Mykologie potravin: studium interakcí mikroskopických hub s potravinou nebo krmivem vedoucí ke kontaminaci, k rozkladným procesům nebo k produkci

Transkript

1 Mykologie potravin Standardní vyšetřovací metody založené na kultivaci kvasinek a plísní na pevných půdách, vyhodnocování morfologie (makro- a mikroskopicky), typy toxinů produkovaných plísněmi.

2 Mykologie potravin: studium interakcí mikroskopických hub s potravinou nebo krmivem vedoucí ke kontaminaci, k rozkladným procesům nebo k produkci mykotoxinů

3 V rámci Mezinárodní unie mikrobiologických společností (IUMS) byla v roce 1990 ustavena Mezinárodní komise pro mykologii potravin (ICFM) Mezinárodní komise pro mykologii potravin (ICFM) V České republice: Dozorové orgány: -Státní zemědělská a potravinářská ispekce -Státní veterinární správa -Orgány ochrany veřejného zdraví (ministerstvo zdravotnictví, krajské hygienické stanice)

4 V České republice: Doc. MVDr. Vladimír Ostrý, CSc. (mykolog, toxikolog) Doc. RNDr. František Malíř, Ph.D. (toxikolog) Ailsa D. Hocking Robert A. Samson Jens C. Frisvad Významní mykologové potravin Doc. Ostrý Doc. Malíř

5 Dříve platná vyhláška: 132/2004 neplatná

6 Vyhláška č.132/2004 V řadě komodit se sledoval celkový počet kvasinek, plísní nebo potenciálně toxinogenních plísní

7 V současné době platí NAŘÍZENÍ KOMISE (ES) č. 1441/2007 Množství kvasinek ani plísní se nesleduje Posouzení plesnivých potravin: Zákon č.110/1997: plesnivé potraviny jsou posouzeny pracovníky dozorových organizací jako jiné než zdravotně nezávadné. Evropská legislativa (č.178/2002, článek 14): při rozhodování o tom, zda potravina není vhodná k lidské spotřebě, se bere v úvahu skutečnost, zda není nepřijatelná pro lidskou spotřebu z důvodu: - kontaminace cizorodými nebo jinými látkami - nebo z důvodu hniloby, kažení nebo rozkladu

8 Přenesení kulturní plísně v domácnosti FALEŠNÉ PLESNIVĚNÍ Penicillium camemberti Ne vše je mikrobiální kontaminace Charakteristické vzdušné mycelium Škrobová zrna, mouka

9 Bez závad tukový výkvět plíseň

10 Mykologický problém ne Pylová zrna se zbytky rostlinného materiálu ano Termotolerantní houba Neosartorya fischeri

11 Nejnovější fylogenetické členění hub Alternativní systém skupin ( říší ) dle Simpsona a Rogera (2004) Vývojová větev (říše) Fungi Zjednodušené schema pro základní orientaci: Oddělení: Chytridiomycota Microsporidiomycota Zygomycota Glomeromycota Ascomycota Basidiomycota

12 Zygomycety Askomycety Basidiomycety Asky s askosporami Bazidie Sterigmata Bazidiospory Bohaté vzdušné mycelium, většinou nepřehrádkované Plodnice (perithecium)

13 Životní cyklus Penicillium Talaromyces flavus Aspergillus Vegetativní mycelium Kleistothecium Jednotlivé plodničky kleistothecia (Emericella nidulans

14 MYKOLOGIE POTRAVIN 1. Fytopatologické houby (napadají plodiny při růstu na poli) Nekrotrofní parazité Biotrofní parazité 2. Skládkové houby (rozmnožují se na uskladněných plodinách a potravinách) Saprotrofní houby

15 Nekrotrofní parazit Napadení živé tkáně vznik nekrotického ložiska dále saprotrofní přežívání Biotrofní parazit zde úplně chybí saprotrofní fáze, v přirozených systémech vazba pouze na živá pletiva

16

17 Saprotrofové Získávají živiny enzymatickým rozkladem organických zbytků Cladosporium herbarum Aspergillus flavus

18 STANOVENÍ POČTU KVASINEK A PLÍSNÍ - normy Zkušební laboratoř Ústavu biochemie a mikrobiologie akreditované metody včetně stanovení počtu kvasinek a plísní

19 a w > 0,95 DRBC (dichloran, bengálská červeň, chloramfenikol) Přítomnost bengálské červeně a dichloranu umožňuje lepší izolaci narostlých kolonií, protože omezuje růst mikromycetů a zabraňuje vzájemnému prorůstání kolonií na Petriho miskách. Výhodou (někdy i nevýhodou) tohoto izolačního média je nižší zastoupení mukorovitých hub a částečná inhibice jejich růstu. Světlosenzitivní médium -roztěr na povrch -aerobní kultivace při 25 C po dobu 5 dní -počet kvasinek a plísní se přepočítá na gram nebo mililitr vzorku

