Sborník přednášek. Květen 2012

Transkript

1 Sborník přednášek 1 Květen 2012

2 2

3 BEST servis Ústí nad Labem Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v. v. i., Praha Biofyzikální ústav AV ČR, v. v. i., Brno Sborník přednášek mezinárodní odborné konference XXXII. Moderní Elektrochemické Metody Jetřichovice května 2012 Uspořádali: Navrátil Tomáš, Fojta Miroslav ISBN (Brož.) 1

4 Tato publikace je určena pro účastníky konference a členy pořádajících organizací. Za obsah veškerých textů nesou plnou zodpovědnost autoři. Publikace neprošla odbornou ani jazykovou úpravou. Zveřejněné informace mohou být dále použity za předpokladu úplného citování původního zdroje. Přetiskování, kopírování či převádění této publikace do jakékoliv tištěné či elektronické formy a její prodej je možný pouze na základě písemného souhlasu vydavatele. (Bona fide vědečtí pracovníci si mohou pořídit jednotlivé kopie pro vlastní potřebu). ISBN (Brož.) 2

5 BEST servis Ústí nad Labem J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Prague Institute of Biophysics of the AS CR, v.v.i., Brno Collection of Conference Proceedings International Conference Modern Electrochemical Methods XXXII Jetřichovice, Czech Republic May 21 st - May 25 th, 2012 Editors: Navrátil Tomáš, Fojta Miroslav ISBN

6 4

7 Obsah A. M. Ashafi, J. Đorđević, V. Guzsvány, T. Trtić-Petrović, K. Vytřas Determination of Carbendazim Fungicide by Differential Pulse Stripping Adsorptive Voltammetry at a Tricresyl Phosphate-Modified Carbon Paste Electrode in Presence of 2-Hydroxypropyl Beta Cyclodextrin M. Bartoš, I. Žertová Determination of Formaldehyde Using Capillary Isotachophoresis A. Danhel, H. Pivonkova, V. Raindlova, M. Hocek, M. Fojta Nitro-Hydrazine Derivatives Electrochemically Reducible DNA Labels H. Dejmkova, L. Houskova, J. Barek, J. Zima Electrochemical Determination of Chlortoluron on Carbon Paste Electrode D. Deýlová, J. Barek Voltammetric Determination of 5-Nitrobenzimidazole at a Carbon Film Electrode Deposited on a Silver Solid Amalgam Electrode J. Fischer, G. Tsimogianni, V. Vyskočil, A. Economou, J. Barek Voltammetric Determination of 3-Nitrobiphenyl on Meniscus Modified Silver Solid Amalgam Electrode M. Fojta, L. Havran, H. Pivoňková, P. Vidláková, P. Orság, M. Plucnara, P. Horáková, V. Raindlová, J. Balintová, M. Hocek Next Generation of Electrochemically Active Labels for DNA Analysis. How to Utilize Electrochemical Conversions for the Improvement of Signal Resolution M. Gál, R. Sokolová, F. Kielar Electrochemistry of Potential Eu MRI Complexes L. Havran, V. Tichý, J. Špaček, H. Macíčková-Cahová, P. Horáková, H. Pivoňková, M. Fojta, M. Hocek Electrochemical Analysis of Terminal Deoxynucleotidyl Tranferase Reaction Products J. Hrbáč, L. Trnková The Implementation of Elimination Voltammetric Procedure into Electrochemical Analyzers M. Jakl, R. Norková, T. Navrátil, J. Jaklová Dytrtová, J. Balík Investigation of Complexes of Tebuconazole with Zinc J. Jaklová Dytrtová, M. Jakl, R. Norková, T. Navrátil Optimization of a Flow Rate for a Hyphenation of Voltammetry with Electrospray Ionization Mass Spectrometry A. Liška, J. Ludvík Electrochemistry of Polynitrocalix-[4]-arenes K. Lušpai, P. Rapta, V. Brezová, A. Staško Redox Behavior of New Quinolone Derivatives Studied by in situ ESR-UV-VIS Spectroelectrochemistry J. Matějčková, M. Jaček, J. Málek, E. Samcová Determination of Midazolam by HPLC with UV Detection and by GC with Nitrogen- Phosphorus Detector in Rabbit Plasma Str

8 R. Metelka, P. Vlasáková Screen-Printed Carbon Electrodes with Porous Copper Film T. Mikysek, M. Stočes, I. Švancara, K. Vytřas, J. Ludvík New Characterisation Approaches for Carbon Ionic Liquid Electrodes (CILES) T. Navrátil, I. Švancara, K. Mrázová, K. Nováková, J. Chýlková, D. Pelclová Assessment of Potential Risk Connected with the Use of Mercury and Mercury Electrodes K. Nováková, T. Navrátil, J. Jaklová Dytrtová, J. Chýlková Use of Copper Solid Amalgam Electrode for Determination of Triazolic Fungicide Tebuconazole L. Novotný, L. Dušek, B. Vystrčilová, R. Petráňková Possible Application and Monitoring of Electrochemical Treatment of Waters Using Special Electrodes and Techniques V. Novotný Direct Voltammetric Determination of Aclonifen in Natural Waters at a Silver Solid Amalgam Electrode P. Orság, M. Fojta, L. Havran, Z. Vychodilová, M. Plucnara, T. Komárek, J. Riedl, M. Hocek, H. Pivoňková Chemically Modified DNA for DNA-Protein Interaction Studies: Electroactive and Luminescent Labeling Versus Specific Molecular Recognition M. Parisová, T. Navrátil, I. Šestáková, V. Mareček Transport of Copper Ions in the Presence and Absence of Ionophore Calcimycin and the Influence of LMWOAs on this Transport V. Pavlíček, K. Málková, E. Samcová, P. Tůma Fast Determination of Uric Acid in Human Serum and Urine by Capillary Electrophoresis I. Pilařová, L. Trnková Diffusion Characteristics of Chlorine and Methoxy Derivatives of 6 benzylaminopurine Studied by Voltammetric Methods H. Pivoňková, K. Němcová, P. Šebest, L. Havran, P. Orság, M. Fojta Oligonucleotide Probes End-Labeled with Oxoosmium Complexes for Electrochemical Analysis of Sequence and Structure-Specific Interactions of p53 Protein with DNA B. Silver, K. Holub, V. Marecek Ion Current Rectification Behavior at Novel Borosilicate Glass Capillaries M. Stočes, I. Švancara Carbon Paste Electrode Modified with Bismuth Trifluoride and its Applicability in Electrochemical Stripping Analysis for Determination Heavy Metals L. Šimková, E. Dmitrieva., J. Klíma, L. Dunsch, J. Ludvík FOX-7 Study of Reduction Products by Spectroelectrochemical Methods I. Švancara, K. Kalcher, A. Walcarius, K. Vytřas Electroanalysis in a Monothematic Book. Recent Experiences from Making of a Monograph

9 Ľ. Švorc, J. Svítková, P. Tomčík, M. Rievaj, D. Bustin Voltammetric Determination of Caffeine in Commercial Beverages on Bare Boron- Doped Diamond Electrode P. Tůma, F. Opekar, E. Samcová The Use of a Multi-Channel Capillary and a Capillary with Two Different Inner Diameters for Electrophoretic Separation of Neurotransmitters P. Vidláková, J. Balintová, R. Pohl, L. Havran, M. Hocek, M. Fojta Voltammetric Analysis of Anthraquinone- and Nitrophenyl-Labeled Nucleotide Triphosphates and Oligonucleotides B. Vochyánová, F. Opekar, P. Tůma, K. Štulík Rapid Determination of Saccharides in High Energy Drinks by Electrophoresis in a Short Capillary B. Yosypchuk, V. Mareček, O. Yosypchuk (Strept)avidin Biotin Interactions at Amalgam Electrodes Covered by Thiol Monolayer J. Zavázalová, H. Dejmková, J. Barek, K. Pecková Voltammetric Determination of Amino Derivatives of Naphthalenes Using Boron- Doped Diamond Film Electrode

10 8

11 Stejně jako v minulých více než třech desetiletích i letos se scházíme, abychom podiskutovali, vzájemně se poinformovali o nejnovějších výdobytcích spojených s moderními elektrochemickými metodami. Až na několik málo výjimek se tato setkání konala v jarních měsících a v posledních letech se ustálil termín jejich uspořádání v posledních květnových týdnech. Můžeme si proto jen se zpožděním připomenout 90. výročí naměření první polarografické křivky (14. února) tuto bezesporu klíčovou událost jsme si ovšem již připomněli v patřičný den a ještě si ji letos určitě několikrát připomeneme. Při současném nahlédnutí do kalendáře a do seznamu účastníků zjistíme, že již téměř tradičně můžeme v průběhu Jetřichovic popřát ke jmeninám všem Janám, které bývají většinou hojně zastoupeny a ani letošek není výjimkou, zatímco Emil tentokrát mezi námi chybí. Co v kalendáři na první pohled nenajdeme, je jubileum připadající na 29. května, které tak - bohužel, musíme si přiznat - zůstává mírně ve stínu. A je nám ctí a potěšením, že tuto situaci můžeme napravit. Je spojeno s člověkem velice skromným, tichým, dalo by se říci až nenápadným. Toto polední slovo ovšem nemůže být nijak spojováno s jeho prací, s jeho publikacemi a především jeho celkovým významem. Patří k pravidelným kmenovým účastníkům, bez nichž bychom si nedovedli Jetřichovice, ale ani jiné akce vůbec představit. Je to osoba, která nikdy neodmítne podat pomocnou ruku, s entuziasmem a nadšením pomáhá korigovat a vylepšovat publikační výstupy svých spolupracovníků blízkých i vzdálených, je jim vždy po ruce s radou, informací. Trpíme vždy výčitkami svědomí, když jej žádáme o překlady našich textů z naší angličtiny do angličtiny. Je třeba přiznat, že jej obdivujeme za citlivý přístup, kterým nám vysvětluje kde a jakých chyb (jazykových i odborných) jsme se dopustili. Jeho informační databáze se zdá nevyčerpatelná. Jeho nadšení pro vědu i vitalitu je třeba obdivovat. Proto všichni si přejeme, abychom měli možnost ještě po mnoho Jetřichovic uvítat mezi námi pana doktora Michaela Heyrovského, jemuž touto cestou přejeme vše nejlepší, hodně zdraví, štěstí, pracovní i osobní spokojenosti k jeho 80. narozeninám. Jetřichovičtí přátelé 9

12 Determination of Carbendazim Fungicide by Differential Pulse Stripping Adsorptive Voltammetry at a Tricresyl Phosphate-Modified Carbon Paste Electrode in Presence of 2-Hydroxypropyl Beta Cyclodextrin (Stanovení fungicidu Carbendazimu diferenční pulzní rozpouštěcí adsorptivní voltametrií na uhlíkové pastové elektrodě modifikované trikresylfosfátem v přítomnosti 2-hydroxypropyl beta cyclodextrinu) Amir M. Ashafi a, Jelena Đorđević c, Valéria Guzsvány b, Tatjana Trtić-Petrović c, and Karel Vytřas a a University of Pardubice, Department of Analytical Chemistry, Pardubice, Czech Republic b Department of Chemistry, Faculty of Sciences, University of Novi Sad, Trg D. Obradovića 3, Novi Sad, Serbia c Laboratory of Physics, Vinča Institute of Nuclear Sciences, P. O. Box 522, Belgrade, Serbia Abstract In this study, carbon paste electrode based on tricresyl phosphate (TCP-CPE) as a binding liquid has been applied as working electrode for the voltammetric characterization and determination of the Carbendazim. Effects of both the ph value of the supporting electrolyte and the presence of cyclodextrin on the electrochemical behaviour of Carbendazim were investigated. The developed method offered a good linearity in the concentration range of M with the limit of detection of mol dm -3. Satisfactory recovery was achieved with spiked water, inferring that the established method can be applied to real sample analysis. Key Words: Carbendazim, Carbon paste electrode, Adsorptive stripping voltammetry. Introduction Carbendazim (methyl 1H-benzo [d] imidazol-2-ylcarbanate), a toxic class IV pesticide, is a benzamidazole fungicide that plays an important role in plant disease control. It is used to prevent and cure of disease on corp. The compound is chemically stable and can be filtered in the crop through laminas and seeds. The rudimental determination was very important because of its water resistance, long residual period and toxicity. Therefore, the development of rapid, simple, sensitive and selective methodologies for Carbendazim analysis is still required 1. Cyclodextrins (CDs) are cyclic oligosaccharides which are toroidal in shape with a hydrophobic inner cavity and a hydrophilic outer side 2-4. CDs are able to bind selectively various organic, inorganic and biological guest molecules into their cavities to form stable host guest inclusion complexes, providing good opportunities for applications in the fields of sensors, electrocatalysis, luminescence and electronics, etc. 5. This paper deals with the differential pulse adsorptive stripping voltammetric (DPASV) method development of Carbendazim determination using a tricresyl phosphate-based carbon paste electrode (TCP CPE) in presence of 2-hydroxypropyl beta cyclodextrin as a complexing agent and its application in a spiked water sample. Experimental Reagents and Apparatus Carbendazim (95% purity) was obtained from Fitofarmacija a.d. (Zemun, Serbia). The Carbendazim stock solution was (0.01 M), prepared by dissolving this fungicide in N, N- 10

13 dimethylformamide (Sigma-Aldrich) and kept in dark at -4 o C. The ph values of the Carbendazim solutions were adjusted using Britton Robinson (BR) buffer solutions ranging from ph 2 to ph 11. NaBr, K 2 SO 4, NaCl, NaI, NaNO 3, 2-hydroxypropyl beta cyclodextrin (Sigma-Aldrich) were of analytical grade and used without further purification. Voltammetric experiments were performed on an Autolab (Metrohm Autolab, Utrecht, The Netherlands) electrochemical analyzer operated via GPES 4.9 software (Metrohm Autolab, Utrecht, The Netherlands). The conventional three-electrode configuration with a carbon paste electrode was employed throughout the work.the Ag/AgCl saturated electrode and a Pt plate served as the reference and auxiliary electrodes. Preparation of working electrode TCP-CPE Three different carbon pastes were made by intimate hand-mixing of CR 5 graphite powder (Lučební závody Kolín, Czech Republic) with tricresyl phosphate (TCP), paraffin oil, or highly viscous silicone oil as liquid binders as described elsewhere 6. The model system was carried out in ml of Britton Robinson buffer solution and the optimum concentration of cyclodextrin was added. Then, a desired amount of Carbendazim solution was injected. The solution was deaerated by passing an argon stream for 2-3 min. Deposition potential was applied during accumulation time while the solution was stirred and after an equilibrium period, the voltammogram was recorded. Before addition of Carbendazim, the voltammogram of the blank solution was recorded under the same conditions. Results and Discussion Effect of the various binders Different binders like paraffin, silicon, and tricresyl phosphate were used as pasting liquid, the resulted CPEs were inserted in the solution containing 0.01 M Carbendazim, and cyclic voltammograms were recorded. As can be seen in (Figure 1), there is one redox couple which can be used for determination of Carbendazim. Obviously, the peaks are higher and well shaped for determination purpose in the case of TCP-CPE. Considering the shape and highness, the oxidation peak has been chosen for quantitative determination of the compound. Influence of the ph on the oxidation peak DPAS voltammograms of Carbendazim were recorded in the ph range from 2.0 to 11.0 using Briton-Robinson buffers to study the influence of the ph on the shape and highness of M its oxidation peak. To investigate effect of the buffer, some measurements were also carried out in the ph 4 acetic buffer. The results indicated that the best peaks shape and the maximum peaks current occurred in the ph 4.0 Briton-Robinson buffer. Effect of the potential and time and cyclodextrin The oxidation peak was found to be influenced by applied potential and time. With shifting the potential to more negative potentials, the peak current also increased until V and then leveled off which could be caused by saturation of the electrode surface. The peak current highness increased with increasing deposition time to 180 s, and further time prolongation (till 300 s) did not bring any positive effect on the peak current. Thus, time of 120 s was selected as an optimum. As shown (Figure 2), increasing the CD concentration the peak current increased evidently to M CD; further increase of CD did not have any special effect on the peak current. 11

14 Fig.1. Cyclic voltammograms of Carbendazim ( M) in Briton Robinson ph 8 buffer on a CPE electrode with (a) TCP, (b) paraffin or (c) silicon oil. Scan rate, 100 mv s -1. Inset: voltammograms of and blank in the same buffer with scan rate 50 mv s -1 at TCP-CPE I(µA) I(µA) E(V) c CD µm Fig.2. Influence of cyclodextrin addition on the peak height M Carbendazim. Inset: (a) Carbendazim alone; (b) the same with M cyclodextrine. Measured in ph 4 Britton-Robinson buffer; E acc = -0.35V; t acc =120 s; equilibrium time 5 s; amplitude potential 25 mv and step potential 4 mv. Calibration Under optimized conditions, DPAS voltammograms were recorded for increasing Carbendazim concentration in the range of to M and corresponding calibration plot was constructed (Figure 3). The dependency is linear and can be described by the equation I[µA] = c carbendazim ; with R 2 = 0.995; detection limit (evaluated as 3σ) M; and RSD = 4.9% (for M and 8 different measurement) a 12

15 Conclusion The TCP-CPE electrode was found to be efficient for the adsorptive stripping voltammetric determination of Carbendazim in presence of cyclodextrin. High sensitivity, good reproducibility, simple instrumentation, and rapidity of the procedure may additionally be appreciated. No interferences were observed when some various ions as well as one other similar organic compound (Linuron herbicide) were added to M Carbendazim solution. The accuracy of the method was verified applying the method for the determination of Carbendazim in spiked water sample. Corresponding standard addition plot showed good linearity with R 2 = 0.994; recovery rate was calculated to be % y = x R² = I(µA) c CBZ (µm) 17 I(µA) E(V) Fig. 3. Construction of the calibration plot for determination of carbendazim in the concentration range of ppb. Measured in ph 4 Briton-Robinson buffer in the presence of M cyclodextrin; E acc V, t acc 120 s, t eq, 5 s; other parameters as given under Fig. 2. References 1. The European Union On-Line, Official Documents, European Communities, 2000, 2. Rekharsky M., Inoue Y., Chem. Rev, 98, 1875 (1998). 3. Wang F., Khaledi M.G., Anal. Chem. 68, 3460 (1996). 4. Freeman R., Finder T., Bahshi L., Willner I., Nano Lett. 9, 2073 (2009). 5. Guo Y., Guo S., Ren J., Zhai Y., Dong S., Wang E., ACS Nano, 4, 4001 (2010). 6. Švancara I., Vytřas K., Metelka R., Czech. Patent CZ (appl. 2 Dec 2002, adm. 22 Apr 2010). 13

16 Determination of Formaldehyde Using Capillary Isotachophoresis (Stanovení formaldehydu kapilární izotachoforézou) Martin Bartoš and Iva Žertová Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Studentská 573, Pardubice, Czech Republic, Abstract In this article, formaldehyde is determined in commercially marketed gargle. Determination is based on the reaction of formaldehyde with ammonia, when urotropine (hexamine) is formed. Optimum conditions are: sample mol L -1 NH 4 Cl, ph 10 (adjusted by KOH solution), analysis day after using capillary isotachophoresis. The optimal isotachophoretic electrolyte system comprised 0.01 mol L -1 KOH mol L -1 acetic acid + 0.1% hydroxyethylcellulose (ph 4.75) as the leading electrolyte and 0.01 mol L -1 acetic acid as the terminator. The calibration / detection characteristics are as follows: linearity over the concentration range of mg L -1 formaldehyde, limit of detection ca. 30 mg L -1, limit of quantification of ca. 90 mg L -1 formaldehyde. The procedure is suitable for samples containing higher amount of formaldehyde, and after proof, it is possible to use it for analysis of samples where other methods fail or a separation from interferences is necessary. Key Words: Capillary isotachophoresis, Formaldehyde, Determination. Úvod Formaldehyd je považován za látku ohrožující lidské zdraví a to především pro jeho výskyt v ovzduší, ve kterém je jeho obsah nejčastěji sledován. Ke stanovení formaldehydu byla vypracována celá řada metod, využívajících značnou část analytických technik. K nejčastěji používaným technikám patří spektrofotometrie, fluorimetrie a plynová i kapalinová chromatografie 1-3. Obvykle je formaldehyd z ovzduší zachycován do absorpčního roztoku nebo na vhodný sorbent 1-3. V těchto případech má vzorek resp. roztoky před analýzou jednoduchou nebo účelově nastavenou matrici, která pokud možno neruší nebo dokonce napomáhá při následném stanovení formaldehydu. V některých vzorcích jsou ale přítomny látky, které tvoří s formaldehydem více či méně stálé sloučeniny mající charakter aduktů, které mohou výrazně zkomplikovat stanovení. Takovou směsí je i tzv. Kutvirtovo kloktadlo, používané ke zmírnění bolesti v krku při nachlazení, které obsahuje kromě formaldehydu ještě mentol, třísloviny (polyfenoly), etanol a vodu. Obsah formaldehydu v tomto kloktadle se nepodařilo stanovit ani jodometrickou titrací, ani plynovou chromatografií (bez derivatizace). Formaldehyd je sice elektroneutrální v celém rozsahu ph použitelném při izotachoforetických analýzách, vhodnou derivatizací je ale možné jej převést na formu nesoucí elektrický náboj, čehož bylo využito při jeho elektroforetickém stanovení. Jako derivatizační činidlo byl použit například siřičitan, hydrazinobenzensulfonová kyselina, dinitrofenylhydrazin, dansylhydrazin, atd. 1 Jednou z dalších možností je reakce s amoniakem, při které vzniká z formaldehydu urotropin (CH 2 ) 6 N 4. Ten se ve slabě kyselém prostředí protonizuje (v silně kyselém prostředí se rozkládá 4 ) a protonizovaný urotropin lze izotachoforeticky stanovit 5. V této práci je popsáno stanovení formaldehydu po jeho převedení na urotropin. 14

17 Experimentální část Chemikálie a roztoky. Všechny použité chemikálie byly čistoty p.a. Hydroxyethylceluloza pocházela z firmy Serva (Heidelberg, Německo). Všechny ostatní chemikálie byly z Lachemy (Brno, ČR). Modelové vzorky formaldehydu, použité k optimalizaci parametrů analýzy, měření kalibračních řad a dalších parametrů analýzy, byly připravovány ředěním zásobních roztoků formaldehydu a chloridu amonného o koncentracích 0,5 mol L -1. Zásobní roztok urotropinu o koncentraci 0,01 mol L -1, sloužící k porovnávání účinnosti konverze formaldehydu na urotropin, byl připravován denně čerstvý - stáním dochází k jeho pomalému rozkladu 5. Izotachoforetická analýza probíhala na jednokolonovém přístroji Agrofor (JZD Odra, Krmelín, ČR), vybaveném dávkovacím kohoutem s fixním objemem a vodivostním detektorem. Signál detektoru a absolutní hodnota jeho derivace byly zaznamenávány na dvouliniovém zapisovači TZ 4620 (Laboratorní přístroje Praha, ČR). Urotropin, vzniklý reakcí formaldehydu s amoniakem, byl stanovován za následujících podmínek: vedoucí elektrolyt obsahoval 0,01 mol L -1 hydroxid draselný, 0,02 mol L -1 kyselinu octovou a 0,1 % hydroxyethylcelulozu, jeho ph bylo 4,75 (vedoucím iontem byl K + ); koncovým elektrolytem byla kyselina octová o koncentraci 0,01 mol L -1 (koncovým iontem byl H + ). Separační proud byl 60 μa. Příprava zkušebních a kalibračních roztoků (není-li řečeno jinak). V kádince bylo smícháno přibližně 40 ml demineralizované vody, 2 ml 0,5 mol L -1 chloridu amonného a vhodný objem 0,5 mol L -1 formaldehydu. Postupnými malými přídavky roztoku hydroxidu draselného o koncentraci 1 mol L -1 bylo nastaveno ph na hodnotu 10. Roztok byl převeden do 50 ml odměrné baňky, doplněn na jmenovitý objem, promíchán a ponechán ve tmě do druhého dne. Před analýzou byl vhodně zředěn demineralizovanou vodou. Vzorek. Formaldehyd byl stanovován v Kutvirtově kloktadle, připravovaném a dostupném v lékárnách, jehož složení je podle údajů na etiketě: Levomentholum 20,0 g, Ratanhiae tinctura 50,0 g, Formaldehyd solutio 35% 100,0 g, Ethanolum 96% (V/V) 525,0 g, Aqua purificata 305,0 g. Levomentholum je jedním z izomerů mentolu (2-isopropyl-5-methylcyklohexanolu), Ratannae tinctura je alkoholový extrakt z kořene kramerie trojmužné, obsahující především třísloviny (tj. polyfenoly) v množství minimálně 1 %. Příprava vzorku k analýze. V kádince bylo smícháno přibližně 40 ml demineralizované vody, 2 ml 0,5 mol L -1 chloridu amonného a 0,5 ml vzorku kloktadla, přídavky 1 mol L -1 hydroxidu draselného bylo nastaveno ph na hodnotu 10. Roztok byl převeden do 50 ml odměrné baňky, doplněn na jmenovitý objem, promíchán a ponechán ve tmě do druhého dne. Před analýzou byl zředěn v poměru 1 : 4 demineralizovanou vodou. Výsledky a diskuse Formaldehyd pravděpodobně nereaguje s amonnými ionty, ale pouze s amoniakem. 6 CH 2 O + 4 NH H 2 O 15

18 Reakce probíhá až po dosažení ph vyššího než 5, maxima dosahuje při ph 9 až 10, pk A (NH 4 + ) = 9,25. Při ph vyšším než 10 účinnost tvorby urotropinu mírně klesá pravděpodobně v důsledku disociace formaldehydu, pk A (CH 2 O) = 13,3 6 (Obr. 1). Nejvhodnějším způsobem alkalizace reakční směsi je nastavování ph na hodnotu 10 přídavky roztoku KOH. Méně vhodné je přidávání konstantního dostatečně velkého objemu roztoku KOH bez ohledu na výsledné ph. Náhrada chloridu amonného roztokem amoniaku se neosvědčila. Obr. 1. Závislost relativní délky zóny urotropinu (vzniklého reakcí amoniaku s formaldehydem) na ph reakční směsi. A - nastavená hodnota ph, B - ph roztoku po cca 20 hodinách. Délka zóny je vztažena k délce zóny 0,5 mm urotropinu. Podmínky: 0,02 M NH 4 Cl + 0,09 M CH 2 O (trojnásobný nadbytek), ph nastaveno přídavky 1 M KOH, analyzováno druhý den po přípravě, před analýzou 10x zředěno. Rychlost reakce formaldehydu s urotropinem roste s teplotou a s koncentrací reagujících složek. Přesto je poměrně nízká, a pokud je to možné, je vhodné ponechat roztok reagovat minimálně do druhého dne. Kvantitativního průběhu reakce nelze dosáhnout ani zahříváním, ani vhodným nastavením ph, nadbytkem amonných iontů nebo delším stáním roztoku. Urotropinu vzniká při ph 10 po přibližně 20 hodinách asi 60 až 70 % teoretického množství. Závislost délky zóny urotropinu na koncentraci formaldehydu při konstantní koncentraci amonných iontů lze považovat za lineární do asi 60 % teoretického množství formaldehydu k amoniaku (Obr. 2). Koncentrace amonného iontu v reakční směsi byla především s ohledem na dobu trvání měření zvolena 20 mmol L -1 (což odpovídá 5 mmol L -1 urotropinu, resp. 30 mmol L -1 formaldehydu). Vzhledem k rozsahu lineární části kalibrace by koncentrace formaldehydu v reakční směsi neměla překročit cca 20 mmol L -1 (600 mg L -1 ). Kalibrační závislost neprochází nulou, což je pravděpodobně další důsledek relativně pomalé reakce formaldehydu s amoniakem. Úsek na ose x lze zkrátit prodloužením reakční doby (Obr. 3). Relativní odchylka 5x opakovaného měření standardního roztoku o koncentraci 12 mmol L -1 formaldehydu byla 0,5 %. Citlivost stanovení (směrnice kalibračního grafu) neředěného 16

19 roztoku je přibližně 10 mm na mmol L -1 formaldehydu. Detekční limit 1 mmol L -1 a limit stanovení 3 mmol L -1 jsou vzhledem k nelinearitě počátku kalibrace jen hrubými odhady. Obr. 2. Závislost délky zóny urotropinu na koncentraci formaldehydu. A - teoreticky dosažitelná hodnota, B - naměřené hodnoty. Podmínky: 20 mm NH 4 Cl + 6 až 45 mm CH 2 O, ph 10, analyzováno další den, před analýzou 5x zředěno. Obr. 3. Délka zóny urotropinu při nízkých koncentracích formaldehydu. A - analyzováno druhý den, B - analyzováno po třech dnech. Podmínky: 0,02 M NH 4 Cl + 0,6 až 6 mm CH 2 O, ph 10, dávkováno bez ředění. Analýza reálného vzorku. Obsah formaldehydu v Kutvirtově kloktadle byl stanoven metodou kalibrační křivky a standardního přídavku. Průměrná hodnota, zjištěná pomocí kalibrační křivky, byla 1,25 mol L -1 formaldehydu, tj. 4,1 %, hodnota zjištěná metodou standardního přídavku byla 1,18 mol L -1, tj. 3,9 %. Jmenovitý obsah formaldehydu v Kutvirtově kloktadle je podle údajů na etiketě 3,5 %. (Hustota kloktadla, potřebná pro výpočet hmotnostních procent, byla zjištěna pyknometricky.) 17

20 Závěr Uvedené stanovení formaldehydu je příkladem použitelnosti izotachoforézy i pro stanovení látek, které nemají iontovou povahu, které ale lze více či méně úspěšně převést (derivatizovat) na jinou, izotachoforeticky stanovitelnou formu. Popsaný postup sice není použitelný pro stanovení stopových obsahů formaldehydu, lze jej ale po odzkoušení použít i pro matrice, ve kterých jiné postupy selhávají nebo vyžadují oddělení rušivých složek vzorku. Obdobným postupem lze izotachoforeticky stanovit i amonné ionty a amoniak, pro které ale existuje řada jiných (i izotachoforetických) metod, které mají po všech stránkách výhodnější parametry. Poděkování Tato práce vznikla s podporou studentského grantu Univerzity Pardubice SGFChT06/2012. Literatura 1. Motyka K., Mikuška P.: Chem. listy 99, 13 (2005). 2. NIOSH Manual of Analytical Methods, staženo Ferus M., Cihelka J., Civiš S.: Chem. listy 102, 417 (2008). 4. Tada H.: J. Am. Chem. Soc. 82, 255 (1960). 5. Martinková Z., Bartoš M., Mikysek T., Švancara I.: Sensing in Electroanalysis 6, 369 (2011) staženo

21 Nitro-Hydrazine Derivatives - Electrochemically Reducible DNA Labels (Deriváty nitrovaných hydrazínů - elektrochemicky redukovatelné DNA značky) Ales Danhel a, Hana Pivonkova a, Veronika Raindlova b, Michal Hocek b, and Miroslav Fojta a a Institute of Biophysics of the AS CR, v.v.i., Kralovopolska 135, Brno, Czech Republic, danhel@ibp.cz b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo nam. 2, Prague 6, Czech Republic Abstract Electrochemical properties of recently designed DNA-labels: 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNFH) and 4-(1-methylhydrazino)-7-nitrobenzofurazan (NBF) were studied at mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-agsae) using cyclic voltammetry, adsorptive stripping voltammetry (AdSV) and transfer stripping voltammetry (TSV) in this work. These electrochemically reducible DNA labels offer cathodic and also anodic signals at more positive potentials than DNA itself. They are sufficiently adsorbed at m-agsae using AdSV. Sensitivity may be increased about 10x for DNFH and 1.5x for NBF. The labels are just weakly adsorbed at m-agsae using open circuit adsorption, what may be applied for sufficient separation of the large biomolecules (nucleotides, nucleic acids) from their mixtures. These DNA labels were found to be convenient for modification of the nucleotides via specific linker. Such labeled nucleotides may be further enzymatically incorporated to oligonucleotides or DNA using modern biochemical methods. Key Words: Voltammetry, Silver solid amalgam, DNA-labels, nitro- and benzofurazanderivatives. Introduction Modern electrochemical methods represent simple and fast tool in analysis of biological molecules, e.g. nucleic acids and their constituents 1, proteins 2 3,, enzymes 4, polysaccharides 5. Electrochemical activity of the nucleic acids may be applied in the completion of genome sequencing and subsequently utilized for identification of the relationship between the individual genome characteristics, cellular functions and disease, and in development of widely accessible and decentralized diagnostic methods. For these purposes, mercury electrodes have been used since E. Palecek discovered electrochemical activity of the DNA in 1950 s 6. Since 1990 s, when mercury use has started to be regulated, due to its toxicity risks and mechanical instability, a lot of novel electrode materials have been presented 7. Silver solid amalgam electrodes (AgASE) were found to be suitable non-toxic alternatives to hanging mercury drop electrodes (HMDE) with good mechanical stability and with high hydrogen overpotential comparable with that obtained at HMDE in aqueous media, even if the AgSAE exhibits lower sensitivity. Application of DNA labeling significantly increases sensitivity and selectivity of utilized sensors and it also influences diverse responses of the observed bio-molecules. DNA labeling in combination with AgSAE may be used for development of novel, and sufficiently sensitive and robust sensors, and detectors for bioassays in toxicological, biological, and medicinal applications Voltammetric behaviour of selected DNA labels, coming from a group of nitro-hydrazine derivatives (Fig. 1), was observed before their incorporation to nucleotides and/or nucleic acids. Parameters of adsorptive stripping voltammetry (AdSV), usability of a transfer stripping voltammetry (TSV), and parameters, such as potential window and scan rate of the cyclic voltammetry (CV), were observed and optimized for detection and specific control of appearance and/or disappearance of the proper cathodic and anodic signals. This approach 19

22 may be used for signal control and may increase information diversity of the voltammetric measurements in the biological and/or medicinal samples. H 2 N NH NO 2 H 2 N CH N 3 a) NO 2 b) NO 2 Fig. 1. Structure formulae of the observed DNA labels: a) 2,4-dinitrophenylhydrazine, b) 4-(1-methylhydrazino)-7-nitrobenzofurazan. Experimental Methanolic stock solutions of studied compounds: 2-mM 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) and 5-mM 4-(1-methylhydrazino)-7-nitrobenzofurazan (NBF) were obtained from Michal Hocek s collaborative research group coming from the Institute of Organic Chemistry and Biochemistry 11. Supporting electrolyte, 0.3M ammonium formate/disodium hydrogen phosphate buffer (AFP buffer) ph 6.95,was prepared from ACS grade chemicals purchased from Sigma-Aldrich, Germany, using deionized water produced by Milli-Q plus system (Millipore, USA), and utilized during all the experiments in this work. Oxygen was removed from the measured solutions by 5 min of deaeration with Argon ( %, Air Products, Czech Republic). Voltammetric measurements were carried out by an electrochemical workstation CHI440 (CH Instruments, USA) using a three electrode system consisted of platinum wire auxiliary electrode, silver chloride reference electrode (Ag AgCl 3M KCl, both Monokrystaly, Czech Republic) and m-agsae working electrode in 1-ml glass vessel. A mercury meniscus was prepared from a three times distillated polarographic mercury ( %, Polarografie Praha, Czech Republic) on AgSAE polished before an amalgamation on wet filter paper everyday. The CV, AdSV and TSV methods were used at scan rates with in V s 1. Results and discussion According to results from cyclic voltammetry of studied DNFH and NBF, sample CVs see on Fig. 2, their reduction mechanisms could be proposed. The DNFH and NBF are reduced in first negative scan at m-agsae in two steps (two CV peaks) and in case of DNFH also oxidized in first positive scan, see reaction schemes 1 for DNFH and 2 for NBF (Fig. 3). Raising peaks of hydroxylamines corresponding to reduction of the DNFH (I k1 and I k2 ) are consequently oxidized to nitroso-derivatives in the first positive scan (green color in scheme 1), these anodic signals around 180 mv and 20 mv are dependent on scan rate and potential of negative turn. However cathodic peaks corresponding to reduction of nitrosogroups to hydroxylamines do not rise in second cycle; in case of negative turn behind the second peak I c2. If the turn is proceeded behind the first cathodic peak (I c1 ), responses quasireversible peaks I qr and I a1 appear around 20 mv. This quasi-reversible peak is influenced by the scan rate and the electrode reaction is obviously driven by an adsorption process of the analyte at m-agsae. This was confirmed by evaluation of the peak heights on a scan rate, which was found to be linear. The NBF offer only its reduction peaks I k1 and I k2 at potentials 400 mv and 1000 mv. No other oxidative peaks were observed in first positive scan or in second cycle. N O N 20

23 I, na -500 BE DNFH NBF -400 I c I c1-100 I c1 I c Fig. 2. Cyclic voltammograms of: base electrolyte (BE), 40μM DNFH and 40μM NBF at m-agsae in 0.3M AFP buffer ph 6.95, scan rate 100 mv s 1. E, V H 2 N NH NO 2 I c1 H 2 N +4H +, +4e - -H 2 O NH NHOH I c2 H 2 N +4H +, +4e - -H 2 O NH NHOH NO 2 NO 2 NHOH I qr H 2 N NH NHOH -2H +, -2e - I a2 (1) H 2 N NH +2H +, +2e - NO -2H +, -2e - NO I a1 NO H 3 C NH 2 N I c1 H 3 C NH 2 N H 3 C NH 2 N N +4H +, +4e - N +6H +, +6e - NH 2 O O N -H 2 O N -H 2 O NH 2 NO 2 NHOH NHOH I c2 (2) Fig. 3. Proposed reduction/oxidation mechanism of the DNFH (1) and NBF (2) at m-agsae in aqueous media (description see in text). 21

24 Affords to increase sensitivity of detection of selected DNA labels were done using adsorptive stripping voltammetry. Sensitivity of the DNFH and NBF detection may be ten times and about 50% increased using accumulation potential 0.1 V during 60s and 30s, respectively, at scan rate 1.0 V s 1. This method may be used for detection of higher volumes of the DNA labels, about 1 ml. On the other hand, TSV is more convenient method for analysis of small volume samples, around 30 μl. However, this method is sufficient only for strongly adsorbed analytes on the electrode surface using an open circuit adsorption. In this case, the DNFH and NBF are just weakly adsorbed on the m-agsae, but the TSV may be used for analysis of bigger molecules (e.g. labeled nucleotides or nucleic acids) strongly adsorbed on the m-agsae in presence of the labels. Conclusion Thanks to the cathodic/anodic signals, corresponding to the reduction/oxidation of the studied nitro-hydrazine derivatives DNFH and NBF, these compounds may be used for labeling of nucleosides, nucleotides, oligonucleotides, and/or nucleic acids, and further applied in bioanalytical applications engaged in DNA hybridization, primer extension, polymerase chain reaction (PCR), single nucleotide polymorphism (SNP) typing, DNA damage and/or DNA protein interaction. Acknowledgment Financial support from The Czech Science Foundation GACR (project P206/12/G151) and GA ASCR (IAA ) is gratefully acknowledged. References 1. Fojta M.: Electroanalysis 14, 1449 (2002). 2. Doneux T., Ostatna V., Palecek E.: Electrochim. Acta 56, 9337 (2011). 3. Li H. H., Liu S. Q., Dai Z. H., Bao J. C., Yang X. D.: Sensors 9, 8547 (2009). 4. Bistolas N., Wollenberger U., Jung C., Scheller F. W.: Biosens. Bioelectron. 20, 2408 (2005). 5. Trefulka M., Palecek E.: Electroanalysis 22, 1837 (2010). 6. Hocek M., Fojta M.: Chem. Soc. Rev. 40, 5802 (2011). 7. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 8. Fojta M., Havran L., Pivonkova H., Horakova P., Hocek M.: Curr. Org. Chem. 15, 2936 (2011). 9. Labuda J., Brett A. M. O., Evtugyn G., Fojta M., Mascini M., Ozsoz M., Palchetti I., Palecek E., Wang J.: Pure Appl. Chem. 82, 1161 (2010). 10. Fojta M., Jelen F., Havran L., Palecek E.: Curr. Anal. Chem. 4, 250 (2008). 11. Raindlova V., Pohl R., Sanda M., Hocek M.: Angew. Chem., Int. Ed. 49, 1064 (2010). 22

25 Electrochemical Determination of Chlortoluron on Carbon Paste Electrode (Elektrochemické stanovení chlortoluronu na uhlíkové pastové elektrodě) Hana Dejmkova a, Lucie Houskova a, Jiri Barek a, and Jiri Zima a a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, Prague 2, Czech Republic, dejmkova@natur.cuni.cz Abstract Methods for the electrochemical determination of chlortoluron, phenylurea herbicide applied against broadleaf weeds, were developed, using differential pulse voltammetry on carbon paste electrodes of two diameters. Optimum determination medium was selected and the possibility of determination in model samples of river water was confirmed. The determination limits reached submicromolar concentration. The performance of both electrodes was comparable; electrode of smaller dimensions was able to work in sample volume of 0.25 ml. Key Words: Chlortoluron, Pesticide, Differential pulse voltammetry, Carbon paste electrode. Úvod Chlortoluron (N,N-dimethyl-N-(3-chlortolyl)močovina) je kontaktní postřikový herbicid používaný proti širokolistým a travním plevelům pěstování obilovin a máku 1. Je součástí mnoha komerčně dostupných přípravků, například Dicuranu, Syncuranu, Tolurexu, Lentipuru, a dalších. V některých aplikacích je pro zvýšení účinnosti chlortoluron kombinován s jinými herbicidy, nejčastěji ze skupiny sulfonylmočovin. Jako mnoho jiných herbicidů s sebou i chlortoluron nese zdravotní rizika; předpisy Evropské unie ho uvádí jako potenciální karcinogen, kromě toho je to látka riziková pro životní prostředí, zejména z hlediska znečištění vod 2. Běžné způsoby stanovení chlortoluronu zahrnují zejména metody kapalinové chromatografie 3-5 a imunoafinitní metody 6, 7, jež mohou obsah analytu určit s velkou citlivostí a lze je použít i ve složitých matricích. Elektrochemické metody mohou, vzhledem ke své miniaturizovatelnosti a portabilitě, rozšířit tuto škálu možností o rychlé orientační infield stanovení. Pro vývoj metody byla jako pracovní elektroda vybrána uhlíková pastová elektroda; důvodem byla snadná obnovitelnost jejího povrchu, stejně jako její výhodné elektrochemické vlastnosti 8, 9. V běžném uspořádání jsou ovšem uhlíkové pastové elektrody pro polní stanovení zbytečně robustní a je proto vhodnější zvolit některou z miniaturizovaných konstrukcí elektrody Cílem práce je nalézt vhodné podmínky pro voltametrické stanovení chlortoluronu v povrchových vodách s použitím uhlíkové pastové elektrody a ověřit vliv miniaturizace elektrody na získané výsledky. Experimentální část Zásobní roztok chlortoluronu (99,7%, Sigma-Aldrich) o koncentraci 100 μmol L 1 byl připraven rozpuštěním přesně odváženého množství látky v methanolu. Jako základní elektrolyt byl použit Brittonův-Robinsonův (BR) pufr; chemikálie pro přípravu pufru byly v kvalitě p.a. zakoupeny od Lachema Brno. Uhlíková pasta byla připravena smísením 0,25 g mikrokuliček skelného uhlíku (průměr 0,4 1,2 μm, Alfa Aesar, USA) a 0,1 ml minerálního oleje (Fluka, Švýcarsko). 23

26 Byly použity dva typy uhlíkové pastové elektrody; v jednom případě byla pasta naplněna do obvyklého teflonového těla s nerezovým pístem, s aktivní plochou o průměru 2 mm, v druhém případě byla jako pouzdro na pastu použita teflonová kapilára o vnitřním průměru 0,5 mm. Povrch konvenční uhlíkové pastové elektrody (CPE) byl obnovován otřením vlhkým filtračním papírem, povrch miniaturizované uhlíkové pastové elektrody (mcpe) byl obnovován uříznutím tenkého plátku kapiláry. Měření na CPE byla prováděna přístrojem Eco-Tribo-Polarograph (Polaro Sensors, Praha) v roztoku o objemu 10 ml. K měření na mcpe byl využit přenosný přístroj PalmSens (PalmSens, Nizozemí) v roztoku o objemu 0,25 ml. V obou případech byla použita platinová pomocná elektroda a konvenční argentochloridová referentní elektroda. Diferenční pulsní voltametrie (DPV) probíhala s parametry: rychlost scanu 100 mv s 1, výška pulsu 50 mv, šířka pulsu 100 ms. Všechna měření byla opakována třikrát. Koncentrační závislosti byly vyhodnoceny metodou nejmenších čtverců; mez stanovitelnosti byla spočítána jako koncentrace analytu, jehož výška píku odpovídá desetinásobku směrodatné odchylky nejmenší vyhodnotitelné koncentrace. Říční voda byla odebíraná z Vltavy na Výtoni. 5 ml spikovaného vzorku bylo před voltametrickým stanovením doplněno BR pufrem do 10 ml; dále uvedené hodnoty koncentrací se vztahují ke koncentraci ve vzorku před tímto ředěním. Výsledky a diskuse Prvním krokem při optimalizaci DPV stanovení bylo určení vhodného ph měřeného roztoku. Ze série voltamogramů, změřených při hodnotách ph roztoku 2 až 12, vyplývá, že průběh závislosti signálu na ph se shoduje u obou použitých pracovních elektrod; proudová odezva je nejvyšší při silně kyselých ph; kromě toho se výrazně zvýší u silně zásaditých ph. Pro další měření bylo zvoleno ph 3, při kterém dosahovala výška píku maximální hodnoty. Opakovaným měřením byla zjištěna relativní směrodatná odchylka měření, která činila 5,6 % v případě CPE a 8,3 % v případě mcpe (n = 10). Tento výsledek zřejmě souvisí s různým mechanismem obnovy povrchu elektrody. Ve vybraném prostředí byla změřena koncentrační závislost chlortoluronu na obou elektrodách; parametry získaných lineárních závislostí jsou shrnuty v Tabulce I. Odezva mcpe je úměrně k ploše elektrody menší než v případě CPE, stejný vliv ovšem snížil i proud pozadí; na velikost šumu měla pravděpodobně vliv i použitá instrumentace. Dosažená mez stanovitelnosti v obou případech dosáhla submikromolární koncentrace, konkrétně 0,72 μmol L 1 v případě CPE a 0,29 μmol L 1 v případě mcpe. Obdobných výsledků bylo dosaženo při stanovení chlortoluronu v modelových vzorcích říční vody (Tabulka I). Mez stanovitelnosti je v tomto případě ovlivněna ředěním vzorku pufrem před samotným měřením; v případě obou elektrod je její velikost mírně větší než při stanovení v laboratorních podmínkách. Matrice stanovení pozorovatelně neovlivňuje, jak je zřejmé i z voltamogramů látky v nejnižším změřeném koncentračním rozmezí (Obr. 1). 24

27 350 I (na) 300 A 9 8 I (na) 7 B E (V) E (V) Obr. 1. DP voltamogramy koncentračních závislostí modelových vzorků chlortoluronu v říční vodě na CPE (A) a mcpe (B), c = 10; 8; 6; 4; 2; 0 μmol L 1. 5 ml vzorku říční vody doplněno do 10 ml BR pufrem ph 3. Úsek, na Korelační Tabulka I. Parametry koncentračních závislosí chlortoluronu. DPV, BR pufr ph 3. Elektroda Matrice Koncentrační Směrnice, Mez rozsah, μmol L -1 ma L mol 1 koeficient stanovitelnosti, μmol L -1 CPE Deionizovaná 100 0,8 7,8 18 0,9929 0,72 voda Říční voda ,2 7,7 0,9941 1,6 mcpe Deionizovaná 100 0,4 0,45 0,80 0,9975 0,29 voda Říční voda ,22 0,38 0,9952 0,35 Závěr Technika diferenční pulsní voltametrie na uhlíkových pastových elektrodách se ukázala být vhodnou pro stanovení chlortoluronu i v submikromolárních koncentracích a v matrici reálných vzorků povrchových vod. Poděkování Tato práce vznikla byla finančně podpořena Ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy ČR (projekt MSM ), Univerzitou Karlovou v Praze (projekt SVV ) a Technologickou agenturou ČR (projekt TA ). Literatura 1. Pesticide properties Database, Downloaded 29 th March EU Pesticides Database, Downloaded 29 th March

28 3. Wang Y., You J. Y., Ren R. B., Xiao Y., Gao S. Q., Zhang H. Q., Yu A. M.: Journal of Chromatography A 1217, 4241 (2010). 4. Mou R. X., Chen M. X., Zhi J. L.: Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences 875, 437 (2008). 5. Losito I., Amorisco A., Carbonara T., Lofiego S., Palmisano F.: Analytica Chimica Acta 575, 89 (2006). 6. MartinEsteban A., Kwasowski P., Stevenson D.: Chromatographia 45, 364 (1997). 7. Mouvet C., Broussard S., Riolland H., Baran N., Abuknesha R., Ismail G.: Chemosphere 35, 1099 (1997). 8. Svancara I., Vytras K., Barek J., Zima J.: Critical Reviews in Analytical Chemistry 31, 311 (2001). 9. Zima J., Svancara I., Barek J., Vytras K.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 204 (2009). 10. Wang J., Zhang X. J., Prakash M.: Analytica Chimica Acta 395, 11 (1999). 11. Baldrianova L., Svancara I., Sotiropoulos S.: Analytica Chimica Acta 599, 249 (2007). 12. Hocevar S. B., Ogorevc B.: Talanta 74, 405 (2007). 26

