excizní) iii) reparace chybného párování (mismatchrepair) iv) postreplikační reparace v) reparace dvouřetězcových zlomů (DSB repair) vi) SOS reparace

39 i) přímá reparace: DNA fotolyáza (fotoreaktivace) -opravuje pyrimidinové dimery, energii získává z viditelné části světla -enzym poškozené místo rozezná, opraví a poté z DNA disociuje

40 O 6 -alkylguanin-dna-alkyltransferáza -opravuje přímo báze alkylované v pozici O 6 -guanin, O 4 -tymin a alkylovaný fosfát odstraněním (přenesením) navázaných alkylových skupin - sebevražedný enzym (jedna alkyl skupina přenesená na cystein enzymu ho ireverzibilně inaktivuje)

41 ii) nepřímá reparace: Excizní reparace poškozená DNA je odstraněna a nahrazena nově syntetizovanou DNA -base excision repair (BER) -DNA glykosyláza rozpozná poškozené místo (existují různé glykosylázy na rozpoznávání různých typů poškození DNA) přerušení vazby cukr báze a její uvolnění vznik AP místa enzym 5 -AP endonukleáza vytvoří jednořetězcový zlom 5 3 exonukleáza začne odstraňovat přilehlé nukleotidy (krátký úsek) DNA polymeráza I (u bakterií) nebo ß (u eukaryot) zaplní uvolněné místo ligáza kovalentně spojí -DNA polymeráza ßnemá korekční (proofreading) aktivitu (1 chyba na 4000 inkorporovaných nukleotidů; v lidském genomu je denně opraveno tímto způsobem tis. nukleotidů, tj, polymeráza by takto denně vyrobila až 10 mutací) tuto aktivitu zajišťují při této opravě speciální AP endonukleázy, tzv. APE1

42

43 -nucleotide excision repair (NER) -velmi univerzální, odstraňuje velké množství typů poškození -komplexní proces řízený velkým počtem genů -komplex enzymů vyhledává na DNA distorze separace vláken DNA v oblasti poškození a jejich stabilizace navázáním speciálních proteinů zlomy poškozeného vlákna ve vzdálenosti 5 nukleotidů na 3 konci a 8 nukleotidů (u bakterií) nebo nukleotidů (u eukaryot) na 5 konci DNA polymeráza zaplní uvolněné místo DNA ligáza kovalentně spojí iii) reparace chybného párování -DNA polymeráza má spolehlivost 10-4 až10-5, její proofreadingová aktivita zvyšuje spolehlivost replikace až na zbývající chyby opravuje mismatch reparace a dále opravuje malé smyčky DNA vznikající díky sklouzávání vláken DNA při replikaci

44

45

46 iv) postreplikační reparace -probíha po replikaci DNA rekombinačním způsobem -poškození DNA neopravuje, ponechává ho na místě, ale umožní replikaci DNA i v oblasti léze

47 v) reparace dvouřetězcových zlomů Existují dva základní mechanismy opravy: i) homologní rekombinace (jako templát pro opravu DSB využívá totožné nebo velmi podobné sekvence DNA) ii) nelegitimní rekombinace (NHEJ nonhomologous end joining; rekombinuje zcela odlišné sekvence) Homologní rekombinace (HR) -je důležitá při opravě DNA v somatických buňkách a při meióze -existují 3 modely HR (založené ovšem především na studiích na kvasinkách) Nelegitimní rekombinace (NHEJ) -nejčastější způsob opravy DSB v eukaryotních buňkách -iniciační rozpoznání zlomu je zprostředkováno komplexem KU70 a KU80 -následuje opracování konců DNA molekuly (komplex MRN), aby byly substrátem pro DNA ligázu -závěrečná ligace je katalyzována komplexem DNA ligázy IV a proteinu XRCC4

48

49 vi) SOS reparace (chybující, error-prone) -dovoluje překonat replikační blok i za cenu vnesení četných chyb do DNA (což může být meší zlo než nedokončená replikace DNA, která je fatální) -komplexní proces zahrnující nejméně 25 genů

50

51 Detekce mutagenů v prostředí -začíná se nejjednoduššími testy, tj. testy s mikroorganismy -stěžejní je test Amesův, jenž pracuje s auxotrofním mutantem (his - ) Salmonella typhimurium a sleduje vznik zpětných mutací na prototrofii -bakterie má inaktivován reparační systém (=zvýšení citlivosti) a modifikovanou lipopolysacharidovou stěnu (=zvýšení průniku látek z okolí) -pracuje se s řadou kmenů určených pro detekci různých skupin chemických mutagenů -modifikace s mikrozomální jaterní frakcí S9 umožňuje přiblížit prokaryotní systém systému eukaryotnímu a tím dovoluje identifikovat tzv. promutageny, tj. látky, které samy o sobě nejsou mutagenní, mutagenem se stanou až po metabolické aktivaci organismem (buňkou)

52