20 DG18 (Dichloran, glycerol) a w < 0,95 DG18 Izolační: aw< 0,9 DG18, MY50G Eurotium sp. aw> 0,9 DRBC, GKCH, YGC, OGYE aj. Normativní média GKCH GKCH -roztěr na povrch -aerobní kultivace při 25 C po dobu 5 dní -počet kvasinek a plísní se přepočítá na gram nebo mililitr vzorku

21 1.Desítkové ředění Způsob izolace mikromycetů 10 g (ml) do 90 ml ředícího roztoku

22 IZOLACE DBM - příklady Cladosporium sp. + kvasinky Zygosaccharomyces baillii

23 2. Přímá izolace Povrchová sterilace (ethanol, sterilní voda) Izolace jednotlivých kolonií patogena (např.čárkováním) nebo přímá kultivace kousku substrátu Chalara sp. Penicillium expansum

24 IZOLACE DBM příklady Eurotium sp. Wallemia sebi Penicillium sp.

25 3. Technika rozsypu Krmivo pro zvířata kmín technika rozsypu přímá aplikace kontaminovaného substrátu na povrch živného média. čaj

26 sezam A. ochraceus IZOLACE DBM - příklady oves Eurotium Alternaria Penicillium A. niger Penicillium Semena a zrna bez oplachu povrchová mykoflóra (epifyté) Aspergillus candidus Alternaria Rýže Basmati

27 Úskalí techniky rozsypu Vše přerostlé zygomycety (většinou Rhizopus a Mucor) Semena někdy vyklíčí V tomto případě je nutné zvolit další techniku a to OPLACH

28 4. Technika oplachu Naředit, vyočkovat z každého ředění více misek, inokulovat pevné médium Kvalitativní rozbor, nezjišťujeme počty, pouze druhové zastoupení Alternaria sp. Eurotium sp. DRBC DG18 Fusarium sp.

29 5. Filtrace tekutých vzorků (hlavně vody) Této metody se používá pro rozbor pitné vody, nápojů atd., nemůže být použita pro rozbory suspenzí (ucpání pórů membrány)

30 IZOLACE DBM Pichia membranifaciens DSk 36 Cladosporium sp. Zygosaccharomyces bailii DSk 8

31 Izolace termorezistentních a termotolerantních hub Kultivace po předchozím opracování výtřepku při vhodné teplotě Např. 30 min při 80 C (Pitt a Hockingová) Nebo spařit vodou a nechat chladnout (vhodné pro bylinné čaje)

32 Termostabilní houby: Byssochlamys nivea Byssochlamys fulva Paecillomyces variotii (tel. Byssochlamys spectabilis) Neosartorya fischeri Talaromyces macrosporus Eupenicillium sp.

33 Identifikace mikroskopických vláknitých hub Pomocí makro- a mikroskopických znaků kultury Identifikační média: Rod Aspergillus: CZ,CYA, MEA Rod Penicillium: CZ,CYA,MEA Rod Fusarium: PDA,PSA Rod Trichoderma: ovesný a kukuřičný agar Demáciové houby: PCA Zygomycety: MEA Důležitá je volba vhodného média, doba kultivace a technika odběru Např. u rodu Trichoderma je potřeba sledovat charakter větvení na mladých konidioforech Morfologii konidií pozorujeme až když jsou zcela zralé.

34 Příprava preparátu Rod Fusarium indukce sporulace pomocí sterilního filtračního papíru Pomocí sterilní očkovací jehly odebereme několik konidioforů z okraje kolonie Sterilní jehlou odebereme část mycelia z rozhraní bílé a zelené části. Preparát z vysporulovaných zelených zón by obsahoval rušivě velké množství spór. Rod Penicillium

35 Sellotape preparation Sellotape preparation Z kurzu CBS Acremonium mucorum otisk izolepou

36 Sklíčkové kultury kultura rostoucí pod sklíčkem 1. 2.

37 Víčko Petriho misky po kultivaci Candida tropicalis růst pod sklíčkem Bohatá sporulace, snadné prohlížení, lepší manipulace oproti prohlížení celé misky Způsob větvení, typ konidiogeneze (rozpad hyf na jednotlivé články, tvorba blastospor)