29 Voltammetric Determination of 5-Nitrobenzimidazole at a Carbon Film Electrode Deposited on a Silver Solid Amalgam Electrode (Voltametrické stanovení 5-nitrobenzimidazolu na uhlíkové filmové elektrodě deponované na stříbrné pevné amalgámové elektrodě) Dana Deýlová and Jiří Barek Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 2030/8, Prague 2, Czech Republic, barek@natur.cuni.cz Abstract Optimal conditions were found for the determination of 5-nitrobenzimidazole by direct current and differential pulse voltammetry at a polished silver solid amalgam electrode modified by carbon film in the concentration range from to mol L 1 in the Britton-Robinson buffer solutions and model samples of drinking and river water. Key Words: 5-Nitrobenzimidazole, DC voltammetry, Differential pulse voltammetry, Polished silver solid amalgam electrode modified by carbon film. Introduction 5-Nitrobenzimidazole (5-NBIA) is a genotoxic substance which belongs to a group of the nitrated heterocyclic compounds. The occurrence of 5-NBIA in environment is expected in connection with chemical processes during fossil fuels combustion 1. 5-NBIA was polarographically determined as a part of photographic processing solutions in the Seventies of the last century 2 and its properties were studied in the area of metal corrosion protection 3. 5-NBIA is known as a proven carcinogen and mutagen 4. O 2 N N Fig. 1. Structural formula of 5-nitrobenzimidazole. N H In the last decade, increasing fears of the toxicity of liquid mercury 5 one of the best electrode materials for measurement of this group of substances led us to try to find out novel suitable nontoxic materials with similar or better quality as mercury. One of them could be a carbon film deposited on a conventional working electrode providing a carbon film electrode (CFE) 6. It was designed as a film containing some conductive particles (the carbon ones in this case) incorporated in an insulating matrix of a polymer covering a surface of any solid electrode. Solid electrode serves here only as a conductor and electrochemical properties of the CFE thus depend entirely on the character of conductive particles. This concept is mainly profiting from the possibility of an easy renewability of the film (electrochemically active surface of the electrode). The film can be easily removed by wiping it off by a filter paper and reformed by immersing the electrode surface into the carbon ink created from a carbon powder homogenously mixed with some polymer dissolved in a solvent in an exact ratio. Renewing the film is a way how to eliminate the influence of the electrode history completely, however, electrochemical regeneration on the film is also applicable to receive better repeatability of measurement. Regarding the preparation of the carbon ink, the density of carbon material is relatively low and just appropriate in order to create a homogenous mixture (heavier particles would sediment). 27

30 This work aims at developing direct current voltammetric (DCV) and differential pulse voltammetric (DPV) methods for the determination of trace amounts of genotoxic 5-NBIA using CFE. Exprimental Reagents 5-NBIA (98%, CAS Name: 5-nitrobenzimidazole, CAS Registry number: ) was supplied by Sigma Aldrich in the form of nitrate. A mol L 1 stock solution was prepared by dissolving an exactly weighed amount of the substance in water. Diluted solutions were prepared by exact dilution of the stock solution. The solutions were stored in refrigerator. The dilute solutions were prepared every day. The Britton-Robinson (BR) buffer solutions were prepared in a usual way by mixing a 0.04 mol L 1 solution of phosphoric acid, acetic acid and boric acid with an appropriate amount of 0.2 mol L 1 sodium hydroxide, using analytical-reagent grade chemicals obtained from Merck. Deionized water was produced by Milli-Q Plus system, Millipore. The carbon film containing 0.01 g of polystyren, 0.09 g of carbon powder CR2 with particle sizes 2 μm (Maziva Týn, Týn nad Vltavou, Czech Republic) and 0.5 ml 1,2-dichlorethane (Merck, Darmstadt, Germany) was prepared. This mixture was homogenized for five minutes on Vortex Genie 2 (Scientific Industries, USA). Apparatus Voltammetric measurements were carried out using an Eco-Tribo Polarograph driven by Polar Pro 5.1 software (all Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic). The software worked under the operational system Microsoft Windows XP (Microsoft Corporation). All measurements were carried out in a three-electrode system using a platinum electrode PPE (Monokrystaly, Turnov, Czech Republic) as an auxiliary electrode and a silver/silver chloride electrode RAE 113 (3 mol L 1 KCl, Monokrystaly, Turnov, Czech Republic) as a reference electrode. As a working electrode, polished silver solid amalgam electrode (the disc diameter, 0.5 mm) modified by carbon film was used. For both DCV and DPV, a scan rate 20 mv s 1 was used and, moreover, for DPV, a pulse amplitude 50 mv and a pulse width 100 ms were used. Procedures For voltammetric measurements, an appropriate amount of 5-NBIA stock solution was measured into a voltammetric vessel and filled up to 10 ml with BR buffer of appropriate ph. Oxygen was removed from the measured solutions by bubbling with nitrogen for five minutes. All curves were measured 3 times. At the beginning, p-agsae was polished on the alumina with particle size 1.1 μm. The film was formed by immersing the electrode surface in the conductive ink (the active part of the electrode just touched the surface of the ink). Two minutes after immersing, 1,2-dichloroethane evaporates and the film, resp. the electrode is ready to use. When it is necessary to renew the old film (for example because of the passivation), it can be easily removed by wiping it off with a filter paper. The regeneration was carried out by periodical switching every 0.1 s between potentials 100 mv and 900 mv during 30 s. Regeneration always ended at a more negative potential. Drinking water from the public water pipe line in the building of Faculty of Science of the Charles University in Prague, spiked with appropriate amounts of stock solutions of test compounds, were used as model samples. The procedure for the DPV determination of 28

31 5-NBIA in the model samples was as follows: 9.0 ml of a model water sample were diluted to 10.0 ml with 0.01 mol L 1 and, after deaeration with nitrogen, DP voltammograms were recorded. The parameters of calibration curves (e.g., slope, intercept, limit of determination) were calculated using statistic software Adstat which uses confidence bands ( = 0.05) for calculation of the limit of determination (L Q ). It corresponds to the lowest signal for what relative standard deviation is equal 0.1 (ref. 7 ). Results and discussion Initially, the influence of ph on DCV and DPV curves (see Fig. 2) of mol L 1 5-NBIA at CFE was investigated in BR buffer with ph values from 2.0 to NBIA yielded one cathodic peak over the whole ph region and, with the increasing ph value, second peak appeared at more negative potential at ph from 7.0 to I (na) ph2 ph3 ph4 ph5 ph6 ph7 ph8 ph9 ph10 ph11 ph Fig 2. DP voltammograms of 5-NBIA (c = polarization rate 20 mv s E (mv) mol L 1 ) at CFE in the BR buffer; -600 I (na) I p (na) c ( mol/l) E (mv) -700 I (na) I -120 p (na) c ( mol/l) E (mv) Fig 3. DC and DP voltammograms of 5-NBIA at CFE in BR buffer ph 7.0, c 5-NBIA = 0 (0), 2 (1), 4 (2), 6 (3), 8 (4), and 10 µmol L 1. The corresponding calibration straight lines are given in the insets. 29

32 Like the best ph for following measurement was selected ph 7.0. Then, DCV and DPV calibration curves were measured over concentration ranges (2 10) 10 7, (2 10) 10 6, and (2 10) 10 5 mol L 1 for 5-NBIA at CFE (see Fig. 3). The parameters of the calibration curves obtained are summarized in Table I. Table I. Parameters of the calibration straight lines for the determination of 5-NBIA in BR buffer ph 7.0 using DCV and DPV at CFE. Method Concentration Slope Intercept (mol L 1 ) (na mol 1 L) (na) R L Q (mol L 1 ) (2 10) DCV (2 10) (2 10) (2 10) DPV (2 10) (2 10) In order to verify practical applicability of the developed DCV and DPV methods, the determination of 5-NBIA was carried out in model samples of drinking and river water in a submicromolar concentration range under optimum conditions. Calibration curves were measured in a mixture of 9.0 ml of a spiked model water sample and 1.0 ml of BR buffer ph 7.0. DP voltammograms of 5-NBIA in spiked drinking and river water in the concentration range of µmol L 1 are depicted in Fig. 4. The parameters of the calibration curves obtained are summarized in Table 2. These results confirm the possible application of tested electrode for the determination of micromolar concentrations of substance under investigation in drinking and river water I (na) I p (na) c ( mol/l) I (na) I p -100 (na) c ( mol/l) E (mv) E (mv) Fig 4. DP voltammograms of 5-NBIA at CFE in model samples of drinking (A) and river (B) water, c 5-NBIA = 0 (0), 2 (1), 4 (2), 6 (3), 8 (4), and 10 µmol L 1. The corresponding calibration straight lines are given in the insets. Conclusion It has been demonstrated that a carbon film electrode (CFE) represents suitable non-toxic alternative to the traditional mercury electrodes. This electrode, combined with direct current 30

33 voltammetry or differential pulse voltammetry, is suitable sensor for the determination of submicromolar concentrations of 5-nitrobenzimidazole. It provides stable and reproducible responses during measurements within one concentration range by DCV and DPV techniques. The applicability of the electrode for determination of 5-nitrobenzimidazole in model samples of drinking and river water has also been verified. Therefore, this electrode should be preferred for practical applications. Table II. Parameters of the calibration straight lines for the determination of 5-NBIA in model samples waters using DCV and DPV at CFE. Water Method Concentration Slope Intercept (mol L 1 ) (na mol 1 L) (na) R L Q (mol L 1 ) Drinking DCV (2 10) DPV (2 10) River DCV (2 10) DPV (2 10) Acknowledgement This research was supported by The Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (MSM ), by the Charles University in Prague (SVV ) and by The Grant Agency of the Czech Republic (P206/12/G151). Literatura 1. Barek J., Cvacka J., Muck A., Quaiserova V., Zima J.: Electroanalysis 13, 779 (2001). 2. Canterford D. R.: J. Photogr. Sci. 26, 65 (1978). 3. Popova A., Christov M., Raicheva S., Sokolova E.: Corr. Sci. 46, 1333 (2004). 4. Rosenkranz H. S., Karol M. H.: Mutat. Res. 431, 81 (1999). 5. Boyd A. S., Seger D., Vannucci S., Langley M., Abraham J. L., King L. E.: J. Am. Acad. Dermatol. 43, 81 (2000). 6. Yosypchuk B., Barek J., Fojta M.: Electroanalysis 18, 1126 (2006). 7. Meloun M., Militky J., Forina M.: Chemometrics for Analytical Chemistry, PC-Aided Regression and Related Methods, Vol. 2, p Ellis Horwood, Chichester

34 Voltammetric Determination of 3-Nitrobiphenyl on Meniscus Modified Silver Solid Amalgam Electrode (Voltametrické stanovení 3-nitrobifenylu na meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrodě) Jan Fischer a, Genovefa Tsimogianni b, Vlastimil Vyskočil a, Anastasios Economou b, and Jiří Barek a a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, Praha 2, Czech Republic, jan.fischer@natur.cuni.cz b Laboratory of Analytical Chemistry, Department of Chemistry, University of Athens, Athens 15771, Greece, aeconomo@chem.uoa.gr Abstract Voltammetric determination of 3-nitrobiphenyl was studied using DC voltammetry (DCV) and differential pulse voltammetry (DPV) at a meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-agsae). Optimal conditions were found for its determination by DCV and DPV on m-agsae in mixture Britton-Robinson (BR) buffer ph 6 an methanol (MeOH) in ratio 4:1 within the concentration range mol L -1. Key Words: 3-Nitrobiphenyl, DC voltammetry, Differential pulse voltammetry, Meniscus modified silver solid amalgam electrode Introduction Nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons (NPAH) are well known suspicious or proven chemical carcinogens which can be found in incinerators emissions, exhaust gases, fossil fuel combustion products and cigarette smoke or in natural waters, river sediments, river water and food. There is an ever-growing demand for new and more sensitive analytical methods for the determination of this kind of substances 1. Electrochemical methods, such as voltammetry are especially suitable for the determination of nitrated chemical carcinogens since they are inexpensive and sensitive 2. The meniscus-modified silver solid amalgam electrode (m- AgSAE) is suitable for the determination of electrochemically reducible carcinogens since it is based on the non-toxic solid amalgam so it can be applied where the work with traditional electrodes with liquid mercury is forbidden or undesirable. Experimental All reagents were of analytical grade. A stock solutions of mol L -1 3-nitrobiphenyl was prepared by dissolving g of the substance (C. A. S. Registry Number: [ ]; 99%, Sigma-Aldrich, Germany) in 50 ml of deionized water. Britton Robinson buffer was used as a supporting electrolyte. Methanol was from Merck (Germany), deionized water was produced by a Milli-Q plus system. Other chemicals were obtained from Lachema Brno (Czech Republic) in p.a. purity. All the chemicals were used without any further purification. Voltammetric experiments were performed using computer controlled Eco-Tribo Polarograph. The working electrode was meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-agsae). The polished silver solid amalgam electrode was immersed into a small volume of liquid mercury and agitated for 15 seconds to form m-agsae. This process, denoted as amalgamation, was repeated every week. Before starting the experiment for each new surface of m-agsae the electrochemical activation was carried out in 0.2 mol L -1 KCl at 2200 mv under stirring of the solution for 300 s followed by rinsing with distilled water. Work with m-agsae was carried out at a scan rate of 20 mv.s -1, pulse amplitude of 50 mv, pulse 32

35 duration of 100 ms, sampling time of 20 ms beginning 80 ms after the onset of the pulse and interval between pulses of 100 ms. In the case of electrode passivation, a short electrochemical regeneration of m-agsae lasting about 30 s preceded each measurement. The regeneration was carried out by periodical switching every 0.1 s between potentials 100 mv more positive (E reg1 ) than the potential of hydrogen evolution and 100 mv more negative (E reg1 ) than the potential of amalgam dissolution and in the given base electrolyte. Results and discussion As the first step of method s optimization, the effect of ph in range 2 12 of Britton - Robinson buffer to sensitivity of voltammetric determination of 3-nitrobiphenyl was investigated. Because of low solubility of the substance it was necessary to work in the presence of 20% MeOH. For further measurements ph 6 was used where the substance gave well developed wave/peak for the both voltammetric techniques, DCV and DPV. Afterwards, repeatability of measurements at m-agsae was checked. For DPV the repeatability was on acceptable level, but for DCV at ph 6 was necessary to use regeneration of electrode surface using potentials 130 mv (E reg1 ) and 1640 mv (E reg2 ), see in Fig. 1. Found optimal conditions were used for measuring calibration dependences in the concentration range from to mol L -1 with DCV and from to mol L -1 with DPV. According to obtained results, DPV seems to be more sensitive and gives more linear calibration curves then DCV, see in Table I I w, na Number of Measurements Fig. 1. Dependence of wave current of 3-nitrobiphenyl (c = 10-4 mol L -1 ) on serial number of repetitive measurements using DCV at m-agsae in mixture Britton-Robinson buffer ph 6.0 and MeOH (4:1). Measurement without regeneration (1) and with regeneration (2) at potentials E reg1 = 130mV and E reg2 = 1640mV. Table I. Comparison of developed methods for determination of 3-nitrobiphenyl in mixture Britton- Robinson buffer ph 6.0 and MeOH (4:1) on m-agsae. Method Regeneration Calibration range, mol L -1 LOD, mol L -1 DCV E reg1 = 130mV, E reg2 = 1640mV DPV not necessary

36 Conclusions Newly developed methods could be applied for the determinations of 3-nitrobiphenyl in simple environmental matrix like of drinking and river. The m-agsae in combination with electrochemical regeneration showed good response towards 3-nitrobiphenyl with good reproducible results without any surface passivation. This indicated that m-agsae is a suitable sensor for the determination of micromolar concentrations of this substance. The limit of determination was on micromolar level for both used voltammetric techniques and sensitivity of these methods could be further increased by a preconstruction step 3. Acknowledgements Financial support from Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (project MSM ), from Charles University (project UNCE 2012/44), and from the Grant Agency of the Czech Republic (project P206/10/P087) is gratefully acknowledged. References 1. Barek J., Moreira J. C., Zima J.: Sensors 5, 148 (2005). 2. Vyskocil V., Barek J.: Curr. Org. Chem. 15, 3059 (2011). 3. Barek J., Cabalkova D., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Environ. Chem. Lett. 9, 83 (2011). 34

37 Next Generation of Electrochemically Active Labels for DNA Analysis. How to Utilize Electrochemical Conversions for the Improvement of Signal Resolution (Další generace elektroaktivních značek pro analýzu DNA: jak využít elektrochemických přeměn k lepšímu rozlišení voltametrických signálů) Miroslav Fojta a, Luděk Havran a, Hana Pivoňková a, Pavlína Vidláková a, Petr Orság a, Medard Plucnara a, Petra Horáková a, Veronika Raindlová b, Jana Balintová b, and Michal Hocek b a Institute of Biophysics of the AS CR, v.v.i., Kralovopolska 135, Brno, Czech Republic b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo nam. 2, Prague 6, Czech Republic, fojta@ibp.cz Abstract Novel types of electroactive DNA labels have been introduced and applied in electrochemical DNA sensing. We demonstrate an easy detection of organic oxygenous or nitrogenous functional groups attached to DNA, such as anthraquinone (AQ), formyl, hydrazone, aromatic moieties bearing various numbers of nitro groups and furazane heterocycle. Discrimination between redox tags giving electrochemical signals at close potentials (such as AQ and nitrophenyl), as well as discrimination between intrinsic and extrinsic moieties in labeled DNAs (such as guanine and AQ), can be improved via their controlled in situ electrochemical conversion. Key Words: DNA electrochemistry, DNA modification, Redox labels, DNA hybridization, Nucleobase coding. Introduction Nucleic acids have been reported to possess intrinsic electrochemical activity due to electrochemically reducible or oxidizable nucleobases, and a number of label-free electrochemical DNA assays and sensors have been designed 1. Labelling of DNA with electroactive moieties represents a convenient way to more specific and more sensitive electrochemical detection in applications related to sequence-specific DNA sensing, including DNA hybridization, detection of single nucleotide polymorphisms, as well as in some techniques of DNA damage sensing 2-3. Combination of several redox tags differing in their redox potentials (and/or character of electrode process they undergo) allows parallel analysis of multiple nucleotide sequences or specific coding of individual nucleotides. In our previous work we proposed 2 a palette of DNA tags producing electrochemical signals distinguishable from each other as well as from intrinsic DNA (nucleobase) signals. Quite recently we extended possibilities of DNA labelling and electrochemical detection by novel types of labels and analytical procedures to improve versatility of the approach. Experimental Labeled single-stranded oligonucleotides were prepared through primer extension incorporation of modified deoxynucleotide triphosphates (dntps; for more details see 4 ) and the following magnetoseparation procedure: reaction mixture (50 μl) was added to DBS tv [25 μl of the stock solution washed three times by 150 μl of buffer (0.3 M NaCl, 10 mm TRIS, ph = 7.4)]. After binding (30 min at room temperature on shaker), the DBS tv were washed three times with 200 μl of PBS solution (0.14 M NaCl, 3 mm KCl, 4 mm sodium phosphate, ph = 7.4) with 0.01% Tween 20 and then three times by 200 μl of buffer (0.3 M NaCl, 10 mm TRIS, ph = 7.4) and finally by ddh2o (200 μl). Labeled single-strands were released by shaking and heating the sample at 75 C for 2 min. 35

38 Electrochemical analysis: PEX products were analysed by ex situ (adsorptive transfer stripping) cyclic voltammetry (CV). The oligonucleotides were accumulated 60 s from 5 L aliquots containing 0.2 M NaCl at the surface of the working electrode (hanging mercury drop electrode, HMDE, or basal-plane pyrolytic graphite electrode, PGE). The electrode was then rinsed with deionized water and placed in the electrochemical cell. CV settings: scan rate 0.5 V/s, initial potential 0.0 V, for switching and final potentials see Results and discussion and figure legends. Background electrolyte: 0.5 M ammonium formate, 0.05 M sodium phosphate, ph 6.6 (for measurements at HMDE) or 0.2 M sodium acetate ph 5.0 (for measurements at PGE). All measurements were performed at room temperature using an Autolab analyzer (Eco Chemie, The Netherlands) in connection with VA-stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland) and a three-electrode system with Ag AgCl 3M KCl electrode as a reference and platinum wire as an auxiliary electrode. Results and discussion Our previous work resulted in application of several electroactive DNA tags [such as ferrocene, nitro- and aminophenyl, M(bpy) 3 complexes of Ru or Os, 7-deazaguanine] 2 available in the form of base-modified dntp conjugates and incorporable by DNA processing enzymes such as DNA polymerases or terminal deoxynucleotidyl transferase, etc.). Facile distinction among these labels has been attained through different redox potentials at which these moieties are reversibly or irreversibly reduced or oxidized. More recently we have introduced next generation of electroactive DNA labels 5. Our experiments revealed an easy detection of various oxygenous or nitrogenous functional groups attached to DNA or nucleic acids components, including formyl (via reduction of C=O double bond), hydrazone (C=N), nitro derivatives bearing various number of nitro groups and yielding characteristic signal patterns, and furazane heterocycle representing a quite novel electroactive label giving very sensitive signal due to 6-electron reduction, via their electroreduction at mercury or carbon electrodes. Albeit the aldehyde and hydrazone groups are rather reactive and/or unstable to serve, by themselves, as electroactive labels for biosensing applications, their specific electrochemical properties can be used for monitoring of the preparation of functionalized DNA to attach further electroactive tags 5. Improved resolution of analytical signals conferred by intrinsic and extrinsic moieties in chemically modified DNAs can be also attained through their controlled electrochemical conversion into products exhibiting electrochemical properties distinct from that of the original forms. For example, anthraquinone (AQ) produces at mercury-based electrodes a reversible pair of peaks around -0.4 V. Close to the hydroquinone oxidation potential, a peak due to guanine occurs which can be observed only when the electrode is prepolarized to potentials -1.6 V to convert guanine to 7,8-dihydroguanine, which is in turn anodically oxidized back to guanine around -0.3 V. On the other hand, such negative polarization switches off the AQ/AQH 2 couple due to reductive destruction of the AQ moiety. Thus, both signals can be detected without mutual interference in two consecutive potential cycles, the first between 0 and -1.0 V (to observe AQH 2 oxidation) and the other between 0 and V (to observe the guanine peak, Fig. 1). Another tag used recently as a DNA label, nitrophenyl (PhNO 2 ), is irreversibly reduced with four electrons to hydroxylamine (NHOH) close to -0.5 V (inset in Fig. 1). When PhNO 2 is combined with AQ, their reduction signals overlap considerably. On the other hand, using the AQ anodic peak and a peak due to NHOH reversible oxidation close 0 V, one can easily measure both signals independently. 36

39 I [ A] I [ A] st scan 2 nd scan AQH 2 ox G st scan 2 nd scan AQ red NHOH ox NO 2 red NO red -0.5 CA E [V] E [V] Fig. 1. Two successive cyclic voltammograms of AQ-labeled PEX product measured at HMDE. Dashed curve was measured first with switching potential at 1.0 V. Then, the solid curve was measured with switching potential V without the electrode renewal (i.e. with the same adsorbed DNA layer). Inset: Ex situ CVs responses of PhNO 2 labeled PEX product at HMDE. Two consecutive scans at the same HMDE; initial potential V, switching potential -0.7 V. For other conditions see Experimental. Conclusion Labeling of DNA with electrochemically active moieties proved to be a convenient way to development of electrochemical bioassays and biosensors for the analysis of nucleotide sequences. Through combinations of various labels differing in redox potentials and through controlled in situ electrochemical conversions of specific intrinsic and extrinsic DNA components, highly specific electrochemical analysis of DNA sequences can be attained. Electrochemical techniques have also been applied as a potent tool for monitoring of preparation of functionalized DNA and its subsequent post-modification. Acknowledgment Financial support from The Czech Science Foundation GACR (project P206/12/G151) and GA ASCR (IAA ) is gratefully acknowledged. References 1. Paleček E., Bartošík M.: Chem Rev 112 (2012), published ASAP - DOI: /cr200303p. 2. Hocek M., Fojta M. Chem. Soc. Rev. 40, 5802 (2011). 3. Fojta M., Havran L., Pivonkova H., Horakova P., Hocek M.: Curr. Org. Chem. 15, 2936 (2011). 4. Balintova J., Pohl R., Horakova P., Vidlakova P., Havran L., Fojta M., Hocek M.: Chem- Eur. J. 17, (2012). 5. Raindlová V., Pohl R., Klepetářová B., Havran L., Šimková E., Horáková P., Pivoňková H., Fojta M., Hocek M.: ChemPlusChem, accepted. 37

40 Electrochemistry of Potential Eu MRI Complexes (Elektrochemie potenciálních MRI komplexů europia) Miroslav Gál a, Romana Sokolová a and Filip Kielar b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, miroslav.gal@jh-inst.cas.cz b Department of Chemistry, Duke University, Box 90354, Durham NC, USA Abstract Properties of the several potential contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI) with Eu(III)/Eu(II) redox couple were investigated by means of the electrochemical methods. Cyclic voltammetry, phase sensitive AC voltammetry, and DC polarography were utilized to elucidate the mechanism of the reduction/oxidation of Eu ion in the presence of these compounds. Moreover, the stability constants of the Eu(II)-MRI agent complexes were also determined. Some suggestions on the chemical structure of the potential contrast agents for MRI are also made. Key words: Contrast agent, MRI, Cyclic voltammetry, Reaction mechanism, Cyclodextrin, Poly(aminocarboxylate) ligands. Introduction The electrochemical behavior of biologically active compounds has been in the focus of interest for many years The predominant stability of the Eu(III) oxidation state for all lanthanide ions is well known. The Eu(III)/Eu(II) reduction has been studied both by means of calorimetry and electrochemistry. Several reports have dealt with the redox kinetics of the europium aqua ion at various electrode materials and with different supporting electrolytes As reported by Weaver et al., the Eu(III) aq / Eu(II) aq couple shows a small heterogeneous electron transfer rate constant, which results in a chemically reversible and electrochemically irreversible process 18. The reduction of europium seems to be an interesting problem because of its exceptional electronic structure. As pointed out in many papers numerous conflicting results have been published concerning the reduction mechanism of europium Recently, the interest in this class of compounds has been stimulated by the current research in contrast media for magnetic resonance imaging (MRI) 24. New applications are under evaluation which requires paramagnetic probes whose response is a controlled function of a well-defined biochemical parameter 25. A very efficient system could be provided by Eu(III)/Eu(II) complexes, for which relaxivities analogous to Gd(III), the typical metal used for traditional CA, would be expected for the lower oxidation state. Toth and co-workers have pioneered the investigation of the relaxometric and structural properties of Eu(II) complexes in aqueous solution 26. Here, we report a study of the electrochemical behavior of several Eu complexes with ligands with the aim of improving our understanding of the general properties of this class of compounds in view of their potential future applications in biomedical studies. Experimental The ligands diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA), 1,4,7,10,13,16- hexaazacyclooctadecane (HEXACYCLEN), 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane (CYCLAM), 1,4,7,10-Tetraazacyclododecane (DOTA), α, β-cyclodextrin, respectively and EuCl 3.6 H 2 O were purchased from Aldrich. The stock solution of the Eu(III) aqua-ion was prepared by dissolving EuCl 3.6H 2 O in distilled water. The complexes have been prepared by mixing of desire amounts of the Eu aqua-ion and of the ligand, at ph 6.5, and by stirring the resulting aqueous solution for about 1 h to ensure complete complexation. 38

41 Electrochemical measurements were performed using AUTOLAB instrument PG STAT 30 equipped with FRA2 module (ECO Chemie, The Netherlands). An electrochemical data from cyclic voltammetry (CV) and DC polarography were analyzed using AUTOLAB software. A three electrode electrochemical cell was used for all experiments. The reference electrode (RE), Ag AgCl 1 M LiCl, was separated from the test solution by a salt bridge. The working electrode (WE) was a valve-operated static mercury drop electrode (VA Stand 663, Metrohm). The counter electrode (CE) was a platinum sheet with area approximately 200 times higher than that of WE. Total volume of the measured solution was 10 ml. All measurements were carried out in the physiological solution at 25 ± 1 C. Results and discussion The aim of this work is to determine the stability of Eu(II) with several chelators using electrochemical methods (mentioned above). Another point is to elucidate the redox mechanism of Eu in the presence of chelators. The molecules of CD form truncated cones which allow them to accommodate guest molecules selectively according to their size and polarity. For our study -cyclodextrin and -cyclodextrin, respectively were chosen. In the pure 0.1 M KCl well-developed DC reduction wave of Europium(III) at about V vs. RE was obtained. After addition of -cyclodextrin to the solution of Eu(III) the slight shift of the reduction half-wave potential of the Eu-β-CD complex to the more negative values is observed (Fig.1). However, the limiting current remains almost the same. The logarithmic analysis of Eu-β-CD complex with 58 mv slope (inset of Fig. 1) confirms one electron reduction process of Eu(III)-β-CD to complex Eu(II)-β-CD. The slope of the shift of the half-wave potential of the reduction Eu(III) to Eu(II) in the presence of various β-cd concentrations was found to be 26 mv/decade. The reduction process is controlled by dissociation of complex. From the dependence of half-wave potential on the concentration of ligand is possible determine stability constant and stoichiometry of complex. The height of polarographic wave of europium remains the same at the presence of -cyclodextrin. The cyclic voltammetry measurements were carried out in the solution containing of M EuCl 3, 0.1 M KCl and different -cyclodextrin concentrations. One cathodic peak and two anodic peaks were observed. Each of them increases with increasing concentration of Eu. It was found that the potential of cathodic peak is moved to the negative values with increasing concentration of -cyclodextrin. The limiting process is dissociation of complex Eu(III)- -CD. Complex of europium is probably formed by interactions with oxygen bridges of the cyclodextrin. The adsorption of of -CD can be excluded. The dependence of cathodic current on the scan rate v 1/2 is linear and that indicate that the process is diffusion-controlled. 39

42 i / A log [ i / ( id - i ) ] E / V E / V Fig.1. Polarographic waves of M Eu(III) in 0.1 M KCl at the presence of -cyclodextrin at concentration: 0; M; M; * M. Inset: the logarithmic analysis of DC polarograms. Similar mechanism of Eu reduction/oxidation can be observed in the case of other chelators utilized in this work. It is clear, that other peaks, which correspond to the reduction of the respective electrochemically active groups, are also visible. In some cases (α-cd, Hexacyclen ) the adsorption of the complexes plays the important role in the redox mechanism. However, none of these phenomena influences the overall stability of the respective Eu complexes. The big difference is observed in the stability of the Eu complexes (see Fig. 2). K / M a-cd b-cd Cyclam HEXACYCLEN DTPA DOTA Fig.2. The stability constant of Eu(II)-chelator complexes. Conclusion The Eu(II) complexes with acyclic poly(aminocarboxylic) ligands are characterized by lower stability constants than the corresponding Eu(III) complexes. The K values increase with denticity. The more oxygen and nitrogen atoms are presented in the chelators structure, the 40

43 more stable is the final complex. However, the relative stability of Eu(II) vs. Eu(III) complexes is lower probably as a consequence of the increase of the overall negative charge that stabilizes preferentially the harder metal ion. To summarize, a potential use of the Eu(III)/Eu(II) redox couple as a diagnostic probe in living systems requires some structural modification of ligands to stabilize preferably the lower oxidation state of Eu. Acknowledgement This work was supported by the Grant Agency of the Czech Republic (203/09/1607). Literature 1. Hromadova M., Pospisil L., Fanelli N., Giannarelli S.: Langmuir 21, 1923, (2005). 2. Ramesova S., Sokolova R., Degano I., Bulickova J. et. al: Anal. Bioanal. Chem. 402, 975, (2012). 3. Sokolova R., Degano I., Ramesova S., Bulickova J. et. al: Electrochim. Acta 56, 7421, (2011). 4. Hromadova M., Kolivoska V., Gal M., Pospisil L. et. al: J. Incl. Phenom. 70, 461, (2011). 5. Gal M., Sokolova R., Kolivoska V., Turonova A. M. et. al: Collect. Czech. Chem. Commun. 76, 1607, (2011). 6. Gal M., Kolivoska V., Ambrova M., Hives J. et. al: Collect. Czech. Chem. Commun. 76, 937, (2011). 7. Gal M., Hromadova M., Pospisil L., Hives J. et. al: Bioelectrochemistry 78, 118, (2010). 8. Pospisil L., Hromadova M., Gal M., Bulickova J. et. al: Carbon 48, 153, (2010). 9. Pospisil L., Teply F., Gal M., Adriaenssens L. et. al: Phys. Chem. Chem. Phys. 12, 1550, (2010). 10. Gal M., Hives J., Sokolova R., Hromadova M. et. al: Collect. Czech. Chem. Commun. 74, 1571, (2009). 11. Shults W. D.: Anal. Chem. 31, 1095, (1959). 12. Kolthoff I. M.,.Coetzee J. F.: J. Am. Chem. Soc. 79, 1852, (1957). 13. Coetzee J. F.,.Siao W. S.: Inorg. Chem. 2, 14, (1963). 14. Coetzee J. F., Mcguire D. K., Hedrick J. L.: J. Phys. Chem. 67, 1814, (1963). 15. Gaur J. N.,.Zutshi K.: J. Electroanal. Chem. 11, 390, (1966). 16. Chlistunoff J.,.Galus Z.: J. Electroanal. Chem. 193, 175, (1985). 17. Hush N. S.,.Dyke J. M.: J. Electroanal. Chem. 53, 253, (1974). 18. Yee E. L., Cave R. J., Guyer K. L., Tyma P. D. et. al: J. Am. Chem. Soc. 101, 1131, (1979). 19. Gierst L.,.Cornelissen P.: Collect. Czech. Chem. Commun. 25, 3004, (1960). 20. Vlcek A. A.: Chem. Listy 52, 214, (1958). 21. De Kreuk C. W., Sluyters-Rehbach M., Sluyters J. H.: J. Electroanal. Chem. 28, 391, (1970). 22. Niki K.,.Mizota H.: J. Electroanal. Chem. 72, 307, (1976). 23. Ikeda O., Tsuura K., Tamura H.: B. Chem. Soc. Jpn. 54, 661, (1981). 24. Kielar F., Tei L., Terreno E., Botta M.: J. Am. Chem. Soc. 132, 7836, (2010). 25. Parker D., Dickins R. S., Puschmann H., Crossland C. et. al: Chem. Rev. 102, 1977, (2002). 26. Toth E., Burai L., Merbach A. E.: Coordin. Chem. Rev. 216, 363, (2001). 41

44 Electrochemical Analysis of Terminal Deoxynucleotidyl Tranferase Reaction Products (Elektrochemická analýza produktů terminální deoxynukleotidyl transferázy) Luděk Havran a, Vlastimil Tichý a, Jan Špaček a, Hana Macíčková-Cahová b, Petra Horáková a, Hana Pivoňková a, Miroslav Fojta a, and Michal Hocek b a Institute of Biophysics of the ASCR v.v.i., Královopolská 135, Brno, Czech Republic, raven@ibp.cz b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry ASCR v.v.i., Flemingovo nám. 2, Prague 6, Czech Republic Abstract For application of electrochemical approaches in analysis of DNA sequences or interactions it is convenient to use DNA probes containing electroactive tags. Using terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT) reaction is one from methods for preparing such probes. TdT is an enzyme attaching nucleotides at the 3 -OH terminus of DNA using dntps as substrates. Not only natural dntps, but also chemically modified dntps bearing different electroactive groups can be used as substrates of TdT. This contribution brings new information on the electrochemical behavior of TdT tailing reaction products containing attached natural nucleosides, deaza analogs of purine nucleosides, and selected chemically modified nucleosides. Key Words: Labelling of DNA, Electrochemical DNA sensors, Terminal deoxynucleotidyl tranferase. Úvod Nukleové kyseliny jsou přirozeně elektroaktivní látky poskytující řadu vlastních elektrochemických signálů na různých typech pracovních elektrod 1. V případě konstrukce elektrochemický senzorů hybridizace DNA je výhodné pracovat s DNA značenou elektroaktivní značkou. Inkorporace nukleosidtrifosfátů (dntp) nesoucích různé elektroaktivní skupiny pomocí DNA polymeráz je v současnosti jednou z často používaných metod pro přípravu takto značené DNA 2. Další metodou, vhodnou zvláště pak pro přípravu koncově značených oligonukleotidů používaných jako signální sondy v DNA hybridizačních senzorech, je inkorporace značených dntp pomocí terminální deoxynukleotidyl transferázy (TdT). TdT je enzym, který prodlužuje 3 -OH konec DNA 3. Jako substrát mohou být použity jak přirozené dntp, tak i dntp značené různými elektroaktivními skupinami. Takto značené ODN mohou být použity jak pro analýzu nukleotidových sekvencí, tak i pro studium interakcí DNA s proteiny 4. V tomto příspěvku budou prezentovány výsledky elektrochemické analýzy produktů TdT reakce, které obsahují přirozené nukleosidy, deaza analogy purinových nukleosidů nebo chemicky modifikované nukleosidy. Elektrochemické chování těchto produktů TdT reakce bude studováno v závislosti na typu inkorporovaného nukleosidu a struktuře prodlouženého segmentu. Experimentální část TdT (New England Biolabs) reakce byla prováděna 60 minut za teploty 37 o C. Jako substráty byly použity přirozené dntp, 7-deaza-dGTP (dg*tp) (Obr.1A) a 3-nitrofenyl-7-deaza-dGTP (dg NO2 TP) (Obr.1B). Produkty enzymatické reakce byly z reakční směsi izolovány pomocí magnetických mikrokuliček nesoucích oligo dt řetězce (Invitrogen, USA). dg NO2 TP byl připraven pomocí Suzukiho cross-coupling reakce 7-I-7-deaza-dGTP s 3-nitrofenylboronovou 42

45 kyselinou ve vodném prostředí. Produkty TdT reakce byly analyzovány na visící rtuťové kapkové elektrodě (HMDE) a elektrodě z pyrolytického grafitu (PGE) za použití různých voltametrických technik. Všechna voltametrická měření byla prováděna pomocí potenciostatu/galvanostatu Autolab (Metrohm-Autolab, Holandsko) a elektrodového systému 663 VA-stand (Metrohm, Švýcarsko) v tříelektrodovém zapojení. Jako referenční elektroda byla použita Ag/AgCl/3M KCl a jako pomocná elektroda platinový drát. A HN O B HN O NO 2 H 2 N N N H 2 N N N O O O O O O HO P O OH P O OH P O OH O HO P O OH P O OH P O OH O OH OH Obr. 1. Strukturní vzorce dg*tp (A) a dg NO2 TP (B). Výsledky a diskuze Pomocí TdT byl prodloužen modelový ODN A25. V závislosti na použitém substrátu (dgtp, dttp, dg*tp) byly při jeho studiu aplikovány různé voltametrické techniky. Pro analýzu produktů obsahujících oligo dg a oligo 7-deaza-dG (G*) řetězce byla použita adsorptivní přenosová rozpouštěcí voltametrie s vnuceným pravoúhlým napětím (AdTS SWV) na PGE. Takto byly měřeny signály oxidace G a G* (Obr. 2A). Pro analýzu produktů obsahujících pouze oligo G řetězce byla také použita adsorptivní přenosová rozpouštěcí cyklická voltametrie (AdTS CV) na HMDE, kde byl měřen G pík (signál vznikající v důsledku oxidace redukčního produktu G na HMDE) (Obr. 2Ai). V případě produktů TdT reakce se směsí dgtp a dttp bylo pro analýzu použito značení thyminových zbytků komplexy oxidu osmičelého 5 a jejich následné analýzy na PGE pomocí AdTS SWV (Obr. 2B). Ze získaných výsledků vyplývá, že studovaná enzymatická reakce je ovlivněna jak koncentrací použitého substrátu, tak také jeho typem. Například, pokud je modelový ODN A25 prodlužován dgtp dochází k prodloužení pouze o několik nukleosidů, zatímco je-li substrátem dg*tp dochází k významnému nárůstu délky řetězce. Vzhledem k tomu, že úseky DNA bohaté na guanin tvoří G-tetraplexy (na rozdíl od DNA úseku bohatých na 7-deaza-guanin), může v tomto případě tvorba těchto alternativních sekundárních struktur DNA silně ovlivňovat průběh enzymatické reakce. Dále bylo použito prodlužování oligonukleotidových řetězců pomocí TdT k přípravě ODN značených nitrofenylem. dg NO2 TP se ukázal jako vhodný substrát pro TdT. Připravené koncově značené ODN, pak byly používány jako signální sondy pro elektrochemickou detekci hybridizace DNA a také pro studium interakce DNA s proteinem p53. 43

46 Obr. 2. A) AdTS SWV záznamy A25 prodlouženého TdT reakcí se 7 M dgtp (plná čára), neprodloužená kontrola (čárkovaná čára). PGE, E i = 0.2 V, E end = 1.6 V, amplituda 25 mv, frekvence 200 Hz, elektrolyt: 0,2 M acetátový (ph 5,0), ta = 60s. i) AdTS CV záznamy A25 prodlouženého TdT reakcí se 7 M dgtp (plná čára), neprodloužená kontrola (čárkovaná čára). HMDE, E i = 0 V, E sw = V, rychlost scanu 1 V/s, elektrolyt: 50mM fosfátový pufr + 0,3M mravenčan amonný (ph 6,9), ta = 60s. B) AdTS SWV záznamy A25 prodlouženého TdT reakcí s dgtp a dttp v molárním poměru 1:3 po modifikaci komplexem OsO 4 s 2,2 - bipyridinem (2 mm Os,bipy, 37 o C, 30 min.) (plná čára), neprodloužená kontrola (čárkovaná čára). PGE, E i = -1 V, E end = 0.2 V, amplituda 25 mv, frekvence 200 Hz, elektrolyt: 0,2 M acetátový (ph 5,0), ta = 60s. Závěr Pomocí různých voltametrických metod na HMDE a PGE byly studovány produkty TdT reakce. Jako substráty byly použity přirozené nukleosidy, deaza analogy purinových nukleosidů a chemicky modifikované nukleosidy. Bylo zjištěno, že daná enzymatické reakce je ovlivněna koncentrací a typem použitého substrátu. Ze získaných výsledků vyplývá, že tvorba alternativních sekundárních struktur DNA v prodlužovaném úseku silně ovlivňuje studovanou reakci. Reakce katalyzovaná TdT je také vhodná k inkorporaci chemicky modifikovaných dntp do DNA. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu GAČR (P206/12/2378, P206/12/G151). Literatura 1. Paleček E., Jelen F.: In Electrochemistry of nucleic acids and proteins Towards electrochemical sensors for genomics and proteomics Palecek, E., Scheller, F., Wang, J., Elsevier, Amsterdam, Hocek, M.; Fojta, M.: Chem. Soc. Rev. 40, 5802 (2011). 3. Famulok M., Hartig J. S., Mayer G. Chem. Rev.: 107, 3715 (2007). 4. Horáková P., Macíčková-Cahová H., Pivoňková H., Špaček J., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 9, 1366 (2011). 5. Fojta, M.; Kostečka, P.; Pivoňková, H.; Horaková, P.; Havran, L.: Curr. Anal. Chem. 7, 35 (2011). 44

47 The Implementation of Elimination Voltammetric Procedure into Electrochemical Analyzers (Implementace procedur eliminační voltametrie do elektrochemických analyzátorů) Jan Hrbáč a and Libuše Trnková b,c a Department of Physical Chemistry, Faculty of Science, Palacky University, tr. 17. Listopadu 12, Olomouc, Czech Republic jan.hrbac@upol.cz b Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5, Brno, Czech Republic, libuse@chemi.muni.cz c CEITEC, Brno University of Technology, Technická 3058/10, Brno, Czech Republic Abstract A Labview - based application was developed to implement elimination voltammetry method into electrochemical analyzers. Current version of the software performs two elimination procedures on three voltammograms recorded at different scan rates. The parameters belonging to most widely used elimination functions ( E4 and E6 ) are pre-defined, but can be manually changed. The changes in the parameters values are instantly reflected on a graph displaying the elimination voltammograms. Key Words: elimination voltammetry, electrochemical analyzer, Labview. Introduction Electrochemical analyzers in general are working in both potentiostatic and galvanostatic modes. The aim of the contribution is the implementation of the Eliminination voltammetry with linear scan (EVLS) for potentiostatic methods, namely LSV (Linear sweep voltammetry), CV (Cyclic voltammetry) and SWV (Square wave voltammetry). Processing the experimental data by EVLS 1-7 can enrich the analytical information obtained from voltammetric experiments namely through (a) improvement in peak shape and resolution, (b) ability to subtract the baseline without the necessity to measure blank voltammogram, (c) expansion of the accessible potential window, (f) increasing the sensitivity of the voltammetric method (LSV, CV) and consequently reducing the detection limit for certain analyses, especially in the case of adsorbing species, etc. Furthermore, EVLS analysis can contribute to better understanding of the studied electrode process, e.g., (a) gives the possibility to obtain additional information about proceeding processes at an electrode surface, especially by comparing the different elimination functions, (b) provides the information on the slowest (control) step in the electrode process, (c) allows for the calculation of the diffusion-controlled process charge transfer coefficient, (d) reveals the processes behind the process through elimination of kinetic currents (e.g., the elimination of hydrogen evolution currents), (e) points to a system of interacting processes (catalysis, coherence, synergy) of electrode processes, (f) quickly reveals an electrode process in the adsorbed state of the investigated analyte with greater sensitivity than semi-integration method, (g) reflects the roughness of electrode surfaces, etc. The EVLS procedure is based on different scan rate dependence of the individual current components (diffusion, kinetic and capacitive) constituting the total current measured during the voltammetric experiment. Some partial currents can be eliminated by conventional voltammetric methods, such as pulse techniques reducing the capacitive component of current to a negligible value. The elimination (EVLS) procedure allows performing the similar task by mathematical treatment of a set of conventional voltammograms. Additionally, EVLS allows also eliminating other sub-currents from the measured current-voltage curves. The 45

48 transformations used in EVLS are based on two assumptions. The first assumption is that the total current I consists of component (particular) currents: I n j 1 I j I d I c I k... (1) where I d is the diffusion current, I c is the charging (capacitive) current and I k is the kinetic current. The second assumption is that each particular current can be expressed as the product of two independent functions the scan rate function W j (ν) and the potential function Y j (E): I Y ) j x j ( E) W j ( ) or I j Yj ( E (2) Specifically, for the individual sub-current (diffusion, capacitive, kinetic): I Y ( E) I Y ( E) I Y ( E) 1/ d d c c k k (3) By solving the sets of combinations of eq. 1 and eq. 3 for individual voltammograms recorded at different scan rates the transformed voltammograms can be obtained, in which some current components are conserved and some eliminated. EVLS function eliminating the kinetic and capacitive current components (I k, I c ) and conserving the diffusion current (I d ) component (usually denoted as E4 in the associated literature) is the most widely used one to study the redox processes. Experimental The electrochemical experiments were performed using a preliminary version of the electrochemical analyzer developed within the framework of MPO FR-TI4/457 project. This instrument can measure voltammograms/amperograms at current ranges from 10 pa to 0.1 ma with the smallest measurable value about 1 pa and highest measurable value of 1 ma. For current ranges above 1 µa, voltammetric scan rates up to 200 V.s -1 are available. Ag/AgCl was used as a reference electrode (CHI111, CH Instruments, Inc.), platinum wire served as an auxiliary and glassy carbon disk electrode (3 mm in diameter, CHI104, CH Instruments, Inc.) as a working electrode. Working electrode was repolished using alumina slurry (0.05 µm) on Microcloth pad (both Buehler, U.S.A.) before each scan. Voltammograms of Trolox (Fluka) were measured in acetate buffer (ph 3.6, 50 mm) as a supporting electrolyte prepared from acetic acid and NaOH (Lach-Ner, p.a.) in deionized water (Millipore). The measurements were carried out at room temperature (25 C). Results and discussion A routine performing the elimination procedure on three voltammograms recorded at different scan rates has been developed using NI Labview 2011 SP1, released as a part of the software package of the analyzer and also as a standalone application. Labview TM enables a rapid application development by wiring graphical objects performing particular tasks, contrary to conventional programming tools which use program code composed of individual textual commands. The EVLS software consists of a front panel in which original set of voltammograms and two elimination voltammograms are displayed in separate graphs, taking the advantage of powerful Labview graphing options. A four-column ASCII file containing common potential values in its first column and voltammograms current data in second to fourth column serves as an input file. Two pre-defined sets of parameters belonging to elimination functions E4 (only diffusion current is conserved provided that the set of 46

49 voltammograms belongs to a reversible electrochemical process) and E6 (only charging current remains after the application of the elimination procedure in the case of a reversible process) are available to obtain the aforementioned transformations. The predefined parameters are valid for voltammograms recorded at scan rates of 2v, v and v/2 ( integer 2 ), where v is the base scan rate value; e.g. for 200 mv s -1 base scan rate the input set of voltammograms contains (in this order) current data for 400, 200 and 100 mv s -1 in the second, third and fourth column of the input data file. An important feature of the application is the possibility to fine-tune the elimination parameters and to observe the impact of each parameter s change on the resulting elimination voltammograms in real time. A screenshot of the EVLS application is shown in Fig. 1 with Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman- 2-carboxylic acid, a water-soluble derivative of vitamin E, Fig. 2) voltammograms as a working example. In this particular transformation we used two elimination functions; except for E4 which eliminates simultaneously I d + I k and conserves I c the E6 transformation was also used, which conserves a background (capacitive) current in the case of a simple reversible redox process: E4. f ( I) I I I 2, E6. f ( I ) I I I2 f ( I ) is EVLS function, I is the total voltammetric current measured at reference scan rate, I1 2 and I 2 are total voltammetric currents measured at half and twice values of the reference scan rate. Fig. 1. A screenshot of EVLS software showing cyclic voltammograms of trolox (left) and elimination voltammograms (E4 and E6, right). 47