38 Proměřování objektů 18. Objektivové měřítko Kalibrace okulárového mikrometru 10. Počátky měřítek se musí shodovat, hledáme další dílky, které splývají. Objektivové měříko: každý dílek má 0,01mm (10µm) Okulárové měřítko: musíme zjistit kalibrací X = (10 10) / 18 X = 5,5 µm

39 Identifikační literatura např. Samson, Hoekstra, Frisvad: Introduction to Food- and Airborne fungi Konidie: 2,8 µm Měchýřek: µm Fialidy: 10 x 2 µm

40 Identifikace kvasinek Kvasinky: SA,MEA, Sabouraudův agar atd. Většina kvasinek vytváří bílé nebo smetanové kolonie. Mikromorfologie je také velmi podobná, většina kvasinkových buněk je oválných nebo kulatých. NUTNÉ je použití biochemických testů. Asimilace dalších látek, např KNO 3 Asimilace sacharidů Kvasné testy

41 Kurtzman, Fell, Boekhout: The Yeasts, a Taxonomic Study Zkvašování sacharidů: glu+, gal+, sach+, mal - Růst při 37 C: - Asimilace nitrátů: -

42 Další metody identifikace mikroskopických hub Molekulární metody (PCR) Biochemické metody (např. BIOLOG) Analýza mastných kyselin (MIDI) Analýza proteinů (MALDI) aj. PCR

43 Důsledky napadení potravinářských surovin mikromycety: -ztráty na výnosech Omezení asimilační plochy -senzorické znehodnocení surovin i výsledných potravin -Nejvýznamnějším rizikovým faktorem je produkce mykotoxinů Hlavní mykotoxiny v zájmu světové legislativy (pořadí podle důležitosti) 1.Aflatoxiny B a G 2.Aflatoxin M1 3.Patulin 4.Ochratoxin A 5.Deoxynivalenol (DON) 6.Zearalenon 7.Fumonisiny 8.T-2 toxin

44 Mykotoxiny (nejzávažnější kontaminanty přírodního původu) Mykotoxiny = sekundární metabolity mikroskopických hub, toxické pro obratlovce a jiné živočichy (Frisvad et Thane 1996). Primární metabolity: základní látky nezbytné pro živý organismus Sekundární metabolity: uplatňují se v ekologických vztazích s jinými organismy působí jako chemické signály v komunikaci mezi druhy Bylo identifikováno více než 400 mykotoxinů (ještě na konci 90 let minulého st. se uvádělo 300) - Ne všechny kmeny téhož druhu jsou schopny produkce určitých mykotoxinů. Dokonce i u jednoho a téhož kmene dochází ke změnám v produkci mykotoxinů (rozhoduje složení substrátu, teplota, vlhkost a obsah kyslíku) - Záchyt toxinogenních mikromycetů např. v potravinách ještě neznamená přítomnost mykotoxinů. Ke kontaminaci surovin, potravin a krmiv dochází dvěma způsoby: Primární kontaminací (k výrobě potravin byly použity suroviny již kontaminované mykotoxiny např. kontaminace plodin na poli) Sekundární kontaminace (růst toxinogenních vláknitých hub na nevhodně skladované surovině, původně nekontaminované, a následné produkci mykotoxinů)

45 Rozdělení mykotoxinů podle účinků: Cytotoxické mykotoxiny Toxiny s imunosupresivními účinky Teratogenní toxiny Mutagenní toxiny Karcinogenní toxiny Rozdělení mykotoxinů podle působení na orgány: Hepatotoxiny Nefrotoxiny Neurotoxiny Dermatotoxiny Kardiotoxiny Gastrointestinální toxiny Hemolytické toxiny Toxiny s estrogenními a anabolickými účinky Klasifikace kancerogenity mykotoxinů Sk.1 karcinogenní pro člověka, prokázaný karcinogen (aflatoxin B1,B2, G1, G2) Sk.2A pravděpodobně karcinogenní pro člověka Sk.2B možný karcinogen pro člověka (např. ochratoxin A, sterigmatocystin) Sk.3 není dost podkladů k posouzení karcinogenního účinku (např. patulin) Sk.4 pravděpodobně nekarcinogenní pro člověka Hlavní mykotoxiny v zájmu světové legislativy (pořadí podle důležitosti) Aflatoxiny B a G Aflatoxin M1 = hydroxyaflatoxin B1 Patulin Ochratoxin A Deoxynivalenol (DON) Zearalenon Fumonisiny T-2 toxin Účinky mykotoxinů 1. Akutní (projevují se ve velmi krátkých časových intervalech vyšších dávek toxinu) 2. Pozdní (např. mutagenní, karcinogenní, imunosupresivní aj. vyskytují se za delší dobu po expozici, jsou tedy zákeřnější a nebezpečnější) - nízkodávková expozice v dlouhém časovém období

46 Starověk, středověk 20. st. (obilí s námelem) - Gangrény, křeče, halucinace 60.léta 20 st. Anglie (plesnivá moučka z burských oříšků) hromadný úhyn krůťat v Anglii léta 20 st. (kontaminované krmivo) porucha renálních funkcí 19.,20. st. Rusko (seno kontaminované Stachybotrys) nekrózy ústní dutiny, jícnu, žaludku - u koní Beri -beri 2.sv.válka, Japonsko (plesnivá rýže) ochrnutí končetin, křeče 19. st., 2.sv. válka, Rusko - (konzumace plesnivého obilí) otok krku, poškození krvetvorného systému

47 Mykotoxikózy v poměrně nedávné minulosti: Duben 2004 Keňa: 317 případů akutních a subakutních otrav s následkem 125 úmrtí po konzumaci aflatoxiny kontaminované kukuřice Malajsie: během pořádání slavnosti zasvěcené bohům devíti císařů zemřelo 13 dětí z celkem 45 osob, které požili nudle kontaminované aflatoxiny. Akutní toxické účinky aflatoxinů jsou v současnost pozorovatelné pouze ve výjimečných případech. Přesto k nim dochází.

48 Platnou legislativou EU jsou nyní mykotoxiny limitovány v souladu s: Regulace mykotoxinů v EU -Nařízením Komise č. 1881/2006 ES. Limitovány jsou konkrétně: aflatoxiny B1, suma B1, B2, G1, G2, aflatoxin M1, ochratoxin A, DON, zearalenon, fumonisiny B1 a B2. Pro T-2 a HT-2 toxin zatím limity nejsou stanoveny -Nařízením Komise č. 1126/2007 se stanovují maximální hodnoty obsahu toxinů rodu Fusarium tj. fumonisiny, DON, zearalenon. -Nařízením Komise č. 105/2010 se stanovují maximální limity pro ochratoxin A (změna 1881/2006) + 594/2012 -Nařízením Komise č. 165/2010 EU, kterým se mění nařízení (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity aflatoxinů Dále řada nařízení týkající se vzorkování a analýzy či stanovení zvláštních podmínek dovozu některých potravin z některých třetích zemí v důsledku rizika kontaminace aflatoxiny.

49

50 Dovoz potravin z třetích zemí Vstupní místo do EU Letiště Václava Havla (Ruzyně) Celní úřad Rudná u Prahy (určené místo dovozu)

51 1. Potraviny, které lze dovážet jen přes schválená místa vstupu/dovozu zvláštní režim dovozu Nařízení komise (ES) č. 1152/2009 stanovuje komodity, pro které jsou stanoveny zvláštní podmínky při dovozu. Jedná se o para ořechy z Brazílie, arašídy z Číny a Egypta, pistácie z Iránu a Turecka, fíky a lískové ořechy z Turecka a mandle z USA (vše riziko kontaminace aflatoxiny). Zásilky přichází (po přistání na Letišti Praha Ruzyně a kontrole dokladů) pouze přes jedno místo dovozu, kterým je Celní úřad Praha D5 Rudná. Každá komodita musí být vybavena výsledky odběru vzorků s osvědčením o zdravotní nezávadnosti. V určeném místě dovozu (CU Praha 5 Rudná) je pak u stanoveného procenta zásilek, dle nařízení Komise (ES) č. 1152/2009, provedena fyzická kontrola včetně odběru vzorků a analýzy aflatoxinů Vše přes jediný celní úřad Praha D5 Rudná

52 Nařízení Komise (ES) č. 1152/2009

53 2. Potraviny, které lze dovážet jen přes schválená místa vstupu/dovozu zesílená úřední kontrola Nařízení (ES) č. 669/2009 stanovuje komodity podléhající tzv. zesílené úřední kontrole. Zásilky opět mohou do Společenství vstupovat pouze přes určená místa vstupu (v ČR Letiště Praha Ruzyně), nejsou ale stanoveny žádné další dokumenty, které musí zásilku doprovázet. V nařízení 669/2009 je určena četnost kontrol pro jednotlivé komodity.

54

55 3. Potraviny s kontrolou jakostních parametrů Kontrola jakostních parametrů se provádí u řady plodin, mykotoxinů se týká pouze dovoz arašídů z USA. Na základě rozhodntí Komise 2008/47/ES, musí být každá zásilka arašídů vybavená výsledky odběru vzorků a analýzy provedené laboratoří ministerstva zemědělství USA a příslušným osvědčením, které je platné 4 měsíce. Arašídy z USA lze dovést přes kterýkoliv celní úřad na území České republiky.