50 C H 3 CH 3 O HO O CH 3 HO CH 3 Fig. 2. The structure of Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid). While the E4 transformation yields a pair of sharp peaks easier to use for analytical purposes than the original voltammograms, the E6 function reveals that the redox process does not pertain to a simple redox transformation. Indeed, the electrochemical behavior of Trolox (TrOH) 7 is characterized by the mechanism involving one electron oxidation (TrOH TrOH. + e - ), followed by a rapid deprotonation TrOH. TrO. + H + and second electron transfer TrO. TrO + + e -. TrO + is subsequently transformed by a follow-up nucleophilic reaction into a non-electroactive species. For user s convenience, several ways of handling the output data containing voltammograms transformed by elimination procedures are available. Besides the classical Save data button, the curves on graph can be transferred into Excel or into clipboard by right-clicking on graph canvas and choosing Export data to clipboard / Excel from the shortcut menu. Currently, the software is being further developed to be able to calculate the elimination coefficients and to perform desired elimination procedure for a set of voltammograms with arbitrary combination of scan rates. The final version of EVLS implementation will include the sequence of steps, starting from the selection of scan rates, measurement of three voltammograms using e.g. three electrodes in one body, postprocessing of the acquired experimental data if necessary (smoothing or noise filtering), selection of desired elimination procedure, calculation of the elimination coefficients corresponding to selected scan rates, execution of the EVLS curve(s) calculation and displaying the results in a graph. Conclusions In this contribution the implementation of EVLS, as a mathematical procedure of processing the voltammetric data, was discussed and a standalone windows application performing EVLS was introduced. Until now, the individual steps leading to elimination voltammograms were realized using macro commands in Excel. The new software is easily implementable into software packages of the electrochemical workstations. The standalone version of the software is available from the authors at no cost upon request. Acknowledgements This research was supported by the MPO FR-TI4/457 project from the Ministry of Commerce and Trade of the Czech Republic, CEITEC Central European Institute of Technology Project CZ 1.05/1.1.00/ , and by the project MUNI/A/0992/2009 of the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic. The authors wish also to thank the Metrohm company for the possibility to present these results. References 1. Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996). 2. Trnkova L., Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 413, 123 (1996). 3. Trnkova L., Kizek R., Dracka O.: Electroanalysis 12, 905 (2000). 48

51 4. Trnkova L.: Chem. Listy 95, 518 (2001). 5. Trnkova L.: J. Electroanal. Chem. 582, 258 (2005). 6. Trnkova L.: Application of Elimination Voltammetry with Linear Scan in Bioelectrochemistry, in Utilizing of Bio-Electrochemical and Mathematical Methods in Biological Research (Eds.: Adam V., Kizek R.), p. 51. Research Signpost, Kerala, India, Trnkova L., Jelen F., Ozsoz, M.: Electrochemical transducer for oligonucleotide biosensor based on the elimination and adsorptive stripping techniques, in Electrochemical DNA Biosensors, M. Ozsoz (Ed.). Pan Stanford Publishing, Singapore, J. Malyszko, M. Karbarz: J. Electroanal. Chem. 595, 136 (2006). 49

52 Investigation of Complexes of Tebuconazole with Zinc (Studium komplexů tebukonazolu se zinkem) Michal Jakl a, Renáta Norková b, Tomáš Navrátil c, Jana Jaklová Dytrtová b, and Jiří Balík a a Czech University of Life Sciences Prague, Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources, Department of Agro-Environmental Chemistry and Plant Nutrition, Kamýcká 129, Prague Suchdol, Czech Republic, jakl@af.czu.cz b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo náměstí 2, Prague 6, Czech Republic c J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic Abstract Tebuconazole is one of the most utilized triazole pesticides in agriculture. Its stability is highly affected by complexation with metals. Moreover, it creates more or less stable complexes with essential elements that become unavailable to plants. In the system with overabundant tebuconazole, an inert (very stable) complex with Zn was found. Elimination voltammetry with linear scan was used for revealing of the electrode processes on the mercury surface. The relatively slow kinetically controlled step in tebuconazole/zn complex formation indicates the great ability of Zn-tebuconazole system to react with more ligands. Therefore, multiligand Zn-tebuconazole complexes with other ligands are expected in the nature. Key Words: Elimination voltammetry with linear scan, Voltammetry, Pesticide, Triazol, Metal. Úvod Tebukonazol (Teb; (RS)-1-p-chlorofenyl-4,4-dimethyl-3-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)- pentan-3-ol) je velmi rozšířený fungicid používaný jak v zemědělství k ochraně celé řady plodin (obilniny, chmel, réva vinná, ovocné stromy) proti plísním, tak i jako přípravek k ochraně dřevěných povrchů. Oproti tomu zinek je esenciální prvek, který bývá často pro plodiny (kukuřice, chmel, réva vinná, ovocné stromy), především vlivem jeho snížené dostupnosti z půdy, v deficitu narušujícím jejich základní životní funkce 1. Snížená biodostupnost Zn může být způsobena tvorbou komplexů či nerozpustných solí s látkami přítomnými v půdě. Na základě dříve realizovaných výzkumů bylo potvrzeno, že tebukonazol tvoří s kationty kovů komplexy 2-4, čímž může po průniku do půdy snižovat biodostupnost jak esenciálních, tak i rizikových prvků. Studiem komplexů tebukonazolu se kationty zinku (octanem zinečnatým) v krystalech se zabývali Evans et al. 5. Z jejich výsledků plyne, že v krystalickém stavu mají komplexy strukturu [ZnAc 2 (Teb) 2 ], kde se dvě molekuly tebukonazolu váží přes dusík v triazolové skupině a dvě molekuly octanu se váží přes kyslík; atom Zn je tak zcela obklopen, což znemožňuje jeho interakci s okolím. Tato práce se zabývá studiem komplexů tebukonazolu se zinečnatými ionty v roztoku pomocí elektrochemických metod s uplatněním eliminační voltametrie s lineárním scanem (EVLS) 6-11 pro popis dějů na rtuťové elektrodě. Díky této metodě lze eliminovat jednotlivé proudy a na základě jejich průběhů v závislosti na potenciálu pak určit řídicí elektrodové děje 9. 50

53 I (na) Experimentální část Měření byla prováděna na počítačem řízeném analyzátoru PC-ETP (Polaro-Sensors, Praha) vybaveném programem MultiElchem v. 2.3 (ÚFCHJH AVČR, v.v.i.) 12 a POLAR.PRO v. 5.1 (Polaro-Sensors, Praha) v tříelektrodovém zapojení na tužkové visící rtuťové kapkové elektrodě (HMDE; Polaro-Sensors, Praha) vs. Ag/AgCl/KCl sat. (10-20+; Elektrochemické detektory, Turnov) s pomocnou Pt elektrodou, v základním elektrolytu 0,1 mol L -1 KCl. Byla použita diferenční pulsní anodická rozpouštěcí voltametrie (DPASV) a katodická diferenční pulsní voltametrie (DPCV). Pro určení dějů probíhajících na rtuťové kapce bylo využito voltametrie s lineární změnou napětí (LSV) a EVLS 6. Zásobní roztoky, ze kterých byly bezprostředně před vlastní analýzou míchány modelové roztoky, byly připraveny ze ZnCl 2 (99,999% TMB), tebukonazolu (PESTANAL ), HPLCgrade methanolu (vše Sigma-Aldrich, ČR), KCl (Suprapur, Merck) a deionizované vody (18,2 MΩ; Millipore Milli-Q). Výsledky a diskuse V rámci LSV byly zaznamenávány voltamogramy při polarizačních rychlostech mv s -1 (v násobcích 2). Při aplikaci EVLS při nižších rychlostech polarizace (10, 20 a 40 mv s -1 byla zvolena referenční rychlost 20 mv s -1 (Obr. 1a). Z voltamogramů eliminovaných proudů (Obr. 1a) vypočtených na základě matematických vztahů 6 lze dovodit, že pík 1 odpovídá difúzně řízenému procesu redukce volných zinečnatých iontů. Pík 2 lze interpretovat dvěma způsoby: a) děj probíhající na elektrodě je redukce v adsorbovaném stavu, na kterou navazuje další redukce, jejímž řídicím dějem je difúze, nebo b) jedná se o difúzí řízený děj (u mv), za nímž následuje další difúzí řízený děj, kterému je předřazena kineticky řízená reakce. Pokud byla aplikována EVLS při vyšších rychlostech polarizace (40, 80 a 160 mv s -1, při referenční rychlosti 80 mv s -1 ; Obr. 1b), nebyl zaznamenán již eliminační pík u mv a celý probíhající proces bylo možno popsat jako difúzně řízený děj, kterému je předřazena kineticky řízená reakce. Z toho je možno usoudit, že difúzně řízený děj u mv je pomalý. 40 a mv/s Ic Id Ik E (mv) 51

54 I (na) I (na) I (na) mv/s Ic Id Ik b E (mv) Obr. 1. Záznam LSV při polarizační rychlosti a) 20 mv s -1, resp. b) 80 mv s -1 a eliminační voltamogramy při koncentraci Zn mol L -1 a Teb mol L -1 v základním elektrolytu 0,1 mol L -1 KCl; I c kapacitní proud, I d difúzní proud, I k kinetický proud. Další informace o probíhajících dějích by mohla přinést DPASV. V případě, že by se jednalo o případ bez účasti adsorpce, pak by registrovaný proud nezávisel na době akumulace. V případě b by pak proud závisel na době akumulace. Pokud by se jednalo o redukci produktů nějaké pomalé předchozí reakce, s rostoucí dobou akumulace by narůstalo také množství produktů, které by se akumulovaly na elektrodě. V tomto případě se tedy nejspíše jedná o variantu b, protože výška píku 2 se s rostoucí dobou akumulace nemění (Obr. 2). 120 a s 120 b I s 120s 60s 30s 10s E (mv) 40 0 I t acc (s) Obr. 2. a) Voltamogramy DPASV pro směs tebukonazol ( mol L -1 ) a ZnCl 2 ( mol L -1 ) v základním elektrolytu 0,1 mol L -1 KCl při různých dobách akumulace; E in = mv, E fin = -750 mv, E a = mv, t acc = s, rychlost polarizace 10 mv s -1, výška pulsu 50 mv, šířka pulsu 80 ms, klidový čas 15 s; b) Závislost výšek píků 1 a 2 na době akumulace. Další informace vedoucí k objasnění registrovaných dějů by mohly přinést výsledky získané pomocí DPCV. Bylo zjištěno, že výška píku u ca mv se s rostoucí koncentrací zvětšuje (Obr. 3). 52

55 I (na) c teb E(mV) Obr. 3. Záznam DPCV voltamogramů při přídavcích tebukonazolu. Výchozí koncentrace Zn mol L -1 v základním elektrolytu 0,1 mol L -1 KCl, poměry Zn 2+ a Teb 1:1 až 1:100 s přídavky 10 µl Teb (10-3 a 10-2 mol L -1 ), E in = -750 mv, E fin = mv, rychlost polarizace 10 mv s -1, výška pulsu -50 mv, šířka pulsu 80 ms, klidový čas 15 s. Závěr Redukce zinku, vázaného v komplexu s tebukonazolem, je reprezentována na voltamogramu píkem u potenciálu přibližně mv na HMDE. Vrchol tohoto píku se posouvá s rostoucí koncentrací zinku směrem k negativním potenciálům, zatímco redukční pík volných zinečnatých iontů není potenciálově (ca mv) ani proudově závislý na koncentraci Zn 2+. Signál redukce iontů vázaných v komplexu je složen pravděpodobně z několika dílčích reakcí řízených difúzí, přičemž alespoň jednomu z nich je předřazen kineticky řízený děj. Poděkování Tato práce vznikla s podporou grantů GA AV ČR (IAA a RVO ), GA ČR (P206/11/1638 a P208/12/1645) a S grantu MŠMT ČR. Literatura 1. Vaněk V., Balík J., Pavlíková D., Tlustoš P.: Výživa polních a zahradních plodin. Profi Press, Praha Jaklová Dytrtová J., Jakl M., Schröder D., Čadková E., Komárek M.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 1037 (2011). 3. Jakl M., Jaklová Dytrtová J., Čadková E.: An electrochemical approach to study biscoordinated copper/tebuconazole complexes. BEST servis, Ústí nad Labem, Jetřichovice Norková R., Jaklová Dytrtová J., Jakl M., Schröder D.: Water, Air, Soil Pollut. in press (2012). 5. Evans P. D., Schmalzl K. J., Forsyth C. M., Fallon G. D., Schmid S., Bendixen B., Heimdal S.: J. Wood Chem. Technol. 27, 243 (2007). 6. Dračka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996). 7. Skopalová J., Navrátil T.: Chemia Analityczna (Warsaw) 52, 961 (2007). 8. Sander S., Navrátil T., Novotný L.: Electroanalysis 15, 1513 (2003). 9. Trnková L., Kizek R., Dračka O.: Electroanalysis 12, 905 (2000). 10. Trnková L.: J. Electroanal. Chem. 582, 258 (2005). 11. Serrano N., Klosová K., Trnková L.: Electroanalysis 22, 2071 (2010). 12. Navrátil T., Yosypchuk B., Barek J.: Chem. Anal. (Warsaw) 54, 3 (2009). 53

56 Optimization of a Flow Rate for a Hyphenation of Voltammetry with Electrospray Ionization Mass Spectrometry (Optimalizace průtoku pro spojení amperometrie s hmotnostní spektrometrií s ionizací elektrosprayem) Jana Jaklová Dytrtová a, Michal Jakl b, Renáta Norková a, and Tomáš Navrátil c a Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo náměstí 2, Prague 6, Czech Republic, dytrtova@uochb.cas.cz b Department of Agro-Environmental Chemistry and Plant Nutrition, Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources, Czech University of Life Sciences Prague, Kamýcká 129, Prague Suchdol, Czech Republic c J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic Abstract The hyphenation of an electrochemical cell prior to mass spectrometer with electrospray ionization allows studying of products and/or of intermediates of electrode reactions. The measurement is realized in a flowing system. The flow rate of the sample markedly influences the MS signal intensity of the product. The calculated optimum value for the electrochemical cell with the sweep volume 0.72 µl is in the range from 0.4 to 0.5 ml h -1. The experimental optimal value is 0.45 ml h -1. The optimization of the flow rate has to be provided individually for each product, because the intensity also depends on the rate of the electrode reaction and product stability. Key Words: Electrochemistry, Amperometry, ESI-MS, Tebuconazole, Copper, Silver. Úvod Spojení elektrochemických metod (EC) a elektrospraye s hmotnostní detekcí (ESI-MS) je v současnosti velmi slibným cílem 1-4. Lze tak rozšířit využití EC metod zejména ke kombinovanému studiu elektrochemických reakcí či k přímému studiu produktů těchto reakcí 5. Spojení EC s ESI-MS má samozřejmě několik omezení, které vycházejí z experimentálního uspořádání obou metod 6-8. Cílem této studie bylo optimalizovat průtok vzorku obsahujícího tebukonazol pro experimentální uspořádání: elektrochemická cela následována electrosprayem s hmotnostní detekcí. Experimentální část Konstrukce cely (Obr. 1a) byla použita stejná jako bylo popsáno v cit. 9, 10, pro jejíž vnitřní objem byl spočítán optimální průtok 0,4 až 0,5 ml h -1. Tělo cely bylo zhotoveno z fitinkového kříže (P-729 PEEK Cross thru-hole with F-300 Fittings, Upchurch Scientific Rheodyne, IDEX Health & Science), jehož efektivní objem je 0,72 µl. Přívod a odvod vzorku do/z cely byl realizován kapilárou o průměru 0,25 mm (Upchurch Scientific Rheodyne, IDEX Health & Science). EC cela pracovala v dvouelektrodovém zapojení počítačem řízeného polarografického/voltametrického analyzátoru (PC-ETP, Polaro-Sensors, ČR), s programem MultiElchem 2.3 (ÚFCHJH AVČR, v.v.i., ČR) 11 a POLAR.PRO 5.1 (Polaro-Sensors, ČR). Měděný drát (průměr 1 mm, Lachema, ČR) a stříbrný drát (průměr 1mm, Goodfellow, USA) byly použity jako elektrody. Ty jsou v cele umístěny naproti sobě, což zaručuje rovnoměrnou polarizaci elektrod a minimální nekompenzovaný ohmický spád (Obr. 1b). Z důvodů kompatibility EC s ESI-MS bylo nutné použít průtok cca 0,5 ml h -1. Při takto nízkém průtoku nabývá tloušťka hydrodynamické hraniční vrstvy milimetrových rozměrů 12. Problém byl částečně minimalizován použitím elektrod malých průměrů

57 K míchání bylo dále využito turbulencí v proudícím roztoku, které vznikající na elektrodách vyčnívajících do roztoku (Obr. 1b). Vzorek byl připraven ze zásobního roztoku tebukonazolu v methanolu (10-2 mol L -1 ), 0,1 mol L -1 vodného roztoku acetátového pufru, 99,9% methanolu (vše Sigma-Aldrich, ČR) a deionizované vody. Použitá koncentrace tebukonazolu ve vzorku byla 2, mol L -1 a koncentrace acetátového pufru 25 mmol L -1. Vzorek byl dodáván vždy s kontinuálním průtokem z Hamiltonovy stříkačky (Thermo Fisher Scientific, ČR) pomocí pumpy (KD Scientific, USA). a b Obr. 1. (a) Zapojení elektrochemické cely; (b) Schéma umístění elektrod v cele, vznik turbulentního proudění na nerovnostech. Pro optimalizaci podmínek průtoku bylo využito akumulačního kroku, při němž byla oxidována pracovní elektroda a na ní se vytvářely komplexy tebukonazolu (1). Tyto byly odnášeny proudícím elektrolytem a následně byly zaznamenávány změny v intenzitě komplexů metodou ESI-MS. Při vkládání kladného potenciálu (700 mv) byl pomocí ESI-MS detekován [Cu(1)] +, při vkládání záporného potenciálu (-850 mv) byl detekován [Ag(1)] +. [Cu(1)] + je jedním z komplexů tebukonazolu s mědí 14. Měď se zde vyskytuje jako Cu +, protože během procesu elektrospraye 15 a také během reakce s tebukonazolem 14 dochází k redukci mědi z Cu 2+ na Cu +. Následně získaný DC voltamogram sloužil k posouzení vlivu průtoku na elektrochemickou reakci. Polarizační rychlost byla 50 mv s -1. ESI-MS experimenty byly provedeny na hmotnostním spektrometru s iontovou pastí (Thermo Finnigan LCQ Advantage MS System; ThermoFinnigan, USA) se zdrojem elektrospraye s možností polarizace v záporném i pozitivním modu 16. Optimalizované podmínky pro detekci [Cu(1)] +, byly následující: napětí ve sprayi 5,0 kv, napětí na kapiláře 100 V, teplota v kapiláře 250 C, průtok ochranného a pomocného plynu arbitrárních jednotek. Výsledky a diskuse Obr. 2 ukazuje závislost logaritmu intenzity [Cu(1)] +, jehož velikost je závislá na efektivitě elektrodové reakce (Cu 0 Cu 2+ ) a přítomném množství [Na(CH 3 COONa) 4 ] +, který pochází ze základního elektrolytu a není zavislý na průběhu elektrodové reakce. Z Obr. 2 je patrné, že již průtok 0,2 ml h -1 poskytuje signál dostatečné intenzity. Nejvyšší intenzita [Cu(1)] + vztažená k intenzitě [Na(CH 3 COONa) 4 ] + byla získána pro průtok 0,45 ml h -1. Proto se tato hodnota zdála být optimální. 55

58 norm. intenzita log (intenzita) [Na(CH 3 COONa) 4 ] + [Cu(1)] + 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 průtok (ml h -1 ) Obr. 2. Závislost logaritmu intenzity [Cu(1)] + a intenzity [Na(CH 3 COONa) 4 ] + na rychlosti průtoku vzorku. Výsledný signál [Cu(1)] + je tedy ovlivněn zejména (i) efektivitou elektrodové reakce, která je vyšší při nízkých průtocích, a (ii) množstvím prošlého vzorku; s vyšším průtokem stoupá i intenzita. Tento trend je patrný i z Obr ,2 0,3 0,4 0,5 0,6 ml h -1 Obr. 3. Závislost normalizované intenzity [Cu(1)] + na průtoku vzorku. Na získaných voltamogramech (Obr. 4) je patrné, že se zvyšujícím se průtokem vzorku klesá redukční pík (při -500 mv), což potvrzuje předpoklad (i). Oproti tomu situace během oxidace není na první pohled jednoznačná. Při průtocích do 0,3 ml h -1 je okolo potenciálu 0 mv patrný pík. Se zvyšujícím se průtokem (nad 0,35 ml h -1 ) tento pík narůstá, mění svůj tvar (zdá se, že obsahuje více než jeden pík) a posouvá se ke kladnějším potenciálům. Pro průtok 0,45 ml h -1 se tvar oxidačního píku blíží tvaru píku získaného při nízkých průtocích. Tímto tedy byla ověřena experimentálně vhodnost průtoku 0,45 ml h -1. Přičemž toto je hodnota z intervalu vypočítaného optimálního průtoku pro daný objem cely. Závěr Zapojení elektrochemické cely před hmotnostní spektrometr s ionizaci elektrosprayem skýtá velký potenciál pro možnosti studia produktů i meziproduktů elektrodových reakcí. Měření je realizováno v průtoku, jehož hodnota značně ovlivňuje nejen intenzitu specií přítomných ve vzorku, ale především intenzitu specií vzniklých během elektrodové reakce. Hodnotu průtoku je třeba optimalizovat pro každý produkt elektrodové reakce zvlášť, protože výsledná intenzita je zejména ovlivněna rychlostí vzniku tohoto produktu, případně jeho stabilitou. 56

59 i/ A ,35-0,43 ml h -1 0,47-0,60 ml h -1 0,25-0,30 ml h -1 0,45 ml h E/mV Obr. 4. Voltamogramy 700 až -850 mv pořízené při různých průtocích vzorku. Polarizační rychlost 50 mv s -1. Poděkování Tato práce vznikla s podporou grantů GA ČR (P208/12/1645), GA AVČR (IAA a RVO ) a S grantu MSMT ČR. Literatura 1. Jaklová Dytrtová J., Šestáková I., Jakl M., Navrátil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009). 2. Navrátil T., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 131 (2009). 3. Šestáková I., Navrátil T.: Bioinorg. Chem. Appl. 3, 43 (2005). 4. Čížková P., Navrátil T., Šestáková I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007). 5. Jaklová Dytrtová J., Jakl M., Schröder D., Navrátil T.: Curr. Org. Chem. 15, 2970 (2011). 6. Ma L., Iezzi M., Kaucher M. S., Lam Y. F., Davis J. T.: J. Am. Chem. Soc. 128, (2006). 7. Blades A. T., Ikonomou M. G., Kebarle P.: Anal. Chem. 63, 2109 (1991). 8. Arakawa R., Abura T., Fukuo T., Horiguchi H., Matsubayashi G.: Bull. Chem. Soc. Jpn. 72, 1519 (1999). 9. Jaklová Dytrtová J., Jakl M., Schröder D.: Modern Electrochemical Methods XXX, Jetřichovice, (Eds: Navrátil T., Barek J.), BEST servis, Ústí nad Labem, p. 89, Jetřichovice Jaklová Dytrtová J., Jakl M., Schröder D.: Modern Electrochemical Methods XXXI, Jetřichovice, (Eds: Navrátil T., Barek J.), BEST servis, Ústí nad Labem, p. 69, Jetřichovice Navrátil T., Yosypchuk B., Barek J.: Chem. Anal. (Warsaw) 54, 3 (2009). 12. Gunasingham H., Fleet B.: Anal. Chem. 55, 1409 (1983). 13. Gunasingham H.: Anal. Chim. Acta 159, 139 (1984). 14. Jaklová Dytrtová J., Jakl M., Schröder D., Čadková E., Komárek M.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 1037 (2011). 15. Tintaru A., Charles L., Milko P., Roithová J., Schröder D.: J. Phys. Org. Chem. 22, 229 (2009). 16. der D., Charles L., Jusinski I. - M.: J. Phys. Chem. 112, (2008). 57

60 Electrochemistry of Polynitrocalix-[4]-arenes (Elektrochemie polynitro-kalix-[4]-arenů) Alan Liška and Jiří Ludvík J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejskova 3, Prague 8, Czech Republic, Abstract Calix[4]arene is a suitable inert and stable frame for building "smart" molecules and supramolecular assemblies. Polynitrocalix[4]arenes where reducible nitro groups are located at the upper rim are promising precursors for aimed development of sensors. In this work a series of mono-, di-, tri- and tetra nitroderivatives was reduced, the sequence of individual steps was described and the mechanism discussed. It was found that in this molecule with several redox centers all nitro groups are electronically isolated and thus are reduced independently yielding poly-radical ions. Two different couples of equivalent nitro groups were proved in tetranitro derivatives. The experimental results were confirmed by quantum chemical calculations. Introduction During last ten years, design of various sensors including anion or cation receptors have become one of the most investigated and fast developing area of analytical chemistry 1-2. The specific formation of a complex between a receptor and an analyzed anion (or cation), accompanied by a change of an optical or electrochemical response, is the main goal of this research. Calixarenes 3-7 cyclic compounds prepared by a condensation procedure between p-tert.butylphenol and formaldehyde have suitable properties for this use. The number of phenol units in a molecule is depicted in brackets in this work only calix[4]arenes will be used. Calix[4]arenes may occur in four possible conformations: cone, partial cone, 1,2-alternate and 1,3-alternate (Fig. 1). A calix[4]arene unsubstituted at the lower rim is conformationally mobile and in solution an equilibrium mixture of conformers is formed (by oxygen-throughthe-annulus mechanism) 8. However, by an appropriate substitution with bulky substituents (for example propyl or 2-ethoxy group) a desired conformer may be obtained and stabilized (in this study only compounds with fixed cone conformation were used. The oxygen at the lower rim can be substituted by another nucleophile (e.g. nitrogen) under formation of a polydentate ligand cavity being able to coordinate cations. In the case of a modification of the lower rim by thiols, a self-assembled monolayer can be formed at a gold electrode. HO HO OH OH HO cone OH HO HO partial cone OH HO OH HO OH HO HO OH 1,2-alternate 1,3-alternate Fig. 1. Calix[4]arene and its four possible conformers. 58

61 A possibility which attracts our attention is to substitute the upper rim by electrochemically reducible nitro groups. This choice has several reasons: a) calixarenes are not electrochemically active; b) by reduction of the nitrogroup, an imino-intermediate or aminoproduct is formed which is able to serve as a ligand or as a precursor for further prolongation of the pendant being able to form a hosting space for analyzed molecules.. The aim is to design an electrosynthetic one-pot procedure of calixarenes modification.; c) a calixarene substituted by several nitro groups represents a molecule having specific properties due to multiple redox centers. The presence of four nitro groups in tetranitrocalixarene molecules provokes many principal questions: Are they reduced simultaneously or stepwisely? Which part of the molecule is reduced first? How the nitro groups influence each other? What is the impact of the reduction on the molecular geometry? What are the properties or reactivity of poly-radical anion intermediates? What is the role of the lower rim substitution in the reduction of the nitro groups? Since the number of published papers dealing with electrochemical studies of calixarenes is very scarce and only several contributions is devoted to electrochemical oxidation of nonsymetric sulfonated or hydroxylated calixarenes, the aim of this contribution is to use the nitro groups as electrochemical probes in order to answer the above mentioned fundamental questions. In order to stabilize radicalic species, the reduction experiments were performed in aprotic media. Experimental Acetonitrile (AN) 99.8% Lachema, dried by distillation with P 2 O 5, or dimethylformamide (DMF) dried by azeotropic distillation with benzene and water were used as solvents, tetrabutylammonium hexafluorophosphate (TBAHFP) pure, Fluka, recrystalized from EtOH, or tetrabutylammonium tetrafluoroborate, (TBATFB) pure, Fluka served as electrolytes in conc. 0.1M. Seven nitrocalix[4]arenes were received from the Department of organic chemistry at the Prague Inst. of Chem. Technology (Prof. P. Lhoták) or from the department of inorganic chemistry at the Faculty of Sciences, Charles University Prague (Prof. P. Vojtisek) and used in conc mm. They involve four tetranitro derivatives with different lower rim (II-V) and a series of tetra-, tri- di- and mono-nitroderivatives with the same lower rim (V-VIII) cf. Table I. The model compound (I) was prepared in our laboratory by a standard procedure. The solutions were deaerated by argon before the experiment. The measurements proceeded in a two-compartment cell with separated reference electrode, using the potentiostat Polarographic analyzer PA3 (Laboratorní přístroje Praha) equipped with an XY-recorder. A three-electrode system was used for dc-polarographic and cyclovoltammetric (CV) experiments with dropping mercury electrode (DME), hanging mercury drop electrode (HMDE) or stationary platinum disk as working electrodes, platinum wire as auxiliary electrode and saturated calomel electrode (SCE) as a reference. Results and discussion "Monomer" model Before the investigation of the authentic nitrocalix[4]arenes, the electroreduction of a model compound - 1-methoxy-2,5-dimethyl-4-nitrobenzene (I), representing one building block of studied molecules was electrochemically reduced in DMF under the same conditions. The behaviour corresponds to the literature about reduction of nitroaromates in aprotic media 9 and the mechanism of a 1-electron reversible process followed by an irreversible 3-electron one, was obtained. 59

62 R-Ph-NO 2 + e [R-Ph-NO 2 ] E1- reversible (1) [R-Ph-NO 2 ] + 3 e + 4 SolvH R-Ph-NHOH + H 2 O + 4 Solv E3 (2) Table I Studied compounds and their electroreduction potentials. No. upper rim lower rim E1 E2 E2-E1 E3 E3-E2 I a NO 2 p-o-me II 4x NO 2 4x -O-Me III 4x NO 2 4x -O-Oct IV 4x NO 2 4x -O-CH2-COOEt V 4x NO 2 4x -O-Pr VI 3x NO 2 4x -O-Pr VII 2x NO 2 4x -O-Pr VIII 1x NO 2 4x -O-Pr a the model compound a "monomer" building block Tetranitrocalix[4]arenes The polarographic reduction of the tetranitrocalix[4]arenes (II-V) starts always with two 2- electron fully reversible waves E1 and E2 (the reversibility was proved by cyclic voltammetry even at the scan rate of 50 mv/s). This fact excludes the model of four equivalent nitro groups on the upper rim because two nitro groups are reduced more easily than the other two. The limiting current of each wave corresponded to two electrons (in comparison with the oneelectron reduction wave of the standard I). It is evident that this four-electron reversible reduction represents four one-electron reversible electron transfers giving the corresponding stable anion radical of each nitro group; hence, tetranitro tetraanion tetraradical is formed. The finding, that two one electron reductions proceed at a single potential shows that two equivalent non-interacting nitro groups are reduced and the observed two-electron reversible wave is, in fact, a one-electron reversible wave of double concentration. The presence of two such processes means that two different couples of two equivalent nitrogroups are reduced. This finding, however, suggests that in the solution the upper rim of calixarenes cannot have the C 4 symmetry and two types of nitro groups with different properties and reduction potentials exist. This electrochemical result is in full agreement with the x-ray crystal structure analysis: the calix in crystal as well as in the solution has a pinched shape with a "π-stacking" of the opposite benzene rings. Two nitrobenzenes are thus practically parallel whereas the other two are nearly in a plane. At more negative potentials a single, broad and irreversible multielectron wave E3 appears, the limiting current of which corresponds approx. to 12 electrons (4x 3 electrons). This observation suggests that the four nitro radical anions are further independently reduced according to the expected mechanism "1+3" 9 by other three electrons, each yielding the tetra hydroxylamino derivative, either at the same potential or at potentials very close to each other. Due to the broadness of this wave and proximity to the cathodic potential limit, it is impossible to distinguish these two possibilities. 60

63 Mono-, Di-, Tri- and Tetranitro derivatives Besides various tetranitro derivatives, we investigated also mono-, di- and trinitro[4]calix arenes with the same lower rim substituent, enabling their mutual comparison in the homologous series V-VI-VII-VIII. The mononitro calix[4]arene VIII is reduced just in the same way as the above mentioned monomeric model molecule (I): a one-electron reversible wave is followed by a three electron irreversible one. The first reduction potential of the compound VIII is localized between the first and the second reduction of all other calixarenes, the three-electron wave is about 0.2 V less negative. As a result, however, the potential difference between the processes E1 and E3 in compound VIII is the same like the difference between E2 and E3 in all other calixarenes. The 1,2-dinitro calix[4]arene (VII) is bearing two different nitro groups due to the pinched shape. As a result, two reversible one-electron reduction waves separated by ca. 200 mv were observed. About one volt more negatively a single six-electron irreversible wave appeared corresponding to simultaneous reduction of two nitro radical anions. The compound VII behaves similarly like tetranitro calixarenes I - IV, but with the half current. The reduction of trinitro calix[4]arene (VI) fits well to the suggested model: Since it contains two equivalent and one different nitro groups, the reduction process starts with a two-electron reversible wave which is followed ca. 200 mv more negatively by a one-electron reversible step. These three reversibly transferred electrons represent a formation of a tris-radical anion which is reduced at about -2.4 V in a single nine-electron irreversible wave. The reduction of the tetranitro calix[4]arene V was already discussed and fits to the suggested pattern. Fig. 2. Schematic picture of polarographic waves of compounds I, V-VIII. The values of all reduction potentials are summarized in the Table I and the polarographic curves are schematically presented at the Fig. 2. Striking (remarkable) feature following from the table is that the respective reduction potentials of all polynitrocalixarenes (II-VII) are very similar: The first reduction E1 is around V (± 0.02 V), the second one E2 occurs at about V (±0.03V) and the broad wave E3 is always near to V (± 0.08V). Thus, the potential differences E1-E2 and E2-E3 remain approximately the same. This finding says that the neither the number of nitro groups at the upper rim, nor the different substitution at the lower rim (namely its volume) play an important role in reducibility of the whole molecule. Due to a relatively rigid and electronically non-conjugated skeleton of calix[4]arenes, the nitro groups on the upper rim do not interact electronically along the bonds in any stage of their reduction with the neighboring parts of the molecule. 61

64 Theoretical treatment In order to check the relevance of the presented interpretation of electrochemical data and in order to answer the question put in the introduction about the sequence of the reduced nitro groups, quantum chemical calculations of the tetranitrocalixarenes as well as of all radical intermediates have been performed. At the Fig. 3, the localization of HOMO and LUMO in the dianion-biradical of the parent tetranitrocalixarene shows unambiguously that the first reductions occur at the distant nitrogroups. Fig. 3. Localization of HOMO (left) and LUMO (right) in dianion-biradical of the parent tetranitro[4]calixarene Conclusions and perspectives: The first electrochemical investigation of polynitrocalix[4]arenes was performed. The pinched shape of calix[4]arenes in the solution was experimentally proved showing that the nitrogroups exist in two energetically different forms, where a π-stacking of two opposite parallel rings makes their reduction more difficult. It was found that in the frame of tetranitro calix[4]arenes no electron delocalization takes place and the nitrogroups do not mutually interact. This is the reason for formation of various stable multi-radical intermediates. Their existence was supported by quantum chemical calculations. The recent preliminary experiments show that the reduced form of calix[4]arenes interact with alkali metals. This feature is continuously studied aiming to the explanation of this effect and to design of a respective sensor. Acknowledgement: The authors are grateful to prof. Al Fry (Wesleyan University, Middletown, Connecticut, USA) for quantum chemical calculations and prof. P. Lhoták and P. Vojtíšek for granting the compounds. This work is supported by the grant KONTAKT ME (MŠMT). References 1. Beer P. D., Gale P.: Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 486 (2001). 2. Schmidtchen F. P., Berger M.: Chem. Rev. 97, 1609 (1997). 3. Gutsche C. D.: Calixarenes. Monographs in Supramolecular Chemistry. The Royal Society of Chemistry, (Stoddart J. F., Ed.), Cambridge Kyrš M., Svoboda K., Lhoták P., Alexová J.: J. Radioanal. Nucl. Chem. 258, 497 (2003). 5. Lhoták P., Zieba R., Hromádko V., Stibor I., Sýkora J.: Tetrahedron Lett. 44, 4519 (2003). 6. Dudič M., Lhoták P., Stibor I., Lang K., Prošková P.: Org. Lett. 5, 149 (2003). 7. Šťastný V., Lhoták P., Michlová V., Stibor I., Sýkora J.: Tetrahedron 58, 5475 (2002). 8. Shinkai S., Ikeda A.: Chem. Rev. 97, 1713 (1997). 9. Lund H.: Cathodic Reduction of Nitro and related Compounds. Organic Electrochemistry. Fourth Edition, (Lund H., Hammerich O., Eds.), p. 389 and following. Marcel Dekker, New York

65 Redox Behavior of New Quinolone Derivatives Studied by in situ ESR-UV-VIS Spectroelectrochemistry (Použití in situ ESR-UV-VIS spektroelektrochemie k objasnění redoxního chování nových chinolonových derivátů) Karol Lušpai, Peter Rapta, Vlasta Brezová, and Andrej Staško Institute of Physical Chemistry and Chemical Physics, Faculty of Chemical and Food Technology, Slovak University of Technology in Bratislava, Radlinského 9, SK Bratislava, Slovak Republic, karol.luspai@stuba.sk Abstract In situ spectroelectrochemistry brings new dimensions into a conventional electrochemical experiment. Quinolone derivatives are for many years well known and important group of drugs. Two groups of novel quinolone derivatives with various structure and substituents were studied by spectroelectrochemical techniques in order to better understand their redox behavior. ESR spectroscopy provides valuable information about paramagnetic species (radical ions) generated upon electrochemical oxidation/reduction. On the basis of spectral and electrochemical data we proposed the mechanism of electrochemical reduction of presented quinolone derivatives. Key Words: Spectroelectrochemistry, Cyclic Voltammetry, ESR, EPR, UV-VIS, Quinolones, Selenadiazoloquinolones. Introduction In situ spectroelectrochemistry represents conventional electrochemistry enriched by different spectral methods, i.e., the products of electrochemical reactions on working electrode are simultaneously detected by spectroscopical techniques. Most often spectral method for use in spectroelectrochemistry is ESR or UV-VIS-NIR spectroscopy 1,2. Other techniques, like IR, Raman spectroscopy, can be also used, but more complicated and expensive equipment is needed 3. Every additional spectral technique used in the spectroelectrochemical investigations brings one more dimension to the electrochemical experiments. Therefore spectroelectrochemistry is very useful for investigation of complex reaction mechanisms with variety of consecutive reactions. Quinolone derivatives are for many years group of wellknown therapeutic agents 4. The understanding of the electrochemical reduction mechanism of quinolones can bring, along with photochemical research 5, more light into their reactions coupled with electron transfer. Experimental The spectroelectrochemical experiments were carried out in special flat (0.1 mm cell path length) spectroelectrochemical cell (Fig. 1, left), suitable for an optical transmission ESR resonator (ER 4104OP) of X-band ESR spectrometer Bruker EMX, Germany. The working electrode was laminated Pt mesh with small hole in the foil serving for light beam and for limiting the active surface area of the electrode. Pt wire as auxiliary (counter) electrode and Ag wire covered by oxides layer as pseudoreference electrode, were used. Because of using pseudoreference electrode, all potentials were recalculated vs. ferrocene/ferrocenium (Fc/Fc + ) redox couple on the basis of the performed cyclovoltammetric measurements in the presence of ferrocene internal standard. Both spectroelectrochemical and cyclovoltammetric experiments were carried out under inert argon atmosphere. Potentiostat Heka PG285, Lambrecht, Germany was used. Optical ESR resonator cavity was connected to the diodearray UV-VIS spectrometer Sentronic S2000 by using optical fibers. Deuterium-halogen lamp DH 2000 (Sentronic, Germany) was used as a light source. Dimethylsulphoxide (DMSO) of SeccoSolv quality was purchased from Merck and used in all experiments as received. 63

66 Tetrabuthylammonium hexafluorophosphate (TBAPF 6 ) from Fluka dried in vacuum oven for 16 hours at 120 C was used as supporting electrolyte. Fig. 1. Scheme of the ESR-UV-VIS spectroelectrochemical experiment. Investigated quinolones were synthesized at Department of Organic Chemistry, Catalysis and Petrochemistry, Slovak University of Technology [7]. Quinolone concentration of 10 4 M and 10 3 M in DMSO was used in cyclic voltammetry and spectroelectrochemistry, respectively. Due to the limited solubility of quinolones their saturated solutions were prepared. Results and discussion Four representative derivatives of quinolone derivatives (selenadiazoloquinolones) EQ1, EQN1, SeQ1, SeQN1 (Scheme 1, left) were chosen to study the mechanism of their electrochemical reduction with aim to obtain the relationship between their molecular structure and electrochemical behavior. The cyclic voltammetry of the samples EQ1 and EQN1 possessing ethyl substitution at nitrogen atom of 4-pyridone ring shows only one reversible peak in the cathodic part (not shown). For these samples with substituted nitrogen (EQ1 and EQN1) a formation of the stable radical anion in the region of the first reversible reduction step was confirmed by ESR spectroelectrochemistry. High stability of the corresponding radical anions is probably due to the steric effect of bulky substituent on the nitrogen (see Scheme 1). Samples from series SeQ and SeQN show similar redox behavior upon reduction. Characteristic cyclic voltammogram (CV) for this series of quinolones is shown in Fig. 2 for SeQ1 reduction in TBAPF 6 /DMSO. The first reduction step is irreversible and is followed by the nearly reversible reduction step at more negative potentials. During the second and the third cyclovoltammetric cycle for the same sample, the current of the first irreversible CV peak decreases. This indicates the consecutive chemical reactions of the formed radical anions near the electrode surface. We propose that for all investigated quinolone samples the first reduction step is associated with the formation of radical anion. However, the stability of this radical anion for samples SeQ1 and SeQN1 with imine groups is too low and was not observed in ESR spectroelectrochemistry at the first reduction peak. 64

67 I / A E / V vs. Fc/ Fc + Fig. 2. Cyclic voltammetry (three repeated scans) of 10 3 M SeQ1 sample in 0.1 M TBAPF 6 in DMSO (scan rate 100 mv s 1 ). We assume that the radical anions generated upon cathodic reduction of SeQ1 and SeQN1 (SeQ) undergo consecutive dimerization reaction leading to the dimer dianion (Scheme 1, right) [5]. Scheme 1. Schematic structure of the investigated selenadiazoloquinolone samples and the reaction mechanism proposed for their electrochemical reduction in non aqueous media. This dimer dianion can be reduced to the stable dimer radical trianion in the region of the second reversible (or quasireversible for some samples) cathodic voltammetric peak at more negative potential comparing to the first reduction peak. The generation of stable radical at the second voltammetric peak was unambiguously confirmed by in situ ESR spectroelectrochemical experiment as shown in Fig. 3 for SeQ1N sample in 0.2 M TBAPF 6 in 65

68 I / A I / A I / A I / A DMSO (scan rate 4 mv s 1 ). Interestingly, the dimer dianion can be reversibly reoxidized back to the neutral initial compound at strongly anodically shifted potentials (Fig. 3c) what clearly indicates that the proposed dimer dianion is of sigma type dimer ( -dimer). It should be noted that complexity of the cyclovoltammetric curve in the anodic part indicates also other follow up products in addition to the dimers. 10 a) b) c) 60 d) 40 E / V vs. Fc/Fc E / V vs. Fc/Fc E / V vs. Fc/Fc + E / V vs. Fc/Fc + Fig. 3. In situ cyclic voltammograms of SeQ1N sample taken during spectroelectrochemical experiment (scan rate 4 mv s 1, Pt-mesh working electrode) with representative ESR spectra measured in the region of the second cathodic peak during the (a) first, (b) second, (c) back reoxidation and (d) third voltammetric scan. Conclusions On the basis of the EPR spectroelectrochemical measurements possible reaction mechanisms for quinolones under study was proposed. The results confirmed the importance of nitrogen substitution (R) at nitrogen of 4-pyridone ring and its influence on stability of the radical anions generated from selenadiazoloquinolones SeQ, SeQN, EQ and EQN by electrochemical reduction. For quinolone derivatives with unsubstituted nitrogen stable sigma dimer dianion is formed from the corresponding primarily formed radical anions. Dimer-dianion can be reversibly reoxidized back at strongly positively shifted potential comparing to the monoanion reduction peak. Acknowledgement This study was financially supported by the Scientific Grant Agency (Project VEGA 1/0289/12) and the Research and Development Agency of the Slovak Republic (contract No. APVV ). Maroš Bella and Viktor Milata are gratefully acknowledged for selenadiazoloquinolones synthesis. 66

69 References 1. Gale R. J.: Spectroelectrochemistry: Theory and Practice. New York: Plenum Press W. Kaim, A. Klein: Spectroelectrochemistry. Cambridge: RSC Publishing Dunsch L.: J. Solid State Electrochem. 15, 1631 (2011). 4. Boteva A., Krasnykh O.: Chem. Heterocycl. Compd. 45, 757 (2009). 5. Nishinaga T., Komatsu K.: Org. Biomol. Chem. 3, 561 (2005). 6. Barbieriková Z., Bella M., Kučerák J., Milata V., Jantová S., Dvoranová D., Veselá M., Staško A., Brezová V.: Photochem. Photobiol. 87, 32 (2011). 7. Bella M., Schultz M., Milata V., Koňariková K., Breza M.: Tetrahedron 66, 8169 (2010). 67

70 Determination of Midazolam by HPLC with UV Detection and by GC with Nitrogen- Phosphorus Detector in Rabbit Plasma (Stanovení anestetika midazolamu pomocí HPLC s UV detekcí a GC s dusíkofosforovým detektorem v krvi králíka) Jana Matějčková a, Martin Jaček a, Jiří Málek b, and Eva Samcová a a Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Department of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Ruská 87, Prague 10, Czech Republic jana.matejckova@seznam.cz b Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Anaesthesiology and Resuscitation, Šrobárova 50, Prague 10 Abstract A HPLC method with UV detection and GC method with nitrogen-phosphorus detector for determination of anesthetic midazolam were developed. The LOD for HPLC method is 3,4 ng/ml and for GC method is 0,34 ng/ml. Repeatability of both methods are satisfactory for monitoring midazolam in plasma. Both methods were used for determination of midazolam in rabbit blood samples after nasal application (1 mg/kg). Both methods give comparable results. Key Words: Midazolam, Fentanyl, GC, NPD, HPLC-UV. Úvod Midazolam (MDZ Obr. 1) je látka ze skupiny benzodiazepinů, která se používá pro navození sedace a anestezie při lékařských zákrocích. MDZ má anxiolytické, antikonvulzivní a myorelaxační účinky. MDZ je v organismu rychle metabolizován za vzniku 1 -hydroxymidazolamu jako hlavního produktu, v malém množství vzniká též 4-hydroxymidazolam a 1, 4-dihydroxymidazolam 1,2. Obr. 1. Struktura anestetika midazolamu a interního standardu fentanylu. Pro stanovení benzodiazepinů v biologickém materiálu je možné využít imunnoassay metody, známé pod zkratkami EIA, ELISA a RIA. Nevýhodou těchto metod je jejich nízká selektivita 2. Pro stanovení MDZ v biologických vzorcích se využívá vysokoúčinných separačních technik jako je plynová chromatografie (GC) s dusíko-fosforovým detektorem (NPD) 3, s detektorem elektronového záchytu (ECD) nebo hmotnostní detekcí 4. Další metodou je kapalinová chromatografie (HPLC) s UV detekcí při 200 nm nebo s hmotnostní detekcí 5-7. Cílem této práce je vývoj HPLC a GC metody pro stanovení plazmatických hladin MDZ v krvi králíka po netradičních způsobech aplikace. Jde především o nazální, konjunktivální či transbukální podání, které nachází uplatnění v medicíně katastrof, kdy nejsou běžné způsoby aplikace dosažitelné. 68