56 4. Dovoz potravin uvedených v červeném seznamu Dle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 882/2004 mají členské země možnost stanovit si další vlastní rizikové komodity ze třetích zemí. Česká republika má v červeném seznamu (kromě komodit u kterých se sledují rezidua pesticidů a dalších nepovolených látek) para ořechy původem z Bolívie (nebezpečí kontaminace aflatoxiny). Zásilka zboží uvedeného v červeném seznamu může vstupovat do ČR přes kterýkoliv celní úřad, nemusí být vybavena žádným zvláštním dokladem. SZPI vyhodnotí každou komoditu a rozhodne o případné analýze přítomnosti aflatoxinů.

57 RASFF Rapid Alarm System for Food and Feed (RASFF) systém rychlého varování pro potraviny a krmiva Systém RASFF slouží pro ohlašování rizikových potravin a krmiv za účelem zamezení jejich uvádění do oběhu nebo za účelem jejich stažení ze společného evropského trhu let existence RASFF

58 Země, která problém ohlásila Země původu výrobku

59 Hlavní mykotoxiny v zájmu světové legislativy (pořadí podle důležitosti) 1.Aflatoxiny B a G 2.Aflatoxin M1 = hydroxyaflatoxin B 1 3.Patulin 4.Ochratoxin A 5.Deoxynivalenol (DON) 6.Zearalenon 7.Fumonisiny 8.T-2 toxin

60 Aflatoxiny a jejich producenti Nařízením Komise č. 1881/2006 ES. Limitovány jsou konkrétně: aflatoxiny B1, suma B1, B2, G1, G2, aflatoxin M1, ochratoxin A, DON, zearalenon, fumonisiny B1 a B2. Pro T-2 a HT-2 toxin zatím limity nejsou stanoveny Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Aspergillus nomius A některé další aspergily sekce Flavi Nařízením Komise č. 165/2010 EU, kterým se mění nařízení (ES) č. 1881/2006, kterým se stanoví maximální limity aflatoxinů

61 Rod Aspergillus Aspergillus sekce Flavi Heslo: mikrodem Informace obsažené v základní mykologické přednášce Mikroskopické vláknité houby (systematické členění)

62 Aflatoxiny -Polycyklické, nesaturované, vysoce substituované kumariny -Dosud bylo identifikováno přibližně 20 aflatoxinů, nejčastěji se přirozeně vyskytuji aflatoxin B1 (AFB 1 ), AFB 2, AFG 1 a AFG 2 -Nejvíce kancerogenní je AFB1 -Bezprahové působení (neexistuje bezpečná hladina expozice) -Karcinogenní účinky (s latencí let) -Genotoxické, mutagenní a teratogenní působení -Primární cílový orgán po dietární expozici AFB 1 jsou játra -První klinické příznaky: anorexie, pocit neklidu, úbytek hmotnosti letální akutní hepatitida se zvracením, bolestmi břicha až smrtí -Chronické působení: hepatocelulární karcinom Toxikokinetika AFB 1 -absorpce do krve do žluče AFB 1 je metabolizován mikrozomálními cytochrom P-450 dependentními oxidázami na aktivní metabolit AFB1 8,9- epoxid -AFB 1 a jeho metabolity se váží na DNA (tvorba reaktivních DNA aduktů)

63 Toxický účinek ovlivní kromě dávky a délky expozice i věk, individuální zdravotní stav a synergické spolupůsobení dalších chemických látek (toxinů) v potravinách Za určitých podmínek aspergily sekce Flavi rostou a tvoří mykotoxiny téměř na každém organickém substrátu. Důležitá je teplota (pro produkci toxinů ideálně okolo C) a vlhkost nad 70% V našich oblastech je nižší výskyt aspergilů (jsou to teplomilné houby) i nižší výskyt sekundárních metabolitů Důležitou vlastností je značná termostabilita Ke kontaminaci plodin dochází buď na poli nebo při skladování. Zdroj inokula (aspergily sekce Flavi) je v půdě, ale i jako endofyt v kořenech, v listech, v květech.

64 ENDOFYTY Informace obsažené v základní mykologické přednášce Mikroskopické vláknité houby (systematické členění) Povrchová sterilace: Ethanol Savo Ethanol Voda sterilní

65 Aspergily sekce Flavi a Nigri jako endofytní houby

66 Nejčastější komodity, kontaminované aflatoxiny: Kukuřice Pistácie Arašídy Paraořechy Mandle Fíky některé další druhy ořechů a semen Koření Rýže

67 Nálezy vyšších hladin aflatoxinů v potravinách Informace obsažené v základní mykologické přednášce Mikroskopické vláknité houby (systematické členění)

68 Rok 2015 leden - březen Sušené fíky mandle Ovocná tyčinka sezam Rýže basmati Burské oříšky Rýže basmati

69 Rýže basmati Burské oříšky Pistácie Burské oříšky Pistácie Burské oříšky Bílé fazole

70 Lískové ořechy Burské oříšky Burské oříšky Leden březen 2015 převažují nálezy u burských ořechů

71 Pistácie, arašídy, arašídové máslo

72 Aflatoxiny 20 výrobků (arašídy): v 17 žádné aflatoxiny ve 3 aflatoxiny přítomné, ale pod limitem

73

74

75 Ostatní ořechy paraořechy 4. Dovoz potravin uvedených v červeném seznamu Dle nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 882/2004 mají členské země možnost stanovit si další vlastní rizikové komodity ze třetích zemí. Česká republika má v červeném seznamu (kromě komodit u kterých se sledují rezidua pesticidů a dalších nepovolených látek) para ořechy původem z Bolívie (nebezpečí kontaminace aflatoxiny). Zásilka zboží uvedeného v červeném seznamu může vstupovat do ČR přes kterýkoliv celní úřad, nemusí být vybavena žádným zvláštním dokladem. SZPI vyhodnotí každou komoditu a rozhodne o případné analýze přítomnosti aflatoxinů.

76 Lískové ořechy Gruzie

77

78 rýže

79 Problémy s rýží basmati Úřad pro potraviny a veterinární záležitosti Evropské komise (FVO) -Kontroluje se každá zásilka do EU -Detekce aflatoxinů zařazana do kontrolních systémů každého závodu Přesto je problém splnit nařízení (ES) č.1881/2006

80 Aflatoxin M1 Mléčné výrobky Limit 0,05µg /kg mléka Přeměna B1 (v krmivu) na M1 (v trávicím ústrojí skotu)

81 Aflatoxin M1

82 KRMIVA Aflatoxiny nejsou v našich zemích problémem č.1, jejich množství je buď pod úrovní detekce nebo na její nejnižší úrovni. Problém v krmivech: fusariové mykotoxiny

83 Lískový ořech Izolace a identifikace v DBM MEA AFPA rub Aspergillus sekce Flavi

84 Únor 2015 Izolace a identifikace v DBM Aspergillus sekce Flavi AFPA líc AFPA rub

85 Izolace a identifikace v DBM Izolace ve studentských laboratořích Aspergillus sekce Flavi, bakterie, kvasinky

86 Ochratoxin A a jeho producenti Nařízením Komise č. 1881/2006 ES. Limitovány jsou konkrétně: aflatoxiny B1, suma B1, B2, G1, G2, aflatoxin M1, ochratoxin A, DON, zearalenon, fumonisiny B1 a B2. Pro T-2 a HT-2 toxin zatím limity nejsou stanoveny Nařízením Komise č. 105/2010 se stanovují maximální limity pro ochratoxin A (změna 1881/2006) V teplejších oblastech Aspergillus ochraceus aspergily sekce Nigri (v některých komoditách V chladnějších oblastech Penicillium verrucosum Penicillium nordicum

87 Ochratoxiny : A, B, C, D, α Nejvýznamnější je ochratoxin A (OTA) derivát 7- izokumarinu - Nefrotoxický mykotoxin (cílovým orgánem jsou ledviny a vylučovací systém) - IARC FAO/WHO klasifikuje OTA jako možný kancerogen pro člověka (kategorie 2B) - Dle IARC/WHO je tolerovatelný týdenní přívod 100 ng/kg t.hm/týden

88 Aspergillus ochraceus, aspergily sekce Nigri potenciální producenti ochratoxinu A Produkce OTA nejvíce při 28 C (ale i v rozsahu C) Informace obsažené v základní mykologické přednášce Mikroskopické vláknité houby (systematické členění)

89 Aspergillus sekce Nigri Významní kontaminanti vinné révy, kávovníku, čaje, koření ochratoxin A

90 V chladnějších oblastech je P. verrucosum hlavní producent ochratoxinu A (častější výskyt) Produkce OTA při 4 30 C Nadlimitní množství ochratoxinu A je nejčastěji detekováno v obilí (včetně cereálních výrobků) a v koření; ale i v rozinkách, kávě, čaji apod.