71 Experimentální část Klinický experiment MDZ byl aplikován pomocí mikrostříkačky s kanylou do jedné nozdry králíka (plemeno, činčila šedá) v množství 1 mg/ kg tělesné váhy. Krev byla odebírána ve třech intervalech do ztráty reflexu polohy. Odběr krve byl proveden z aurikulární žíly kanylou. Odběry byly provedeny ve 3., 14. a 30. min po podání anestetika. Odebraná krev byla centrifugována a oddělená plazma byla ihned zamražena tekutým dusíkem. Jako interní standard byl použit fentanyl (obrázek 1). Kalibrační roztoky byly připravovány pomocí standardního roztoku MDZ (Midazolam, 5 mg/ml, Torrex CHIESI Pharma GmBh, Rakousko). Tento roztok byl naředěn na různé koncentrace a ty pak byly přidávány ke krevní. HPLC stanovení HPLC měření byla provedena na přístroji HPLC (Schimadzu, Japonsko), zahrnujícím pumpu LC-10ADvp, autosampler SIL-10ADvp, UV/Vis detektor SPD-10Avp. Použita byla kolona Ascentis Express RP-Amide 10 mm x 3 mm, s velikostí částic 2,7 m. Mobilní fáze byla míchána z acetonitrilu (LachNer, 99%) a deionizované vody (okyselené HClO 4 na ph 2,7) v poměru 30:70 (v/v) po celou dobu analýzy. Průtok mobilní fáze byl 0,4 ml/min s maximálním tlakem 23 MPa. Odezva detektoru byla zaznamenávána při vlnové délce 200 nm. Pro ovládání přístroje a vyhodnocení chromatogramů byl použit software LCSolution verze 1.11SP1. Vzorky krevní plazmy byly připraveny odpipetováním 500 l plazmy, 100 l interního standardu (fentanyl, 2 g/ml) a 100 l 1,5 M NaOH. Směs byla promíchána a extrahována 2 x 2 ml hexanu. Extrakt byl vysušen proudem dusíku při 40 o C, rozpuštěn v 50 µl mobilní fáze a 10 µl takto připraveného vzorku bylo nadávkováno na kolonu. GC stanovení GC měření byla provedena na přístroji GC-17A (Shimadzu, Japonsko) s dusíko-fosforovým detektorem FTD-17. Použita byla kolona Zebron ZB-5 (Phenomenex, USA) 30 m x 0,25 mm, 0,25 m. Jako nosný plyn bylo použito He (99,996%, Linde) o průtoku 2,4 ml/min a lineární průtokové rychlosti 53 cm/s. Nástřikový port pracoval ve splitless režimu s vložkou s deaktivací Siltek. Teplota nástřikového portu byla 340 o C a teplota detektoru 370 o C. Proud NPD lože byl nastaven v rozmezí pa podle stupně opotřebení. Průtok vodíku a vzduchu detektorem byl nastaven na hodnoty 3,4 ml/min a 125 ml/min. Průtok He detektorem byl nastaven manometrem na 80 kpa. Teplotní program začal na 180 o C po dobu 1,5 min s následným gradientem 20 o C/min na 230 o C držených 9 min a gradientem 5 o C/min na 270 o C držených 1 min. Poslední gradient 80 o C/min na 340 o C držených 7 min sloužil k rychlému odstranění nečistot z kolony před další analýzou. Vzorky krevní plazmy byly připraveny odpipetováním 200 l krevní plazmy, 50 l interního standardu (fentanyl, 200 ng/ml), 40 l 10M NaOH a 600 l 5% isopropanolu v butylchloridu. Směs byla 5 min protřepávána a následně krátce centrifugována. Horní organická frakce byla odebrána do vialky se 400 l 1M HCl. Směs byla znovu 5 min třepána a krátce zcentrifugována. Horní organická frakce byla odstraněna a zbylý roztok byl alkalizován přídavkem 100 l 10M NaOH. Vzorek byl poté 40 min třepán. Ke směsi bylo napipetováno 600 l butylchloridu a 5 min protřepáváno. Po krátké centrifugaci byla organická fáze odebrána a vysušena proudem dusíku při 40 o C. Odparek byl rozpuštěn ve 20 l toluenu a 4 l byly nastříknuty na GC. Výsledky a diskuse Při stanovení MDZ v krevní plazmě metodou HPLC byla použita krátká separační kolona, která umožňuje rychlou analýzu. Při vývoji metody byl sledován vliv průtoku mobilní fáze 69

72 (0,7-0,3 ml/min), složení mobilní fáze (acetonitril:methanol:voda) a množství dávkovaného vzorku (5-20 l vzorku). Nejoptimálnější stanovení bylo za podmínek složení mobilní fáze acetonitril:voda (okyselená HClO 4 na ph 2,7) v poměru 30:70 (v/v). Optimální průtok mobilní fáze byl 0,4 ml/min. Pro úplné oddělení MDZ od všech ostatních komponent krevní plazmy bylo dávkováno 10 l vzorku. Metoda použitá při GC stanovení MDZ byla původně používána pro stanovení fentanylu v krevní plazmě 9. Po optimalizaci přípravy vzorku však dává velmi dobré výsledky i při stanovení MDZ. V posledním kroku alkalizace bylo nutné rozdělit vzorek od extrakce chlorbutanem a ponechat dostatečný čas pro opětovný vznik benzodiazepinového cyklu. Tímto krokem byla zvýšena výtěžnost extrakce vzorku z původních 80 % na 99,6 %. Zlepšila se i přesnost výsledků udaná jako variační koeficient z původních 20 % na 3,4 %. Důvod použití zpětné extrakce byla snaha získat co nejčistší extrakt s minimálním množstvím dalších látek (např. látek lipidové povahy). To vede také k udržení větší čistoty NPD lože a prodloužení jeho životnosti. Ukázkový GC- (graf A) a HPLC-chromatogram (graf B) krevní plazmy králíka o koncentraci MDZ 75 ng/ml je uveden na Obr. 2. Obr. 2. Stanovení MDZ v krevní plazmě činčily o koncentraci 75 ng/ml. A GC stanovení s NPD detekcí; B HPLC stanovení s UV detekcí při 220 nm. Identifikace píků: 1 midazolam, 2 fentanyl. Parametry kalibrační závislosti vypočtené z plochy píku pro vzorek MDZ v krevní plazmě pro HPLC i GC stanovení jsou shrnuty v Tabulce I. Pro sestrojení kalibrační závislosti v plazmě byla použita metoda přídavku standardu MDZ k biologickému materiálu. Limity detekce, vypočítané z výšky píku odpovídající trojnásobku šumu detektoru, jsou pro obě metody dostatečně nízké pro stanovení MDZ v krevní plazmě králíka po nazálním podání MDZ. Pro GC stanovení je limit detekce 0,34 ng/ml, což je 10x nižší než u HPLC stanovení. Zároveň je pro GC stanovení použito pouze 200 l krevní plazmy a k HPLC stanovení 500 l plazmy. V klinických pokusech na zvířatech je vždy výhodnější použití menšího množství biologického materiálu. 70

73 Tabulka I. Parametry kalibrační závislosti HPLC a GC metody pro MDZ v krevní plazmě. V závorkách jsou uvedeny hodnoty směrodatných odchylek. Parametr HPLC stanovení GC stanovení Retenční čas MDZ (min) 3,39 (0,01) 14,52 (0,03) Testované koncentrační rozmezí (ng/ml) ,5-600 Citlivost ( V s ng -1 ml) 645 (4) 1479 (25) Úsek ( V s) 2714 (1178) (4322) Korelační koeficient R 0, ,99914 LOD (ng/ml) 3,7 0,34 Celková doba stanovení včetně přípravy vzorku je 60 min. pro HPLC a 120 min. pro GC. Opakovatelnost chromatografických stanovení byla testována na 6 analýzách vzorku krve. Hodnota opakovatelnosti metody s koeficientem variace pro koncentraci 75 ng/ml je pro HPLC 2,0 % a pro GC stanovení 3,4 %. Obě hodnoty jsou vyhovující a odpovídají opakovatelnosti chromatografických metod. Hodnoty analytické výtěžnosti pro přídavek MDZ 75 ng/ml ke krevní plazmě jsou pro HPLC stanovení 104,4 % a pro GC stanovení 99,6 %. Pomocí HPLC i GC metody bylo změřeno 18 reálných vzorků krve králíka po předchozí aplikaci MDZ. Stanovené koncentrace MDZ se pohybovaly v rozmezí ng/ml pro HPLC ng/ml pro GC. Jednovýběrový t-test na hladině významnosti 0,05 neprokázal statisticky významný rozdíl mezi oběma metodami. Provedená klinická studie ukázala, že po 3 min od nazálního podání anestetika je plazmatická koncentrace MDZ 171 ± 87 ng/ml, po 14 min 132 ± 66 ng/ml a po 30 min 81 ± 41 ng/ml. MDZ je v těle rychle metabolizován a jeho plazmatická koncentrace klesá po 30 min. od aplikace na 50%. Závěr Pro stanovení plazmatických hladin anestetika midazolamu v krvi králíka byla vyvinuta metoda HPLC s UV detekcí a metoda GC s dusíko-fosforovým detektorem. Stanovení pomocí HPLC je rychlejší (10 min) s menšími požadavky na úpravu vzorku v porovnání s 30 min dobou stanovení pomocí GC. Na druhou stranu GC metoda poskytuje 10krát nižší limit detekce a má širší klinické uplatnění. Obě metody byly použity při stanovení MDZ v reálných vzorcích krve králíka a poskytly srovnatelné výsledky. Z provedené klinické studie vyplynulo, že MDZ je v těle rychle metabolizován a po 30 min od aplikace klesá jeho koncentrace na polovinu. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu IGA NT Literatura 1. Juřica J., Dostálek M., Konečný, Glatz Z., Hadašová E., Tomandl J.: J Chromatogr. B 852, 571 (2001). 2. Drummer O. H.: J Chromatogr. B 713, 201 (1998). 3. Raikos N, Theodoridis G., Alexiadou E., Gika H., Argiriadou H., Parlapani H., Tsoukali H.: J. Sep. Sci. 32, 1018 (2009). 4. Kaartama R., Jarho P., Savolainen J., Kokki H., Lehtonen M: J Chromatogr. B 879, 1668 (2011). 5. Hamdy D. A, Brocks D. R.: Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 53, 617 (2010). 71

74 6. Svanstrom C., Hansson G. P., Svensson L. D., Sennbro C. J.: Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 58, 71 (2012) 7. Portier E. J. G., de Blok K., Butter J. J., van Boxtel C. J.: J Chromatogr. B 723, 313(1999). 8. Dussy F. E., Hamberg C., Briellmann T. A.: Int J Legal Med 120, 323 (2006). 9. Choi H. S., Shin H. C., Kyany G., Rhee J. M., Lee H. B.: J Chromatogr. B 765, 63(2001). 72

75 Screen-Printed Carbon Electrodes with Porous Copper Film (Uhlíkové tištěné elektrody s porézním filmem mědi) Radovan Metelka and Pavlína Vlasáková University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry, Studentská 573, Pardubice, Czech Republic, radovan.metelka@upce.cz Abstract Porous copper films were formed on the surface of screen-printed carbon electrodes via colloidal crystal template technique. The template made of self-assembled monodisperse polystyrene spheres of 200 nm or 500 nm diameters was coated by the copper using galvanostatical deposition from a plating solution. The porous structure was revealed after dissolution of spheres in toluene. The morphology of the final deposit was ascertained with the aid of SEM. Analytical performance of prepared porous electrodes was tested in hydrodynamic amperometry of glucose and other saccharides in alkaline solution and compared to that of screen-printed carbon electrodes with ex situ copper film. Increased current responses were observed at porous electrodes due to the enlarged surface area. Key Words: Porous electrodes, Copper, Colloidal crystal templating, Screen-printed carbon electrodes, Glucose. Úvod Úprava pracovního povrchu elektrody je jednou z cest pro zlepšení analytických parametrů elektrochemického senzoru. Vhodnou technologií lze několikanásobně zvětšit elektroaktivní povrch elektrody v porovnání s její geometrickou plochou. Z řady dostupných možností se často využívá tvorby porézních vrstev různými postupy 1. Jednoduchou technikou pro přípravu uspořádaných porézních struktur se širokými možnostmi je vzorování koloidního krystalu (z angl. colloidal crystal templating) 2. Při ní vytvářejí monodisperzní kulové částice o průměru stovek nanometrů samouspořádáním nebo mechanickým působením koloidní krystaly. Do volného prostoru mezi částicemi je poté vpraven kapalný prekurzor, který je následně vhodným způsobem převeden do pevného stavu a po odstranění vzoru rozpuštěním nebo vyšší teplotou se získá vrstva porézního materiálu. Velikost pórů je pak dána průměrem použitých kuliček. Vylučování požadovaného materiálu elektrodepozicí přináší řadu výhod. Lze snadno kontrolovat množství vyloučeného depozitu, proces probíhá rychle v celém objemu mezer vzoru, který tak není mechanicky namáhán a je možné připravovat porézní vrstvy z kovů, jejich slitin a oxidů, polovodičů a vodivých polymerů 3. Výsledné strukturované materiály jsou použitelné v optice, katalýze, palivových článcích nebo senzorech. Využití výše uvedené techniky k přípravě kovových porézních elektrod pro elektrochemické senzory bylo publikováno pouze v několika málo případech. Jsou popsány (bio)senzory na bázi modifikovaných zlatých elektrod 4-6 a porézní bismutové 7 a antimonové 8 filmové elektrody pro stanovení těžkých kovů. Tento příspěvek se zabývá přípravou a možným analytickým využitím měděných porézních vrstev, vytvořených na substrátu uhlíkové tištěné elektrody vzorováním koloidního krystalu z monodisperzních kuliček polystyrenu. Byla sledována elektrochemická oxidace vybraných sacharidů na těchto elektrodách v alkalickém prostředí 9 a zjištěné charakteristiky byly porovnány s uhlíkovými tištěnými elektrodami s neporézním filmem mědi, vytvořeným elektrodepozicí ex situ z pokovovacího roztoku. 73

76 Experimentální část Příprava uhlíkových tištěných elektrod s filmy mědi Uhlíková tisková pasta (typ C10903P14, Gwent Electronics Materials, Velká Británie) byla vytištěna na keramické substráty (typ CLS R, Coors Ceramics, USA) pomocí poloautomatického tiskového stroje UL 1505 A (Tesla, Česká republika). Vytvořená vrstva byla poté vytvrzována 30 min při 60 C v sušárně. Pro přípravu porézní vrstvy mědi byly na povrch elektrody umístěny kruhové formy s plochou 0,1 cm 2 a do nich napipetováno 30 µl 0,3 1% vodné suspenze monodisperzních polystyrenových kuliček (Sigma-Aldrich, Německo) o průměru 200 a 500 nm. Po odpaření rozpouštědla a vytvoření koloidního krystalu samouspořádáním kuliček byly formy odstraněny a elektroda byla opatrně ponořena do pokovovacího roztoku 0,1 M Cu(NO 3 ) 2, okyseleného na ph 2 přídavkem konc. HNO 3. Po delším ponechání elektrody v roztoku k dostatečné penetraci roztoku do struktury koloidního krystalu byla přes něj galvanostaticky vyloučena měď proudem -1,5 ma s různým časem depozice. Následně byly polystyrenové kuličky odstraněny ponořením elektrody do toluenu na 15 min a po opláchnutí destilovanou vodou a osušením byla elektroda izolována bezbarvým lakem na nehty. Pro srovnávací měření byly připraveny také uhlíkové tištěné elektrody s filmem mědi, vytvořeným galvanostatickou depozicí proudem -1,5 ma po zvolenou dobu ve výše uvedeném pokovovacím roztoku. Před vlastní depozicí byla vymezena plocha pracovní elektrody 0,1 cm 2. Morfologie depozitů byla sledována rastrovacím elektronovým mikroskopem JSM-5500LV (JEOL, Japonsko) se zobrazením pomocí sekundárních elektronů a urychlovacím napětím 15 a 20 kv (porézní elektrody). Elektrochemická detekce sacharidů Cyklické voltamogramy byly měřeny na elektrochemickém analyzátoru BAS 100B/W s drátkovou Pt pomocnou a Ag/AgCl/3 M KCl referentní elektrodou (vše BASi, USA). Byly použity následující experimentální parametry: počáteční potenciál 0 V, koncový potenciál 800 mv a rychlost polarizace 50 mv s 1. Při technice hydrodynamické amperometrie byl měřený roztok míchán teflonovým míchadlem při 600 ot min 1 a proud byl zaznamenáván při potenciálu detekce +600 mv vs. Ag/AgCl. Modelové roztoky galaktózy, fruktózy (obě Sigma-Aldrich, Německo), glukózy a sacharózy (obě Lachema, Česká republika) o koncentraci 1 mm byly připraveny v základním elektrolytu 0,1 M NaOH a po zředění dávkovány po ustálení základní linie. Hodnota proudu byla poté odečítána 50 s po nadávkování přídavku sacharidu. Výsledky a diskuse Morfologie výsledných porézních vrstev mědi na heterogenním uhlíkovém substrátu je do značné míry ovlivněna průměrem použitých polystyrenových kuliček. Sice se podařilo vytvořit požadovanou strukturu i s kuličkami o průměru 200 nm, avšak výsledná vrstva byla značně nesourodá. Na ploše elektrody se vytvořily různé agregáty, obsahující jak porézní, tak i neporézní depozit mědi spolu s nerozpuštěnými shluky uspořádaných kuliček (Obr. 1). Naopak při použití částic o průměru 500 nm a stejné době rozpouštění v toluenu byly v závislosti na koncentraci polystyrenových kuliček a času depozice pozorovány izolované porézní ostrůvky mědi až rozsáhlé souvislé oblasti s pravidelnou porézní strukturou (Obr. 1). Pouze tento průměr kuliček byl proto dále používán pro přípravu porézních elektrod. Měděné filmové elektrody byly charakterizovány cyklickou voltametrií některých sacharidů v alkalickém prostředí. Pro tento účel byly připraveny porézní vrstvy z 1% suspenze částic a provedena galvanostatická depozice mědi po dobu 120 s při -1,5 ma. Za stejných parametrů byl vytvořen i neporézní film mědi. Na obr. 2 jsou uvedeny získané záznamy pro roztok glukózy, kde lze pozorovat významné zvýšení proudové hustoty (přepočítané na 74

77 geometrickou plochu) na porézní elektrodě. Podobný charakter záznamů poskytují i ostatní měřené sacharidy. Při jejich elektrochemické oxidaci se předpokládá interakce s vrstvou oxidu/hydroxidu, vytvořenou na povrchu elektrody, dochází k adsorpci a následné oxidaci 9. Pro tento typ elektrochemické reakce s adsorpcí sledované látky se uvádí nárůst měřených proudů až o dva řády pro případ makroporézních elektrod (póry větší než 50 nm) 2. Obr. 1. SEM fotografie porézní (vlevo) a neporézní měděné filmové SPCE (vpravo). Vzor ze suspenze 0,5 % polystyrenových kuliček o průměru 500 nm, depozice mědi 60 s. Obr. 2. Cyklické voltammogramy 1 mm glukózy v 0,1 M NaOH na porézní (plná čára) a neporézní měděné filmové SPCE (čerchovaná čára) a na čisté SPCE (tečkovaná čára). Při amperometrickém sledování oxidace glukózy za míchání roztoku základního elektrolytu jsou patrné větší odezvy porézní elektrody na zvyšování koncentrace analytu oproti ex situ filmové měděné elektrodě. Směrnice kalibrační přímky je zhruba čtyřikrát větší a tento poměr je víceméně zachován i při měření roztoků glukózy až do koncentrace 2 µm. Pro sacharózu a galaktózu byly zjištěny podobné závislosti, u fruktózy nebyl proudový nárůst na porézních elektrodách tak výrazný jako u ostatních sacharidů. 75

78 Obr. 3. Hydrodynamická amperometrie glukózy na a) čisté SPCE, b) neporézní a c) porézní měděné filmové SPCE spolu s odpovídajícími kalibračními závislostmi. Závěr Porézní vrstvy různých materiálů připravené technikou vzorování koloidního krystalu umožňují další zvýšení citlivosti elektrochemických senzorů zvětšením jejich dostupné elektroaktivní plochy. Vlastní provedení není experimentálně náročné ani nákladné, je nutná pouze opatrná manipulace se senzorem po odpaření rozpouštědla před depozicí materiálu, aby nedošlo k mechanickému poškození koloidního krystalu a rozpadu celé struktury. Získané výsledky na porézních měděných elektrodách jsou slibné např. pro detekci glukózy v klinických vzorcích. Poděkování Příspěvek vznikl za podpory Grantové agentury ČR (projekt P206/12/0381) a Interní grantové agentury Univerzity Pardubice (projekt SGFChT06/2012). Literatura 1. Walcarius A.: Anal. Bioanal. Chem. 396, 261 (2010). 2. Walcarius A., Kuhn A.: Trend. Anal. Chem. 27, 593 (2008). 3. Bartlett P. N., Baumberg J. J., Birkin P. R., Ghanem M. A., Netti M. C.: Chem. Mater. 14, 2199 (2002). 4. Szamocki R., Reculusa S., Ravaine S., Bartlett N. P., Kuhn A., Hempelmann R.: Angew. Chem. Int. Edit. 45, 1317 (2006). 5. Szamocki R., Velichko A., Holzapfel C., Mücklich F., Ravaine S., Garrigue P., Sojic N., Hempelmann R., Kuhn A.: Anal. Chem. 79, 533 (2007). 6. Ben-Ali S., Cook A. D., Evans S. A. G., Thienpont A., Bartlett N. P., Kuhn A.: Electrochem. Commun. 5, 747 (2003). 7. Urbanová V., Bartoš M., Vytřas K., Kuhn A.: Electroanal. 22, 1524 (2010). 8. Urbanová V., Vytřas K., Kuhn A.: Electrochem. Commun. 12, 114 (2010). 9. Sun F, Li L., Liu P., LianY.: Electroanal. 23, 395 (2011). 76

79 New Characterisation Approaches for Carbon Ionic Liquid Electrodes (CILES) (Nové přístupy k charakterizaci uhlíkových elektrod s iontovými kapalinami) Tomáš Mikysek a, Matěj Stočes a, Ivan Švancara a, Karel Vytřas a, and Jiří Ludvík b a University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry, Studentská 573, Pardubice,Czech Republic, Tomas.Mikysek@upce.cz b J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, jiri.ludvik@jh-inst.cas.cz Abstract Within this study, some new approaches to characterize the carbon paste mixtures and the respective carbon ionic liquid electrodes (CILEs) are presented and their properties discussed. Particular attention has been paid to the changes of the resistivity, relative to the dependence on composition of the CILE. Three types of carbon ionic liquid pastes were examined, and for the interpretation of experimental data, the results were compared with those of "classic" carbon paste electrode (CPE) based on graphite powder. Some problems connected with homogeneity and stability of carbon pastes are also discussed. Key Words: carbon, paste, electrode, ionic liquid, characterisation. Úvod Uhlíkové pastové elektrody (CPEs) se staly nedílnou součástí elektroanalytické chemie a na toto téma vyšla od roku 1958, kdy byla publikována první práce R. N. Adamsem 1, celá řada prací 1-5. Nicméně při přípravě každé nové uhlíkové pastové elektrody je nezbytné provést její základní charakterizaci. V minulosti byly popsány některé charakterizační přístupy 2, 6, 7, které se postupem času měnily s různými složkami pastových směsí. 8 V současné době byla řada prací, popisující charakterizace nových typů CPE, rozšířena o měření ohmického odporu v závislosti na složení a zároveň byly zveřejněny některé nové aspekty, které je nutné brát v úvahu při přípravě kvalitní uhlíkové pastové elektrody 9, 10. Charakterizace je stále aktuálním tématem, jelikož se stále objevují nové uhlíkové materiály spolu s novými typy pojiv, které tvoří hlavní složky pastové směsi. Prvním významným krokem vpřed bylo využití uhlíkových nanotrubiček v elektrochemii a elektroanalýze s uhlíkovými pastovými elektrodami. Uhlíkové nanotrubičky (CNTs) přinesly nové možnosti a v případě CNTPEs (z angl. Carbon Nanotubes Paste Electrodes ) nahradily tradiční grafit 11, 12. Později byly uhlíkové nanotrubičky využity spíše jako modifikátor CPEs 4. V posledních deseti letech se staly populárními iontové kapaliny RTILs ( Room-Temperature Ionic Liquids) a díky jejich vlastnostem došlo i na jejich využití v oblasti uhlíkových pastových elektrod Použitím iontových kapalin jako pojiva CPE se ve svých pracech věnovali Liu 14 a Safavi 16 a stejně jako v případě uhlíkových nanotrubiček vznikly dva typy nových uhlíkových pastových elektrod: (i) CILEs ( Carbon Ionic Liquid Electrodes ); (ii) IL- CPEs ( Ionic Liquid-Modified Carbon Paste Electrodes ) 3, přičemž v druhém případě bývá iontová kapalina použita jako další složka a slouží jako speciální modifikátor. U všech výše uvedených typů nových CPEs byla provedena nezbytná základní charakterizace, jelikož iontové kapaliny významně mění vlastnosti elektrodového materiálu (např. změny vodivosti, elektrokatalytické jevy, aktuální intenzita nabíjecího proudu, aj.) V tomto příspěvku je prezentována charakterizace CILEs z pohledu zkoumání fyzikálněchemických vlastností, které korespondují s elektrochemickými měřeními. Výsledky a pozorování byly srovnány s předchozími výsledky publikovanými pro CPE a CNTPEs 9,

80 Experimentální část Chemikálie Hexakyanoželezitan draselný (p.a. kvalita), chlorid draselný, KCl (Suprapur) obojí dodáno firmou Merck. Všechny potřebné roztoky byly připraveny z deionizované vody pomocí systému Milli-Q od firmy Millipore. Instrumentace Všechna elektrochemická měření byla prováděna na přístroji AUTOLAB (model "PGSTAT- 128"; Metrohm - Autolab B.V., Utrecht, Nizozemí), ke kterému byla připojena měřicí cela s tří-elektrodovým systémem obsahujícím pracovní elektrodu (viz. níže), referentní elektrodu Ag AgCl 3 M KCl a pomocnou elektrodu (Pt). Uhlíkové pastové elektrody Směsi uhlíkových past byly připravovány smísením určitého množství uhlíku s pastovou kapalinou a následnou homogenizací v třecí misce. Během experimentu byly používány dva typy uhlíku: a) "CR-5" (spektroskopický grafit s velikostí částic 5 m; Maziva Týn nad Vltavou, Česká republika) b) skelný uhlík ("Sigradur-G", HTW Meitingen, Německo). Pastovou kapalinou byl buď (i) trihexyltetradecylfosfonium dicyanamid (označen v textu jako "IL-1"; od Merck), nebo (ii) 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorofosfát ("IL-2"; Sigma- Aldrich). Po homogenizaci byla směs naplněna do teflonového pouzdra s otvorem o průměru 2 mm. Z kombinací uhlíkového materiálu a pastové kapaliny byly připraveny následující směsi: CR-5/IL-1, CR-5/IL-2, GC/IL-2 s různým procentuálním zastoupením pastové kapaliny ve směsi. U čerstvě připravené série elektrod byl změřen ohmický odpor a následně byl obnoven povrch otřením o filtrační papír. Postupy Měření ohmického odporu Ve všech případech tělo elektrody bylo umístěno vertikálně tak, aby se elektrodový povrch dotýkal vodivé podložky. Kovový píst (součást elektrodového těla) byl druhým kontaktem připojeným na multimetr ( Voltcraft ; Conrad Electronics, SRN). Cyclická Voltametrie (CV) Tyto experimenty byly prováděny v roztoku 0,1 M KCl obsahujícího 5 mm K 3 Fe(CN) 6. U většiny experimentů počáteční potenciál byl 0,0 V vs. Ag/AgCl a změna potenciálu probíhala v katodickém směru a následně pak v anodickém při rychlosti polarizačního napětí 50 mv/s; vše při trojím opakování. Před každým měřením byl roztok důkladně probublán argonem a čerstvě obnoven povrch elektrody. Výsledky a diskuse Tato studie navazuje na předchozí charakterizace 9, 10, které byly prováděny jak s tradičními uhlíkovými pastovými elektrodami, tak s elektrodami z uhlíkových nanotrubiček (CNTPEs). První část experimentů byla zaměřena na měření ohmického odporu. Podle modelu nejtěsnějšího možného uspořádání částic 9 dochází k tomu, že měrný odpor se nijak dramaticky nemění s rostoucím množstvím pojiva v pastové směsi až do mezní hodnoty, kde dochází k prudkému zvýšení měrného odporu (viz. obr.1 vlevo). Tento efekt byl pozorován jak u klasických CPE tak u CNTPE a také u zde prezentovaných CILEs. U CPE se tato mezní hodnota (zlom) pohybuje kolem 25% (hm.) pojiva ve směsi, a překvapivě v případě CNTPE tato hodnota je až u 60% (hm.), u CILEs pak hodnota zlomu je někde kolem 40-45% (hm.). 78

81 Vysvětlení samotné existence zlomu vychází z výše uvedeného modelu nejtěsnějšího možného uspořádání částic 9, kde v případě CPE dochází, během přídavku 20-30% pojiva, k tomu, že pojivo nejprve vyplní všechen zbývající prostor mezi uhlíkovými částicemi, které zůstávají ve stálém kontaktu. Po překročení této hranice částice začnou plavat v pastové kapalině, dojde k postupnému snižování míry kontaktu mezi nimi, což má za následek prudký nárůst ohmického odporu. V případě CNTPEs lze výrazný posun hodnoty zlomu vysvětlit faktem, že uhlíkové nanotrubičky jsou schopny adsorbovat poměrně velké množství pojiva díky velkému lipofilnímu povrchu a také díky jejich vláknité struktuře, zabraňující samovolnému vytékání pojiva ( krvácení elektrody). Experimenty s oběma typy CILEs (CR-5/IL-1, CR-5/IL-2) v kombinaci se spektroskopickým grafitem ukázaly, že zlom se pohybuje někde u % (hm.), tedy mezi oběma dříve prezentovanými typy uhlíkových past (CPE, CNTPE). Při provedení stejného experimentu se skelným uhlíkem (směs GC/IL-2) se ale ukázalo, že zlom nastává již kolem 30 % (hm.) stejně jako v předchozích případech směsi grafitu CR-5 s jinými pojivy (silikonový, parafínový olej) 9. Posunutí zlomu na 40-45% (hm.) pastové kapaliny u kombinace CR-5/IL-1 a CR-5/IL-2 (oproti CR-5/SO či CR-5/PO) ukazuje na to, že iontová kapalina výrazněji proniká do grafitického materiálu (resp. silněji se adsorbuje na jeho povrchu). Na druhé straně samotná vodivost iontové kapaliny zde zřejmě nehraje klíčovou roli, neboť při použití skelného uhlíku zlom nastává při zhruba stejném složení pasty jako s tradičními pojivy. Obr. 1. Závislost měrného odporu (rezistivity) uhlíkové pasty typu CR-5/IL-1 na množství použitého pojiva (vlevo); závislost rozdílu katodického a anodického píku systému 4 3 Fe(CN) 6 / Fe(CN) 6 pro směs CR-5/IL-1 na množství použitého pojiva (vpravo). Podmínky měření viz. experimentální část. Druhou částí charakterizace bylo zkoumání elektrochemického chování jednotlivých typů připravených elektrod. K těmto účelům bylo využíváno cyklické voltametrie (CV) a 4 3 standardního elektrodového systému Fe(CN) 6 / Fe(CN) 6 (5 mm v 1 M KCl), jehož chování na běžných elektrodách je takřka ideálně reverzibilní (tj. rozdíl potenciálů anodického a katodického píku, E P = 59 mv), zatímco na površích uhlíkových past příslušná hodnota E P dosahuje 150 mv anebo i více. Tento vyšší rozdíl mezi anodickým a katodickým píkem odráží nárůst odporu (= pokles vodivosti) elektrody způsobený nadbytkem pojiva a v případě výše uvedeného elektrochemického měření nastává při překročení hodnoty zlomu. 79

82 Elektrochemický zlom u CPE koresponduje se zlomem zjištěným při měření odporu, podobně jako v případě CNTPE. U past připravených z nanotrubiček je rozdíl katodického a anodického potenciálu píku nižší než u klasické CPE, což je opět způsobeno vláknitou strukturou uhlíkových nanotrubiček, které mají lepší celkovou vodivost než grafitové shluky v případě CPE. V případě testovaných CILEs je situace poněkud složitější. Zatímco v případě CPE, CNTPE a také CR-5/IL-1, elektrochemický zlom koresponduje se zlomem získaným při měření odporu, u směsi CR-5/IL-2 tato skutečnost neplatí a zatímco s nárůstem pojiva IL-2 nad 45% (hm.) dochází k nárůstu měrného odporu (poklesu vodivosti), rozdíl katodického a anodického potenciálu se výrazněji nemění i když dochází k poklesu proudu v důsledku nižšího obsahu uhlíku ve směsi. Tento problém a jeho vysvětlení spočívá pravděpodobně v tom, že IL-2 v měřeném roztoku (K 3 Fe(CN) 6 v KCl) přestavuje fázové rozhraní dvou navzájem nemísitelných elektrolytů a tudíž může být uvažován elektrodový děj s přenosem náboje na tomto rozhraní. Rozdílné chování dvou zkoumaných iontových kapalin může být způsobeno jejich rozdílnou strukturou a rozpustností, což je výzva pro další studie. Pomocí cyklické voltametrie bylo také možno sledovat časovou stabilitu elektrodového materiálu. Elektrochemické chování jednotlivých elektrod v systému modelovém systému bylo zkoumáno ihned po jejich přípravě a poté se elektrody nechaly 5 dnů ve vertikální poloze za laboratorní teploty na vzduchu a následně pak byla zkoumána jejich elektrochemická aktivita v tomtéž sytému (viz. Obr. 1 vpravo). Výsledky ukázaly, že u elektrod s výrazně vyšším obsahem pastové kapaliny dochází k postupnému vytékání pojiva z elektrody, čímž se mění poměr uhlíkového materiálu a pastové kapaliny. Na základě měření odporu a vodivosti bylo možno rovněž ověřit, zda nedochází ke změnám složení a porušení homogenity elektrodového materiálu (např. ztráta pastové kapaliny) CILEs. U past s vyšším obsahem pojiva (60 hm.% a více) po určité době dochází ke krvácení elektrody. Naopak u past s minimem pastové kapaliny docházelo vysypání elektrodového materiálu z těla elektrody, plnění a vlastní příprava byla obtížná. Fyzikálně-chemické vlastnosti jsou jakýmsi prvním vodítkem k volbě a následné přípravě past. Závěr Jak ukázaly výše uvedené experimenty, měření ohmického odporu a rozdílu potenciálů píků modelového reverzibilního redox systému nabízejí základní informace o kvalitě a stabilitě uhlíkové pasty a zároveň vedou k nalezení optimálního poměru uhlíkového materiálu a pastové kapaliny. Prezentované výsledky dále poukazují na fakt, že optimální poměr jednotlivých komponent se může lišit pro různé druhy uhlíkových pastových elektrod. Hlavní pozornost byla věnována studiu CILEs a lze konstatovat, že optimální konzistence a složení směsí CR-5/ IL-1 a CR-5/ IL-2 je přibližně 35-40% (hm.) iontové kapaliny, zatímco při použití skelného uhlíku je lepší použít méně iontové kapaliny (pod 30% hm.), vždy před zlomovým bodem závislosti odpormnožství pastové kapaliny. Je-li obsah pastové kapaliny za uvedeným zlomem, pak naplnění pouzdra je obtížnější a pastová kapalina vytéká z elektrody. Na druhou stranu příliš málo pastové kapaliny vede k tomu, že pasta má spíše drobivou konzistenci a elektrodový materiál má tendenci se vysypávat z elektrody. Již osvědčená 5,9,10 a zde opět použitá charakterizace nabízí srovnání různých typů uhlíkových past (CPE, CNTPE, and CILE). K podrobnějšímu zkoumání mohou pomoci i některé další diagnostické techniky, jako např. electrochemická impedanční spektroskopie (EIS). 80

83 Poděkování Tato práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České Republiky projektu CZ.1.07/2.3.00/ "Posílení excelentních týmů výzkumu a vývoje na Univerzitě Pardubice". Literatura 1. Adams R.N.: Analytical Chemistry 30, 1576 (1958). 2. Olson C., Adams R.N.: Analytica Chimica Acta 22, 582 (1960). 3. Švancara I., Walcarius A., Kalcher K., Vytřas K.: Central European Journal of Chemistry 7, 598 (2009). 4. Švancara I., Kalcher K., Vytřas K., Walcarius A.: Electroanalysis with Carbon Paste Electrodes. CRC Press, Boca Raton Kalcher K., Švancara I., Metelka R., Vytřas K., Walcarius A., Heterogenous carbon based sensors, in: Grimes C.A., Dickey E.C., Pishko M.V. (Eds.) The Encyclopedia of Sensors, vol. 4, American Scientific Publishers, Stevenson Ranch, 2006, pp Rice M.E., Galus Z., Adams R.N.: Journal of Electroanalytical Chemistry 143, 89 (1983). 7. Švancara I., Schachl K.: Chemicke Listy 93, 498 (1999). 8. Švancara I., Vytřas K., Kalcher K., Walcarius A., Wang J.: Electroanalysis 21, 7 (2009). 9. Mikysek T., Švancara I., Kalcher K., Bartoš M., Vytřas K., Ludvík J.: Analytical Chemistry 81, 6327 (2009). 10. Mikysek T., Stočes M., Švancara I., Ludvík J.: RSC Advances DOI: /C2RA20202F (2012). 11. Rubianes M.D., Rivas G.A.: Electrochemistry Communications 5, (2003). 12. Valentini F., Amine A., Orlanducci S., Terranova M.L., Palleschi G.: Analytical Chemistry 75, (2003). 13. Tiyapiboonchaiya C., Pringle J.M., MacFarlane D.R., Forsyth M., Sun J.: Macromolecular Chemistry and Physics 204, 2147 (2003). 14. Liu H., He P., Li Z., Sun C., Shi L., Liu Y., Zhu G., Li J.: Electrochemistry Communications 7, 1357 (2005). 15. Rozniecka E., Shul G., Sirieix-Plenet J., Gaillon L., Opallo M.: Electrochemistry Communications 7, 299 (2005). 16. Maleki N., Safavi A., Tajabadi F.: Analytical Chemistry 78, 3820 (2006). 17. Liu H., He P., Li Z., Liu Y., Li J., Zheng L.: Electrochemical and Solid-State Letters 8, J17 (2005). 18. Shul G., Murphy M.A., Wilcox G.D., Marken F., Opallo M.: Journal of Solid State Electrochemistry 9, 874 (2005). 81

84 Assessment of Potential Risk Connected with the Use of Mercury and Mercury Electrodes (Zhodnocení potenciálního rizika spojeného s použítím rtuti a rtuťových elektrod) Tomáš Navrátil a, Ivan Švancara b, Karolina Mrázová c, Kateřina Nováková a, Jaromíra Chýlková b and Daniela Pelclová c a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, Tomas.Navratil@jh-inst.cas.cz b University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Studentská 573, HB/C, Pardubice, Czech Republic c Toxicological Information Centre, Department of Occupational Medicine of the First Faculty of Medicine, Charles University in Prague, Prague 2, Czech Republic Abstract This contribution tries to asses critically the danger connected with utilization of mercury in different branches of human activities. The main attention was devoted to electrochemistry, mainly to voltammetry and polarography. However, the other branches were characterized as well: dentistry, in battery production, mining industry, and a few others. The most toxic and contrarily almost nontoxic forms of mercury and of its compounds were characterized. Some interesting cases of exposure to mercury, according to the database of the Czech Toxicological Information Centre (TIC) (from years ), have been reported. Key Words: Mercury, Polarography, Voltammetry, Poisoning, Toxicity of mercury, Czech Toxicological Information Centre. Introduction Mercury is present in our environment as the only liquid metallic element under room temperature. For some people, it represents high danger in any form and dose. Nevertheless, the specialists know that this danger is relatively limited. For the people dealing with electrochemistry, the utilization is of mercury connected with the worldwide famous polarography and voltammetry. However, the human life has been accompanied with mercury for many hundreds or even for thousands of years. Even, the anthropogenic sources of mercury cover % of its present amount in the environment. In other words, up to about 40% of the total amount of this metal in the man s neighborhood is occurring without connection with human activities (soil erosion, volcanic activity, wood fires, evaporation of oceans, etc.) 1. On the other hand, there are many branches, where this very unique metallic element can find its field of application. We can mention the most important ones 1 : - Measuring devices (thermometers, tonometers, barometers, electrochemical devices, mainly polarographic and voltammetric analyzers); - Mining industry; - Electrolyzers; - Batteries; - Drugs; - Paints; - Dentistry. We are witnessing increasing fears of toxicity of mercury in the last decades, which has resulted in almost mercury-phobia, nowadays even reflected in resolutions of European parliament 2. Strict ecological and safety rules introduced in the world, as well as popular prejudices, fears and faults, essentially complicate the use of mercury (thermometers, manometers, tonometers for blood pressure, etc.) or liquid mercury containing electrodes 82

85 (including hanging mercury drop electrode (HMDE)). Thus, it is prohibited to sell the body thermometers containing mercury and the other similar devices (thermometers, barometers, sfygmomanometrs) 3, the batteries and accumulators containing more than (m/m) % of mercury 2, the button cells containing more than 2 % of mercury 2, and many other (mostly liquid) mercury containing devices. On the other hand, it is allowed to use and sell compact fluorescent lamps with mercury content below 5 mg per lamp 4, straight fluorescent lamps for general purposes with mercury content below 10 mg per halophosphate lamp, triphosphate lamp with a normal life time with mercury content below 5 mg per piece 4, special fluorescent lamps and other lamps for special purposes containing mercury 4, etc. 1. Experimental Methods of Mercury Determination It is necessary to take into account that mercury is present in different forms and concentration levels in the environment. Probably, the most common methods of mercury determination utilize spectroscopic techniques, more precisely, atomic absorption spectroscopy (AAS). It is applicable for the determination of mercury vapors as well as for the determination of this metal in solid forms (the solid or liquid material is thermally decomposed, the generated vapors are concentrated in the form of the gold amalgam from which mercury is released and determined using AAS (e.g., AMA 254, Altec, Czech Republic) 5. Limit of detection (LOD) of Hg amounts to 0.01 ng Hg, in urine 0.1 ng.l -1. Voltammetric techniques are applicable for Hg determination, too. For that purposes, commonly used mercury electrodes must be replaced by a gold electrode (similarly as in case of arsenic 6 determination) or by a glassy carbon electrode. Application of the respective methods is more complicated, because the electrode surfaces must be mechanically polished and finally electrochemically cleaned from the oxidation products and other rests of previous analyses. The LODs amount to about 0.03 to 0.1 μg L -1. Data Collection Data concerning mercury intoxication were extracted from the special database (programmed in MS Access) of the calls to the Czech TIC, Prague, between 1995 and 2011; the institution of choice being the only center in CR. In each inquiry, several data concerning the exposure were recorded according to the standard protocol, e.g., age and sex of the patient, time of the intoxication, dose and symptoms of intoxication and whether first aid and any treatment has already been administered. In addition, the prognosis of the patient at the time of the call was considered and, if needed, further management and therapy were recommended. In case that the patient needed a hospitalization, the discharge report from the hospital was asked for. Results and Discussion Various hygienic and similar limits valid for utilization of mercury, based on information gained from databases available in the Czech TIC, were summarized in 1, 7. We can mention some of them: Urine: Normal population level: 3-7 µg L -1, biological limit in urine (for workers according to the Czech legislation) 0.1 mg g -1 of creatinine (0.056 µmol mmol -1 of creatinine) 8, 9. Blood: Population level 4 10 µg L -1 ; biological limit for workers limit in Czech Republic is not given, in USA population level 8 µg L -1 and occupational limit in exposed workers 15 µg L -1 ; in case of acute intoxications 9 the levels are > 95 µg L -1. Air: Maximal allowed concentration: on average: 0.05 mg m -3 ; ceiling: 0.15 mg m -3, or mg m -3 in the USA (ACGIH)

86 Toxicity of Various Forms of Mercury According to the general rule valid in toxicology: the doses are the most important. On the other hand, it is necessary to add that the form is very important, too. The pattern and severity of toxicity are highly dependent on the form of mercury and the route of exposure 1, 10. The toxicity of the liquid mercury is connected with many fears and disinformation and therefore, it is a very frequently discussed topic 10. Liquid metallic mercury is poorly absorbed by the gastrointestinal tract, and acute ingestion has been associated with poisoning only in the presence of abnormal gut motility that markedly delays normal fecal elimination or after peritoneal contamination 7. On the other hand, inhalation of Hg vapors is very dangerous, because they are absorbed practically completely by lungs 1. Acute inhalation of high concentrations of mercury vapor may cause severe chemical pneumonitis and noncardiogenic pulmonary edema 11. Chronic intoxication from inhalation of mercury vapor produces a classic triad of tremor, neuropsychiatric disturbances, and gingivostomatitis 10. Mercury molecules, soluble in fats, come into brain circulation. They cross hematoencephalic barrier and they act neurotoxically. Hg is oxidized to Hg 2+ in brain tissue (these ions cross hematoencephalic barrier back only less easily) which accumulates in cortex and basal ganglions 11. Similarly, mercury is transformed using catalase to Hg 2+ in erythrocytes, these ions are distributed into tissues and they interact with SH groups of enzymes. The highest depot is present in kidneys, mostly in adrenals. Kidneys react by production of metallothioneins (MT) cysteine rich proteins 12 - which bind mercury 1. Therefore, the activities of some ecologists in removing of practically nontoxic liquid mercury are very interesting, more precisely controversial e.g. from thermometers, i.e., in small scale. On the contrary, they are much more active in introduction of mercury containing saving bulbs and fluorescent tubes. Some of these controversial steps were mentioned in 1, e.g., the example of usual 23 W saving light bulb (equivalent to classical, totally mercury free, 100 W bulb) contains 5-10 mg of mercury 13. It is necessary to take into account huge amount of produced saving light bulb and the fact that only 10 % of all saving light bulbs is disposed ecologically 13. Moreover, it is necessary to take into account that mercury is present in the form of vapors in fluorescent tubes. The various amalgams have been present in human life for hundreds of years 7, e.g., Hg-Ag mixtures used in dentistry 14, amalgamation processes in mining industry 11 and recently also in polarography/voltammetry In case of these alloys, many fears were introduced by non-specialists. However, we can conclude that the dental amalgams used as dental fillings and in voltammetry can be seen, from toxicological point of view as almost nontoxic 7. The inorganic compounds which contain mercury are considered as highly toxic. Nevertheless, it is necessary to differentiate among those soluble (e.g., HgCl 2, Hg(NO 3 ) 2 ) and insoluble (Hg 2 Cl 2 ) in polar solvents (water). The oral lethal dose of white precipitate (calomel, Hg 2 Cl 2 ) amounts to 2-3 g, on the other hand sublimate, HgCl 2, may kill in the amount of g, similarly as g of Hg(NO 3 ) 2. Depending on the dose and time latency since the ingestion, treatment with chelating antidotes may be successful 1. Therefore, very controversial are tendencies of some research workers to replace the mercury electrodes containing liquid mercury by mercury film modified solid electrodes, which are prepared by deposition of mercury from plating solutions with soluble salts. Organo-metallic compounds (RHgX or RHgR' -R and R' are hydrocarbon rests, mostly CH 3 -, C 2 H 5 -, and X anion is halogenide, nitrate, sulfide or sulfate) are highly toxic. Especially, 84

87 methyl mercury, CH 3 Hg +, is highly dangerous due to its bioaccumulation capabilities. The efficacy of chelating antidotes is not sufficiently proven and very low doses can be lethal 7, 32. Dimaval (DMPS, unithiol) is the chelating antidote of choice. Compared with previously used antidotes (such as BAL), it has many advantages, such as lower toxicity and the availability of both oral and parenteral preparations. More is known about the pharmacokinetics of DMPS (given p.o. or i.v) in human body than about any other dimercapto chelating agent. Another possibility is to use DMSA (dimercaptosuccinic acid, succimer) 5, 33. Conclusions The human life is cross-linked with the existence of many chemical elements in their various forms. Some of them are essential. Generally, mercury does not belong to them. In spite of fears about high toxicity of mercury in all forms, it is necessary to differentiate among its different forms and of course, very important role plays the dose of its toxic forms (organic, soluble inorganic salts, and mercury vapors) to which the subject has been exposed. The article tries to disprove the currently perceived information about high toxicity of amalgams and ingested liquid mercury. We can conclude that the fields of application of mercury are very wide. In some applications, it could be replaced by other substances (by ethanol in thermometers) or technologies (e.g., in production of sodium hydroxide and chlorine). However, it is necessary to consider the forms of mercury which should be replaced without delay and others that do not represent a serious danger. Finally, there are some historical aspects that could be considered with some benevolence. It is mainly polarography and the use of the mercury drop-based electrodes whose modern and often miniaturized constructions do not seem to represent any serious danger for environment and human life as being used on specialized locations only and operated by the authorized and experienced personnel. In order to tolerate the use of both HMDE and DME in reasonable scope, it also requires a certain compromise with the eager propagators of new non-mercury electrodes in electroanalysis, such as bismuth-based electrodes and related sensors 34, 35. Acknowledgement The authors gratefully acknowledge financial support from the GA AV CR (projects No. IAA ), the GA CR (project No. P206/11/1638, project No. P208/12/1645), and the Ministry of Education, Youth, and Sports of the CR (project KONTAKT, No. MEB ). References 1. Navratil T., Svancara I., Mrazova K., Novakova K., Sestakova I., Heyrovsky M., Pelclova D., v knize: Sensing in Electroanalysis Vol. 6.; (Kalcher K., Metelka R., Svancara I., Vytras K., Eds.),sv.Vol. 6 University Press Centre, Pardubice, IPR false/default_en.htm, Downloaded: European_Commission, Commission Regulation (EC) No 552/2009 of 22 June 2009 amending Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council on the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH) as regards Annex XVII (Text with EEA relevance), IPR false/default_en.htm, European_Commission, Consolidate Guide to EuRoHS Application Exemtions 2002/95/EC of January , IPR false/default_en.htm,