91 Nálezy ochratoxinu v dalších komoditách Sběrné centrum RASF

92

93 2015 leden - březen

94 Ochratoxin A Limit: 10µg/kg

95

96 Patulin a jeho producenti Klasifikace kancerogenity: 3 Penicillium expansum Byssochlamys nivea Paecilomyces variotii Limit: 50µg/kg ovocné džusy s jablečným podílem 25 µg/kg produkty s pevným jablečným podílem 10 µg/kg dětská výživa

97 Informace obsažené v základní mykologické přednášce Mikroskopické vláknité houby (systematické členění)

98 Informace obsažené v základní mykologické přednášce Mikroskopické vláknité houby (systematické členění) Paecilomyces variotii

99 Deoxynivalenol, zearalenon, fumonisiny, T-2 toxin a jejich producenti Fusariové mykotoxiny Houby rodu Fusarium Nařízením Komise č. 1881/2006 ES. Limitovány jsou konkrétně: aflatoxiny B1, suma B1, B2, G1, G2, aflatoxin M1, ochratoxin A, DON, zearalenon, fumonisiny B1 a B2. Pro T-2 a HT-2 toxin zatím limity nejsou stanoveny Nařízením Komise č. 1126/2007 se stanovují maximální hodnoty obsahu toxinů rodu Fusarium tj. fumonisiny, DON, zearalenon. DON

100 Informace obsažené v základní mykologické přednášce Mikroskopické vláknité houby (systematické členění)

101 Kvetení obilovin 1 plevy 2 pluchy 3 osiny 4 plušky 6 - tyčinky Teplota okolo 20 C a vysoká vzdušná vlhkost ideální podmínky pro infekci klasů

102 Informace obsažené v základní mykologické přednášce Mikroskopické vláknité houby (systematické členění)

103 Fumonisiny nachází se především v kukuřici, rýži a prosu. Značná termostabilita. Lze je odstranit z povrchu kukuřice omytím, zejména v alkalických roztocích. Klasifikace kancerogenity: 2B - fumonisiny 3 - zearalenon, DON Trichotheceny (např. deoxynivalenol, nivalenol, T-2 toxin, HT-2 toxin) Producenti: F.graminearum, F.sporotrichioides, F. culmorum, Fusarium poae Jedná se o hepatotoxické a nefrotoxické toxiny. Producenti: F. verticillioides (syn. F. moniliforme) Mohou se uplatňovat jako promotory kancerogenního procesu Trichotheceny jsou velmi odolné vůči inaktivaci, proces zpracování obilí je neúčinný. Nejčastěji je jejich přítomnost sledována u cereálií, zvláště u pšenice a kukuřice (T-2 a HT-2 v ječmeni a ovsu, producent F. sporotrichioides) Zearalenon Nejvýznamnější producenti: F. graminearum a F.sporotrichioides, F.culmorum, F. roseum, F. moniliforme Hepatotoxické, hematotoxické, imunotoxické a genotoxické účinky, ale není významně akutně toxický.

104 Deoxynivalenol trichotheceny

105 Deoxynivalenol

106 Informace obsažené v základní mykologické přednášce Mikroskopické vláknité houby (systematické členění)

107 + mykotoxiny

108 trichotheceny

109 Fumonisiny Velmi často v kukuřici

110

111 V poslední době se intenzivně zkoumají také tzv. maskované formy některých trichothecenů, fumonisinů a zearalenonu (konjugáty se sacharidy), jenž jsou výsledkem detoxikačního procesu metabolismu rostlin. Konjugované (maskované) formy mykotoxinů vznikají působením enzymových systémů rostlin, při zpracování potravin či v tělech savců. -jen pro některé jsou komerčně dostupné analytické standardy, často nízká stabilita a nejasný osud v organismu savců Nebezpečí maskovaných mykotoxinů spočívá v jejich hydrolýze při průchodu trávicím traktem savců, při kterém může dojít k uvolnění původního, více toxického metabolitu. K rozkladu konjugovaných mykotoxinů dochází pravděpodobně také za vhodných podmínek při technologickém zpracování obilného zrna Konjugované formy mykotoxinů nejsou zatím v potravinách a krmivech rutinní chemickou analýzou sledovány.