88 5. Nerudova J., Cabelkova Z., Frantik E., Lukas E., Urban P., Blaha K., Pelclova D., Lebedova J., Cikrt M.: Int. J. Occ. Med. Env. Health 13, 131 (2000). 6. Navratil T., Kopanica M., Krista J.: Chem. Anal. (Warsaw) 48, 265 (2003). 7. Navratil T. In Medical Chemistry and Biochemistry; Institute of Medical Biochemistry and Laboratory Diagnostic, 1st Faculty of Medicine, Charles University in Prague: Prague, MZ_CR, Vyhláška Ministerstva zdravotnictví č. 432/2003 Sb., kterou se stanoví podmínky pro zařazování prací do kategorií, limitní hodnoty ukazatelů biologických expozičních testů a náležitosti hlášení prací s azbestem a biologickými činiteli, Downloaded: Olson K. R.: Poison&Drug Overdose, 5 th ed.; McGraw-Hill, USA Navratil T., Rakovcova H., Senholdova Z.: XXIV. Modern Elektrochemical Methods, Does represent mercury a danger in the polarographic laboratory?, Jetrichovice, , (Barek J., Labuda J., Navratil T., Novotny L., Eds.), SES logis, p Sestakova I., Navratil T.: Bioinorg. Chem. Appl. 3, 43 (2005). 13. Vespalcova R.; Usporim.cz, Downloaded: Tucek M., Bencko V., Krysl S.: Chem. Listy 101, 1038 (2007). 15. Yosypchuk B., Novotny L.: Electroanalysis 14, 1739 (2002). 16. Yosypchuk B., Novotny L.: Chem. Listy 96, 756 (2002). 17. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 18. Peckova K., Barek J., Navratil T., Yosypchuk B., Zima J.: Anal. Lett. 42, 2339 (2009). 19. Bandzuchova L., Selesovska R., Navratil T., Chylkova J.: Electrochim. Acta 56, 2411 (2011). 20. Barek J., Cabalkova D., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Environ. Chem. Lett. 9, 83 (2011). 21. Cabalkova D., Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Chem. Listy 103, 236 (2009). 22. Cizkova P., Navratil T., Sestakova I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007). 23. Danhel A., Peckova K., Cizek K., Barek J., Zima J., Yosypchuk B., Navratil T.: Chem. Listy 101, 144 (2007). 24. Fischer J., Vanourkova L., Barek J., Navratil T., Novotny L., Yosypchuk B., Zima J.: Chem. Listy 98, 612 (2004). 25. Peckova K., Navratil T., Yosypchuk B., Moreira J. C., Leandro K. C., Barek J.: Electroanalysis 21, 1750 (2009). 26. Selesovska-Fadrna R., Navratil T., Vlcek M.: Chem. Anal. (Warsaw) 52, 911 (2007). 27. Vankova L., Maixnerova L., Cizek K., Fischer J., Barek J., Navratil T., Yosypchuk B.: Chem. Listy 100, 1105 (2006). 28. Vyskocil V., Navratil T., Danhel A., Dedik J., Krejcova Z., Skvorova L., Tvrdikova J., Barek J.: Electroanalysis 23, 129 (2011). 29. Vyskocil V., Navratil T., Polaskova P., Barek J.: Electroanalysis 22, 2034 (2010). 30. De Souza D., de Toledo R. A., Galli A., Salazar-Banda G. R., Silva M. R. C., Garbellini G. S., Mazo L. H., Avaca L. A., Machado S. A. S.: Anal. Bioanal. Chem. 387, 2245 (2007). 31. Mikkelsen O., Schroder K.: Anal. Lett. 33, 3253 (2000). 32. Pelclova D., Lebedova J., Fenclova Z., Lukas E.: Nemoci z povolání a intoxikace Karolinum, Prague Gonzalez-Ramirez D., Zuniga-Charles M., Narro-Juarez A., Molina-Recio Y., Hurlbut K. M., Dart R. C., Aposhian H. V.: J. Pharmacol. Exp. Ther. 287, 8 (1998). 34. Svancara I., Vytras K.: Chem. Listy 100, 90 (2006). 35. Svancara I., Prior C., Hocevar S. B., Wang J.: Electroanalysis 22, 1405 (2010). 86

89 Use of Copper Solid Amalgam Electrode for Determination of Triazolic Fungicide Tebuconazole (Využití měděné amalgámové elektrody pro stanovení triazolického fungicidu tebuconazolu) Kateřina Nováková a,b, Tomáš Navrátil a, Jana Jaklová Dytrtová c, and Jaromíra Chýlková b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, Katerina.Novakova@jh-inst.cas.cz b University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and Chemical Engineering, Studentská 573, Pardubice, Czech Republic c Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo náměstí 2, Prague 6, Czech Republic Abstract With the use of the newly developed mercury meniscus-modified copper solid amalgam electrode (inner diameter 1.5 mm), the voltammetric behaviour of fungicide tebuconazole was researched by differential pulse voltammetry (DPV) and cyclic voltammetry (CV). Applying CV and elimination voltammetry with linear scan (EVLS), the reaction mechanism was investigated. The optimum conditions for DPV determination of this triazolic fungicide were identified in Britton-Robinson buffer/methanol (1:1, v/v) of ph 6.3. DPV with optimized parameters (E in = +400 mv, E acc = +400 mv vs. Ag/AgCl/3M KCl, scan rate 20 mv s -1 ) was used for determination of tebuconazole in analyzed solutions. Application the prolonged time (60 s), the limit of detection mol L -1 was reached. The applicability of the developed method was verified on the analysis of the real soil solution sample. Key Words: Tebuconazole, Copper solid amalgam electrode, Fungicide, DPV, Elimination voltammetry with linear scan. Cyclic voltammetry. Úvod Použití pesticidů v zemědělství je z hledista maximalizace výnosů dnes již běžnou praxí 1. Většina těchto látek je však lidskému zdraví škodlivá. Proto jejich analýza v biologických matricích je v popředí zájmu analytické chemie. Nepřiměřené a nadměrné používání pesticidů vede k jejich akumulaci v životním prostředí a má za následek značnou zátěž pro všechny složky biosféry. Studie ukazují, že cílového škůdce zasáhne méně než 0,3% použitých pesticidů, zbývajících 99,7 % je uvolňováno do životního prostředí, což představuje potenciální riziko pro necílené organismy, člověka nevyjímaje 2. Tebukonazol ((RS)-1-p-chlorophenyl-4,4-dimethyl-3-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)-pentan-3- ol; Obr. 1) je běžně používaný fungicid. Používá se v zemědělství k ochraně rostlin proti patogenním houbám a plísním. Zejména se využívá k ochraně z hlediska výživy významných plodin jako je vinná réva, ječmen, kukuřice a pšenice. Tento fungicid inhibuje biosyntézu ergosterolu a tím zabraňuje rozvoji mycelia 3, 4. Studie poukazují na to, že by mohl vyvolávat hypertrofii nadledvin (ukázáno při chronických testech na psech) a mohl mít teratogenní účinky na myši 5. Tebukonazol je v některých publikacích veden jako potenciální neurotoxická látka, která by mohla mít za následek funkční endokrinní a imunitní změny 6. Také je jednou z mnohých substancí, které jsou toxické pro vodní živočichy, a mohl by vést k dlouhodobým nepříznivým vlivům na vodní prostředí. Z literatury přitom není jasné, jaký je jeho poločas rozpadu v životním prostředí. Údaje se velmi různí, udává se 40 a 120 dní 7, přičemž jeho stabilita je výzazně ovlivněha (zvýšena) přítomností kationtů v prostředí 8. Častá aplikace tohoto fungicidu vede k akumulaci tebukonazolu v půdě a může ohrozit půdní ekosystém, podzemní a povrchové vody 9. Tebukonazol může reagovat také se základními prvky v půdě (jako je měď) 10 či například s nebezpečnými těžkými kovy jako kadmium 8. 87

90 Měď a tebukonazol spolu za pokojové teploty tvoří několik rozdílných komplexů s vysokou stabilitou. Cl Obr. 1. Strukturní vzorec fungicidu tebuconazolu. HO N N N Experimentální část Zásobní roztok tebukonazolu (Sigma-Aldrich, CR) o koncentraci 0,0162 mol L -1 byl připraven rozpuštěním 260 mg v 50 ml metanolu (Penta-Švec, CR), byl uchováván při teplotě 5 C a ve tmě. Analyzovaný roztok byl ředěním denně připravován, aby bylo minimalizováno riziko adsorpce tebukonazolu na sklo. Brittonův-Robinsonův pufr (dále pak BR) v rozsahu ph 2-12 byl připraven ze zásobních roztoků kyselé (0,04 mol L -1 ) a zásadité složky (0,2 mol L -1 ). Všechny roztoky byly připraveny v metanolu a všechny použité chemikálie byly čistoty p.a. Voltametrická měření byla prováděna na Eco-Tribo polarografu (Polaro-Sensors, Praha, ČR) řízeném programem MultiElChem 2.3 pro Windows 7 (Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV CR). Pracovní elektroda (p-cusae) měla vnitřní průměr 1,5 mm (pracovní povrch měl velikost 1,8 mm 2 ). Pracovní povrch použité meniskové měděné amalgámové elektrody (m-cusae) byl 2,1 mm 2 (opakovatelnost < ±5 %). V popisovaných experimentech byla jako referentní elektroda použita Ag/AgCl/3M KCl, platinový drátek byl použit jako elektroda pomocná (obě dvě z Elektrochemické detektory, Turnov, CR). Měření byla prováděna při pokojové teplotě (23 ± 2 C). Kyslík byl odstraňován z měřeného roztoku pomocí probublávání dusíkem (o čistotě 4.6, Messer Technogas, Praha, CR) po dobu 10 minut. Hodnoty ph byly měřeny s použitím ph metru Jenway 3505 (Bibby Scientific Limited, UK). Pro všechna měření byla použita deionizovaná voda (Milli-Q-Gradient, Millipore, Praha, CR). Jako pracovní elektroda byla použita m-cusae. Elektroda se skládala z protáhlé skleněné trubičky, jejíž užší konec byl naplněn měděným amalgámem a elektrický kontakt zajišťován propojením s měděným drátkem. Poté byla elektroda ponořena do malého množství rtuti a po dobu 15 sekund s ní v rtuti bylo mírně mícháno, čímž došlo k vytvoření rtuťového menisku. Před začátkem práce, stejně jako po pasivaci elektrody či po každé přestávce mezi jednotlivými měřeními, která byla delší než jednu hodinu, byla provedena elektrochemická aktivace m-cusae v prostředí KCl při potenciálu mv za míchání po dobu 300 s, poté byla elektroda opláchnuta vodou. Většina měření pro studium voltametrického chování tebukonazolu na m-cusae byla provedena pomocí metody diferenční pulzní volumetrie (DPV). Optimální parametry byly nalezeny: počáteční potenciál E in = +400 mv a konečný potenciál E fin = mv. Potenciál akumulace byl optimalizován na E acc = +400 mv. Jako nejvhodnější prostředí se jeví pufr BR/metanol (1:1, v/v) o ph 6,4 a rychlost polarizace 20 mv s -1. Dusík byl přiváděn do měřicí nádobky přes probublávačku, ve které byla směs metanol/destilovaná voda (1:1,v/v), přes vzorek byl dusík veden vždy 10 minut před každým měřením. Každé měření bylo opakováno nejméně 3krát a minimální počet standardních přídavků bylo 7. Získané výsledky byly hodnoceny dle 11 a pomocí QC Expert software (Trilobyte, CR). 88

91 Výsedky a diskuze Voltametrické chování tebukonazolu v závislosti na ph bylo studováno pomocí metody cyklické voltametrie (CV) na m-cusae. Použitá koncentrace pro optimalizaci měřicích parametrů činila 3, mol L -1. Nejvíce zřetelný a nejlépe reprodukovatelný pík byl registrován v prostředí BR pufru s metanolem (1:1,v/v) při ph = 6,4. Toto ph bylo následně použito ve všech měřeních. Pík (náležící komplexu tebukonazolu a mědi) nebyl pozorován ani v silně kyselém (ph = 2) a ani v silně alkalickém prostředí (ph = 12). Polohy všech píků byly posouvány se zvyšujícím se ph k záporným hodnotám potenciálů. Závislost na rychlosti polarizace byla zjištěna také pomocí CV. Závislosti na rychlosti polarizace byly lineární jak pro oxidační, tak pro redukční píky v rozsahu mv s -1, jako nejvhodnější byla vybrána hodnota 20 mv s -1. EVLS byla použita pro charakterizaci procesů probíhajících na povrchu rtuťového menisku CuSAE (v průběhu katodického i anodického scanu). S použitím této techniky byly křivky hodnoceny v rozsahu rychlostí polarizace mv s -1. V katodickém směru DC voltamogramu jsme byli schopni rozeznat 6 signálů, které patří jednotlivým procesům. Ionty Cu 2+ jsou uvolňovány z měděného amalgámu při pozitivním potenciálu (během akumulačního kroku). Můžeme tedy předpokládat, že dva nejvíce pozitivní signály (-90 mv a -170 mv) patří k tvorbě buď dvou různých komplexů iontů Cu 2+ s ionty tebukonazolu nebo tvorbě komplexů Cu 2+ a Cu + s tímto ligandem. V souladu s touto hypotézou, dva nejvíce negativní signály (-400 mv a -500 mv) patří k rozkladu těchto komplexů, přičemž měděné kationty se opět redukují na kovovou měď. Signály okolo -250 mv a -290 mv, které jsou registrovány i v základním elektrolytu, lze vysvětlit jako píky odpovídající redukci mědi z Cu 2+ na Cu + a z Cu + na Cu 0. Koncentrační závislosti byly měřeny za optimálních podmínek. Po vložení potenciálu akumulace byla zjištěna nejnižší stanovitelná koncentrace o hodnotě mol L -1. Stanovená koncentrace tebukonazolu v reálném vzorku půdního výluhu činila (7,15 ± 0,56) 10-4 mol L -1 (R = 0,998). Závěr V této práci bylo hlavním cílem vypracovat metodiku stanovení tebukonazolu pomocí CuSAE na základě tvorby jeho komplexů s mědí. Pomocí vyvinutého postupu lze na použité m-cusae stanovit tebukonazol v submikromolárních koncentracích při reprodukovateknosti lepší než 5 %. Aplikovatelnost této metody byla vyzkoušena na reálném vzorku. Poděkování Tato práce vznikla s podporou grantů GA AV CR (IAA ), GA ČR (P206/11/1638 a P208/12/1645), S grantu MŠMT ČR a Studentského grantu UPa (SGFCHT05/2012). Literatura Munoz-Leoz B., Ruiz-Romera E., Antiguedad I., Garbisu C.: Soil Biol. Biochem. 43, 2176 (2011). 3. Wang X., Wang X., Zhang H., Wu C., Wang X., Xu H., Wang X., Li Z.: Chirality 24, 104 (2012). 4. Sehnem N. T., Souza-Cruz P., Peralba M. D. R., Ayub M. A. Z.: J. Env. Sci. Health - Part B 45, 67 (2010). 5. WHO, v knize: Pesticide residues in food 2008; (World Health Organization, Rome, Italy,

92 6. Filipov N. M., Lawrence D. A.: Toxicol. Sci. 62, 185 (2001). 7. Shen Z., Zhu W., Liu D., Xu X., Zhang P., Zhou Z.: Chirality 24, 67 (2012). 8. Norkova R., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D.: Water, Air, Soil Pollut., /s11270 (2012). 9. Jakl M., Jaklova Dytrtova J., Cadkova E.: An electrochemical approach to study biscoordinated copper/tebuconazole complexes BEST servis, Ústí nad Labem, Jetřichovice Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D., Cadkova E., Komarek M.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 1037 (2011). 11. Miller J. N., Miller J. C.: Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 2nd ed.; Pearson Education, Harlow

93 Possible Application and Monitoring of Electrochemical Treatment of Waters Using Special Electrodes and Techniques (Možnosti provádění a sledování elektrochemické úpravy vod s využitím speciálních elektrod a technik) Ladislav Novotný, Libor Dušek, Barbora Vystrčilová, and Renáta Petráňková University Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Environmental and Chemical Engineering, Studentská 573, Pardubice, Czech Republic, nvt.l@seznam.cz Abstract History and possible application and monitoring of electrochemical treatment of waters using special electrodes and techniques were described. Use of electrooxidation processes, mechanisms and products for cleaning waters or aqueous solutions was discussed. Ready analysis of dissolved iron (the electrooxidation product) using voltammetry with a hanging mercury drop electrode or special amalgam electrodes, or potenciometric ph-measurements have proved suitable for the mentioned purposes. Key Words: Electrochemical cleaning waters, Voltammetry, Special mercury or amalgam electrodes, Potenciometric (ph) measurements. Úvod Chemické úpravy pitných a užitkových vod byly v minulosti vedeny zejména snahou o zajištění jejich zdravotní nezávadnosti. Jejich historie sahá do období poloviny 19. století, kdy byl v Londýně použit chlor pro dezinfekci veřejné studny, označené jako zdroj epidemie cholery 1,2. Průběžná dezinfekce vody ve vodojemech byla pak představena v r v USA. V Čechách byla tato vodárenská technologie zavedena zpočátku nepravidelně a později systematicky 3 od r. 1924; poprvé se tak stalo v pražské Vršovické vodárně. Zmíněné chlorování přineslo do vodárenství výrazné zkvalitnění pitných a užitných vod. Má se též za to, že se podstatně zasloužilo o prakticky vymýcení řady infekčních chorob (zejm., cholery) v oblastech, kde bylo aplikováno. Současně však výzkum a praxe ukázaly, že obsah volného chloru ve vodě regulovaný stanovenými limity 4 (např. v pitné vodě 0,3 mg L -1 ) musí být sledován, nemá-li být sám příčinou zdravotní závadnosti vody. Je známo, že vedle jeho přímého působení na organizmy může např. v jeho přítomnosti docházet k vytváření řady nebezpečných chlorderivátů eventuálně přítomných stop organických látek, jako jsou fenoly, huminové kyseliny, polyaromáty apod. V průmyslově vyspělých zemích je proto snaha vyvíjet a aplikovat takové technologie, které minimalizují riziko tvorby zmíněných chlorderivátů. Mezi nadějné směry se v tomto směru řadí využití elektrochemických metod. Cílem práce bylo posouzení možností provádění a sledování elektrochemické úpravy vod s využitím speciálních elektrod, elektrochemických případně i analytických technik a podle možností i návrh dalšího postupu výzkumu, umožňující návrh vhodných uspořádání a režimů pro čištění specifikovaných typů vod, např. znečištěných oleji, ropnými látkami ap. Experimentální část Průzkumné experimenty byly prováděny zejména s využitím sestav nebo komponent polarografu PC-ETP (po rekonstrukci společností ECO-TREND PLUS s.r.o., Praha), popř. i PA4 (Laboratorní přístroje LP, Praha), s miniaturizovanou rtuťovou tužkovou elektrodou, se stříbrnou amalgamovou elektrodou ve variantě se rtuťovým meniskem 5. Podle potřeby byla též využita elektrodová uspořádání s plastovými nástavci či zakončeními a s modifikovanými amalgamy dle užitných vzorů Voltametrická měření byla prováděna v tříelektrodovém uspořádání v režimu DPV, výška pulzu 50 mv, frekvence 5 Hz, popřípadě i v režimu DCV; 91

94 roztoky obsahující rozpuštěné železo byly analyzovány v prostředí 0,1 M chloracetátového pufru ph 3 obsahujícího 0,1 M chelaton III. Pro měření ph byly použity upravené elektrody od spol. Elektrochemické detektory, Turnov. Použité elektrolyzéry (např. typu 6,7 ) mohly pracovat buď v potenciostatickém nebo galvanostatickém režimu. Čistota použitých chemikálií byla p.a.; podle potřeby byly měřené roztoky probublány dusíkem. Výsledky a diskuse Posouzení možností využití elektrochemických metod pro čištění vymezených typů vod bylo zaměřeno jak na oblast uplatnění vhodných procesů, tak na možnosti alespoň orientační analýzy či sledování zvolených složek roztoků. Pro naše potřeby byly uvažovány takové postupy, do nichž bylo možné začlenit vhodné elektrochemické kroky, nebo které přímo využívaly elektrochemických mechanizmů k degradačním dějům. Při tom byly ověřeny resp. modelově odzkoušeny např. následující možnosti: Je známo 11, že v přítomnosti Cl lze za vhodného režimu generovat elektrooxidací "in-situ" Cl 2 a současně omezit i riziko přesycení roztoku plynným chlorem. V závislosti na ph dochází pak k tvorbě různě zastoupených dalších iontových složek roztoku, např. ClO, v silně kyselé oblasti i Cl 3, v alkalickém prostředí ve větší míře ClO 2, ClO 3 a ClO 4 a vedle toho k případnému fotorozkladu ClO na O 2, ke zpětné elektroredukci ClO na Cl, apod. V našem případě jsme testy prováděli za použití železné katody i anody s využitím upraveného průběhu střídavého proudu tak, aby současně docházelo k intenzivní elektrooxidaci Fe s následnou koagulací, dík tvorbě sraženin hydroxidů. Zvolené podmínky odpovídaly představám o modelu anodicko-katodické polarizace obou železných elektrod a dosažení ustálených polarizačních cyklů, doprovázených tvorbou příslušných oxidačních a redukčních produktů. Použité proudové hustoty byly pod úrovní příp. na úrovni 0,1 A cm -2, kdy např. v oblasti ph 5-6 docházelo k výrazné tvorbě elektrooxidačních produktů železa, schopných mj. účinně sorbovat nežádoucí složky roztoku. Poměrně vysoká proudová hustota v galvanostatickém uspořádání (příp. poměrně vysoké efektivní napětí v řádu několika voltů v potenciostatickém uspořádání) umožňovaly souběžné využití dalšího elektrochemického mechanizmu, a to elektrooxidace přítomných OH na hydroxylový radikál OH 12 na povrchu kovu (podobně jako v 13 ). Tento meziprodukt se pak mohl uplatnit jak přímo jako reaktivní degradační činidlo, tak nepřímo v rámci interakce s Cl za tvorby Cl 2 či ClO. V případě orientační elektroanalýzy pro sledování průběhu (resp. postupu) uvedené elektrolýzy se ukázaly jako aplikovatelné např. stanovení Fe 2+ v odebraných a vhodně upravených vzorcích (po vhodné úpravě, např. silném okyselení ap.) pomocí technologicky využitelných řešení rtuťových, amalgamových, speciálních hybridních amalgamových nebo podobných elektrod, nebo nepřímo na základě měření změn ph roztoku. V posledně uvedeném případě bylo využito přibližně lineárního posuvu ph z neutrální do kyselé oblasti při přídavku roztoků obsahujících Fe 2+, vlivem tvorby hydroxyoproduktů; při změnách koncentrace 0 až 0,01 gion L -1 Fe 2+ činil např. posuv ph = 1,6. Závěr Provedený rozbor i experimenty potvrdily možnosti provádění a sledování elektrochemické úpravy vod s využitím speciálních elektrod, elektrochemických mechanizmů a technik a umožnily zvolit další postup výzkumu v uvedeném směru. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektů VZ UPa a TACR TA

95 Literatura 1. Rideal S.: Disinfection and Disinfectans. C. Lochwood and son, Rideal S.: Water and its purification, C. Lochwood and son, Z expozice Muzea pražského vodárenství a vodárny v Podolí, Praha, zřizovatel expozice Pražské vodovody a kanalizace a.s. 4. Nařízení vlády č. 61/2003 Sb. Příloha Yosypchuk B., Novotný L.: Crit. Rev. Anal. Chem. 32, 141 (2002). 6. Dušek L.: Chem. Listy 104, 846 (2010). 7. Novotný L.: ÚPV Praha, PUV , UV Novotný L.: ÚPV Praha, P , č Novotný L.: ÚPV Praha, PUV ; UV Novotný L.: ÚPV Praha, PUV ; UV Klikorka S., Hájek B., Votinský S.: Obecná a anorganická chemie. SNTL, Praha Bonfatti F., Ferro S., Lavezzo F., Malacarne M., Lodi G., Battisti A.: J. Electrochem. Soc. 147, 592 (2000). 13. Novotný L., Navrátil T.: Chem. Listy 90, 121 (1996). 93

96 Direct Voltammetric Determination of Aclonifen in Natural Waters at a Silver Solid Amalgam Electrode (Přímé voltametrické stanovení aclonifenu v přírodních vodách na pevné stříbrné amalgámové elektrodě) Vít Novotný UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Department of Analytical Chemistry, Charles University, Albertov 2030, Prague 2, Czech Republic, novotny1@natur.cuni.cz Abstract A method for the SPE extraction and determination of Aclonifen in drinking water and Vltava river water by differential pulse voltammetry on a meniscus modified silver solid amalgam electrode is described. SPE preconcentration from 100 ml to 10 ml, 1 L to 10 ml and 1 L to 1 ml has been used. All measured calibration dependencies are linear. The detection limit for the determination of AC in Vltava river water is mol L -1. Lower concentrations could not be determined due to unknown interfering substances. The detection limit for the determination of AC in drinking water is mol L -1. SPE followed DPV AgSAE is therefore a suitable method for determining trace amounts of Aclonifen in environmental waters. Key Words: Aclonifen, Solid phase extraction, Silver solid amalgam electrode, Drinking water, River water. Introduction Aclonifen (AC) is a preemergent diphenyl ether herbicide (DPhEH) used to combat weeds in potatoes, peas, carrot, corn, rice and sunflowers 1. DPhEHs inhibit plant growth via their photodegradation products that inhibit the activity of protoporphyrinogen oxidase. As other DPhEHs AC exhibits some side effects 2, such as high toxicity for aquatic organisms and hepatotoxicity in mammals in high doses 3. It is listed as a suspected human carcinogen and substances with similar structures are endocrine disruptors and have adverse effects on blood formation 4, 5. It has been registered for use in the European Union since 2008 under the trade names Bandur, Bander or Mikado. Silver solid amalgam electrodes (AgSAE) have already proved themselves to be suitable sensors for the determination of trace amounts of pollutants in the environment 6 including the determination of some DPhEHs at a meniscus modified AgSAE (m-agsae) 7, 8. Among their advantages are low price, high sensitivity, easy handling and mechanical robustness. Various methods for the determination of AC are described in the literature 9-13, some use SPE but none uses voltammetry at AgSAE. Materials and methods The stock solution (c mol L -1 ) of Aclonifen (2-chloro-6-nitro-3-phenoxybenzenamine 99%, Sigma Aldrich Laborchemikalien, Germany.) has been prepared by dissolving g of AC in 100 ml of methanol. Stock solutions of lower concentrations were prepared by precise diluting of the stock solution with methanol. The stock solution was kept in the dark in the refrigerator. The stability of the stock solution has been checked by UV-VIS spectrophotometric measurements. The stock solution was stable for at least 6 months in the conditions under which it was kept. Other used chemicals were boric acid, acetic acid (99%), phosphoric acid (85%), sodium hydroxide, potassium chloride, all chemicals p. a., Lachema Brno, Czech Republic. Methanol p.a. Merck, Germany was used. Britton-Robinson buffers of the desired ph were prepared by mixing of 0.2 mol L -1 NaOH with a solution containing 0.04 M boric acid, phosphoric acid and acetic acid. Measurements of ph were performed on a Jenway 3510 (Jenway, Essex, Great Britain) ph-meter with a combined glass membrane 94

97 electrode (type ). The electrode was calibrated by standard buffer solutions in water. Deionized water (Millipore, USA) was used as a solvent. Palmsens Electrochemical Sensor Interface (Palm Instruments BV, Ruitercamp, The Netherlands) and the PalmsensPC software was used for all voltammetric techniques. The software was running under the Windows XP (Microsoft Corp.) operating system. Pulses of width of 80 ms and height of 50 mv were used while performing DPV. A polarization rate of 20 mv.s -1, and potential resolution of 5 mv were used. All measurements were performed using a three electrode system. A silver chloride electrode (1 mol L -1 KCl) type RAE 113, Monokrystaly, Turnov, Czech Republic, a platinum wire auxiliary electrode and a meniscus modified silver solid amalgam electrode that was purchased from Polaro Sensors, Prague, Czech Republic. After extended periods of storage and if the behavior of the electrode starts changing the meniscus is renewed by immersing the electrode in a vial containing a small quantity of mercury, the process is called amalgamation. Each day at the start of using the electrode it was activated in 0.2 M KCl solution by applying of a potential of mv for 300 s, as described in 14. For the SPE preconcentration 3 ml 200 mg Lichrolut (Merck, Germany) RP-18E cartridges were used. The cartridges were conditioned by passing 10 ml methanol and 10 ml deionized water through them. After the extraction they were washed by 10 ml deionized water and dried in air for 5 min. The trapped analyte was then eluted by 2 ml methanol. In the concentration range mol L -1 samples were prepared by dissolving the appropriate amount of mol L -1 AC stock solution in 100 ml dinking water, performing SPE, eluting by 2 ml methanol into a 10 ml volumetric flask and filing up to 10 ml by BR buffer ph 12. This solution was then used for measurement. The drinking water was taken after letting it flow for 5 minutes to remove any impurities or gas pockets in the tubing (SPE 1). In the concentration range mol L -1 samples were prepared by dissolving the appropriate amount of mol L -1 AC stock solution in 1000 ml dinking water, adding 10 ml methanol, performing SPE, eluting by 2 ml methanol into a 10 ml volumetric flask and filing up to 10 ml by BR buffer ph 12 (SPE 2). In the concentration range mol L -1 samples were prepared by dissolving the appropriate amount of mol L -1 AC stock solution in 1000 ml dinking water, adding 10 ml methanol, performing SPE, eluting by 2 ml methanol into a 5 ml volumetric flask. The methanol solution was then dried at room temperature by a flow of nitrogen and then dissolved in 1 ml of a mixture of 20% methanol and 80% BR buffer ph 12 (SPE 3). Analogous procedures were used for the determination of AC in Vltava river water. The ph of the river water model samples was adjusted to 8 by adding 20 ml BR buffer ph 8 and they were filtered using Macherey-Nagel GF 3 glass filters to remove mechanic impurities. Values of points in calibration curves are arithmetic averages of 3 measurements. Error bars are derived from the same data. Detection limits are calculated according to the formula L D = 3.3 σ/s 15 where σ is the standard deviation of 10 measurements of the lowest concentration when the signal can still be evaluated and S is the slope of calibration curve in the vicinity of that concentration. Results and discussion The voltammograms of AC in the concentration range ( ) mol L -1 in drinking water can be seen in Fig. 1. The calibration dependences is linear in the concentration range from mol L -1 to mol L -1 and lower concentrations could not be determined. The 95

98 detection limit reached is mol L -1. The voltammograms of AC in the concentration range ( ) mol L -1 in Vltava river water can be seen in Fig. 2. The calibration dependence is linear in the concentration range from mol L -1 to mol L -1 and lower concentrations could not be determined due to interfering substances present in the matrix. The detection limit reached is mol L -1. The parameters of the calibration dependencies in real samples can be found in Table I. -12 I [na] -11-2,0-1,5-1,0-0, ,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 c [nmol.l -1 ] E [mv] -900 Fig. 1. DP voltammograms of AC at m-agsae after SPE extraction from 1 L drinking water. The corresponding calibration dependence is in the inset. Measured in a solution obtained by dissolving the dried eluate after SPE in 1 ml of solution of BR buffer ph 12 and MeOH (8:2). AC concentration in drinking water 0 (1), (2), (3), (4), mol L -1 (5), and mol L -1 (6). -15,0 I [na] , , c [nmol.l -1 ] 3-10, , E [mv] Fig. 2. DP voltammograms of AC at m-agsae after SPE extraction from 1 L drinking water. The corresponding calibration dependence is in the inset. Measured in a solution obtained by diluting 2 ml of the methanol eluate in a 10 ml volumetric flask by BR buffer ph 12. AC concentration in river water 0 (1), (2), (3), (4), mol L -1 (5), and mol L -1 (6). Conclusions A method for the determination of AC in model samples of drinking water using SPE preconcentration followed by DPV at m-agsae has been successfully developed. The calibration dependences in drinking water are linear in the concentration range from to mol L -1. The detection limit reached is mol L -1. A method for the determination of AC in model samples of Vltava river water by SPE preconcentration followed by DPV at m-agsae has been successfully developed. The calibration dependences in Vltava river water are linear in the concentration range from to mol L -1. The detection limit reached is mol L -1. Further attempts to decrease the detection limits in drinking water even lower seem impractical, as they would involve extracting the substance 96

99 from volumes higher than 1 L or performing DPV measurements in volumes lower than 1 ml. In river water a procedure to identify and remove the interfering substances would have to be developed in order to reach lower concentrations. Table I. Parameters of the calibration dependences of AC in Vltava river and drinking water. c denotes the investigated concentration range, k denotes the slope of the calibration curve, q the intercept, σ the standard deviation of 10 measurements of the lowest concentration, R the correlation coefficient and L D the limit of detection. c [mol L -1 ] procedure water k [na mol -1 L] q [na] σ [na] R L D [mol L -1 ] (2-10) 10-8 SPE 1 deionised (2-10) 10-8 SPE 1 drinking (2-10) 10-9 SPE 2 drinking (2-10) SPE 3 drinking (2-10) 10-8 SPE 1 river (2-10) 10-9 SPE 2 river Acknowledgements Financial support of this work, provided by The Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (project MSM ), Technological Agency of Czech Republic (project TA ), Charles University in Prague (project SVV ) and Grant Agency of Czech Republic (project P206/12/G151) is gratefully acknowledged. References 1. Cobucci T., Prates H.T., Falcão C.L.M., Rezende M.M.V.: Weed Sci. 46, 258 (1998). 2. Kilinc Ö., Reynaud S., Perez L., Tissut M., Ravanel P.: Pestic. Biochem. Physiol. 93, 65 (2009). 3. Scrano L., Bufo S.A., D Auria M., Meallier P., Behechti A., Shramm K.W.: J. Environ. Qual. 31, 268 (2002). 4. Teshima R., Nakamura R., Nakajima O., Hachisuka A., Sawada J.-I.: Toxicol. Lett. 150, 277 (2004). 5. Francis B.M., Metcalf R.L., Lewis P.A., Chernoff N.: Teratology 59, 69 (1999). 6. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 7. Novotný V., Barek J.: Chem. Listy 103, 217 (2009). 8. Cabalková D., Barek J., Fischer J., Navrátil T., Pecková K., Yosypchuk B.: Chem. Listy 103, 236 (2009). 9. Laganà A., Fago G., Fasciani L., Marino A., Mosso M.: Anal. Chim. Acta 414, 79 (2000). 10. Sheu H.-L., Sung Y.-H., Melwanki M.B., Huang S.-D.: J. Sep. Sci. 29, 2647 (2006). 11. Pang G.-F., Liu Y.-M., Fan C.-L., Zhang J.-J., Cao Y.-Z., Li X.-M., Li Z.-Y., Wu Y.-P., Guo T.-T.: Anal. Bioanal. Chem. 384, 1366 (2006). 12. Perreau F., Einhorn J.: Anal. Bioanal. Chem. 386, 1449 (2006). 13. Sagratini G., Ametisti M., Canella M., Cristalli G., Francoletti E., Giardina D., Luminari M.C., Paparelli G., Picó Y., Volpini R., Vittori S.: Fresenius Environ. Bull. 16, 973 (2007). 14. Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis 14, 1733 (2002). 15. Hayashi Y., Matsuda R., Ito K., Nishimura W., Imai K., Maeda M.: Anal. Sci. 21, 167 (2005). 97

100 Chemically modified DNA for DNA-protein interaction studies: electroactive and luminescent labeling versus specific molecular recognition (Chemicky modifikované DNA pro studium interakcí DNA s proteiny: elektroaktivní a luminiscenční značení versus specifické molekulární rozpoznání) Petr Orság a, Miroslav Fojta a, Luděk Havran a, Zdenka Vychodilová a, Medard Plucnara a, Tomáš Komárek a, Jan Riedl b, Michal Hocek b, and Hana Pivoňková a a Institute of Biophysics of the AS CR, v.v.i., Kralovopolska 135, Brno, Czech Republic, verves11@gmail.com b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo nam. 2, Prague 6, Czech Republic Abstract Labeled nucleic acids bearing various electroactive (7-deazaguanine, anthraquinone, nitrophenyl or an oxoosmium complex) or luminescent (phtalimide derivatives) moieties were applied in DNA-protein interaction studies. Diverse effects of the modifications on sequencespecific recognition and/or non-specific DNA binding by tumor suppressor protein p53 were observed, which has been taken into consideration in selection of electroactive tags suitable for construction of labeled ON substrates for DNA-protein interaction probing. Key Words: Modified DNA, Labeling, Molecular recognition, Electrochemical detection, Luminescence. Introduction Modified/labeled nucleic acids are widely used as a potent tool for various bioassays, including techniques designed for nucleotide sequence analysis (DNA hybridization, detection of mutations/polymorphisms, gene expression assay) as well as DNA-protein interaction experiments 1. Synthetic oligonucleotides (ONs) bearing various modified components (sugars, nucleobases) are utilized to optimize specific properties of the ONs and their interactions in the given assay (such as stability of hybrid duplexes, prevention of Hoogsteen pairing) while extra functional groups are often attached as anchors (to immobilize ON probes at surfaces) or as labels producing well detectable signals in connection with a proper detection platform (e.g., optical or electrochemical). However, chemical modification of DNA may change its molecular recognition features which in turn may affect its interactions with other molecules, such as complementary DNA strands (in DNA hybridization studies) or proteins. In this work we studied effects of ON modifications, applicable as electroactive or fluorescence labeling, on sequence-specific and non-specific interactions of the modified ON with tumor suppressor p53 protein 2. Experimental Labeled oligonucleotides (ONs) were prepared through primer extension incorporation of modified deoxynucleotide triphosphates (dntps; for more details see 3 ), terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) tailing reaction (details in 4 ) or chemical modification of oligot overhangs with an oxoosmium complex (see contribution by Pivoňková et al. in this proceedings). DNA-protein binding studies were conducted using electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and/or electrochemical immunoprecipitiation assay with magnetic beads (MBIP). Purified p53 protein was incubated with labeled DNA substrate and unlabeled non-specific competitor DNA in 50 mm KCl, 5 mm Tris ph 7.6, 2 mm DTT, 0.01% Triton-X100 for 30 min on ice, followed by separation in 5 % native polyacrylamide gel and autoradiography. For details of the MBIP assay, see contribution by Pivoňková et al. 98

101 Electrochemical analysis: Modified dntps were analysed by conventional cyclic voltammetry (CV) while oligonucleotides by ex situ (adsorptive transfer stripping) CV at hanging mercury drop electrode (HMDE), or basal-plane pyrolytic graphite electrode (PGE). Oligonucleotides were accumulated at the electrode from 5 L aliquots containing 0.2 M NaCl, followed by the electrode rinsing with deionized water and transfer into standard electrochemical cell. CV settings: scan rate 0.5 V/s, initial potential 0.0 V, for switching and final potentials see figures. Background electrolyte: 0.5 M ammonium formate, 0.05 M sodium phosphate, ph 6.8 (for measurements of DNA at HMDE) or 0.2 M sodium acetate ph 5.0 (other measurements). All measurements were performed at room temperature using an Autolab analyzer (Eco Chemie, The Netherlands) in connection with VA-stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland) and a three-electrode system with Ag AgCl 3M KCl electrode as a reference and platinum wire as an auxiliary electrode. Results and discussion In our previous work we applied various base-modified nucleotides (such as 7-deazaguanosine 5, nucleotide conjugates with nitrophenyl or anthraquinone 3, or thymidine adducts with oxoosmium moieties 6 ) as redox DNA labels suitable for electrochemical monitoring of DNA hybridization, single nucleotide polymorphism typing, enzymatic DNA synthesis via primer extension or via PCR. The above mentioned species produce specific electrochemical signals due to reduction or oxidation, allowing their distinction from one another as well as from natural DNA components being in general reduced/oxidized at more negative/positive potentials. Here we focused on the effects of ON modifications on the interactions of p53 protein with the modified ONs, and in some cases on their applicability in novel DNA-protein interactions assays p53-dna Fig. 1. Binding of wild type p53 protein to 50-mer ONs involving (lanes 1-3) or lacking (lanes 4-5) a specific p53 binding site (p53con). Lane 1 and 4: unmodified ONs; lane 2: ON in one strand globally modified with 7-deaza guanine; lanes 3 and 5: ONs in one strand globally modified with 4-aminophthalimide (API) attached to cytosine at 5-position via propargyl linker (structure of corresponding dntp shown on the right). Effects in internal modifications of ON substrates encompassing or lacking specific recognition site for the p53 (p53con) was tested. We observed that global substitution of guanine residues within the entire p53con with 7-deazaguanine resulted in a loss of sequence-specific recognition of the modified DNA by the protein (resulting in disappearance of a specific band on the autoradiogram resulting from EMSA, Fig. 1, lane 2). On the other hand, substitution of guanines with 7-deazaguanines in a stretch flanking the p53con (i.e. outside the p53con) did not affect the sequence-specific p53-dna binding, offering a possibility of using the 7-deazaguanines as an electrochemical label. Analogous experiments were performed with cytidine conjugates bearing fluorescent phtalimide derivatives [4-aminophthalimide (API) or 4-(N,N-dimethylamino)phthalimide 99

102 I[ A] I[ A] (dapi), see an example in Fig. 1). Surprisingly, p53con with cytosines fully substituted with cytosine-api conjugate retained p53 binding (Fig. 1, lane 3). Control experiment with nonspecific ON (lacking p53), which was not bound by the protein in its unmodified form (Fig. 1, lane 4) showed a strong binding after incorporation of the API-labeled cytosine. Hence, this observation demonstrates an example of augmentation of non-specific protein-dna binding due to the DNA modification, which may compensate for a loss of the specific binding and strongly suggests necessity of conducting careful control experiments before applying new types of labeled DNA in biosensing. Formation of stable complexes of p53 with the APImodified DNA has nevertheless recently been utilized in studies of the protein binding on the API fluorescence 7. In addition, the phtalimide exhibit electrochemical activity at both mercury (Fig. 2) and carbon electrodes, offering possibilities of electrochemical monitoring of DNA modification with these species and distinction between API and dapi-modified DNAs (Fig. 2) C red A red X red da API TP da dapi TP dc API TP dc dapi TP E [V] E [V] Fig. 2. Cyclic voltammograms of cytosine or 7-deazaadenine dntps labeled with API or dapi at HMDE (inset shows detail of the curves). Peaks A red and C red correspond to reduction of the respective nucleobases, peak X red is probably due to reduction of the C-C triple bond within the propargyl linker (see Fig. 1). The strong catalytic effects at potentials more negative than -1.2 V are specific for the dapi conjugates. Experiments with tail-labeled ON probes bearing or lacking p53con revealed diverse effects of various types of modifications on the specificity of binding. Since such modifications do not introduce chemically modified nucleotides within the specific sequence, the sequencespecific binding is retained. On the other hand, increased affinity of the protein to the labeled single-stranded tail may increase the overall binding and result in false-positives. We have observed that modification of single-stranded oligot tails with oxoosmium complexes did not significantly change recognition properties of the respective ON probes in the MBIP assay (see contribution by Pivoňková et al.). On the other hand, analogous probes tail-labeled with athraquinone exhibited, under the same conditions, considerable non-specific protein binding and/or adsorption on the magnetic bead surface. 100

103 Conclusion Modified ONs were applied as labeled probes in various bioassays utilizing electrochemical and/or luminescence detection platform. Besides DNA hybridization, the labeled DNAs proved useful also in DNA-protein interactions studies. Depending on the modification type, introducing nucleotide derivatives into DNA substrates may affect DNA-protein recognition either via a loss of sequence-specific binding or via augmentation of sequence non-specific interactions. These phenomena should be considered and tested carefully for any newly introduced DNA labeling approach. Acknowledgements: This work was supported by the Czech Science Foundation (grant P301/11/2076 to H.P., P206/12/G151 to M.F.) and by the Grant Agency of the ASCR (grant IAA to M.F.), and by RVO References 1. Hocek M., Fojta M.: Chem. Soc. Rev. 40, 5802 (2011). 2. Pivonkova H., Sebest P., Pecinka P., Ticha O., Nemcova K., Brazdova M., Brazdova Jagelska E., Brazda V., Fojta M.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 894, (2010) 3. Balintova J., Pohl R., Horakova P., Vidlakova P., Havran L., Fojta M., Hocek M.: Chem- Eur. J. 17, (2012) 4. Horakova P.; Macickova-Cahova H.; Pivonkova H.; Spacek J.; Havran L.; Hocek M.; Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 9, 1366 (2011). 5. Pivonkova H.; Horakova P.; Fojtova M.; Fojta M.: Anal. Chem. 82, 6807, (2010) 6. Fojta M., Kostecka P., Pivonkova H., Horakova P., Havran L.: Curr Anal Chem, 7, 35 (2011). 7. Riedl J., Ernsting N.P., Orság P., Fojta M., Hocek M.: Chem Sci., submitted. 101

104 Transport of Copper Ions in the Presence and Absence of Ionophore Calcimycin and the Influence of LMWOAs on this Transport (Transport měďnatých iontů v přítomnosti a nepřítomnosti ionforu calcimycinu a ovlivňování tohoto transportu LMWOAs) Martina Parisová, Tomáš Navrátil, Ivana Šestáková, and Vladimír Mareček J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague, Czech Republic, navratil@jh-inst.cas.cz Abstract This work was focused on preparation of model membranes formed on porous polycarbonate substrate. 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine was used to form stable lipid bilayers in hydrophilic pores of polycarbonate membrane. For their characterization, electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and voltammetry were applied. The transport of copper ions across these membranes in presence and absence of ionophore calcimycin has been studied. The effect of LMWOAs on transporting processes was investigated too. Key Words: Membranes, Phospholipids, Heavy metals, Copper, Transport across the membrane, Voltammetry, Electrochemical impedance spectroscopy. Úvod Těžké kovy představují stále větší problém v životním a pracovním prostředí. S rozvojem společnosti, průmyslu a dalšími pokroky neustále stoupá spotřeba kovů a polokovů, organických a anorganických sloučenin. Rychlá a intenzivní industrializace způsobuje kontaminaci půdy, vody a vzduchu látkami, které nelze biologicky rozložit. V některých případech se jedná o látky toxické a karcinogenní. Do této skupiny látek patří zejména kadmium, měď, olovo, zinek, nikl a jejich sloučeniny, s nimiž se pracuje například při povrchové úpravě kovů, v těžebním a hutnickém průmyslu, zemědělství či chemickém a elektronickém průmyslu, a které představují významnou hrozbu pro životní prostředí a zdraví člověka. Uvedené látky mohou přecházet do živých organizmů, přesněji do buněk, ve kterých se částečně akumulují a ovlivňují nejen jejich růst, ale také morfologii či biologickou aktivitu. Pro normální životní funkce buňky je nezbytný transport různých anorganických a organických látek do a ven z buňky nebo do různých intracelulárních buněčných struktur, realizovaný transportem přes biologickou membránu. Touto cestou získává buňka nejen potřebné živiny a jiné pro ni potřebné látky, ale bohužel jsou takto transportovány i nežádoucí ionty těžkých kovů 1. Základní procesy a mechanismy transportu, na nichž je založen přenos mnoha různorodých látek, jsou zajišťovány různými systémy a pro jejich studium lze použít různé techniky. Příslušná měření v této práci byla prováděna pomocí elektrochemických metod - voltametrie, elektrochemická impedanční spektroskopie, konduktometrie, potenciometrie, které jsou vysoce citlivé a poskytují velmi přesná a reprodukovatelná data 2-4. Biologické membrány ohraničují buňku, oddělují vnější, entropické prostředí buňky od vnitřního prostředí a jsou tedy klíčové pro existenci života na Zemi. Plazmatická membrána je velice unikátní struktura s řadou specifických vlastností (mechanická odolnost, flexibilita, plasticita), které ji poskytují amfipatické molekuly fosfolipidy tvořící základ struktury buněčných membrán. Hydrofobní části těchto molekul se k sobě spontánně orientují a vytváří strukturu dvojvrstvy. Hydrofilní konce molekul jsou orientovány do vodného prostředí. Jedná se tedy o tenkou vrstvu lipidových molekul o tloušťce asi 5-7 nm, která slouží jako semipermiabilní bariéra zajišťující transport živin a odpadních látek do a z buňky. Protože práce s přirozenými buňkami, a tedy skutečnými biologickými membránami, je velmi komplikovaná, je pro studium transportu látek do buňky, mechanismu pronikání a dalších 102