112 Alternariol, kyselina tenuazonová a jejich producenti Alternariové mykotoxiny Houby rodu Alternaria alternariol -Členské země vyzývány k intenzivnímu monitorování těchto mykotoxinů v potravinách -Zpracovávají se informace o jejich toxicitě a výskytu

113 Alternariol, kyselina tenuazonová a jejich producenti Informace obsažené v základní mykologické přednášce Mikroskopické vláknité houby (systematické členění)

114 Rajčata častý zdroj alternariových mykotoxinů Informace obsažené v základní mykologické přednášce Mikroskopické vláknité houby (systematické členění)

115

116 Citrinin Producenti: Další významné mykotoxiny a jejich producenti P.citrinum, P.verrucosum, P. lividum, P.westtlingii, Aspergillus terreus, A.niveus, A.carneus Výskyt: cereálie, červená rýže Biologická aktivita: silný nefrotoxin Penicillium citrinum Sterigmatocystin Hlavní producenti: Aspergillus versicolor, A.nidulans Zdroj: rýže, ječmen, pšenice, sýry Biologická aktivita: poškození jater a ledvin Přes svoji výraznou kancerogenitu (2B) není výrazným nebezpečím pro lidské zdraví. Jeho kancerogenní aktivita se rovná 1/10 kancerogenity aflatoxinu B1 Aspergillus versicolor Výskyt na potravinách, v prostředí budov, v půdě.

117 Stachybotryotoxiny - Stachybotrys chartarum Stachybotryotoxikóza: postihuje především domácí zvířata konzumující kontaminované seno nebo slámu. Snižuje se srážlivost krve a nastává septikémie. Současně trávicí potíže, ztížené polykání, ztráta hmotnosti. Lidská stachybotryotoxikóza byla popsána u zemědělců pracujících s kontaminovaným senem (dermatitida, faryngitida, konjunktivitida) Phomopsin A Producent: Phomopsis leptostromiformis (tel. Diaporthe woodii), fytopatogenní coelomycet vytvářející černé pyknidy na stoncích lupinu

118 Informace obsažené v základní mykologické přednášce Mikroskopické vláknité houby (systematické členění) Claviceps purpurea (Paličkovice nachová) Námel obsahuje toxické látky námelové alkaloidy Otrava po požití námele mykotoxikóza ergotismus

119 - Nejčastěji na žitě rostoucím na vlhčí a zastíněné půdě. - Jeho výskyt je podporován mrazivými zimami. - chladné a deštivé počasí v době květu ideální pro Claviceps. - Nejnáchylnější jsou hybridní odrůdy žita Příměsi jako např. námel zůstávají na dně a zrno je vyneseno

120 Shrnutí nejdůležitějších poznatků -Nařízení Komise (ES) č.1441/2007 neukládá sledování množství kvasinek a plísní v potravinách (na rozdíl od dříve platných vyhlášek) -plesnivé potraviny jsou posuzovány pracovníky dozorových organizací jako jiné než zdravotně nezávadné (zákon 110/1997, ES 178/2002) -houby napadající potraviny můžeme rozdělit na nekrotrofní parazity a saprotrotrofy. Ke kolonizaci dochází buď na poli nebo při uskladnění potravin a surovin -Stanovení počtu kvasinek a plísní v potravinách se provádí podle 2 norem v závislosti na vodní aktivitě substrátu (různá izolační média) -mikroskopické vláknité houby lze nejčastěji identifikovat podle makro- a mikroskopických znaků na doporučených identifikačních médiích nebo pomocí molekulárních metod. -kvasinky se idenfifikují pomocí morfologických, fyziologických a biochemických testů, molekulárními metodami, hmotnostní spektrofotometrií aj. -Mykotoxiny: sekundární metabolity mikroskopických hub -Nejvýznamnější toxinogenní rody: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Byssochlamys, Paecilomyces, Alternaria -Nejsledovanější mykotoxiny: aflatoxiny, patulin, ochratoxin A, trichotheceny (deoxynivalenol, T-2 toxin), zearalenon, fumonisiny

121 - Nejsilnější přírodní kancerogen aflatoxin B 1 - Významnou vlastností mykotoxinů je většinou značná termorezistence - Ke kontaminaci surovin může dojít na poli (primární kontaminace) nebo při uskladnění (sekundární kontaminace). Z plesnivých surovin se mykotoxiny dostávají až do finálních výrobků. - Účinky mykotoxinů můžeme rozdělit na akutní a pozdní (např. kancerogenní) - Ne každý potenciálně toxinogenní kmen skutečně produkuje mykotoxiny - Záchyt toxinogenních hub v potravině neznamená nutně přítomnost mykotoxinů - Hladiny mykotoxinů v potravinách a krmivech jsou regulovány (v rámci EU pomocí Nařízení Komise ES stanovení maximálních hodnot) - Producenti aflatoxinů: aspergily sekce Flavi (A.flavus, A.parasiticus aj.) - Nejvýznamnější producenti patulinu: Penicillium expansum, Byssochlamys (an. Paecilomyces) - Nejvýznamnější producenti ochratoxinu A: Aspergillus ochraceus, Penicillium verrucosum - Producenti trichothecenů, zearalenonu a fumonisinů: řada druhů rodu Fusarium