105 dějů spojených s buňkou využíváno modelových membrán. Tato měření bývají realizována pomocí stabilizované černé lipidové dvojvrstvy (BLM) v mikrometrových pórech (2 8 μm) polykarbonátového nosiče, který se vkládá mezi dvě části cely (teflonové) propojené malým otvorem. Na obě strany takovéto porézní polykarbonátové membrány se nanáší roztok příslušného fosfolipidu a obě cely se následně zaplní roztokem elektrolytu 2, 5. Transport mědnatých iontů byl studován v přítomnosti ionoforu calcimycinu 6. Protože těžké kovy v podstatě neexistují v životním prostředí ve formě iontů, ale často jsou vázány v komplexech s různými látkami, jako jsou nízkomolekulární organické kyseliny (low molecular weight organic acids, LMWOAs), je velice důležité objasnit transport těchto komplexů přes studované biologické membrány. Transport mědnatých iontů byl studován v přítomnosti kyseliny šťavelové, citronové a jablečné, a to při různém ph prostředí. Experimentální část Aparatura Pro kvantifikaci elektrochemických impedancí byly jako pomocné a referentní elektrody použity Ag/AgCl elektrody (stříbrný drát, průměr 1 mm potažený AgCl) a jako pomocná elektroda sloužil platinový drát o průměru 1 mm. Tato měření byla realizována pomocí CHI 650C Electrochemical Analyzer/Workstation, Software: CHI v. 8.1 (IJ Cambrija Scientific, Carms, UK). Stanovení měďnatých iontů bylo provedeno voltametricky pomocí PC-řízeného voltametrického analyzátoru ECO-TRIBO polarografu (Polaro-Sensors, Praha, ČR), který je vybaven MultiElchem v. 2.3 softwarem (J. Heyrovského, Ústav fyzikální chemie AV ČR, v.v.i., ČR). Rtuťová kapková elektroda HMDE byla použita jako pracovní elektroda, Ag/AgCl/KCl (3 mol.l -1 ) (Elektrochemické detektory, Turnov, ČR) jako referentní elektroda a jako pomocná elektroda byl použit platinový drát (průměr 1 mm). Analyzovaný vzorek, obsahující příslušný iont a KCl, p.a. (Merck, Praha, ČR), byl vždy okyselen 100 µl HNO 3, p.a., probublán dusíkem a analyzován pomocí diferenční pulsní anodické rozpouštěcí voltametrie (DPASV) za následujících podmínek: počáteční potenciál -800 mv, konečný potenciál +150 mv, doba akumulace 120 s, potenciál akumulace -800 mv, rychlost scanu 20 mv.s -1, výška pulzu 50 mv, šířka pulzu 80 mv, klidová doba 15 s. Stanovení nízkomolekulárních organických kyselin (LMWOAs), vázaných v komplexu s měďnatými bylo prováděno pomocí DC voltametrie. Činidla a materiály Základní roztok elektrolytu 0,1M KCl byl připraven z KCl, p.a. (Merck, Česká republika). Všechna rozpouštědla čistoty p.a. byla získána z Penta-Švec, Praha, ČR. Pro všechna měření byla použita deionizovaná voda z Milli-Q-filtru (Millipore, ČR) (vodivost <0,05 µs.cm -1 ). Pro přípravu modelové membrány byl použit fosfolipid 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- fosfatydilcholin (lecithin, DPPC, GPCho (16:0/16:0), CAS No ) (Sigma-Aldrich, Prague, Czech Republic). Fosfolipidová dvojvrstva (PLBs) se vytvářela v pórech polykarbonátové membrány po nanesení roztoku fosfolipidu na její obě strany. Byly použity hydrofilní polykarbonátové membránové filtry (nosiče) (Millipore, USA) s velikostí pórů 8 µm, plocha jednoho póru je 50µm 2 a pórovitost je %. Transportní procesy příslušných iontů byly studovány v přítomnosti ionoforu calcimycinu (ionofor vápníku, antibiotikum A23187) čistota > 98% (Sigma-Aldrich, ČR) 7, který byl přidán k roztoku příslušného fosfolipidu před jeho nanesením na polykarbonátový nosič. 103

106 Příprava stabilizované fosfolipidové dvojvrstvy Alikvotní množství fosfolipidu bylo rozpuštěno ve 100 µl N-heptanu a 10 µl ethanolu, ohřáto v teplé vodě a z takto připraveného roztoku fosfolipidu (20 mg/ml v N-heptanu) bylo pipetováno 20 µl na obě strany polykarbonátové membrány umístěné mezi dvě části cely (teflonové) propojené malým otvorem. Poté se nechalo rozpouštědlo odpařit a membrána se nechala 30 minut v klidovém stavu. Následně byly obě části cely zaplněny roztokem elektrolytu. Před každým experimentem byla cela řádně promyta koncentrovanou HNO 3 a opláchnuta destilovanou vodou. S takto připravenou celou byl ještě proveden slepý pokus za stejných podmínek jako u experimentálního měření, pouze byly obě části cely oddělené nepotaženou polykarbonátovou membránou a nebyly k elektrolytu přidávány ionty. Odebraný roztok byl poté opět vyhodnocen pomocí DPASV. Roztok ionoforu byl přidán k roztoku fosfolipidu před jeho aplikaci na polykarbonátovou membránu. Calcimycin byl rozpuštěn v ethanolu a N-heptanu (koncentrace ionoforu v lipidu činila mol/l). Obě části cely, a tedy obě strany membrány, byly zaplněny po 30 minutách roztokem elektrolytu. Cela pro elektrochemická impedanční měření (EIS) Cela je tvořena dvěma teflonovými kroužky s malým otvorem v jejich středu, mezi které je umístěna polykarbonátová membrána. Oba kroužky jsou k sobě těsně přichyceny a do každého kroužku jsou ze strany zasunuty skleněné cely s malými otvory pro elektrody. Cela je znázorněna na Obr. 1. Obr. 1. Elektrochemická cela pro EIS měření, levá polovina cela 1, pravá polovina cela 2. Náhradní elektrické obvody Pro charakterizaci stabilizovaných PLBs (SPLBs) byly využity dva obvody, které byly podrobně popsány v ref. 3, 8, 9. Jednodušší obvod (Obr. 2A) sloužil pro charakterizaci nepokryté polykarbonátové membrány, kde R s představuje odpor elektrolytu, kapacita kondenzátoru odpovídá kapacitě polykarbonátové membrány a R p odpor samotné membrány. Druhý obvod (Obr. 2B) byl pro charakterizaci SPLB, vytvořené na polykarbonátové membráně, vhodnější. Tento obvod obsahuje komponenty podobné jednoduššímu obvodu a navíc jeho součástí je paralelní kombinace kondenzátoru C 2 a odporu R 2 popisující elektrické vlastnosti fosfolipidové membrány. Výsledky a diskuse Při aplikaci výše uvedeného postupu se podařilo vypracovat metodiku tvorby reprodukovatelné a stabilní SPLB na polykarbonátovém nosiči. Dále byl studován transport měďnatých iontů přes tyto membrány, tvořené DPPC, v přítomnosti a nepřítomnosti ionoforu. Pokud byl calcimycin součástí lipidové dvojvrstvy bylo množství transportovaných 104

107 měďnatých iontů 4-5%, v nepřítomnosti ionoforu nebyly transportovány žádné ionty a jejich množství ve vzorku bylo stanoveno na 0,3-0,5 %. Tato hodnota představuje chybu, která může být způsobena špatným promytím cely nebo její částečnou destrukcí v některých pórech polykarbonátového nosiče. Obr. 2. A) jednoduchý obvod B) složený obvod. Dále byl studován transport měďnatých iontů z cely 1 (elektrolytu 1) do cely 2 (elektrolytu 2) v přítomnosti LMWOAs přes DPPC v přítomnosti ionoforu při různém ph. Při kyselém ph nedochází ke vzniku komplexů měďnatých iontů s příslušnými kyselinami a nemají tedy vliv na transport měďnatých iontů do elektrolytu 2. Množství transportovaných Cu 2+ iontů je přibližně stejné jako v nepřítomnosti LMWOAs. Pokud bylo v cele 1 ph elektrolytu 5,8-6,5, vytvářely se měďnaté ionty komplexy se šťavelovou, citronovou a jablečnou kyselinou. Díky vzniku těchto komplexů se snížilo množství prošlých Cu 2+ iontů přes fosfolipidovou dvojvrstvu. Množství Cu 2+ iontů bylo stanoveno voltametrickou analýzou elektrolytu přítomného v cele 2 (elektrolyt 2). Zda byl komplex měďnatých iontů s příslušnými kyselinami přítomen v elektrolytu 2, bylo zjišťováno pomocí DP voltametrie v případě kyseliny šťavelové a DC voltametrie s adsorpční akumulací v případě jablečné a citronové kyseliny. Kyselina šťavelová byla v obou případech rozdílného ph v elektrolytu 2 přítomna. Kyseliny jablečná a citronová se za kyselého a téměř neutrálního ph v elektrolytu 2 nenacházely. Závěr Během této studie se zjistil vhodný způsob přípravy a charakterizace stabilních fosfolipidových membrán a pro tyto účely byla sestavena vhodná měřicí aparatura. Dále bylo prokázáno, že EIS měření umožňuje sledovat vznik a vlastnosti stabilizovaných lipidových membrán a také studovat transport iontů přes tyto membrány. Úspěšné zabudování ionoforu calcimycinu do lecitinové membrány umožnilo transport měďnatých iontů přes tuto membránu. Přítomnost LMWOAs ovlivňuje transport Cu 2+ iontů přes SPLBs a tyto procesy mohou být charakterizovány vyhodnocením parametrů náhradních elektrických obvodů získaných během EIS měření. Poděkování Tato práce vznikla s podporou grantů GA AV CR (IAA ) a GACR (P206/11/1638 a P208/12/1645). Literatura 1. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Int. J. Energy Env. 5, 337 (2011). 2. Navratil T., Sestakova I., Stulik K., Marecek V.: Electroanalysis 22, 2043 (2010). 3. Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Marecek V.: WSEAS Trans. Environ. Dev. 6, 208 (2010). 105

108 4. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods XXXI, Transport of divalent cations across the gel supported phospholipid membranes, Jetrichovice, , (Navratil T., Barek J., Eds.), BEST servis, p Navratil T., Sestakova I., Marecek V., Stulik K.: Modern Electrochemical Methods XXX, Transport of cadmium ions across model supported phospholipid membranes, Jetrichovice, , (Barek J., Navratil T., Eds.), BEST servis, p Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Navratil T.: Development, Energy, Environment, Economics (DEEE '10), The electrochemical assessment of cadmium and lead mobility in the rhizosphere, Puerto de la Cruz, (Mladenov V., Psarris K., Mastorakis N., Caballero A., Vachtsevanos G., Eds.), p Taylor R. W., Pfeiffer D. R., Chapman C. J., Craig M. E., Thomas T. P.: Pure Appl. Chem. 65, 579 (1993). 8. Parisova M., Navratil T., Sestakova I., Kohlikova E., Petr M.: Atherosklerosa 2011, Artificial phospholipid membranes as models of real membranes and trasnport of charged particles across them, Prague, , (Tvrzicka E., Eds.), 4th Department of Internal Medicine of First Faculty of Medicine, Charles University in Prague and the General Teaching Hospital in Prague, p Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Int. J. Electrochem. Sci. 6, 6032 (2011). 106

109 Fast Determination of Uric Acid in Human Serum and Urine by Capillary Electrophoresis (Rychlé stanovení kyseliny močové v lidském séru a moči pomocí kapilární elektroforézy) Václav Pavlíček, Klára Málková, Eva Samcová, and Petr Tůma Institute of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Third Faculty of Medicine, Charles University in Prague, Ruská 87, Prague 10, Czech Republic, vpavlicek@gmail.com Abstract Capillary electrophoresis with (DAD) was used for the determination of uric acid and allantoin. CE separation was successfully performed in CHES/NaOH and MES/NaOH solutions. The developed method is characterized by a separation time shorter than 1 min. and limit of detection 0.8 mg L -1. The method was applied to the determination of uric acid in human serum and urine. Key Words: Capillary electrophoresis, Diode array detector, Uric acid, Allantoin Úvod Kyselina močová (KM) (Obr. 1) je u člověka a primátů konečným metabolitem purinů, které jsou součástí nukleových kyselin a řady koenzymů (ATP, NAD +, aj.). Ostatní savci ji dále přeměňují na alantoin 1,2 (Obr. 2). Malé množství alantoinu lze prokázat i v krvi člověka, kde je ukazatelem zátěže organismu volnými radikály, jejichž účinkem na KM alantoin vzniká 2. KM je považována za významnou antioxidační látku, ovšem nedávné studie naznačily, že KM vstupuje do buněk prostřednictvím specifických transportérů a vyvolává zde prozánětlivé a prooxidační reakce 3. Porucha metabolismu KM souvisí se vznikem řady onemocnění jako je dna, Lesch-Nyhanův syndrom, aj. Zvýšená koncentrace KM v organismu (hyperurikémie) indikuje hypertenzi, kardiovaskulární a renální onemocnění. V klinické praxi se stanovení KM provádí enzymatickými metodami. Nejběžnější z nich využívá oxidace kyseliny močové kyslíkem za katalýzy enzymem urikázou na alantoin a peroxid vodíku. Využít lze však i řadu dalších metod, jako jsou vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) 3, plynová chromatografie (GC) 4, hmotnostní spektrometrie (MS) 5 a kapilární elektroforéza (CE) 6. A HO N OH N Obr. 1. Strukturní vzorec kyseliny močové (A) a alantoinu (B). N N H OH B O H N N H H N O O NH 2 Experimentální část Elektroforetická měření byla provedena na přístroji kapilární elektroforézy HP 3D CE (Agilent Technologies, Německo) s integrovaným detektorem diodového pole (diode-array detector - DAD) a kontrolovaným softwarem ChemStation. Elektroferogramy byly zaznamenávány a vyhodnocovány při vlnové délce 191 nm a 292 nm. K analýze byla použita křemenná kapilára (Composite Metal Services, Velká Británie) s vnější ochrannou vrstvou polyimidu, o celkové délce 32,5 cm, vnitřním průměru 50 m a vnějším průměru 360 m. Vzdálenost k detektoru od krátkého konce kapiláry činila 8,3 cm. Před použitím byla nová kapilára aktivována promýváním 0,1 mol L -1 NaOH po dobu 10 min., poté byla 10 min. promývána deionizovanou vodou a na závěr 10 min. separačním elektrolytem. Vybraná měření byla 107

110 prováděna v kapiláře pokryté pomocí INST coating solution (Biotaq, USA). Před každou separací modelového vzorku i biologického materiálu byla pokrytá kapilára promyta v sekvenci: 2 min. deionizovaná voda a 2 min. separační elektrolyt. Nepokrytá kapilára byla promyta v sekvenci: 30 s 0,1 mol L -1 NaOH, 30 s deionizovaná voda a 30 s separační elektrolyt. Vzorek byl dávkován hydrodynamicky z krátkého konce kapiláry. Separace probíhaly při napětí 30 kv a konstantní teplotě 25 C. Pro statistické zpracování dat byl použit program Origin 8.0 (OriginLab Corporation, USA). Veškeré použité chemikálie vykazovaly analytický stupeň čistoty: kyselina močová (Fluka), hydroxid sodný (Fluka), kyselina p-aminosalicylová (PAS, Sigma - Aldrich), 2-(Nmorpholin)ethansulfonová kyselina (MES hydrát, Sigma Aldrich), alantoin (Fluka), 2- (Cyclohexylamino)ethansulfonová kyselina (CHES, Sigma - Aldrich). K přípravě separačních elektrolytů a zásobních roztoků standardů byla použita deionizovaná voda (Millipore, Bedford, USA). Standardní roztok kyseliny močové (1 mg.ml -1 ) a 4-aminosalicylové kyseliny (1 mg.ml -1 ) byl získán rozpuštěním pevných látek v deionizované vodě s přídavkem NaOH do úplného rozpuštění. Separační pufry o složení 60 mm MES + 30 mm NaOH (ph = 6,0) a 80 mm CHES + 40 mm NaOH (ph = 9,6), byly připravovány každý den čerstvé. ph bylo měřeno laboratorním ph metrem pmx 3000 WTW (Německo). Vzorky krevního séra a moči byly odebrány nalačno. Krevní sérum bylo získáno odebráním srážlivé krve do vakuových zkumavek; centrifugace při ot. min -1 po dobu 15 minut. Vzorky krevní plazmy byly uchovány v 0,5 ml nádobkách Eppendorf při teplotě - 20 C, naopak vzorky moči v plastových uzavíratelných zkumavkách při teplotě 2 C. Před elektroforetickou separací byly vzorky temperovány na laboratorní teplotu, poté zpracovány dle následující metodiky: 50 l vzorku bylo smícháno s 10 l 10 mg L -1 roztoku kyseliny p- aminosalicylové (PAS), 10 l 1 mol L -1 NaOH a 930 l deionizované vody. Tímto postupem je získán 20krát zředěný vzorek. Výsledná koncentrace PAS je 10 mg L -1 a koncentrace NaOH 0,01 mol L -1. PAS je použita jako vnitřní standard pro zvýšení přesnosti elektroforetického stanovení a NaOH je přidáván z důvodu malé rozpustnosti KM ve vodě 7. Výsledky a diskuze KM je slabá dvojsytná kyselina s hodnotou pk A pro první disociační stupeň 5,4. Pro CE stanovení kyseliny močové byly testovány dva separační elektrolyty o složení: 60 mm MES + 30 mm NaOH (ph 6,0) a 80 mm CHES + 40 mm NaOH (ph 9,6). Kyselé složky separačních pufrů (MES, CHES) vykazují nízkou iontovou vodivost a mohou být tedy použity ve vysokých koncentracích 7,8. V koncentrovaných pufrech dochází k zaostření zón analyzovaných látek, které se od sebe snáze oddělí, což má zásadní význam při separaci biologických vzorků 7. Vysoké koncentrace složek separačního elektrolytu mohou též bránit adsorpci proteinů přítomných v biologickém vzorku na stěnu kapiláry 8. Separace v MES/NaOH (ph 6,0) byla prováděna v pokryté kapiláře se zastaveným elektroosmotickým tokem při použití negativního separačního napětí (-30 kv). Naopak separace v CHES/NaOH (ph 9,6) byla prováděna v nepokryté kapiláře při pozitivní polaritě (+30 kv); za těchto podmínek migruje KM proti elektroosmotickému toku. Záznamy separací jsou uvedeny na obr. 2 a 3. Parametry kalibračních závislostí pro obě metody jsou shrnuty do Tabulky I. 108

111 Obr. 2. Záznam elektroforetického stanovení kyseliny močové v lidské moči (A, 541 mg L -1 ) a v krevním séru (B, 49,8 mg L -1 ). Experimentální podmínky: separační elektrolyt; 60 mm MES + 30 mm NaOH (ph 6,0), hydrodynamické dávkování 200 mbar.s, napětí +30 kv, UV detekce při 292 nm, indentifikace píků; PAS (1) a KM (2). Obr. 3. Záznam elektroforetického stanovení kyseliny močové v lidské moči (A, 322 mg L -1 ) a v psí moči (B, 11,2 mg L -1 ). Experimentální podmínky: separační elektrolyt; 80 mm CHES + 40 mm NaOH (ph 9,6), hydrodynamické dávkování 100 mbar.s, napětí - 30 kv, UV detekce při 292 (A) a 191 (B) nm, indentifikace píků; PAS (1), KM (2) a alantoin (3). Obě metody jsou lineární v testovaném koncentračním rozsahu 2,5 10 mg L -1 s hodnotou korelačního koeficientu (R) větší než 0,999 a s limitem detekce (LOD) 5 μmol L -1. Při stanovení kyseliny močové ve stejném vzorku lidské moče se výsledek nelišil o více jak 3 %. Pro kontrolu bylo stanovení kyseliny močové prováděno i standardní enzymatickou metodou (KM, Urikáza PAP (146200), Greiner Diagnostic GmbH, Německo) používanou v klinických laboratořích, která poskytla hodnoty lišící se o 7 % pro krevní sérum a o 4 % pro moč. V alkalickém separačním elektrolytu složeném z CHES/NaOH (ph 9,6) lze vedle kyseliny močové stanovovat i alantoin (pk A 8,5), jak je demonstrováno na analýze psí moči (obr. 3B). 109

112 Tabulka I. Parametry lineárních regresních závislostí výšky píku na koncentraci KM. Parametry byly získány ze čtyř různých koncentrací v rozmezí 2,5 až 10 mg L -1. Separační elektrolyt MES/NaOH, ph 6,0 CHES/NaOH, ph 9,6 Citlivost [mau mg L -1 ] Úsek [mg L -1 ] R LOD [mg L -1 ] LOD [µmol L -1 ] 0,318-0,135 0,9991 0,8 4,8 1,071-0,048 0,9997 0,8 4,7 Obě metody byly porovnány z hlediska migračního času, separační účinnosti a rozlišení blízkých píků, viz Tabulka II. V alkalickém separačním elektrolytu CHES/NaOH (ph 9,6) s rychlým elektroosmotickým tokem bylo dosaženo nejkratšího migračního času pro KM cca 20 s; s rozlišením, KM/PAS, 1,2. Při použití MES/NaOH (ph 6,0), kdy je separační kapilára pokrytaa je zastaven elektroosmotický tok, vzroste doba separace pro KM dvojnásobně na cca 40 s, s rozlišením, KM/PAS, 12,1. Z těchto dat vyplývá, že pro aplikace, u kterých je limitujícím faktorem doba separace a nezáleží na separační účinnosti, je vhodnějším prostředím CHES/NaOH, ve kterém lze kromě KM stanovit i alantoin. V případech, kdy je potřeba dosáhnout vyššího rozlišení, je vhodnějším separačním elektrolytem MES/NaOH. Předností nově vyvinutých elektroforetických metod pro stanovení KM na krátké efektivní dráze v porovnání s tradičním CE stanovením v dlouhé kapiláře (efektivní délka 69 cm) vyplývá 8, že zkrácením separační dráhy lze několikanásobně zredukovat dobu separace (z původních cca 11 min. na méně než 1 min.), při zachování totožné separační účinnosti. LOD na dlouhé separační dráze jsou přibližně 4krát nižší, což souvisí s větším množstvím vzorku nadávkovaným do kapiláry. Tabulka II. Migrační čas, separační účinnosti, rozlišení a LOD. Efektivní délka Separační Migrační čas kapiláry elektrolyt [s] [cm] MES/NaOH, ph 6,0 CHES/NaOH, ph 9,6 MES/Tris + polybren, ph 6,1 N [m -1 ] R LOD [µmol L -1 ] 8, ,1 4,7 8, ,2 4,8 69, ,6 1,2 Závěr Dávkováním vzorku z krátkého konce kapiláry lze docílit sub-minutových separačních časů, jak bylo demonstrováno u dvou nově vyvinutých metod pro stanovení kyseliny močové v moči a séru. Dále bylo ukázáno, že i na krátké separační dráze lze dosáhnout dobrého rozlišení, které je dostatečné pro analýzu biologických vzorků. Velmi rychlé elektroforetické separace se v budoucnu mohou stát silným nástrojem v klinické analýze. 110

113 Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury Univerzity Karlovy, grant č a UNCE Literatura 1. Murray R. K., Granner D. K., Mayes P. A., Rodwell V. W.: Harperova biochemie. Nakladatelství a vydatelství H & H Racek J. et al.: Klinická biochemie. Galén, Karolinum Kanďár R., Žáková P., Mocová P., Skalický J., Kovařík J.: Klin. Biochem. Metab. 18, 167 (2010). 4. Lakshmi D., Whitcombe M. J., Davis F., Skarun P. S., Prasad B. B.: Electroanalysis 23, 305 (2011). 5. Chen X. B., Calder A. G., Prasitkusol P., Kyle D. J., Jayasuriya M. C.: J. Mass Spectrom. 33, 130 (1998). 6. Pormsila W., Krähenbühl S., Hauser P. C.: Anal. Chim. Acta 636, 224 (2009). 7. Tůma P., Samcová E.: Chem. Listy 103, 919 (2009). 8. Matějčková J., Tůma P., Samcová E., Zemanová Z.: J. Sep. Sci. 30, 1947 (2007). 111

114 Diffusion Characteristics of Chlorine and Methoxy Derivatives of 6 benzylaminopurine Studied by Voltammetric Methods (Difuzní charakteristiky chlor a methoxy derivátů 6-benzylaminopurinů studované voltametrickými metodami) Iveta Pilařová a,b and Libuše Trnková a,c a Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kamenice 5, Brno, Czech Republic, E mail: @mail.muni.cz, libuse@chemi.muni.cz b Central European Institute of Technology CEITEC, Masaryk University, Zerotinovo namesti 617/9, Brno, Czech Republic c Central European Institute of Technology CEITEC, Brno University of Technology, Technicka 3058/10, Brno, Czech Republic Abstract The metal complexes of chlorinated and methoxylated derivatives of 6 benzylaminopurine (6 BAP) can be used as potential antineoplastic agents. From this point of view, the knowledge of the ability of these substances to diffuse into the intracellular area is very important. This property is characterized by the diffusion coefficient. The aim of our research is to determine the diffusion coefficients D of 6 BAP and its derivatives in buffered solutions (ph 3.21) containing 10% v/v CH 3 OH for two ionic strengths. Using the Delahay equation involving the reduction peaks of BAP derivatives on a mercury electrode we calculated D and the charge transfer coefficients α we obtained from the elimination functions E1 and E4. The effect of some experimental parameters on D values was monitored. Key Words: Chlorine and Methoxy derivatives, Diffusion coefficient, Delahay equation, Linear sweep voltammetry, Elimination voltammetry with linear scan. Introduction 6 benzylaminopurine (6 BAP) is the most important adenine type cytokinin. Cytokinins are phytohormones that promote cell division, growth of plants, bud development, and branching of stems 1. Nowadays, great attention has been paid to chlorinated and methoxylated derivatives of 6 BAP. These derivatives, which in protonated state readily form complexes with divalent metals (Cu, Co, Pt, Pd, Fe), are used as potential antineoplastic agents. Their antitumor activity was monitored primarily for the treatment of breast carcinoma, chronic myelogenous leukemia, and osteogenic sarcoma From the electrochemical point of view, purines and their substituted derivatives are substances with electroactive properties. The redox behavior of purine derivatives on mercury and graphite electrodes was studied previously 5, 6. The electrochemical methods enable to determine not only the redox potentials of electrochemical reactions but also to analyze the mechanism of electrode processes. The knowledge of the redox responses is necessary also for the determination of important parameters of substances such as the diffusion coefficient 6. And, because of the utilization of these derivatives as potential cytostatics, diffusion plays a crucial role in the transport of these drugs across cell membranes into the intracellular area, where they undergo biotransformation. The aim of our research is to determine the diffusion coefficients (D) of chlorinated and methoxylated derivatives of 6 BAP using linear sweep voltammetry (LSV) in connection with elimination voltammetry with linear scan (EVLS). Using the elimination of one of the partial current components (diffusion, capacity, kinetics) EVLS, as a mathematical procedure, allows to sensitively detecting the hidden minority processes in the major processes. It is an easy tool for fast detection of the depolarizer adsorption on the electrode surface

115 Moreover, the adsorption process can be determined by diffusion. Our research was aimed to submit the diffusion characterization of 6-BAP and its derivatives showing all parameters that affect the values of diffusion coefficients. Experimental Chemicals Because of the solubility of 6 BAP (Lachema, Brno) and methoxy and chlorine derivatives of 6 BAP (synthetically prepared at the Department of Inorganic Chemistry, Faculty of Science, Palacky University, Olomouc, Czech Republic), their stock solutions were prepared in the 100 % v/v CH 3 OH (p.a.; Penta, Chrudim, Czech Republic). For the preparation of phosphate acetate buffer a mixture of acetic acid (glacial; Sigma Aldrich; ACS reagent), phosphoric acid (84%; p.a.; Penta) and sodium hydroxide (Sigma Aldrich; 97%; p.a.) was used. The ionic strength was adjusted by NaCl (Sigma Aldrich; ACS reagent; 99%; p.a.). Solutions of acetic acid, phosphoric acid, sodium hydroxide, and sodium chloride in distilled MILI Q water were prepared. Methods The voltammetric experiment was performed using an electrochemical analyzer AUTOLAB PGSTAT 302 N (Metrohm) in connection with VA Stand 663, controlled by GPES Manager software. The typical three-electrode set was used: a mercury drop electrode (HMDE) with an effective area of 0.3 mm 2 as a working electrode, the Ag/AgCl/3M KCl and platinum wire as a reference and an auxiliary electrode, respectively. The supporting electrolyte was phosphate acetate buffer (ph 3.21) containing 10% v/v CH 3 OH. Ionic strength was adjusted to 0.1 and 1 M NaCl. The concentration of 6 BAP and its derivatives was mol L -1. The LSV curves were measured in the range of potentials from 1 to 1.7 V at scan rates from 100 to 800 mv.s -1 at 23 C. From the smoothed LSV curves (Sawitzky Golay filter; level 2) measured at scan rates 200, 400, and 800 mv.s -1 the elimination functions E1 and E4 with the conservation of the diffusion current were used. While EVLS function E1 eliminates only the kinetic current component, EVLS function E4 eliminates simultaneously the kinetic and charging current components corresponding to equations: E1: f(i) = I I 1/2 and E4: f(i) = I I 1/ I 2 7, 8, 12, 13. Results and discussion Linear sweep voltammetry (LSV) and elimination voltammetry with linear scan (EVLS) The LSV curves for chlorine and methoxy derivatives of 6 BAP at ionic strengths of 0.1 M and 1 M (NaCl) in phosphate acetate buffer (ph 3.21) containing 10% v/v CH 3 OH, in the range of potentials from 1 to 1.7 V at scan rates from 100 to 800 mv/s were measured. In the case of 6 BAP and 2 methoxy and 4 methoxy derivatives the LSV experiment indicates a new process. This new process proceeding in the adsorbed state (EVLS peak counterpeak) was sensitively detected by elimination voltammetry (EVLS) as a second peak in the region of more negative potentials. In the case of 3' methoxy BAP the EVLS also provides a readable peak counterpeak signal showing the presence of the substance in the adsorbed state. It can be observed that the substituent on the benzene ring in the molecule of 6 BAP causes a shift to more negative potentials. Simultaneously, with increasing distance of the methoxy substituent from the basic aminopurine skeleton, the height of the reduction signal is increasing (Figs. 1A1 and 1B1). The increasing ionic strength causes a decrease of the height of the reduction peaks, but without any potential shift. The methoxy derivatives of 6 BAP provide a four times higher EVLS signal than does the unsubstituted 6 BAP. 113

116 Fig. 1. LSV (A1, B1) and EVLS E4 (A2, B2) curves for 6 BAP and its methoxy derivatives at two ionic strengths. In comparison with the redox behavior of methoxy derivatives of 6 BAP, the chlorinated derivatives, presented here, show a different behavior. The chlorine on the benzene ring causes a shift of the reduction signals to more negative potentials, resulting in the LSV and EVLS curves. It is evident that chlorine derivatives of 6 BAP provide higher reduction signals than does unsubstituted 6-BAP. In the case of 6 BAP, the LSV experiment indicates a new process, not occurring in the case of chlorine derivatives. For 6 BAP and its chlorinated derivatives EVLS yields peak counterpeak signals confirming an adsorbed state. Moreover, in the case of 6 BAP the EVLS indicates a second peak at more negative potentials. While the height of the reduction signals of methoxy derivatives increases with the distance of the substituent from the aminopurine skeleton, the height of the reduction signals of chlorinated derivatives is not increasing (Figs. 2C1 and 2D1). Concerning the influence of ionic strength it can be concluded that the higher ionic strength causes only a decrease of the height of the reduction signals without any potential shift. Fig. 2. LSV (C1, D1) and EVLS E4 (C2, D2) curves for 6 BAP and its chlorine derivatives at two ionic strengths. 114

117 Using the Delahay equation 5 for an irreversible system: 5 1/ 2 1/ 2 1/ 2 Ip n na A D C v, where n and αn a is the total electron number and the product of the charge transfer coefficient with the number of electrons participating in the slowest step respectively, A is the electrode area (cm 2 ), D is the diffusion coefficient (cm 2.s -1 ), C (mol.cm -3 ) is the bulk concentration of the analyte, and v (V.s -1 ) is the scan rate. Applying the LSV reduction peak heights, the diffusion coefficients of 6 BAP and of its chlorinated and methoxylated derivatives were calculated. The charge transfer coefficient together with the number of electrons participating in the slowest step (αn a ) was estimated from the difference between E1 and E4 elimination peak potentials. The D values for all derivatives, extrapolated to zero scan rates, are presented in the following Tables. Table I. Diffusion coefficients for methoxy derivatives of 6 BAP. I = 0.1 M I = 1 M D extrapol. (10 5 cm 2 /s) D extrapol. (10 5 cm 2 /s) 6 BAP OCH 3 BAP OCH 3 BAP OCH 3 BAP It follows from Table I that the binding of the methoxy group in position 4 '(para) causes a substantial increase of the diffusion coefficient, but, with a decreasing distance of the substituent from the aminopurine skeleton, the value of the diffusion coefficient decreases. In the case of the substituent in position 2' (ortho) the D value is the lowest. It was found that the influence of ionic strength can be generalized for all derivatives: the diffusion coefficients have lower values at higher ionic strengths. From Table II it is evident that the trend valid for methoxy derivatives is analogous for chlorine derivatives. It is worth noting that the para substituent shows the highest D values. In the case of 3' Cl BAP the D value is lower than for 3' OCH 3 BAP for both ionic strengths. Table II. Diffusion coefficients for chlorine derivatives of 6 BAP. I = 0.1 M D extrapol. (10 5 I = 1 M D extrapol. (10 5 cm 2 /s) cm 2 /s) 6 BAP Cl BAP Cl BAP Cl BAP Conclusion The redox behavior of 6 BAP and its methoxylated and chlorinated derivatives on a mercury drop electrode (HMDE) using linear sweep voltammetry (LSV) in connection with elimination voltammetry with linear scan (EVLS) was studied. For further evaluation of the electrode processes the elimination function E4 was calculated. For all studied derivatives the EVLS provided readable peak peak counter signals and indicated the presence of the substance in an adsorbed state. Moreover, in the case of 6 BAP and 2' OCH 3 BAP, EVLS sensitively revealed a new process in the form of a second peak in the more negative potential region. Generally, due to increasing ionic strength the height of the reduction signal 115

118 decreases. Using the Delahay equation for an irreversible process the values of the diffusion coefficient were estimated. It was observed that D is influenced not only by the substituent, but also by its position on the benzene ring. The substituent (methoxy or chlorine) binding into the para position causes a substantial increase of the D value. It therefore follows that the substituent in the para position allows the best diffusion transport of the substances studied to the electrode surface. With a decreasing distance of the substituent from the aminopurine skeleton the D values decrease. Simultaneously, the increasing ionic strength contributes to the decrease of the diffusion coefficient. We can conclude that there is one important fact to be noted. For a given ph (3.21) all derivatives are in protonated forms 5 and their diffusion mass transport could be influenced by electrostatic interactions between the derivatives and the negatively charged electrode surface and also by their adsorption. Acknowledgment This research was supported by Project 106/09/H035 of the GA CR and by the CEITEC Central European Institute of Technology Project CZ.1.05/1.1.00/ , and by the project MUNI/A/0992/2009 of the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic. The authors thank Professor Zdeněk Trávníček (Dept. of Inorganic Chemistry, Faculty of Science, Palacky University, Olomouc, Czech Republic) for the synthesis of 6 BAP derivatives and the Metrohm Company for the possibility of presenting these results. References 1. Malon M., Travnicek Z., Marek R., Strnad M.: J. Inorg. Biochem. 99, 2127 (2005). 2. Malon M., Travnicek Z., Marysko M., Marek J., Dolezal K., Rolcik J., Strnad M.: Trans. Metal Chem. 27, 580 (2002). 3. Malon M., Travnicek Z., Marysko M., Zboril R., Maslan M., Marek J., Dolezal K., Rolcik J., Krystof V., Strnad M.: Inorg. Chim. Acta 323, 119 (2001). 4. Klanicova A., Travnicek Z., Vanco J., Popa I., Sindelar Z.: Polyhedron 29, Dryhurst G.: Electrochemistry of Biological Molecules London Tarkowska D., Kotoucek M., Dolezal K.: Collect. Czech. Chem. Commun. 68, 1076 (2003). 7. Dracka O., Trnkova L.: J. Electroanal. Chem 413, 123 (1996). 8. Dracka O.: J. Electroanal. Chem 402, 19 (1996). 9. Trnkova L., Jelen F., Postbieglova I.: Electroanalysis 15, 1529 (2003). 10. Trnkova L., Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 348, 265 (1993). 11. Trnkova L., Kizek R., Dracka O.: Electroanalysis 12, 905 (2000). 12. Trnkova L., v knize: Utilizing of bio-electrochemical and mathematical methods in biological research. (Adam V., Kizek R., Eds.), sv.vol. Research Signpost, Kerala, Trnkova L.: Chem. Listy 95, 518 (2001). 116

119 Oligonucleotide Probes End-Labeled with Oxoosmium Complexes for Electrochemical Analysis of Sequence and Structure-Specific Interactions of p53 Protein with DNA (Oligonukleotidové sondy koncově značené komplexy oxoosmia pro elektrochemickou analýzu sekvenčně a strukturně specifických interakcí proteinu p53 s DNA) Hana Pivoňková, Kateřina Němcová, Peter Šebest, Luděk Havran, Petr Orság, and Miroslav Fojta Institute of Biophysics of the AS CR, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Czech Republic, hapi@ibp.cz Abstract In this paper, we extend the area of utilization of electrochemically active compounds for probing DNA-protein interactions, using immunoprecipitation of protein-dna complexes at magnetic beads covered with protein G. We use double-stranded oligonucleotides bearing a dt 20 single-stranded overhangs which are selectively labeled with Os,bipy adducts and are specifically recognized by the tumour suppressor p53 protein according to the presence or absence of a specific binding site (consensus sequence, p53con) and in dependence on antibody used. The labeled probes recovered from immunoprecipitated complexes are determined voltammetrically at hanging mercury drop electrode, using a catalytic peak produced by the osmium marker. Key Words: Electrochemical analysis, Osmium complex, Protein p53, DNA-protein interaction, Immunoprecipitation. Introduction Osmium tetroxide complexes with nitrogen ligands (such as 2,2 -bipyridine, Os,bipy) have been widely used as electroactive labels of DNA 1. It was found that Os,bipy covalently binds to pyrimidine bases (especially thymines) in single-stranded DNA forming stable adducts and at mercury based electrodes gives well developed peaks. Since that, Os,bipy was often used as a sensitive and highly selective probe of DNA structure and was used in connection with DNA sensors. Electrochemical methods used for detection of DNA hybridization often utilize labeling of DNA (oligonucleotides) with electroactive moieties which results in better discrimination between labeled and non-labeled DNA and improves sensitivity and selectivity of the analysis. Specific labels can be introduced into nucleic acids during chemical synthesis of oligonucleotides, through enzymatic incorporation of modified nucleotides or via chemical modification of natural nucleic acids. Tumor suppressor protein p53 is one of the most important stress-induced transcription factors involved in the cell defense against genomic instability and malignant transformation. Its functions are closely connected with its ability to bind DNA. Protein p53 consists of several domains; two of them are involved in DNA binding. Central domain is responsible for sequence-specific DNA recognition (binding to p53 consensus sequence, p53con) and C- terminal DNA binding site (CTDBS) is responsible for structure-specific DNA binding. DNA-protein interactions can be modulated in many ways (posttranslational modification of protein, binding of monoclonal antibodies and influence of environment, e.g. salt concentration, presence of divalent ions or oxidative agents). DNA-protein interactions are studied primarily using electromobility shift assay (EMSA) in agarose gels. Nevertheless, this technique is not suitable in all cases, e.g. when using non-purified proteins, cell lysates or DNA topoisomers. Recently, a new capture-release technique was introduced 2, assessing recognition of various targets sites within DNA by the protein p53 using immunoprecipitation of protein-dna complexes at magnetic beads via specific anti-p53 antibodies. Here we 117

120 present combination of this technique with electrochemical detection of captured DNA modified with osmium complexes. Experimental Synthetic 70-mer oligonucleotides, either containing or lacking p53con and both containing single-stranded dt 20 overhang, were annealed with complementary 50-mer strands and mixed with 2 mm Os,bipy to introduce osmium labels within the oligot tail. After 2-hour incubation at 20 C in 100 mm Tris buffer ph 7.0, unreacted Os,bipy was removed by dialysis. The p53 immune complexes were prepared by mixing of a monoclonal antibody (DO-1 or Bp ) with the protein in binding buffer (50mM KCl, 5mM Tris and 0.01% Triton X- 100, ph 7.6) in a total volume of 20 l, followed by 20-min incubation. Then, 10 ng of the modified probe and/or 600 ng (equimolar amount) of the competitor plasmid DNA /sc or lin were mixed with the immune complex and incubated in the binding buffer for 30 min on ice. Magnetic beads (12.5 L of the stock suspension per sample) coated with protein G (DBG, Dynal/Invitrogen), were washed three times with 100 L of the binding buffer. The beads were separated from the supernatant using magnetic particle concentrator. Then the binding reaction mixture was added and incubated with the beads for 30 min at 10 C whilst shaking mildly. Finally, after triplicate washing with the binding buffer, the DNA was released from the beads and analyzed electrochemically. Electrochemical responses of Os,bipy modified ODN probes were measured by means of adsorptive transfer stripping differential pulse voltammetry (AdTS DPV) at hanging mercury drop electrode (HMDE). The three-electrode system was used. The working electrode was HMDE, the reference electrode was Ag/AgCl/3M KCl electrode, and platinum wire was used as the auxiliary electrode. Following settings were used: room temperature, accumulation time (t a ) 60 s, initial potential -0.4 V, end potential -1.6 V, amplitude 50 mv, background electrolyte Britton-Robinson buffer ph 4.0. The analyte solution was deaerated before each experiment by bubbling argon. DBG antibody washing dissociation p53 detection Os-labeled probe Fig. 1. Scheme of the electrochemical magnetic beads-based immunoprecipitation assay of the p53 DNA binding. Immune complex antibody-protein-labeled DNA is formed in solution and captured at magnetic beads covered with protein G. After repeated magnetic separation and washing steps, the p53-dna complex is dissociated and the labeled probe determined by AdTS DPV at HMDE. Results and discussion Binding of the osmium labeled oligonucleotide probes resulted, after the MBIP procedure depicted in Fig. 1 and subsequent AdTS DPV analysis of output samples, in appearance of characteristic voltammetric peak around -1.2 V corresponding to catalytic hydrogen evolution that is known to accompany last reduction step of the osmium-dna adduct 1 (Fig. 2). In the absence of any unlabeled competitor DNA, both non-specific and specific probes were bound 118

121 I[ A] by the protein, while in the presence of long plasmid DNA competitors binding of the protein to the short oligonucleotide probes was depressed, resulting in diminution of the osmium signal after the MBIP procedure. For the non-specific probe, any (specific or non-specific) competitor DNA caused disappearance of the osmium peak. For the specific probe, the result depended on presence of p53con in the competitor DNA and on antibody used. In general, antibody Bp potentiated binding of the protein to the specific probe in agreement with a known activation effect of the antibody towards the sequence specific binding. However, when specific plasmid competitor was added to the reaction mixture, binging of the p53 protein to the short probe was depressed, in contrast to a considerable signal observed with the specific labeled probe while competing with non-specific plasmid DNA (Fig. 2) el E [V] Fig. 2. AdTS DPV responses resulting from competition MBIP assay with antibody Bp , labeled specific (curves 1,2) or non-specific (curve 3) probes and unlabeled plasmid DNA non-specific (curve 2) or specific (curve 3) competitors. Curve 1 is positive control (specific probe in the absence of any competitor), el stands for blank background electrolyte. Conclusion We successfully connected simple electrochemical detection of tail-labeled DNA (using both mercury and carbon electrodes) with capture-release technique suitable for studying protein-dna interactions. We found, that protein p53 retains its DNA binding features including the ability to modulate sequence- and structure-specific interactions through antibody blocking of its C-terminal DNA binding site and that modification of single-stranded overhangs doesn t influence protein-dna recognition. Measurement of Os,bipy-modified DNA at the mercury-based electrodes, allow facile determination of subnanogram or even tens-of-picogram quantities of the labeled probes. This approach can easily be used also for other DNA-binding proteins. Acknowledgements: This work was supported by the Czech Science Foundation (grant P301/11/2076 to H.P.) and by the Grant Agency of the ASCR (grant IAA to M.F.), and by RVO Literature 1. Fojta M.; Kostecka P.; Pivonkova H.; Horakova P.; Havran L. Curr Anal Chem, 7, 35 (2011). 2. Pivonkova H., Šebest P., Pecinka P., Ticha O., Nemcova K., Brazdova M., Brazdova Jagelska E., Brazda V., Fojta M.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 393, 894, (2010). 119

122 Ion Current Rectification Behavior at Novel Borosilicate Glass Capillaries (Usměrněný transport iontů v borosilikátových kapilárách) Barry Silver, Karel Holub, and Vladimir Marecek J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, barry.silver@jh-inst.cas.cz Abstract We present an easy methodology to produce novel, robust and reusable borosilicate glass microcapillaries. Using these capillaries we investigate ion current rectification behavior using DC and AC electrochemical techniques. We find that two non-ohmic behaviors can manifest. The presence of low frequency inductive loops on the Nyquist plot tentatively suggests electrokinetic mass transport processes may be present at the capillary wall. Key Words: Ion, Rectification, Impedance, Capillary. Introduction Glass electrodes, fabricated from glass capillaries (typically from quartz, borosilicate or aluminosilicate glasses) filled with electrolyte solutions, have found extensive use in a wide range of electrochemical applications within the life and physical sciences 1, 2. Capillary-based electrodes have been used as nanosensors 3, for scanning ion conductance microscopy applications 4, as microelectrodes for electrophysiological patch-clamp measurements 1 and for the study of ion-transfer reactions at the interface between two immiscible electrolyte solutions (micro-ities) 5. Glass microcapillaries are easily produced (with a laser puller) which facilitates even heating of the glass surface with simultaneous application of tensile force 6. The combination of even heating and tensile stress leads to the production of a fragile micron to nano-sized orifice at the tip of a pulled glass capillary 6. Capillaries thus made are seldom re-useable without tip breakage. Microcapillaries with orifice diameters of approximately 20 microns typically produce an ohmic current response to the applied potential 2. In this size range, contributions to the total cell impedance from the double-layer capacitances (of both the capillary and reference electrodes) are usually negligible and can often be disregarded 2. Also often neglected in impedance calculations are contributions from rapid charge transfer reactions taking place at the reference electrodes 2. Capillary tip geometries of nanoscale dimension (typically tens of nanometres), have been found to exhibit non-ohmic current response behaviors to an applied potential difference 2, 7-9. Perhaps the most well-known example of the non-ohmic response is ion current rectification (ICR) 8, 10. ICR has been frequently reported and studied at nano-sized tip geometries 2, 7, 8. A major characteristic of classical ICR 7 is that currents produced under positive bias (polarity of reference electrode within the capillary) is lower than that produced at negative bias 7. The majority, but not all 11, of previous simulation and experimental work has been conducted on tip geometries which are of definite nanoscale dimension. The fabrication of robust nano to micron-sized pore geometries usually involves a set of complicated manufacturing procedures (involving pulsed lasers 11 and heavy ion track etching 12 for example). In this paper we show that non-ohmic effects are still very much evident at borosilicate glass capillaries exhibiting orifice diameters in size ranges in the order of 1 μm. Using EIS, we corroborate findings concerning the existence of low-frequency inductive loops on unmodified glass capillaries which exhibit non-ohmic behavior. Equivalent circuit 120

123 modeling of this impedance data suggests the existence of a possible, often ignored electrokinetic mass transport effects. Experimental All electrolyte solutions were made using reagent dissolved in distilled water (Goro, Prague, Czech Republic). LiCl (Fluka, Biochemika, 62476, > 99% purity) was used throughout. Methodology outlined herein for capillary fabrication (vide infra) is based upon that previously reported 13. A Sutter Model P-2000 laser pipette puller (Sutter Instruments Co.) was used to produce pulled glass capillaries with an abnormally long shank length. Borosilicate capillaries (Hilgenberg, Germany, # ; o.d. of 1 mm and wall thickness of 0.21 mm) were used for this purpose. Using long shank geometry, the glass is slowly bulbed by hand (Fig. 1a) (vide infra). Bulbed capillaries were subsequently rough grinded by sanding on a home-made grinding apparatus. Successive grades of sandpaper were used to reveal an opening in the tip region (Fig. 1c). Variation in tip geometry may be obtained by varying pulling parameters and by variation of the bulbing stage (Fig. 1d and 1e). The clean and polished glass capillaries were then filled with electrolyte solution via rapid boiling in electrolyte solution (typically 10 mm LiCl). Capillaries can at this stage be examined via optical microscopy to see if any trapped air-bubbles are present. Micron-sized orifice diameters were measured using optical microscopy. Capillaries were removed from the heated electrolyte solution and left to cool at room temperature in an electrolyte bath (containing the same electrolyte at room temperature). Capillaries thus fabricated may be re-used a number of times after washing (in water and acetone for example). A small chlorodized silver wire (smaller than the i.d. of the capillary) was inserted into the back of the capillary (after electrolyte filling) and served as a quasi-reference electrode (Ag/AgCl). Another chlorodized silver wire served as a quasi-reference electrode in the outer solution. A 1 mm diameter plain silver wire served as a counter electrode and located in the outer solution. The 3- electrode electrochemical cell, which was housed within a Faraday cage, and used throughout was of the following form: Ag/AgCl (capillary) / 10 mm LiCl / 10 mm LiCl(outside solution) / AgCl/Ag (outside solution) Electrochemical polarization curves were produced using a Solartron SI1287 electrochemical interface (Solartron Analytical, U.K) controlled via in-house, custom-built Labview (National Instruments, USA) control software. Electrochemical impedance spectroscopy was conducted on a SI1287 electrochemical interface in conjunction with a SI1255 frequency response analyseds (Solartron Analytical, U.K). Both instruments were controlled via in-house, custom-built Labview control software. Electrochemical impedance spectra were analyzed and modeled using LEVM / LEVMW ver (a well-known complex non-linear least squares fitting program made freely available by J.Ross Macdonald 14 ). 121

124 Results and discussion Fig. 1 (a) An optical micrograph indicating a pulled glass capillary which has been bulbed. A red line indicates an arbitrary point to which the capillary may be machined to reveal an orifice (b) An black arrow points to the location of an orifice produced after rough grinding the bulbed section back to an arbitrary point. Diameter of the orifice shown by black arrow in (b) is 20 µm. (c) and (d) indicate two of many possible tip geometries that can be easily and quickly produced using methodology reported herein. Conclusions We have presented a methodology which enables the facile production of robust and reuseable borosilicate glass capillaries with micro- to nanosized tip geometries. Using these easily fabricated glass capillaries (with orifice diameters of well over 500 nm), two nonohmic current response behaviors have been produced. The presence of low frequency inductive behavior in the enhanced current arm of non-functionalized borosilicate capillaries exhibiting non-ohmic behavior has been observed. This observation corroborates findings of recent studies. The existence of low frequency inductive behavior tentatively suggests a role for cation-specific electrokinetic effects in ICR. The effects of the non-ohmic behavior on ion transfer processes occurring at the interface between two immiscible electrolyte solutions will form the basis for future work. 122

125 Fig. 2. (a) and (b) a capillary exhibiting higher currents at positive potential than at negative potential. The unpolarised capillary resistance derived from modelling impedance spectra (denoted EIS) at zero potential provides a useful datum line. Potential was scanned from 0 V to -1 V (2(a)) and from 0 V to +1 V (2b) respectively at varied scan rate. Electrolyte 10 mm LiCl. Capillary orifice diameter was approximately 1.8 µm. 2(c) and 2(d) impedance spectra collected from capillary featured in 2(a) and 2(b). The impedance modulus 2(c) ( Z Re( Z) Im( Z ) ) is shown versus the log of the frequency for potentiostatic EIS conducted at +1V, 0V and -1V respectively. 2(d) Nyquist plot representation of the impedance data. The line in 2(c) denotes the frequency at which the three potentiostatic impedance spectra begin to depart from each other (approx. 300 Hz). The horizontal line in 2(d) indicates a horizontal dividing line between the point of negative and positive imaginary impedance, and is shown as a guide for the eye. Electrolyte 10 mm LiCl. Fig. 2(e) and 2(f) a capillary exhibiting classical rectification behavior. The unpolarized capillary resistance derived from modeling impedance spectra (denoted EIS) at zero potential provides a useful datum line. Potential was scanned from 0 to -1 V (e) and 0 to +1 V (f) respectively at varied scan rate. 10 mm LiCl as the electrolyte. Capillary orifice diameter 1.83 µm. Impedance spectra for the capillary featured in 2(g) and (h) The impedance modulus 2(g) ( Z Re( Z) Im( Z ) ) is shown versus the log of the frequency for potentiostatic EIS conducted at 0V and -1V respectively. 2(h) Nyquist plot representation of impedance data. A horizontal line in 2(h) indicates a horizontal dividing line between the point of negative and positive imaginary impedance, and is shown as a guide for the eye. EIS spectra collected for the -1 V case was conducted at 20 mv signal perturbation whilst that of 0 V was conducted at 10 mv perturbation. 10 mm LiCl as the electrolyte. 123

126 References 1. Hamill O. P., Marty A., Neher E., Sakmann B., Sigworth F. J.: Pflüg. Arch. Eur. J. Physiol. 391, 85 (1981). 2. Wei C., Bard A. J., Feldberg S. W.: Anal. Chem. 69, 4627 (1997). 3. Piper J. D., Clarke R. W., Korchev Y. E., Ying L., Klenerman D.: J. Am. Chem. Soc. 128, (2006). 4. Hansma P., Drake B., Marti O., Gould S., Prater C.: Science 243, 641 (1989). 5. Shao Y., Osborne M. D., Girault H. H.: J. Electroanal. Chem. Inter. Electrochem. 318, 101 (1991). 6. Instruments S.; Sutter Instruments: Novato, CA, USA; Vol. REV. 2.2 ( ) 7. Momotenko D., Cortes-Salazar F., Josserand J., Liu S., Shao Y., Girault H. H.: Phys. Chem. Chem. Phys. 13, 5430 (2011). 8. White H. S., Bund A.: Langmuir 24, 2212 (2008). 9. Bhattacharya A. A., Curry S., Franks N. P.: J. Biol. Chem. 275, (2000). 10. Kubeil C., Bund A.: J. Phys. Chem. C 115, 7866 (2011). 11. Yusko E. C., An R., Mayer M.: ACS Nano 4, 477 (2009). 12. Siwy Z., Apel P., Dobrev D., Neumann R., Spohr R., Trautmann C., Voss K.: Nucl. Inst. Met. Phys. Res. Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms 208, 143 (2003). 13. Gao C., Ding S., Tan Q., Gu L.-Q.: Anal. Chem. 81, 80 (2008) Downloaded:

127 Carbon Paste Electrode Modified with Bismuth Trifluoride and its Applicability in Electrochemical Stripping Analysis for Determination Heavy Metals (Uhlíková pastová elektroda modifikovaná fluoridem bismutitým a její využití v elektrochemické rozpouštěcí analýze pro stanovení těžkých kovů) Matěj Stočes and Ivan Švancara Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, , Pardubice, Czech Republic. Matej.Stoces@upce.cz Abstract Basic characterization of carbon paste electrodes bulk-modified with solid bismuth trifluoride ("BiF 3 -CPE" type) has been carried out, when investigating mainly the optimal amount of BiF 3 in the carbon paste mixture. As the most suitable electrode for detection of Cd(II) and Pb(II) at the low microgram-per-litre concentration level, the configuration of 10% BiF 3 -CPE was found showing good stability and linearity within 2-12 μg/l. This novel type of bismuthbased electrode was then tested to determine lead in sewage sludge and the content of lead found has corresponded well to the certified value for this type of reference material. Key Words: Stripping analysis, Bismuth trifluoride bulk-modified carbon paste electrode, characterisation, Determination, Cadmium and lead. Úvod Bismutové filmové elektrody (BiFE; z angl. "Bismuth Film Electrode") jsou v moderní elektroanalýze známy přibližně jedno desetiletí, ale i za tak krátkou dobu si již vydobyly uznávanou pozici. Poprvé byla BiFE představena na lokální konferenci v rakouském Grazu v roce , krátce poté i na mezinárodním poli 2. Dokladem toho, o jak dynamický obor se jedná, je nedávný přehledový referát z roku 2010, který bilancuje dekádu bismutových elektrod v elektroanalýze 3 z pohledu faktů a čísel; standardním způsobem je problematika shrnuta již v předchozích referátech 4-6. Bismutové povlaky na pracovních elektrodách lze vylučovat za použití metod in situ a ex situ 6,7. Příprava bismutového filmu in situ spočívá v elektrolytickém vylučování bismutu redukcí bismutité soli na povrchu pracovní elektrody přímo v měřeném roztoku; děje se tak za současného nahromadění analytu. Zdrojem bismutového filmu u těchto postupů bývá dusičnan bismutitý, Bi(NO 3 ) 3, jenž se do měřeného roztoku přidává o koncentraci deseti až dvacetinásobně převyšující koncentrační úroveň stanovovaného analytu, obyčejně vybraného těžkého kovu 8. Trojmocný bismut pak redukován potenciostaticky během nahromaďovacího kroku v režimu stripping analýzy, kdy kromě bismutového povlaku dochází k vyloučení a nahromadění analyzovaných kovů. Filmy připravované metodou in situ jsou v drtivé většině případů používány pouze pro jedno měření na konci voltametrické analýzy je film elektrochemicky odstraněn a při dalším měření je film vytvořen znovu (během nahromadění). Jsou-li podmínky analýzy nezměněny, jsou vlastnosti jednotlivých bismutových filmů srovnatelné. V druhém případě jsou bismutové filmy na povrchu pracovních elektrod deponovány ze speciálního pokovovacího roztoku, obvykle s vyšším obsahem Bi III. Variantou přípravy BiFE in situ je přístup, kdy bismutitá sůl není přítomna v roztoku, ale vhodná sloučenina je obsažena přímo v materiálu pracovní elektrody. Takový modifikátor je během nahromaďovacího kroku redukován na elementární bismut, který se vyloučí na povrchu elektrody (in statu nascenti). Z toho hlediska našly své velké uplatnění elektrody na bázi uhlíkové pasty a uhlíkové inkoustu, které lze velmi jednoduše modifikovat. První experimenty tohoto druhu byly prováděny s pevným oxidem bismutitým 9,

128 Modifikované uhlíkové pastové elektrody (CPE) a uhlíkové tištěné elektrody (SPCE) 14 s příměsí 1 5% hm. Bi 2 O 3 vytvářejí bismutový film při potenciálu 1,0 až 0,8 V, jehož tvorba je ovlivňována ph elektrolytu: Bi 2 O 3 + 6H + + 6e - 2Bi + 3H 2 O Bi 2 O 3 + 3H 2 O + 6e - 2Bi + 6OH - Při použití modifikovaných CPE a SPCE odpadá nutnost přidávat do analyzovaného roztoku bismutitou sůl, což stanovení zjednodušuje. Slabinou takto připravovaných BiFE se může jevit vyšší pozadí a problémy s heterogenitou modifikovaných uhlíkových past či uhlíkových inkoustů. Hledání nových typů modifikátorů uhlíkové pasty není omezeno pouze na práškovité formy příslušných kovů či příslušné oxidy. V principu lze použít jakoukoli sloučeninu bismutu, která je stabilní a z materiálu neuniká. (V případě, kdy je modifikátor zčásti rozpustný ve vodě, může být vyluhován z nitra pasty a elektroda krvácet.) Jedním z příkladů atypických modifikátorů je nedávno vyvinutá elektroda NH 4 BiF 4 -CPE 15. Podmínku nerozpustnosti ve vodě splňuje i fluorid bismutitý (BiF 3 ) a charakterizací elektrody typu "BiF 3 -CPE" se zabývá právě tato studie, která navazuje na některé předchozí studie (viz např. 10,14,15 ) a rozšiřuje tak i paletu stávajících, objemově modifikovaných uhlíkových pastových elektrod. Experimentální část Chemikálie Všechny použité chemikálie byly čistoty p.a. od firmy Aldrich nebo Merck. Standardní roztoky olova a kadmia o koncentraci 1000 mg/l (Merck) byly ředěny dle potřeby. Příprava pracovních elektrod Uhlíková pastová byla připravena důkladným smícháním 2 g uhlíkového prášku (CR-5, Lučební závody Kolín) s 0,860 g vysoce viskózního silikonového oleje (SO, typ LUKOIL MV 8000; Lučební závody Kolín). Z této uhlíkové pasty byly připraveny tři pracovní elektrody přimíšením a homogenizováním BiF 3 o obsahu 1%, 3% a 10% hm. (dále označené jako 1, 3 nebo 10% BiF 3 -CPE). Zhotovené pasty byly vpraveny do pouzder vlastní konstrukce. Instrumentace Pro všechna měření v režimu stripping voltametrie bylo použito elektrochemické pracovní stanice Autolab PGSTAT12 (Eco Chemie / Metrohm) ovládané pomocí softwaru NOVA (tentýž výrobce). Pracovní elektrodou byla příslušná modifikovaná uhlíková pastová elektroda; referenční (ref.) elektrodou pak Ag/AgCl/3M KCl a pomocnou platinová elektroda (PtE). Všechna měření byla prováděna ve voltametrické nádobce o kapacitě 20 ml při konstantní laboratorní teplotě (20 ± 2 ºC). Postup a měření Všechna měření probíhala v režimu anodické stripping voltametrie. Nahromadění analytu na pracovní elektrodě probíhala při potenciálu 0,9 až 1,4 V vs. ref., po dobu 20 až 900 s. Po době klidu (15 s) bylo provedeno voltametrické měření technikou square-wave voltametrie (frekvence 50 Hz, amplituda 50 mv). Před každým měření byla rovněž prováděna kondicionace elektrody po dobu 30 s při potenciálu +0,2 V vs. ref. 126

129 Výsledky a diskuse První předběžná měření s BiF 3 -CPE byla prováděna v modelovém roztoku 0,2 M octanového puru, který obsahoval 90 μg/l olova a kadmia. Uhlíková pasta s příměsí jednoho procenta BiF 3 ( 1% BiF 3 -CPE) prokazovala nejnižší citlivost k oběma stanovovaným kovům. 10%BiF 3 -CPE v porovnání s ostatními BIF 3 -CPE poskytovala jednoznačně za daných podmínek nejvyšší hodnoty proudových signálu daných kovů. Vyšší obsah BiF 3 v uhlíkové pastě již měl za následek nejen pokles signálu olova a mírný pokles signálu kadmia, ale zejména zvýšení proudové pozadí. S ohledem na tato pozorování byla k dalším studiím používána 10 % BiF 3 -CPE. Vedle víceméně standardního octanového pufru byly zaznamenány odezvy i v roztocích minerálních kyselin (ph 1), které nejsou typickým prostředím při analýzách s BiFE. Jak ukazuje Obr. 1, vývoj vodíku ve všech kyselých prostředích je posunut k pozitivnějším hodnotám a znemožňuje tak např. stanovení zinku. Bylo také zjištěno, že s elektrodou 10%BiF 3 -CPE je možno pracovat kaj v bazickém, tak i silně alkalickém prostředí. Odezva Pb(II) v amonném pufru byla však velmi malá a roztok 0,1 M NaOH byl vhodný ještě méně, neboť oba signály byly deformovány nepříznivým průběhem základní linie (Pozn: Oba experimenty nejsou na obrázku znázorněny). Obr. 1. Chování 10%BiF 3 -CPE v rozličných typech elektrolytů v kyselé oblasti ph. Experimentální podmínky: c (cd), c (pb) = 90 μg L -1, E dep = -1,1 V, t dep = 120 s). Při optimalizaci celého postupu elektrochemické rozpouštěcí analýzy bylo zjištěno, že ani dlouhé depoziční časy akumulačního kroku nevedly k saturaci povrchu elektrody. Závislost výšky píků Cd(II) a Pb(II) na době depozice je v případě Pb(II) lineární až do hodnoty 1800 s (30 min), zatímco v případě Cd(II) je pro čas od 900 s pozorována jistá odchylka od linearity. Citlivost 10% BiF 3 -CPE byla natolik vysoká, že bylo možné provést kalibrační měření na koncentrační úrovni 2 μg L -1 až 12 μg L -1, lineární odezva pak dosahovala u obou kovů stejné hodnoty korelačního koeficientu R 2 = 0,9987. Hodnota reprodukovatelnosti pro deset 127

130 Plocha píku ( A) identických měření s koncentracemi Cd(II) a Pb(II) = 100 μg L -1 dosahovala hodnot ±1,1 % pro Pb(II) a ±1,4 % pro Cd(II). Posledním a důležitým krokem bylo ověření funkčnosti 10%BiF 3 -CPE při analýze Pb(II) v reálném vzorku (viz Obr. 2). K tomuto účelu byl použit certifikovaný referenční materiál (CRM) z kategorie odpadních kalů. (Vzorek tohoto typu byl zvolen záměrně, protože příslušné CRM obecně obsahují množství kovů, z nichž některé na poměrně vysokých koncentračních úrovních a velmi dobře poslouží především při ověřování selektivity měření.) Po mikrovlnném rozkladu byl vzorek analyzován metodou standardního přídavku a nalezená hodnota 227,55 μg L -1 odpovídala certifikovanému obsahu 235,28 ± 11,0 μg L -1. Tento výsledek naznačil, že nový typ elektrody 10% BiF 3 -CPE je využitelný pro analýzu reálných vzorků podobného původu, a to bez nutností jakýchkoli speciálních úprav. 4 y = x R 2 = koncetrace ( g/l) Obr. 2: Stanovení olova v odpadního kalu po jeho mikrovlnném rozkladu metodou standardního přídavku. Legenda:... vzorek,... std. přídavky. Experimentální podmínky: 10% BiF 3 - CPE; jednotlivé přídavky odpovídají c (pb) = 50 μg L -1, E dep = -1,1 V, t dep = 300 s. Závěr V předložené studii bylo ukázáno, že bismutová elektroda připravená objemovou modifikací uhlíkové pasty BiF 3 má v prostředí octanového pufru všechny předpoklady pro elektroanalytické stanovení Pb 2+ a Cd 2+ ve směsích, a to až na atraktivní mikrogramové koncentrační úrovni. Na základě předchozích zkušeností 12,14,15 se plně potvrdilo, že množství modifikátoru v uhlíkové pastě zásadně ovlivňuje výsledný signál daných kovů, přičemž jako nejvhodnější se jevila konfigurace 10% BiF 3 -CPE s optimálním poměrem signál-vs-šum, ale i nejvyšší citlivostí ke stanovovaným kovům. Poděkování Tato práce vznikla s podporou MŠMT a AIP ČR v rámci bilaterálního programu KONTAKT, ev. č. MEB

131 Literatura 1. Hočevar S.B., Ogorevc B., Wang J. 7th YISAC 00, (2000) Graz: UNI Graz. 2. Wang J., Lu J.-M., Hočevar S.B., Farias P.A.M., Ogorevc B. Anal. Chem. 72, 3218 (2000). 3. Švancara I., Prior C., Hočevar S.B., Wang J. Electroanalysis 22, 1405 (2010). 4. Economou A. TrAC Trends Anal. Chem. 24, 334 (2005). 5. Wang J. Electroanalysis 17, 1341 (2005). 6. Švancara I., Vytřas K.: Chem. Listy 100, 90 (2006). 7. Economou A., Fielden P.R. Analyst 128, 205 (2003). 8. Baldrianová L., Švancara I., Vlček M., Economou A., Sotiropoulos S. Electrochim. Acta 52, 481 (2006). 9. Pauliukaitė R., Kalcher K. Worshop on Electrochemical Sensors Prague, Book of Abstracts p30 (2001). Praha: Česká společnost chemická. 10. Pauliukaitė R., Kalcher K. 8th YISAC 01, (2001) Pardubice: Univerzita Pardubice. 11. Królicka A., Pauliukaitė R., Švancara I., Metelka R., Norkus E., Bobrowski A., Kalcher K., Vytřas K. Electrochem. Commun. 4, 193 (2002). 12. Pauliukaitė R., Metelka R., Švancara I., Królicka A., Bobrowski A., Vytřas K., Norkus E., Kalcher K. Anal. Bioanal. Chem. 374, 1155 (2002). 13. Švancara I., Metelka R., Stibůrková M., Jansová G., Seidlová J., Vytřas K., Pihlar B. Sci. Pap. Univ. Pardubice Ser. A 8, 19 (2002). 14. Pauliukaitė R., Metelka R., Švancara I., Królicka A., Bobrowski A., Norkus E., Kalcher K., Vytřas K. Sci. Pap. Univ. Pardubice, Ser. A 10, 47 (2004). 15. Sopha H., Baldrianová L., Tesařová E., Grincienė G., Weidlich T., Švancara I., Hočevar S.B. Electroanalysis 22, 1489 (2010). 129

132 FOX-7 Study of Reduction Products by Spectroelectrochemical Methods (FOX-7 Studium produktů redukce pomocí spektroelektrochemických metod) Ludmila Šimková a, Evgenia Dmitrieva b, Jiří Klíma a, Lothar Dunsch b, and Jiří Ludvík a a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, Prague 8, Czech Republic, ludmila.simkova@jh-inst.cas.cz b Leibniz Institute for Solid State and Materials Research Dresden (IFW), Center of spectroelectrochemistry, Department of Electrochemistry and Conducting Polymers, Helmholtzstraβe 20, Dresden Abstract A new energetic material 2,2-dinitroethene-1,1-diamine (FOX-7) is recently broadly tested because of its high performance and very low sensitivity. On the other hand, its electrochemical and redox properties have not been studied yet. Our results show that FOX-7 is reduced in aprotic solvents only by two one-electron steps up to 2.9 V. The color changes during reduction of FOX-7 and reversibility of the redox process indicate the presence of radical intermediates. Therefore in situ UV-vis-NIR and ESR spectroelectrochemical investigations were performed. The products after exhaustive electrolyses were separated by HPLC and are identified by mass spectrometry. The possible formation of gaseous products was followed by online EC-GC. Key words: FOX-7, 2,2-dinitroethene-1,1-diamine, Spectroelectrochemistry, ESR spectroscopy, UV-vis-NIR, Reduction, Mechanism. Introduction 2,2-Dinitroethene-1,1-diamine (FOX-7), acronym DADNE or DANE, is a recently synthesized 1 material with significant potential for application due to its excellent properties high detonation energy and velocity and simultaneously low impact and friction sensitivity. Its chemical and physical properties have been recently extensively reviewed 2. From the electrochemical point of view, FOX-7 is a very interesting molecule with multiple redox centers. Its structure is remarkable due to the combination of geminal reducible nitro-groups in neighborhood of geminal oxidizable amino-groups. This combination represents a typical case of push-pull delocalization which allows an intramolecular electron transfer. Therefore FOX-7 can be presented in several different mesomeric, tautomeric and also acidobasic forms (Fig. 1). O 2 N C - NH OH - O 2 N NH 2 H + O 2 N NH 2 O 2 N NH 2 Fig. 1. Acidobasic equilibria of FOX-7. H + O 2 N NH 3 + O 2 N NH 2 Redox properties of FOX-7 have not been studied yet. Recently we found that electrochemical reduction in aqueous solutions is able to provoke the chain of follow-up processes leading to the total degradation of the parent substance 3. The results of the electrochemical reduction of FOX-7 in non-aqueous media are also surprising. In aprotic solvents FOX-7 is reduced in only two one-electron steps with reversible character. This number is lower than theoretical expectations. In addition to this its electrolysis is accompanied by color changes. For better understanding of reduction mechanism of FOX-7 in aprotic solvents the UV-vis-NIR and ERS spectra were continuously recorded during electrolysis. 130

133 Experimental The sample of FOX 7 was received directly from the laboratory of organic synthesis at the University of Pardubice. As aprotic solvents dimethylforamide (DMF) or acetonitrile (AN) were used with 0.1 M terabutylammoniumtetrafluoroborate (TBATFB) or tetrabutylamoniumhexafluorophosphate (TBAHFP). For all electrochemical experiments three-electrode system was used. Dc-polarography, cyclic voltammetry, differential pulse polarography (DPP) and preparative electrolysis were conducted by the analog potentiostat Polarographic analyzer PA 4 with XYrecorder (laboratorní přístroje Praha). Classical dropping mercury electrode (DME) with a controlled drop time was used for dc-polarography and DPP. A hanging mercury drop electrode (HMDE) was used for cyclic voltammetry. For these experiments a stock solution of 0.01 mol.l -l FOX-7 in DMF was every day freshly prepared and diluted according to the need. The preparative electrolysis on mercury pool (area cca 1 cm 2 ) proceeded in a divided H- type cell, where anodic and cathodic parts are separated by a dense frit. Concentration of FOX-7 in these experiments was less than 0.05 mol.l -l. In situ ESR/UV-vis-NIR spectroelectrochemical experiments were performed in the optical ESR cavity (ER 4104OR, Bruker Germany), ESR spectra were recorded by the EMX X-band CW spectrometer (Bruker, Germany). UV-vis-NIR spectra were measured by Avantes spectrometers AvaSpec-2048x14-USB2 with the CCD detector and AvaSpec-NIR with the InGaAs detector applying the AvaSoft 7.5 software. Both the ESR spectrometer and the UV-vis-NIR spectrometers were linked to a HEKA potentiostat PG 390. Triggering was performed by the software package PotMaster v2x40 (HEKA Electronic, Germany). A spectroelectrochemical flat cell with a three-electrode arrangement consisting of a laminated working electrode with a gold mesh, a platinum wire as a counter electrode, and a silver chloride-coated silver wire as a pseudoreference electrode was used. The scan rate for in situ spectroelectrochemical measurements was around 4 mv/s. All solutions were prepared in glove box. Results and discussion The reduction of FOX-7 on mercury electrode in aprotic media (AN, DMF) proceeds in two or three waves (up to the potential 2.9 V) in dependence on concentration (Fig. 2). The first reduction wave (E 1 1/2 = 0.75 V) appears at concentration lower than mol.l -1. At higher concentration its limiting current i 1 remains constant and a second reduction wave is formed at E 2 1/2 = 1.1 V. Its limiting current, i 2 increases linearly with concentration. The sum i 1 + i 2 is proportional to the concentration and corresponds to consumption of one Faraday per mol. These two reduction waves represent the first reduction step of FOX-7, where the first wave is an adsorption pre-wave. One can conclude that the product of the first electron transfer is adsorbed at the electrode. This finding was also proved by DPP. The limiting current of the third reduction wave, i 3 is linearly dependent on concentration of FOX-7, equals to the sum of i 1 and i 2 and represents the second reduction step. Whole process is controlled by diffusion. 131

134 current [A] Fig. 2. The polarography curve of FOX-7 in AN M TBATFB. Concentration of FOX-7 is mol.l -1. The electrolysis of FOX-7 in AN (as well as in DMF) is dependent on applied potential and corresponds to the voltammetric results: For electrolysis at the limiting current of i 2, one electron per molecule is consumed. Electrolysis at potentials corresponding to the limiting current i 3, requires two electrons and proceeds in two phases (cf. Fig. 3). From the shape of the i-t curve it is evident that the reaction mechanism is complicated and involves consecutive reactions. -0,0040-0,0035-0,0030-0,0025-0,0020-0,0015-0,0010-0,0005 0, time [s] Fig. 3. The chart of dependence of current on time during electrolysis of FOX-7 in AN M TBAHFP in potential 1.8 V. The concentration of FOX-7 is mol.l -1. During electrolysis in both aprotic solvents the solution changes its color from yellow through orange to green color upon electrolysis at higher potentials. Therefore in situ UV-vis- NIR spectra were continuously recorded during electrolysis up to 2.0 V. The spectra show increase of new absorption bands in UV as well as in visible area and the changing shape of the spectrum points to the presence of at least two different stable intermediates (products) when the potential is kept in the region of limiting current i 2. The reduction at the most negative potentials (i 3 ) is accompanied by decomposition of one stable intermediate generated at i 2 and a new product is formed with characteristic bands at 306 and 710 nm. These wavelengths belong to the radical(s) which was proved using in situ EC-ESR experiments. The electrolyzed solutions of FOX-7 in AN were continuously analyzed by dc-polarography during the electroreduction. From the first moment of electrolysis a new oxidation wave at potential 0.2 V was observed (Fig. 4), the current of which increased with time. 132

135 Fig. 4. The chart of dependence of current on potential. (a) Polarography curve of sample before electrolysis. (b) Polarography curve after electrolysis of FOX-7 in AN M TBAHFP in potential 1.3 V. In addition to this, formation of gaseous products during electrolysis was observed, similarly like in acidic aqueous solutions 3. The isolation (by liquid or online gas chromatography) and identification (by mass spectrometry) of all products after exhaustive electrolysis are now under way. Conclusion Based on the results of cyclic voltammetry, dc-polarography and controlled potential electrolysis, FOX-7 is reduced in aprotic solvents by only two electrons in contrary to the experiments in aqueous media. The electrochemical reduction is accompanied by changing of colors pointing to the participation of radical species in the degradation mechanism, where several follow-up reactions take place. In situ UV-vis-NIR/ESR spectroelectrochemistry show that upon the first reduction step at least two different stable intermediates are formed. During the second reversible reduction step an ESR signal is observed. As a result, instead of a standard electrochemical reduction of the title dinitro-compound, an electrochemically initiated degradation process occurs. Due to the presence of gaseous products, an eventual analogy with the mechanism during explosion should be considered, where the primary reduction serves as an activation impulse initiating a chain of intramolecular redox reactions leading to total degradation of FOX-7. Acknowledgements This work is supported by the project P206/11/0727 Grant Agency of the Czech Republic (GAČR). The authors are grateful to Ing. Zdeněk Jalový from the University Pardubice for granting the sample and to Prof. F. Liška for valuable consultations. References 1. Latypov N. V., Bergman J., Langlet A., Wellmar U., Bemm U: Tetrahedron, 54, (1998). 2. Šimková L., Liška F., Ludvík J.: Current Organic Chemistry, 15, 2983 (2011). 3. Šimková L., Klíma J., Sazama P., Ludvík J.: J. Solid State Electrochem., 15, 2133 (2011). 133

136 Electroanalysis in a Monothematic Book: Recent Experiences from Making of a Monograph (Elektroanalýza v monotematické knize aneb Nedávné zkušenosti z přípravy monografie pro zahraničního nakladatele) Ivan Švancara a, Kurt Kalcher b, Alain Walcarius c, and Karel Vytřas a a Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, , Pardubice, Czech Republic. Ivan.Svancara@upce.cz b Institute of Chemistry Analytical Chemistry, Karl-Franzens-University of Graz, Universitaetsplatz 1, A-3000 Graz, Austria. c Laboratory of Physical Chemistry and Microbiology for the Environment, UMR 7564 CNRS University of Nancy I, Villers-les-Nancy, France. Abstract On one example of the just-released book, the adventure of issuing a scientific monograph in cooperation with a renowned publishing house is overviewed. The process is described and discussed in its entirety, from the initial impulse, official administration and communication with the publisher, via the individual steps of preparation, scheduling (as authors teamwork), and proper making of, up to the final compilation of the manuscript and its release as a book. Key Words: Electroanalysis, book, preparation and making of, retrospective insight. Úvodem V tomto poněkud neobvyklém příspěvku by se autoři rádi podělili o své čerstvé zkušenosti s přípravou odborné knihy typu tradiční monografie tj. spisu na jedno ucelené téma, na jehož náplni se každý ze čtyř autorů podílel průběžně v celém textu. Není tajemstvím, že podobný počin bývá ve vědecké sféře považován za jakési vyvrcholení publikačních snah o dané problematice, obvykle jako bilancování určité etapy daného oboru nebo naopak poukázání na nejnovější trendy; obojí v šíři, kterou autoři ve standardních přehledných referátech obsáhnout nemohou nebo ani nechtějí. K tomu, aby nějaká monografie vůbec vznikla, je samozřejmě zapotřebí příznivá konstelace celé řady faktorů. Mezi rozhodující určitě patří aktuální situace v oboru a tím i potenciální poptávka po zamýšleném díle, potřebná erudice autorů a od ní odvislá podpora vydavatele, vítány jsou určitě dlouhodobější zkušenosti a bohaté kontakty s obdobně zaměřenými pracovišti. A i toto nemusí stačit, pokud nejsou potřebné časové možnosti a s tím související odhodlání autorů obětovat část svých soukromých aktivit. Prakticky se vším jsme se během práce na knize setkali, což dokládá i stručný přehled toho podstatného anebo i méně podstatného, ale o to zajímavějšího co se událo během přípravy, vlastního sepisování a konečné kompletace naší debutové monografie. Poznámka: Pro případ, že by byl tento příspěvek zpřístupněn odborné veřejnosti v plném rozsahu, popisovaná kniha není v textu jmenována z důvodu publikační / autorské etiky. Specifikovány nejsou ani údaje, které by mohly vést k její jednoznačné identifikaci. Jak kniha vznikala Počáteční impuls Ke vzniku knihy přispěla zvláštní shoda okolností; šlo o kompenzační nabídku vlivného zástupce vydavatele z konce roku 2008, který spis typu monografie navrhl jako protihodnotu za odmítnutí předem vyžádaného referátu; ten totiž svojí přílišnou délkou i značně širokým záběrem nevyhovoval představám nových majitelů vydavatelství. 134

137 Komunikace s vydavatelem Nabídka, jakožto příležitost, která se již nemusí opakovat, byla okamžitě přijata; vše související přišlo až poté. Šlo však o promyšlené rozhodnutí, neboť stejný autorský kolektiv v minulosti nejednou spolupracoval na rozsáhlejších referátech 1-3 a případná opravdová monografie byla také nejednou uvažována. Poté následovala oboustranná intenzivní ová korespondence, během níž si dvojice do projektu zasvěcených redaktorů postupně vyžádala: (i) podrobná CV, (ii) seznamy publikačních aktivit a (iii) předběžnou podobu zamýšleného obsahu knihy. Následovalo první schválení a hned poté podrobný (iv) marketingový dotazník, jehož úplné vyplnění vyžadovalo plnou součinnost všech zainteresovaných autorů. Klíčovou částí dotazníku bylo zdůvodnění, v čemž autoři spatřují hlavní priority jejich projektu a která literatura může představovat případnou konkurenci chystanému spisu. Posledním důležitějším požadavkem vydavatelství byl (v) návrh pěti až šesti recenzentů, kterým byl předložen vypracovaný předběžný obsah. (Autorům dodnes není známo, jestli doporučenou pětici doplnili ještě nějací další recenzenti, vybraní samotným vydavatelstvím.) Smlouva o projektu Po několika měsících, konkrétně v polovině léta 2009, přišel definitivní souhlas vydavatele s projektem, což každý autorů ztvrdil svým podpisem na vlastním exempláři oficiální smlouvy (Ve světle příštích událostí je na tomto místě dobré uvést, že smlouva zahrnovala jak časový plán, včetně konkrétní uzávěrky, tak i přibližný stránkový rozsah rukopisu.) Po parafování smluv dorazila obratem poslední zásilka série oficiálních brožurek z nakladatelství s podrobnými pokyny pro formální stylizaci rukopisu a způsobu jeho ukládání do konečné elektronické podoby. A mohlo se začít... Přípravné práce a pracovní plán Po rozdělení všech částí textu mezi jednotlivé autory nebylo podrobněji určeno, v jaké podobě mají své příspěvky připravit; byly zde předchozí zkušenosti a respektovat se měl jen společný obsah a předem přibližně určený počet stran, obrázků a tabulek. Určitě největší část přípravných prací pohltila nutná aktualizace dostupné literatury a její roztřídění, což si vyžádalo min. půl roku intenzivní práce (Zde poprvé přišel zákon schválnosti zatímco v celém předchozím období , které jsme mapovali společně 1, přibývalo ročně nových publikací (viz Obr. 1), tak ve všech následujících letech to bylo až 5 více. Na jedné straně to svědčilo o novém rozmachu oboru a správném načasování knihy, na straně druhé to znamenalo obrovské množství práce navíc, přičemž velkou měrou se na tom podepsalo tehdejší lavinovité šíření nových on-line časopisů.) Obr. 1. Osvědčená papírová kartotéka prvního z autorů se záznamy o publikacích z předešlých čtyř dekád zůstala během práce na knize téměř nedotčena. Přednost již dostaly vesměs zkompletované elektronické databáze. 135

138 Seznam literatury Přípravná fáze byla završena domluvou o podobě citované literatury a způsobu uvádění v textu, jež byla dána striktním požadavkem nakladatelství používat "full-text" citace. Kvůli úspoře místa bylo nutno upustit od pohodlnějšího citování po kapitolách a pracovat s předběžnými dílčími soubory referencí s dohodnutým kódováním a počítat s jejich pozdějším sloučením v jeden celek. (To nás čekalo až v závěrečné fázi práce a i když jsme tušili, že nepůjde o zrovna snadný úkol, pozdější realita překonala veškerá očekávání.) Sepisujeme ve čtyřech, ale víceméně každý sám Tento podtitulek věrně vystihuje průběh vlastního psaní, které probíhalo od podzimu 2009 až do února 2011, a nepotřebuje další komentář. Snad jen poznámku, že původní představy o širším využívání předchozích textů vzaly u všech autorů brzy za své při potřebě zapracovat do textů enormní množství nové literatury a nesčetných novinek v jednotlivých oblastech. Nestíháme, ale jinak se daří Jak čas plynul a jednotlivé kapitoly či podkapitoly získávaly svoji konkrétní podobu, ukazovalo se, že původně dohodnutý termín odevzdání rukopisu i předběžně stanovený celkový rozsah rukopisu se nepodaří splnit. Občasné poraženecké nálady naštěstí vždy rozptýlil vstřícný přístup nakladatelství, ale i některé další výdobytky, které dodávaly potřebný elán. V této souvislosti je nutno vzpomenout úspěch při získání zřejmě posledního žijícího svědka úplných začátků oboru k napsání ryze autentického Úvodu, vyslyšena byla i žádost u jiné osobnosti oboru o shlédnutí a komentář k pracovní verzi jedné z nejproblematičtějších podkapitol. Do stejné kategorie patřila i nabídka představitelů fakulty k využití zvláštní dotace MŠMT ČR k pokrytí nákladů s tiskem barevných předloh obrázků a schémat. (V tomto případě, v duchu rčení o zabití dvou much jednou ranou, získal obrázkový materiál na přitažlivosti a dodatečným vybarvením již existujících obrázků bylo také možno obejít nepříjemnou povinnost žádat o "copyright" pro své vlastní ilustrace.) Dáváme vše dohromady Jak již bylo naznačeno, všechny dílčí příspěvky shromažďované na přelomu let 2010/2011 byly skládány dohromady až v samotném závěru, což se neobešlo bez drobných kolizí, ale u textů, tabulek a obrázků vše proběhlo nad očekávání uspokojivě. Příslovečným hororem však byly soubory citací a jejich slučování, kdy konečný aglomerát čítal na 3300 odkazů. S odstupem času lze konstatovat, že i přes několikadenní manuální kontroly a posléze i použití speciálně navrženého počítačového programu nebyla závěrečná verze Seznamu použité literatury vydařená a stále obsahovala řadu zdvojených citací. Naštěstí a díky profesionálnímu přístupu nakladatele byly duplikáty vesměs objeveny a odstraněny ještě před finálními korekturami. Jinak by v původním souboru a v konfrontaci se sloučeným textem a sérií rozsáhlých tabulek byly všechny následné úpravy nadlidským úkolem. Kniha je tu! Hotový rukopis byl vydavateli odeslán v polovině dubna 2011 (viz Obr. 2, na předchozí straně, vlevo). S malou duší, protože šlo o více jak půlroční zpoždění a konečný rozsah byl překročen skoro o 100 %. Zodpovědní pracovníci nakladatelství tuto skutečnost velkoryse přešli a bezproblémová komunikace pokračovala i v průběhu dvojích korektur. Fázi několikaměsíční výroby knihy ještě doprovázely některé upřesňující y z obou stran, aby během druhého týdne března 2012 byly bezpečně doručeny slíbené autorské výtisky do rukou každého z autorů (viz Obr. 2 vpravo). 136

139 Obr. 2. Přesto, že kniha vznikala hlavně z elektronických předloh, nakladatelství si vyžádalo také tištěný manuskript; ten čítal přes tisíc stran a celá zásilka vážila 4,5 kg (vlevo). Autorské výtisky knihy byly právě doručeny poštou (vpravo). Závěr Rozbalením plastového pytle z obrázku skončila tři a půlletá peripetie jménem Naše první odborná monografie. Výše uvedené vzpomínání je jen heslovitou zkratkou všeho dění kolem, ale případné zájemce o podobný počin z řad účastníků jetřichovického semináře rádi zasvětíme do podrobností. Monografií z elektroanalýzy není zase tak mnoho, aby nás někdo další nemohl následovat... Poděkování Na tomto místě by autoři opět rádi poděkovali za finanční podporu Ministerstvu školství, mládeže a tělovýchovy České republiky (projekt č. MSM ), díky níž mohla být kniha vytištěna ve stávající grafické úpravě. Literatura 1. Kalcher K., Švancara I., Metelka R., Vytřas K., Walcarius A.; in: Encyclopedia of Sensors, Vol. 4 (C.A. Grimes, E.C. Dickey, M.V. Pishko, Eds.), pp American Scientific Publishers, Stevenson Ranch, Švancara I., Walcarius A., Kalcher K., Vytřas K. Cent. Eur. J. Chem. 7, 598 (2009). 3. Švancara I., Vytřas K., Kalcher K., Walcarius A., Wang J. Electroanalysis 21, 7 (2009). 137

140 Voltammetric Determination of Caffeine in Commercial Beverages on Bare Boron- Doped Diamond Electrode (Voltampérometrické stanovenie kofeínu v komerčných nápojov na bórom dopovanej diamantovej elektróde) Ľubomír Švorc a, Jana Svítková a, Peter Tomčík b, Miroslav Rievaj a, and Dušan Bustin a a Slovak University of Technology, Faculty of Chemical and Food Technology, Institute of Analytical Chemistry, Radlinského 9, Bratislava, Slovak Republic, lubomir.svorc@stuba.sk b Catholic University in Ružomberok, Faculty of Education, Department of Chemistry, Hrabovská cesta 1, Ružomberok, Slovak Republic Abstract A sensitive and selective electrochemical method for the caffeine determination using bare boron doped diamond electrode was developed. The effects of supporting electrolyte, ph and scan rate on the voltammetric response of caffeine oxidation were studied to select the optimum experimental conditions. Linear response of peak current on the concentration in the range from 0.4 to 25 μmol L -1, good repeatability (RSD of 2.1 %) and the detection limit of 0.15 μmol L -1 without any chemical modifications and electrochemical surface pretreatment were observed by differential pulse voltammetry. The effect of possible interfering compounds appeared to be negligible which evidently proved good selectivity. The proposed method was successfully applied for the caffeine determination in commercially available beverages, with results in a close statistical agreement to those declared by manufacturer. Key Words: Caffeine, 1,3,7-trimethylxantine, Boron-doped diamond electrode, Voltammetry. Introduction Caffeine (1,3,7-trimethylxantine) is a natural alkaloid belonging to N-methyl derivatives of xanthine. It is found in various kinds of beverages and food such as coffee, coca-cola, tea, cocoa beans and chocolate. Because of high popularity of coffee and other caffeine containing beverages including soft and energy drinks, caffeine is the most commonly used psychoactive substance in daily human life. Caffeine has many important physiological effects, such as stimulation of the central nervous system, diuresis and gastric acid secretion 1,2. However, high amounts of caffeine can cause trembling, nausea, nervousness, and seizures 3. Due to the above mentioned facts detection and quantification of caffeine is important and does not have only clinical significance, but it can also give beneficial advice to people s health and life. Numerous studies aimed towards the development of analytical methods for the caffeine determination in different matrix (environmental, biological, plants, food, etc.) has been published. From the optical techniques UV4 4, FT-infrared 5 and FT-Raman 6 were usually employed for caffeine determination. The separation methods such as capillary electrophoresis 7, gas chromatography 8 and liquid chromatography 9 were used for the analysis of mixtures containing caffeine and other drugs or metabolites. However, these techniques are mostly very expensive and long time is required for some procedures as derivatization, extraction and purification, therefore, the development of reliable, low-cost, rapid, simple and accurate method for caffeine determination in various foodstuffs, pharmaceutical formulations and biological fluids is needed. This fact opens the opportunities for the electrochemical methods employment, however only a few papers dealing with an electroanalysis of caffeine on more common electrode materials had appeared. This is because the oxidation of caffeine occurs at a very high positive potential, and may overlap with electrochemical reactions limiting potential window from the 138

141 anodic side. Boron-doped diamond (BDD) is a modern electrode material which opens new possibilities of electrochemical investigations due to its excellent features, such as the wide potential window in aqueous solutions, low background current, long-term stability of response, low sensitivity to dissolved oxygen and a good resistance to surface fouling due to weak adsorption 10,11. Based on the above mentioned facts this work demonstrates the application of bare BDD electrode as very sensitive electrochemical sensor for the voltammetric determination of caffeine without any chemical modifications and/or electrochemical pretreatment of electrode. This simple and practical analytical approach is illustrated on several commercial beverages. Experimental Caffeine was obtained from Zentiva (Hlohovec, Slovak Republic) and used as received. All reagents were of analytical grade purity. The stock solution of caffeine ( mol L -1 ) was prepared using double-distilled deionized water. All electrochemical experiments were conducted in a three-electrode single compartment glass cell. This cell consisted of Ag/AgCl (3 mol L -1 KCl) reference electrode, a platinum wire as counter electrode and BDD electrode with inner diameter of 3 mm (Windsor Scientific Ltd, United Kingdom) served as the working electrode. Voltammetric measurements were carried out using an AUTOLAB PGSTAT-302N (EcoChemie, The Netherlands) potentiostat/galvanostat controlled with the NOVA 1.7 software. All ph values were measured with ph meter Model 215 (Denver Instrument, USA). Cyclic voltammetry (CV) and differential pulse voltammetry (DPV) were employed without deaeration, since dissolved oxygen did not interfere in anodic potential window of BDD electrode. After optimization of instrumental parameters DPV voltammograms were recorded and then calibration curve was constructed from the average of six consecutive measurements for each addition of standard. The detection limit was calculated using the 3 criterion. In order to fit into linear range of calibration curve, beverages were diluted by a factor 1:200 (v/v) with the supporting electrolyte after sonical elimination of gas. Coffee and tea solutions were prepared by dissolving 1 g of coffee powder and a tea bag in 100 ml of boiling water, then filtered and diluted with the supporting electrolyte. Results and discussion First, CV was applied to elucidate the electrochemical behavior of caffeine on BDD electrode (Fig. 1). Fig. 1. CV voltammograms of (a) 0 μmol L -1 and (b) 10 μmol L -1 caffeine in 0.4 mol L -1 HClO 4 on bare BDD electrode with scan rate of 50 mv s

142 It shows the anodic peak at the potential of about V vs. Ag/AgCl and no presence of any cathodic peak on the reverse scan, indicating that the charge transfer during caffeine oxidation is electrochemically irreversible. Further, as it is apparent in the absence of caffeine no oxidation peak is observed and background current is very low. It was previously observed that low ph has a significant influence on the oxidation of caffeine. We decided to choose and test perchloric acid in the ph range of with 10 μmol L -1 caffeine concentration. Apparently the magnitude of peak current was found to be highest in ph equal to 0.5 (results not shown). Based on this fact 0.4 mol L -1 HClO 4 was chosen and used in further experiments. The peak potential was slightly shifted towards more negative potentials and peak current decreases as the ph increases in the range of Next, we performed further experiments to study the effect of the scan rate on the voltammetric response of caffeine oxidation at bare BDD electrode and characterize the transport in a diffusion layer. Fig. 2 shows the CV voltammograms in the presence of 10 μmol L -1 caffeine in 0.4 mol L -1 HClO 4 recorded at various scan rates. The slight shift of peak potential towards more positive potential was observed as the scan rate increased. From the inset of Fig. 2 it can also be seen that peak current is linearly proportional (R 2 = 0.998) to the square root of the scan rate within the range of mv s -1 indicating that the electrode reaction is controlled by diffusion thus rate-limiting adsorption and/or specific interactions on bare BDD electrode surface are negligible. Fig. 2. CV voltammograms of 10 μmol L -1 caffeine in 0.4 mol L -1 HClO 4 on BDD electrode for scan rates (v) of: (a) 10, (b) 25, (c) 50, (d) 100, (e) 200 and (f) 300 mv s -1. The dependence between peak current (μa) and square root of the scan rate appears in the inset. Differential pulse voltammetry (DPV) was chosen as more sensitive voltammetric technique in comparison with cyclic voltammetry to investigate the dependence between peak currents and caffeine concentrations. The calibration curve was constructed by measuring of peak current with optimized DPV parameters. Fig. 3 displays DPV voltammograms at various concentrations of caffeine in 0.4 mol L -1 HClO 4. An average of six consecutive measurements was used for calibration curve construction. The dependence of peak current on caffeine concentration shows a good linearity in the concentration range from 0.4 to 25 μmol L -1 as depicted in the inset of Fig. 3. and is expressed by the equation: I p ( A) = c (μmol L -1 ), R 2 = The detection limit was calculated according to 3 criterion and was 140

143 found to be 0.15 μmol L -1. The repeatability was evaluated by six successive measurements of 10 μmol L -1 caffeine solution under the same operating conditions over the short time interval (RSD = 2.1%). Fig. 3. DPV voltammograms of caffeine solutions with various concentrations: (a) 0, (b) 0.4, (c) 0.8, (d) 1, (e) 3, (f) 6, (g) 10, (h) 15, (i) 20 and (j) 25 μmol L -1 (supporting electrolyte 0.4 mol L -1 HClO 4 ) on bare BDD electrode at optimized DPV parameters: modulation amplitude of 50 mv, modulation time 20 ms and scan rate 50 mv s -1. The dependence between peak current (μa) and caffeine concentrations (μmol L -1 ) appears in the inset. The potential interferences influencing the caffeine determination was investigated by addition of possible interferent to a solution containing fixed amount of 10 μmol L -1 caffeine. The various species such as glucose, fructose, sucrose and ascorbic acid were tested under the same experimental conditions and had no influence in 100-fold excess. In order to estimate the accuracy of the proposed analytical technique, the standard additions method was used for beverage sample analysis spiked with aliquots amount of caffeine standard. The average results for six replicate measurements with standard deviations (SD) and confidence interval for 95 % probability are summarized in Table I. To investigate matrix effects the caffeine standard was added to the diluted coca-cola sample and the recoveries were calculated. Their values reveal good accuracy of the presented method. Table I. Caffeine spiked coca-cola samples analysis on BDD electrode in DPV mode (n = 6). Added (μmol L -1 ) Expected (μmol L -1 ) Found* (μmol L -1 ) SD (μmol L -1 ) CI for P=95 %** (μmol L -1 ) Recovery (%) (247 ± 11) (292 ± 14) (338 ± 17) (401 ± 19) (457 ± 24) * Average for six replicate measurements (n = 6): x ** Confidence interval calculated according ( x ± t n-1,α SD/n 1/2 ); from tables t 5; 0.05 = The oxidation peak current of caffeine is sensitive to each standard addition, however in the case of coca-cola sample it occurs at slightly more positive potential. This shift is probably the consequence of the residual gas content presence in the coca-cola sample. 141

144 In order to evaluate the validity and practical applicability of the proposed method, three commercially available caffeine containing beverages were directly analyzed. Real samples analysis results of caffeine content in beverage samples are summarized in Table II. The determined value of caffeine content in coca-cola is in good agreement with a content declared by manufacturer. Table II. Real caffeine samples analysis (n = 6). Beverage samples Proposed method bare BDD (DPV) Caffeine content (mg.l -1 ) SD Declared by manufacturer Coca-cola Pepsi-cola Energy drink Conclusions Proposed analytical technique is simple and rapid in comparison with other analytical methods used for the caffeine determination. The low detection limit (0.15 μmol L -1 ) was obtained as a consequence of very high S/N ratio without any chemical modification of the BDD surface and also no electrochemical pretreatment is involved. Method is highly selective because species present in beverages as real samples like glucose or ascorbic acid do not interfere even in a high excess. When tested the accuracy of the method recoveries from 97.4 to % were achieved. Based on these facts, the presented method offers green and sensitive possibility for quality control analysis of food products or pharmaceutical formulations containing caffeine. Acknowledgments The authors thank the Grant Agency of the Ministry of Education of the Slovak Republic (Grant No. 1/0182/11 and 1/0008/12) and Program for support young researchers (No. 6406). References 1. Spătaru N., Sarada B.V., Tryk D.A., Fujishima A.: Electroanalysis 14, (2002). 2. Rostagno M.A., Manchón N., D Arrigo M., Guillamón E., Villares A., García-Lafuente A., Ramos A., Martínez J.A.: Anal. Chim. Acta 685, (2011). 3. Okonny U.L.P., Wang S.X., Stubbs R.J., Guzman N.A.: Electrophoresis 26, (2005). 4. Fernandez-Maestre R., Hill H.H.: Int. J. Ion Mobil. Spec. 12, (2009). 5. Ito M., Suzuki T., Yada S., Kusai A., Nakagami H., Yonemochi E., Terada K.: J. Pharm. Biomed. Anal. 47, (2008). 6. Koleva B.B., Kolev T.M., Tsalev D.L., Spiteller M.: J. Pharm. Biomed. Anal. 46, (2008). 7. Zhao Y., Lunte C.E.: J. Chromatogr. B 688, (1997). 8. Jafari M.T., Rezaei B., Javaheri M.: Food Chem. 126, (2011). 9. Tzanavaras P.D., Themelis D.G.: Anal. Chim. Acta 581, (2007). 10. Pecková K., Musilová J., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, (2009). 11. Pleskov Y.V.: Russ. J. Electrochem. 38, (2002). 142

145 The Use of a Multi-Channel Capillary and a Capillary with Two Different Inner Diameters for Electrophoretic Separation of Neurotransmitters (Použití vícekanálové kapiláry a kapiláry o dvou různých vnitřních průměrech pro elektroforetické stanovení neurotransmiterů) Petr Tůma a, František Opekar b, and Eva Samcová a a Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Institute of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Ruská 87, Prague 10, Czech Republic, petr.tuma@lf3.cuni.cz b Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Albertov 2030, Prague 2, Czech Republic, opekar@natur.cuni.cz Abstract A fused silica capillary with seven inner channels was tested for electrophoretic experiments. An electrophoretic separation of dopamine, noradrenaline and adrenaline was performed in 100 mm acetic acid by use of contactless conductivity detection (C 4 D) and in 20 mm citric acid/naoh (ph 3.2) in combination with UV detection. Numbers of theoretical plates in multi-channel capillary are around for C 4 D and around for UV detection. The sensitivity in multi-channel capillary is 12times higher for C 4 D and 4times higher for UV detection in comparison with 25 μm single-channel capillary. In another sets of experiments, a separation of dopamine, noradrenaline and adrenaline was completed in 18 second by use of parallel connection of 25 μm and 100 μm capillary. Key Words: Contactless conductivity detection, Capillary electrophoresis, Multi-channel capillary, Separation efficiency. Úvod V kapilární elektroforéze se separace standardně provádí v jednokanálových kapilárách o vnitřním průměru (id) 5 až 100 m 1. Vnější průměr kapilár je v porovnání s id několikanásobně větší (pohybuje se kolem 360 m). Pro účinnost separačního procesu v CE, vyjádřenou počtem teoretických pater, N, platí 2 N = u i El ef /2D i, kde u i a D i jsou elektroforetická mobilita a difúzní koeficient sledovaného analytu, E intenzita elektrického pole a l ef efektivní délka kapiláry. Z tohoto vztahu jednoznačně vyplývá, že vysoké separační účinnosti je docíleno pouze při vysokých hodnotách E. S rostoucím E ovšem roste množství Jouleova tepla vznikajícího průchodem proudu roztokem v kapiláře, které způsobuje nežádoucí rozmývání separovaných zón. Pro účinný odvod tepla z kapiláry je proto nutné, aby poměr odvod/generace tepla byl co největší; z tohoto hlediska je proto výhodné používání kapilár s malým id. Na druhou stranu se snižujícím se id kapiláry klesá citlivost detekce; u optických detektorů se snižuje délka optické dráhy, u elektrochemických klesá objem detekční cely, podobně u MS klesá množství analytu vstupujícího do detektoru. Tento rozpor je řešitelný použitím kapiláry s několika vnitřními kanálky (dále multi-channel kapilára). Rozdělením jednoho velkého vnitřního průřezu na několik menších je možno dosáhnout účinnějšího odvodu Jouleova tepla zvětšeným vnitřním povrchem. Toto řešení je výhodné i z hlediska citlivosti bezkontaktní vodivostní detekce (C 4 D), protože při zachování malého id jednotlivých kanálků, je snímán signál z celého průřezu kapiláry 3, tj. současně ze všech kanálků. Jak bude ukázáno dále, vyšší je i citlivost UV detekce. Rychlost elektroforetické migrace v i je přímo závislá na intenzitě použitého elektrického pole E a mobilitě analytu u i, v i = Eu i 2. Z těchto vztahů jednoznačně vyplývá, že pro dosažení krátké doby analýzy a vysoké účinnosti separačního procesu je nutné pracovat při vysokých hodnotách E. Separace prováděné na komerčních přístrojích CE jsou limitovány hodnotou separačního napětí 30 kv a minimální délkou kapiláry cca 30 cm, což ve výsledku umožňuje 143

146 pracovat při maximálních hodnotách E kolem 1 kv/cm. Toto technické omezení je možné obejít spojením dvou kapilár o různém vnitřním průměru id. Spojením analytické kapiláry s malým id, která slouží jako vlastní separační kapilára, a pomocné kapiláry s velkým id, lze docílit toho, že hodnoty E jsou v analytické části kapiláry několikanásobně větší než v pomocné kapiláře, která pouze uzavírá elektrický obvod. Experimentální část Při experimentech byla používána křemenná multi-channel kapilára pokrytá ochrannou vrstvou polyimidu o vnějším průměru (od) 360 µm se sedmi kruhovými kanálky o id 28 µm (CACO, Slovensko), obr. 1. Pro porovnání byly elektroforetické experimenty prováděny ve standardních jednokanálových kapilárách o id 25 a 75 µm a pro UV detekci rovněž v kapiláře o id 25 µm s rozšířenou optickou dráhou v místě detekce na 125 µm; od všech kapilár bylo 360 m (Composite Metal Services, UK). Celková délka používaných kapilár byla 32,5 cm, délka k C 4 D 14,3 cm a délka k UV detektoru 8,3 cm. Pro sub-minutové separace byla použita křemenná kapilára vyrobená spojením 15 cm kapiláry o id 25 μm a 17 cm kapiláry o id 100 μm; délka k UV 8,3 cm. Spojení kapilár bylo provedeno pomocí 1 cm dlouhé bužírky používané pro izolaci proudo-vodičů. Před prvním použitím byly kapiláry aktivovány promytím 0,1 M NaOH (10 min.), vodou (5 min.) a separačním elektrolytem (BGE, 5 min.); mezi jednotlivými analýzami byly kapiláry promývány BGE (1 min.). Pro vybrané aplikace byl elektroosmotický tok v kapilárách potlačen pokrytím kapiláry pomocí INST coatingsolution (Biotaq, USA). Separace byly prováděny v short-end injection módu 4. Obr. 1. Sedmi-kanálová multi-channel kapilára o id 28 μm. Elektroforetická měření byla provedena na přístroji HP 3D CE system (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) vybaveným diod-array detektorem a bezkontaktním vodivostním detektorem (C 4 D) 5, které jsou zabudovány do termostatované kazety s kapilárou. Pro kalibraci C 4 D byly použity roztoky KCl o koncentracích 0,5-7 mm, s hodnotami specifické vodivosti (κ) 7,4 100 ms.m -1. Při měření odezvy C 4 D na Δκ(KCl), byla Δκ(KCl) vyvolána zvýšením teploty elektroforetické kazety z 25.0 ºC na 25.5 ºC 6 ; κ(kcl) závisí na teplotě (T) dle vztahu κ T+ΔT = κ T.(1+β. ΔT) s hodnotou teplotního koeficientu β 0,024 K -1. Experimenty byly prováděny při teplotě 25 ºC. Veškeré použité chemikálie dosahovaly analytického stupně čistoty. Výsledky a diskuse Elektroforetické separace v multi-channel kapiláře s bezkontaktní vodivostní detekcí Směs tří neurotransmiterů, dopamin, noradrenalin a adrenalin, v BGE o složení 100 mm kyselina octová, ph 2,9, byla separována v testované multi-channel kapiláře a pro srovnání v single-channel kapilárách o id 25 a 75 m. Použitý BGE je vhodný pro CE separace aminokyselin a aminů v kombinaci s C 4 D 7;8. Pro zajištění stejné délky nadávkované zóny 144

147 analytu do všech testovaných kapilár bylo použito elektrokinetické dávkování, u kterého je délka nadávkované zóny analytu nezávislá na id kapiláry. Získané elektroferogramy jsou uvedeny na obr. 2 a vyhodnocené parametry separace jsou shrnuty do Tabulky I. Výška píků v multi-channel kapiláře je prakticky stejná jako v 75µm kapiláře a oproti detekci v 25 m kapiláře asi 11.8krát vyšší. Počet teoretických pater N je v multi-channel kapiláře o 38 % menší v porovnání se 75µm kapilárou. Nižší separační účinnost v multi-channel kapiláře je zřejmě způsobena malými rozdíly v rychlosti pohybu analytů v jednotlivých kanálcích. To se projeví větší šířkou píků (w 1/2 ), které jsou v multi-channel kapiláře průměrně o 0,6 s širší v porovnání s šířkou píků v 75 m kapiláře. Podíl tohoto rozdílu a migračního času udává relativní rozdíl mezi rychlostmi pohybu analytů jednotlivými kanálky, který má průměrnou hodnotu 0,4%. Tento poměrně malý rozdíl v rychlosti pohybu analytů jednotlivými kanálky umožňuje požití multi-channel kapiláry pro CE separaci i směsí analytů s blízkými hodnotami mobilit. Píky při separaci v multi-channel kapiláře mají Gaussovský tvar. Obr. 2. CE/C 4 D separace modelové směsi dopaminu (1), noradrenalinu (2) a adrenalinu (3) v multi-channel kapiláře (A) a single-channel kapilárách, id 25 µm (B) and 75 µm (C). Experimentální podmínky: BGE, 100 mm kyselina octová; pokrytá kapilára; elektrokinetické dávkování 1 kv po dobu 10 s; separační napětí +10 kv, proud, 8,2 µa (A), 7,9 µa (B), 1,0 µa (B); vzorek, 5 µm směs neurotransmiterů v BGE/acetonitril 1:1 v/v. Tabulka I Parametry separace neurotransmiterů ve spojení s C 4 D. Multi-channel kapilára 75 μm id 25 μm id Výška píku (mv) N (10 3 m -1 ) Výška píku (mv) N (10 3 m -1 ) Výška píku (mv) N (10 3 m -1 ) Dopamin 1,4 (0,1) 162 (9) 1.3 (0,0) 217 (3) 0,12 (0,00) 313 (16) Noradrenalin 1,3 (0,1) 164 (11) 1,2 (0,0) 227 (8) 0,11 (0,00) 309 (4) Adrenalin 1,4 (0,1) 156 (8) 1,3 (0,1) 223 (13) 0,12 (0,00) 290 (18) N je udáno na jednotku efektivní délky kapiláry 145

148 Elektroforetické separace v multi-channel kapiláře s UV detekcí Použitelnost UV detekce v multi-channel kapiláře byla testována na stejné směsi neurotransmiterů jako při C 4 D. Separace byla provedena v BGE o složení 20 mm kyselina citronová/naoh, ph 3,2 s potlačeným elektroosmotickým tokem. BGE založený na kyselině citronové je vhodnějším separačním médiem pro UV detekci než roztoky kyseliny octové, protože neabsorbuje při 200 nm. Parametry separace v multi-channel kapiláře byly opět srovnávány se single-channel kapilárou o id 25 m a kapilárou o stejném id, ale s optickou drahou rozšířenou v místě detekce na 125 m. Získané elektroferogramy jsou na obr. 3 a parametry separace v Tabulce II. Obr. 3. CE/UV (200 nm) separace modelové směsi dopaminu (1), noradrenalinu (2) a adrenalinu (3) v multi-channel kapiláře (A) a single-channel kapilárách, id 25 µm (B) a 25µm kapilára s rozšířenou optickou dráhou (C). Experimentální podmínky: BGE, 20 mm kyselina citronová/naoh, ph 3,2; pokrytá kapilára; hydrodynamické dávkování 20 mbar po dobu 10 s; separační napětí +30 kv, proud, 37µA (A), 3,7µA(B), 3,7µA(C); vzorek, 100 µm směs neurotransmiterů ve vodě. V multi-channel kapiláře jsou výšky píků asi 4krát větší v porovnání s 25 m kapilárou. Účinnost separace vyjádřená počtem teoretických pater je na úrovni cca až a parametr rozlišení sousedních píků je 2,0 respektive 2,9, což jsou hodnoty plně srovnatelné s hodnotami pro jednokanálovou kapiláru. Výhoda multi-channel kapiláry je zřejmá i při srovnání s kapilárou s rozšířenou optickou drahou, která je běžně používána pro zvýšení citlivosti UV detekce 1;9 ; i v tomto případě jsou výšky píků v multi-channel kapiláře 2krát větší a hodnoty N dokonce více jak 10krát vyšší. Tabulka II Parametry separace neurotransmiterů ve spojení s UV při 200 nm. Multi-channel kapilára 25 μm id 25 μm id s optickou dráhou 125 μm Výška píku (mv) N (10 3 m -1 ) Výška píku (mv) N (10 3 m -1 ) Výška píku (mv) N (10 3 m -1 ) Dopamin 42,1 (1,0) 558 (33) 10,0 (0,3) 608 (38) 17,0 (0,2) 38,0 (0,3) Noradrenalin 41,4 (0,9) 483 (30) 10,3 (0,4) 572 (47) 19,4 (0,2) 55,0 (1,0) Adrenalin 41,3 (1,0) 381 (18) 10,4 (0,4) 483 (38) 23,8 (0,3) 24,0 (1,0) 146

149 Sub-minutová elektroforetická separace neurotransmiterů v kapiláře o dvou různých id Pro dosažení velmi vysoké intenzity separačního pole na komerčním přístroji CE byla použita kapilára vyrobená spojením 15 cm kapiláry o id 25 μm a 17 cm kapiláry o id 100 μm. Na části kapiláry s id 25 μm probíhá vlastní elektroforetická separace a druhá část kapiláry o id 100 μm uzavírá elektrický obvod. Tímto postupem se podařilo zvýšit E z 0,9 kv/cm při použití kapiláry o jednotném id na 1,9 kv. Výsledkem je kompletní separace směsi dopaminu, noradrenalinu a adrenalinu v BGE o složení 20 mm kyselina citronová/naoh, ph 3,2 za dobu kratší než 18 s. Obr. 4. Separace modelové směsi neurotransmiterů (100 µm) v kapiláře vytvořené spojením 25 µm kapiláry (délka 15 cm) a 100 µm kapiláry (17 cm). BGE, 20 mm kyselina citronová/naoh, ph 3,2, +30 kv, délka k UV detektoru 8,3 cm. Závěr Tato studie jasně dokládá, že vysoko-účinnou elektroforetickou separaci je možné provádět v několika paralelních kanálcích v rámci jedné separační kapiláry. Relativní rozdíly v rychlostech pohybu analytu v jednotlivých kanálcích se pohybují na úrovni desetin %, což umožňuje dosažení separační účinnosti několika set tisíc separačních pater na metr. Pro detekci v multi-channel kapiláře lze jak použít C 4 D, který měří signál z celého průřezu kapiláry, tak i standardní UV detektor. Dále se ukázalo, že pro dosažení sub-minutových separací lze s výhodou použít spojení dvou kapilár o různém id. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury České republiky (projekty P206/10/1231 a P206/11/0707) a UNCE Literatura 1. Lauer H. H., Rozing, G. P.: High Performance capillary Electrophoresis, A Primer, Agilent Technologies. Germany Jorgenson J. W., Lukacs K. D.: Anal. Chem. 53, 1298 (1981). 3. Kuban P., Hauser P. C.: Electrophoresis 30, 176 (2009). 4. Geiser L., Rudaz S., Veuthey J. L.: Electrophoresis 26, 2293 (2005). 5. Gas B., Zuska J., Coufal P., van de Goor T.: Electrophoresis 23, 3520 (2002). 6. Tuma P., Samcova E., Stulik K.: Electroanalysis 23, 1870 (2011). 7. Tuma P., Malkova K., Samcova E., Stulik K.: J. Sep. Sci. 33, 2394 (2010). 8. Gong X. Y., Hauser P. C.: Electrophoresis 27, 4375 (2006). 9. Hempel G.: Electrophoresis 21, 691 (2000). 147

150 Voltammetric Analysis of Anthraquinone- and Nitrophenyl-Labeled Nucleotide Triphosphates and Oligonucleotides (Voltametrická analýza nukleosidtrifosfátů a oligonukleotidů značených antrochinonem a nitrofenyl skupinou) Pavlína Vidláková a, Jana Balintová b, Radek Pohl b, Luděk Havran a, Michal Hocek b, and Miroslav Fojta a a Institute of Biophysics of AS CR, v.v.i., Královopolská 135, Brno, Czech Republic, vidlakova@ibp.cz b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry v. v. i., Flemingovo nam. 2, Prague 6, Czech Republic Abstract Anthraquinone and nitrophenyl group are electrochemical-active moieties that have been used for DNA labeling. Both nitro group and antraquinone gave well developed characteristic signals. We tested the possibility of simultaneous detection of DNAs modified with the two types of electroactive tags. We show that using cyclic voltammetry (CV), differentiation between the two labels, as well as between the labels and natural nucleobases, can be improved through optimization of the CV parameters. Key Words: Anthraquinone, Nitro group, Electrochemical analysis, DNA modification. Úvod Elektrochemická aktivita nukleových kyselin byla objevena v 50. letech 20. století a od té doby je používána ke studiu struktury a interakcí přirozených i modifikovaných molekul nukleových kyselin i syntetických oligonukleotidů. Nukleové kyseliny je možné oxidovat nebo redukovat na různých typech elektrod 1. V posledních letech je věnována značná pozornost značení nukleových kyselin elektroaktivními skupinami (například komplexy přechodných kovů 2,3, amino- nebo nitroskupinami 4,5 ). Tyto látky podléhají redoxním reakcím a dávají tak modifikované DNA nové elektrochemické vlastnosti. Takto značené molekuly mohou být využity v biologických, medicínských i nanotechnologických aplikacích. Experimentální část Nukleosidtrifosfáty modifikované antrachinonem a nitrofenylskupinou byly připraveny Sonogashira cross-coupling reakcí halogenovaných nukleosidtrifosfátů s N-(-2-propynyl)- antrachinoncarboamidem nebo 3-nitrofenylboronovou kyselinou. Inkorporace značených nukleosidtrifosfátů byla prováděna metodou prodlužování primeru (PEX) 6. Voltametrická měření byla prováděna na analyzátoru Autolab (Eco Chemie, Utrecht, The Netherlands) spojeném s VA-Stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland) ve tříelektrodovém zapojení (Ag/AgCl/3 M KCl jako referentní elektroda, platinový drátek jako pomocná elektroda). Měření bylo prováděno v inertní atmosféře argonu. Jako pracovní elektroda byla používána visící rtuťová kapková elektroda (HMDE). Doba akumulace byla 60 s. Cyklická voltametrie (CV) na HMDE - základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M fosforečnan sodný, ph 6,9. Výsledky a diskuse Elektrochemické chování nukleosidtrifosfátů (obr. 1) a oligonukleotidů značených antrachinonem a/nebo nitroskupinou bylo studováno pomocí CV na HMDE. Pro elektrochemické chování antrachinonu je charakteristická dvouelektrodová redoxní chinon/hydrochinon přeměna. V katodické větvi cyklického voltamogramu antrachinon 148

151 poskytuje pík AQ red při potenciálu okolo -0,4 V, příslušející redukci antrachinonu na ox antrahydrochinon. V anodické větvi cyklického voltamogramu je patrný pík AQH 2 příslušející zpětné oxidaci antrahydrochinonu (obr. 2). Intenzita píku AQH ox 2 závisí na potenciálu bodu obratu. Intenzita tohoto píku je největší při potenciálech bodu obratu -0, ,2 V, při potenciálech zápornějších než -1,4 V výška píku prudce klesá a při potenciálech zápornějších než -1,6 V pík AQH ox 2 na voltamogramu nepozorujeme. Obr. 1. Cytidintrifosfát značený nitrofenylovou skupinou dnc NO 2TP (A) a cytidintrifosfát značený propargylkarbamoylantrachinonem dc AQ TP (B). Obr. 2. CV dc AQ TP na HMDE základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M fosforečnan sodný, ph 6,9, počáteční potenciál 0,05 V, potenciál obratu -1,85 V (přerušovaná čára), počáteční potenciál 0,05 V, potenciál bodu obratu -0,6 V (plná čára). Nitroskupina během CV na HMDE poskytuje za daných podmínek při potenciálu okolo -0,45 V katodický pík NO 2 red, příslušející čtyřelektronové redukci nitroskupiny na hydroxylamin. Takto vzniklý hydroxylamin je při potenciálu kolem 0,0 V dvouelektronově reverzibilně oxidován a poskytuje anodický pík NHOH ox (obr. 3). Zkoumali jsme možnost současného stanovení antrachinonu a nitroskupiny. Vzhledem k blízkým hodnotám potenciálu redukce obou skupin jsou katodické píky antrachinonu a nitroskupiny často velmi obtížně rozlišitelné. Protože je však redukce nitroskupiny ireverzibilní a neposkytuje žádný oxidační signál v oblasti potenciálů, kde by interferoval s oxidací antrahydrochinonu. Produkt ireverzibilní redukce nitroskupiny navíc poskytuje oxidační signál NHOH ox, jehož potenciál se od potenciálu píku AQH 2 ox liší o cca 400 mv a tudíž se oba signály neovlivňují. Odlišení píku AQH 2 ox od anodického píku G, který poskytují okolo -0.3 V guaninové zbytky obvykle přítomné ve značené DNA 1,6, lze dosáhnout ve dvou 149

152 následných potenciálových cyklech s různým negativním bodem obratu (>-1.4 pro změření píku AQH 2 ox v prvním cyklu a pro změření píku G v cyklu druhém 6 ). Obr. 3. CV dnc NO 2TP na HMDE základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M fosforečnan sodný, ph 6,9, počáteční potenciál 0,05 V, potenciál obratu -1,85 V (přerušovaná čára), počáteční potenciál 0,05 V, potenciál bodu obratu -1 V (plná čára). Závěr V této práci se zabýváme možností stanovení nukleosidtrifosfátů, oligonukleotidů a DNA značených antrachinonem a/nebo nitroskupinou pomocí CV na HMDE. Obě značky je možné velmi dobře elektroanalyticky detekovat jak samostatně, tak i vedle sebe. Antrachinon poskytuje během CV dobře vyvinutý reverzibilní pík v oblasti kolem -0,4 V. Nitroskupina poskytuje během CV ireverzibilní redukční pík v oblasti kolem -0,45 V a oxidační pík hydroxylaminu v oblasti kolem 0,0 V. Naše výsledky ukazují, že tyto elektrochemické značky je možné využít pro analýzu sekvence oligonukleotidů i DNA. Poděkování Tato práce vznikla díky podpoře grantů GA ČR (P206/12/2378, P206/12/G151) a GA AV ČR (IAA ). Literatura 1. Palecek, E., Jelen, F.: In Electrochemistry of nucleic acids and proteins Towards electrochemical sensors for genomics and proteomics (Palecek, E., Scheller, F., Wang, J., ed.), pp , Elsevier, Amsterdam Fojta, M., Havran, L., Kizek, R., Billova, S., Palecek, E.: Biosens. Bioelectron. 20, 985 (2004). 3. Vrabel, M., Horakova, P., Pivonkova, H., Kalachova, L., Cernocka, H., Cahova, H., Pohl, R., Sebest, P., Havran, L., Hocek, M., Fojta, M.: Chem-Eur. J. 15, 1144 (2009). 4. Cahova H., Havran L., Brazdilová P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.: Angew. Chem. Int. Ed. 47, 2059 (2008) 5. Horakova P., Cahova H., Pivonkova H., Spacek J., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 9, 1366 (2011) 6. Balintova J.,Pohl R., Horakova P., Vidlakova P., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Chem- Eur. J. 17, (2011). 150

153 Rapid Determination of Saccharides in High Energy Drinks by Electrophoresis in a Short Capillary (Rychlé stanovení cukrů v energetických nápojích elektroforézou v krátké kapiláře) Blanka Vochyánová a, František Opekar a, Petr Tůma b, and Karel Štulík a a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Albertov 2030, Prague 2, Czech Republic, opekar@natur.cuni.cz b Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Institute of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Ruská 87, Prague 10, Czech Republic, Abstract A new laboratory system has been developed for rapid electrophoretic separations and determinations of inorganic and organic ions. The instrument employs short quartz capillary with a total length of 10 cm and effective lengths of 4 cm. It has been applied to separations of neutral mono- and disaccharides, in combination with contactless conductivity detection. The saccharides are separated in the anionic form, in solutions of alkali hydroxides, namely, KOH, NaOH and LiOH. The separation of a model mixture of five saccharides (sucrose, lactose, glucose, fructose and ribose) takes less than one minute, the detection limits equaling 15 and 35 mg L -1 for sucrose and lactose, respectively. The technique developed has been used to determine sucrose, glucose and fructose in high-energy drinks. Key Words: Capillary electrophoresis, Short capillary, Saccharides, Sucrose, Lactose, Glucose, Fructose, Ribose, Energy drinks. Úvod Kvalitativní i kvantitativní zastoupení jednoduchých cukrů v nápojích a potravinách je důležité pro kontrolu jejich energetické hodnoty, způsobu výroby, doby skladování a může sloužit též k odhalení nezákonného falšování potravin 1. Z důvodu vysoké strukturní podobnosti jednotlivých mono- a disacharidů je pro komplexní analýzu směsí sacharidů nutné používat vysoko-účinnou separační techniku. Nejčastěji používaná je iontově výměnná chromatografie s refraktometrickou nebo pulsní ampérometrickou detekcí 2,3. HPLC stanovení je charakterizováno poměrně dlouhou dobou separace (doba separace nebývá kratší než 10 min.), náročnou úpravou vzorku a použití refraktometrické detekce vyžaduje dlouhý čas pro ustálení základní linie 4. Mnohem jednodušší řešení pro analýzu jednoduchých neutrálních cukrů nabízí metody kapilární elektroforézy (CE) 5-8. Neutrální mono- a disacharidy je možno separovat v silně alkalických separačních elektrolytech o ph větším než 12, v kterých dochází k disociaci poloacetálové skupiny, takže cukry jsou separovány jako anionty. Mezi hlavní přednosti CE analýzy patří snadná příprava vzorku, vysoká separační účinnost a krátká doba separace. Dobu separace lze navíc výrazně zkrátit použitím krátké separační dráhy. Ze vztahu pro migrační čas, t m : tm ( ueff 2 L ueof ) kde L je délka kapiláry, u eff efektivní elektroforetická mobilita analytu, u eof mobilita elektroosmotického toku a U el separační napětí, vyplývá, že zkrácením separační dráhy na polovinu se při zachování konstantní hodnoty separačního napětí docílí čtyřnásobného zkrácení migračního času. Navíc na krátké separační dráze je omezena nežádoucí interakce analytu s vnitřní stěnou kapiláry, což se projeví vyšší separační účinností. Uel, 151

154 U komerčních elektroforetických přístrojů není možno z konstrukčních důvodů používat velmi krátké kapiláry; u často využívaných přístrojů firmy Agilent je minimální délka kapiláry cca 30 cm 9. Pro urychlení separace lze v komerčních přístrojích dávkovat vzorek do výstupního konce kapiláry, tzv. short end injection. Jinou možností, je využít speciálního laboratorního zařízení vyvinutého přímo pro elektroforetické separace v krátkých kapilárách 10. V předkládaném sdělení je jedno z takových zařízení popsáno a jeho přednosti jsou demonstrovány na příkladu stanovení cukrů v běžně dostupných energetických nápojích. Experimentální část Principiálním experimentálním problémem při separacích v krátých kapilárách je jejich omezená pohyblivost. S krátkou kapilárou nelze manipulovat stejně, jako s kapilárami dlouhými několik desítek centimetrů, které jsou používány ve standardních elektroforetických sestavách. Používaná elektroforetická aparatura proto byla navržena tak, aby všechny potřebné experimentální kroky, především dávkování vzorku a promývání kapiláry, bylo možno provést tak, aby s kapilárou nebylo nutno pohybovat. Obr. 1. Principiální schema aparatury pro elektroforézu v krátké kapiláře. Popis viz text. Principiální schema aparatury je na obr. 1, detaily lze nalézt v literatuře 11,12. Dávkovací konec kapiláry (1) je v dávkovací nádobce (2) vložen do hloubky asi 1 mm do PTFE trubičky (3). Vzorek je dávkován pomocí šesticestného dávkovacího ventilu opatřeného dávkovací smyčkou; používána byla smyčka o objemu 15 L. Při dávkování je na definovanou dobu aktivována piezoelektrická mikropumpa, která proudem separačního elektrolytu vypláchne smyčku a nese vzorek kolem dávkovacího konce kapiláry; vzorek je tak dávkován po dobu, kdy je zóna vzorku v kontaktu s dávkovacím koncem kapiláry. Tuto dobu lze řídit průtokovou rychlostí separačního elektrolytu. Přebytek elektrolytu po dobu dávkování odtéká do odpadu. Výstupní konec kapiláry je umístěn v koncové nádobce (4). Po ukončení separace je na určitou dobu v nádobce vytvořen podtlak membránovou pumpou, který umožní propláchnutí kapiláry. V dávkovací a koncové nádobce jsou umístěny elektroforetické elektrody (5). Ve vhodné vzdálenosti od dávkovacího konce kapiláry je bezkontaktní vodivostní detektor, C 4 D (6). Při všech měřeních byl používán separační elektrolyt 75 mm NaOH, křemenná kapilára o vnitřním průměru 10 m, celkové délce 10 cm, efektivní délce 4 cm a separační napětí 5 kv. Zásobní roztoky testovaných cukrů, sacharóza, D-laktóza, D-fruktóza, D-ribóza a D-glukóza o koncentraci 1000 mg L -1 byly připravovány v deionizované vodě a uchovávány v chladničce. Pro přípravy separačního elektrolytu byl používán hydroxid sodný. Reálnými vzorky byly energetické nápoje běžně dostupné v obchodní síti (v závorce je producent nebo distributor a údaj o celkovém obsahu cukru z etikety na obalu nápoje v g na 100 ml: Red Bull (Red Bull GmbH, Austria, 11), KX Energy Stimulation Drink (Cott Beverages Ltd., UK, 11,1), Kamikaze 152

155 C4D odezva C4D odezva (Tecfood, ČR, 11,3) a Burn (Coca Cola, 13,3). Reálné vzorky byly sonikací po dobu 30 minut zbavovány plynných složek. Pro analýzu byly ředěny deionizovanou vodou v poměru 1:50. Stanovení bylo založeno na metodě standardního přídavku, aby byl vyloučen vliv matrice vzorku na odezvu detektoru. Standardní přídavek byl při všech analýzách 1 g L -1. Výsledky a diskuse Elektroferogram modelové směsi běžných cukrů, obr. 2A, dokumentuje, že za používaných experimentálních podmínek lze tyto cukry separovat s dobrým rozlišením za dobu kratší než jedna minuta. Zjištěné hodnoty parametru rozlišení, R, byly: R(Lakt/Gluk) = 1,74, R(Gluk/Frukt) = 1,1 a R(Frukt/Rib) = 1,53. Ilustrační elektroferogramy separací cukrů v testovaných energetických nápojích s nejmenším a největším obsahem fruktózy jsou na obr. 2B. Stanovené obsahy cukrů jsou uvedeny v Tabulce I. Je vidět, že zjištěné hodnoty velice dobře souhlasí s hodnotami deklarovanými výrobcem; ve většině případů je stanovená hodnota v mezích intervalu spolehlivosti rovna hodnotě deklarované. Ve všech testovaných energetických nápojích byly nalezeny sacharóza, glukóza i fruktóza, i když na etiketě s údaji o složení některých z nich nebyl některý z uvedených cukrů jmenovitě uveden. a b mv mv 1 A 1 B Čas, s Čas, s Obr. 2. Elektroforetická separace modelové směsi cukrů o stejné koncentraci 500 mg L -1 (A) a elektroferogramy separace cukrů v energetických nápojích Red Bull (a) a Burn (b) zředěných deionizovanou vodou 1:50 (B). Identifikace: 1 sacharóza, 2 laktóza, 3 glukóza, 4 fruktóza, 5 ribóza. Separační elektrolyt 75 mm NaOH, kapilára o vnitřním průměru 10 m, celkové délce 10 cm a efektivní délce 4 cm, separační napětí 5 kv. Závěr Metodiku elektroforetického stanovení běžně se vyskytujících cukrů, viz např. 7, lze s úspěchem využít i při jejich elektroforetické separaci a stanovení v krátké kapiláře. Hlavní předností této varianty je vysoká rychlost analýzy. Výhody elektroforézy v krátké kapiláře ve srovnání s elektroforézou na čipu jsou zřejmé. Je využíváno běžně dostupné křemenné kapiláry a nikoli speciálního separačního systému čipu. Vlastnosti standardní křemenné kapiláry jsou při elektroforetických stanoveních dobře známé a lze je podle potřeby vhodně modifikovat. Délku i průměr separačního prostředí lze snadno volit změnou délky a vnitřního 153

156 průměru kapiláry, náhrada poškozené (ucpané) kapiláry je snadná. Využít lze i kapilár z jiných materiálů, např. PEEK. Tabulka I. Výsledky stanovení obsahu cukrů v energetických nápojích. Uvedeny jsou střední hodnoty (mediány) obsahu jednotlivých cukrů a totální obsah cukru ze tří nezávislých stanovení (v závorkách je RSD v %). Pro lepší názornost je přesnost stanovení totálního obsahu cukru vyjádřena rovněž intervalem spolehlivosti počítaným pro hladinu významnosti 95 %. Nápoj Sacharóza g L -1 Glukóza g L -1 Fruktóza g L -1 Celkový cukr a g L -1 Deklarovaný cukr g L -1 KX 51,9 (10,7) 42,8 (5,6) 19,6 (7,2) 114,5 4,2 (1,7) 111 Burn 75,0 (2,8) 38,1 (5,7) 31,8 (7,4) 144,9 5,3 (1,7) 133 Red Bull 59,5 (3,1) 43,1 (8,4) 4,6 (7,7) 106,4 5,2 (2,2) 110 Kamikaze 56,8 (1,7) 51,0 (2,9) 8,9 (4,6) 116,1 3,1 (1,1) 113 a ) Celkový obsah cukru byl počítán z výsledků tří nezávislých stanovení obsahu jednotlivých cukrů, nikoli ze středních hodnot uvedených v tabulce. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Ministerstva školství, mládeže a sportu České republiky, projekt MSM , a Grantové Agentury České republiky, grant č. P206/10/1231. Literatura 1. Montero C.M., Dodero M.C.R., Sanchez D.A.G., Barroso C.G., Chromatographia 59, 15 (2004) Bro_Carbohydrates_Food_Beverage_29Aug2007_LPN1971.pdf (January 18, 2012). 3. El Rassi Z., Carbohydrate Analysis: High Performance Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis, Elsevier Science, Amsterdam, Soga T., Serwe M., Food Chem. 69, 339 (2000). 5. Honda S., J. Chromatogr. A 720, 337 (1996). 6. Žídková J., Chmelík J., Chem. Listy 94, 1093 (2000). 7. Tůma P., Málková K., Samcová E., Štulík K., Anal. Chim. Acta 698, 1 (2011). 8. Carvalho A.Z., da Silva J.A.F., do Lago C.L., Electrophoresis 24, 2138 (2003). 9. Lauer H.H., Rozing G.P., High Performance Capillary Electrophoresis, Agilent Technologies, Germany, Opekar F., Coufal P., Štulík K., Chem. Rev. 109, 4487 (2009). 11. Opekar F.: Chem. Listy, v tisku. 12. Vochyánová B., Opekar F., Tůma P., Štulík K.: Anal. Chim. Acta, odesláno. 154

157 (Strept)avidin Biotin Interactions at Amalgam Electrodes Covered by Thiol Monolayer (Interakce (strept)avidin biotin na amalgamových elektrodách pokrytých thiolovou monovrstvou) Bogdan Yosypchuk a, Vladimír Mareček a, and Oksana Yosypchuk b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Dolejskova 3, Prague 8, Czech Republic, josypcuk@jh-inst.cas.cz b Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, Prague 2, Czech Republic Abstract Carboxylic group of 11 mercaptoundecanoic acid (MUA) can be used to creat a peptide bond with species containing amino group, e. g., peptides, and proteins. By the help of EDC NHS technology, streptavidin or avidin was covalently bonded with MUA monolayer at a silver solid amalgam electrode. Such prepared electrode was used for detecting biotin and biotinylated albumin in the supporting electrolyte (0.15 M NaCl, 0.05 M TRIS, ph 7.0). Electrochemical impedance spectroscopy was performed for the biosensor response monitored by impedance spectroscopy. Binding of biotin or biotinylated albumin with (strept)avidin entails a change in the resistance of the sensor in the concentration range of µg ml 1. Electrochemical regeneration of the amalgam electrode permits simply to renew its surface and to create the new biosensor. Key Words: Voltammetry, Amalgam electrodes, Monolayer, Streptavidin, Avidin, Biotin. Úvod Avidin a streptavidin jsou dobře známé svou vysokou afinitou vůči biotinu (K d M) a tato vazba patři k nejpevnějším nekovalentním vazbám. Biotin muže být snadno navázán na různé látky (DNA 1, 2, proteiny 3, enzymy 4 ) bez ovlivnění jejích biologické aktivity. Selektivní a pevná vazba (strept)avidin biotin se široce používá v různých biosenzorech, např., hybridizace DNA 1, v diagnostických testech tělních tekutin a tkání 4. V elektrochemických postupech se obvykle (strept)avidin naváže na pracovní elektrodu a spojení s biotinem značenou látkou se detekuje pomoci voltametrie, amperometrie nebo impedanční metody. Na materiálu pracovní elektrody často záleží, jakým typem vazby bude (strept)avidin spojený s elektrodou. Na uhlíkových elektrodách se většinou používá adsorpce (strept)avidinu přes určitou vysokomolekulární látku. U kovových elektrod se častěji aplikují postupy s vytvořením pevných kovalentních vazeb. Amalgámové elektrody 5-8 se ukázaly být vhodnou podložkou pro vytvoření thiolových monovrstev s vysokou povrchovou koncentrací látky a s malým počtem defektů 9. Většina našich experimentů ze studia tiolových monovrstev na amalgámových elektrodách byla provedena s kyselinou 11-mercaptoundekanovou (MUA). Karboxylová skupina této látky se může použit pro vytvoření peptidové vazby s jinými sloučeninami obsahujícími aminoskupinu, např. peptidy a proteiny. Cílem této práce bylo kovalentně navázat streptavidin nebo avidin na monovrstvu MUA na stříbrné pevné amalgámové elektrodě a vytvořit tak základ pro přípravu širokého spektra různých biosenzorů. Experimentální část Potenciostat galvanostat PGSTST302N s impedančním modulem FRA2 (ECO CHEMIE METROHM AUTOLAB, Nizozemsko) byl použit pro impedanční měření. Voltametrická měření byla prováděna s využitím počítačového analyzátoru řízeného softwarem MultiElchem v. 2.3 (Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i.) a elektrochemického stojánku (Polaro-Sensors, Praha). Pracovními elektrodami (WE) byly 155

158 vyleštěná stříbrná pevná amalgámová elektroda (p-agsae), elektroda pokrytá rtuťovým filmem (MF-AgSAE) nebo rtuťovým meniskem (m-agsae) (A = 0,00358 cm 2 ). Jako referentní sloužila nasycená kalomelová elektroda připravená pomocí stříbrného pastového amalgámu 6, 10 (její potenciál je stejný, jako u klasické kalomelové elektrody). Pomocnou elektrodu tvořil Pt drátek o průměru 1,0 mm a délce 15 mm. Vzdušný kyslík byl z roztoků odstraňován probubláváním dusíkem. Měření byla prováděna při laboratorní teplotě. Pro přípravu roztoků byla použita voda redestilovaná v křemenné aparatuře. Všechny použité chemikálie byly čistoty p. a. Výsledky a diskuse Příprava biosenzoru na základě elektrody ze stříbrného pevného amalgámu využívajícího interakci (strept)avidin biotin se skládá z několika kroků. Nejdříve se na elektrodu elektrochemicky naváže MUA, potom se pomoci EDC NHS technologie aktivuje karboxylová skupina deponované kyseliny 11-mercaptoundekanové a nakonec se takto připravena elektroda inkubuje se (strept)avidinem pro vytvoření peptidové vazby. Popsána struktura biosenzoru je založená na kovalentních vazbách a je dlouhodobě stabilní. Elektrochemická depozice kyseliny 11 mercaptoundekanové na AgSAE Vytvoření nebo obnovení monovrstvy MUA na různých amalgámových elektrodách je detailně popsáno v práci 9 a trvá 10 min. Nejdříve se povrch elektrody elektrochemicky obnovuje (nebo se odstraňuje předchozí monovrstva) v roztoku [0,5 M NaOH; 50 % C 2 H 5 OH; 1 mm MUA] při potenciálu 2200 mv po dobu 180 s. Následně, při potenciálu 350 mv a po dobu 300 s, se thiol kovalentně váže na povrch elektrody a vytváří monovrstvu. Nekovalentně navázána MUA se odstraňuje důkladným promýváním elektrody v etanolu. Přesnost opakovaného vytvoření monovrstvy thiolu se kontroluje podle plochy (náboje) katodického desorpčního píku, jehož RSD byla v daném případě 1 2 %. Aktivace karboxylové skupiny kyseliny 11 mercaptoundekanové Pro vytvoření peptidové vazby mezi COOH-skupinou MUA a NH 2 -skupinou (strept)avidinu se karboxylová skupina musí předem aktivovat. Tato aktivace se provádí ponořením AgSAE+MUA do vodného roztoku [0,2 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N - ethylcarbodiimid hydrochloridu (EDC); 0,05 M N-Hydroxysuccinimidu (NHS)] po dobu 15 min. Elektroda se opláchne vodou a hned se přenese do roztoku avidinu nebo streptavidinu. Stabilita vytvořeného NHS-esteru záleží na kyselosti roztoku. Při ph 7 je poločas hydrolýzy esteru 4 5 hod. Navázání avidinu(streptavidinu) na AgSAE+MUA Amino-skupiny (strept)avidinu reagují s molekulami semi-stabilního NHS-esteru s výsledným vytvořením peptidových vazeb. AgSAE+MUA NHS se ponoří do roztoku 1 mg ml 1 avidinu (0,1 mg ml 1 streptavidinu) v 0,1 M fosfátovém pufru o ph 7,0 po dobu min. Poté se elektroda opláchne vodou a přenese se do pufru [0,15 M NaCl; 0,05 M TRIS; ph 7,0] pro provedení EIS-měření. (Strept)avidin biotin interakce Každá molekula avidinu (streptavidinu) má 4 vazebná místa pro biotin nebo biotinem značené látky. V použitém biosenzoru je povrch elektrody účinně zablokován thiolovou monovrstvou a proto není možné provádět voltametrická měření. Navázání biotinu na avidin mění tloušťku a propustnost povrchové vrstvy biosenzoru, což vyvolá změnu kapacity a odporu celé konstrukce na elektrodě. Tyto změny byly detekovány pomocí elektrochemické impedanční spektroskopie (EIS). Po optimalizaci podmínek impedančních měření se detekce interakce 156

159 (strept)avidin biotin prováděla ve frekvenčním rozsahu od do 0,1 Hz a amplitudě 0,01 V. Potenciál scanu se volil buď v rozsahu potenciálů, kde je thiolová monovrstva stabilní, nebo tak, že se na začátku práce změřil potenciál biosenzoru v otevřeném obvodu (Open Circuit Potential) a potom se zjištěná hodnota používala pro celou sérii měření. Odezva připraveného biosenzoru s avidinem na přídavky biotinu je lineární v log stupnici rozsahu 0,5 5,0 µg ml 1 biotinu. Podobné výsledky byly získány i pro senzor se streptavidinem a albuminem modifikovaným biotinem. Obr. 1. EIS-odezva biosenzoru s avidinem na změnu koncentrace biotinu. Pracovní elektroda MF-AgSAE (D = 0,0675 cm; A = 0,00358 cm 2 ); základní elektrolyt (ZE): 0,15 M NaCl, 0,05 M TRIS, ph 7,0; koncentrace biotinu c = 0,58 4,03 µg ml 1 ; potenciál scanu E scan = 350 mv; frekvenční rozsah a směr scanu od do 0,1 Hz; amplituda 10 mv. R odpor v náhradním obvodu R s (RC) v roztocích s biotinem; R 0 stejný odpor v ZE. Obr. 2. EIS-odezva biosenzoru se streptavidinem na změnu koncentrace biotinem modifikovaného albuminu (BMA). Pracovní elektroda m-agsae (D = 0,0675 cm); koncentrace BMA c = 1,96 20,0 µg ml 1 ; E scan = 62 mv (OCP); náhradní obvod R s (RC)(RC). Ostatní podmínky jsou stejné jako v popisu Obr

160 Závěr Biosenzor založený na využití pevné a selektivní (strept)avidin biotin interakce byl přípraven poprvé na povrchu stříbrné amalgámové elektrody. Výhodou amalgámu je rychlé (3 5 min.) vytvoření kovalentní vazby mezi kovem elektrody a atomem síry kyseliny 11 mercaptoundekanové. (Strept)avidin se váže na monovrstvu zmíněné kyseliny peptidovou vazbou a proto je takto připravený biosenzor velice stabilní. EIS-měřeními bylo prokázáno, že zkoumaný biosenzor je citlivý na změnu koncentrace biotinu nebo biotinem modifikovaného albuminu. Tato práce je začátkem výzkumu biosenzorů připravených na povrchu různých amalgámů. Poděkování Tato práce vznikla s finanční podporou GA ČR (projekty čís. P206/11/1638 a P208/12/1645), GA AV ČR (projekt čís. IAA ), GA Univerzity Karlovy v Praze (projekt /2001/B-Ch/PrF), Univerzity Karlovy v Praze (projekt SVV ) a Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy (projekt MSM ). Literatura 1. Walter A., Wu J., Flechsig G.-U., Haake D. A., Wang J.: Anal. Chim. Acta (2011). 2. Hong S.-R., Jeong H.-D., Hong S.: Talanta 82, 899 (2010). 3. Zhaoyin W., Lei L., Yuanyuan X., Lizhou S., Genxi L.: Biosensors and Bioelectronics 26, 4610 (2011). 4. Schetters H.: Biomolecular Engineering 16, 73 (1999). 5. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 6. Yosypchuk B., Sestakova I.: Electroanalysis 20, 426 (2008). 7. Yosypchuk B., Fojta M., Barek J.: Electroanalysis 22, 1967 (2010). 8. Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis 15, 121 (2003). 9. Yosypchuk B., Marecek V.: J. Electroanal. Chem. 653, 7 (2011). 10. Yosypchuk B., Barek J., Yosypchuk O.: Electroanalysis 23, 2226 (2011). 158

161 Voltammetric Determination of Amino Derivatives of Naphthalene Using Boron-Doped Diamond Film Electrode (Voltametrické stanovení aminoderivátů naftalenu s využitím bórem dopované diamantové filmové elektrody) Jaroslava Zavázalová, Hana Dejmková, Jiří Barek, and Karolina Pecková Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, , Prague 2, Czech Republic, jaroslava.zavazalova@natur.cuni.cz Abstract Amino derivatives of naphthalene are suspected mutagens and/or carcinogens, thus they are widely monitored in the environment as well as in biological liquids. Voltammetric behaviour of 1-aminonaphthalene and 2-aminonaphthalene was investigated using differential pulse voltammetry at boron-doped diamond film electrode. The passivation of the electrode surface can be prevented by electrochemical activation at high anodic potential between individual scans. Optimum conditions for the determinations of studied analytes were estimated based on the influence of ph on the voltammograms in Britton-Robinson buffer. Key Words: Boron-doped diamond film electrode, 1-aminonaphthalene, 2-aminonapthalene, Differential pulse voltammetry. Úvod 1-Aminonaftalen (1-AN) a 2-aminonaftalen (2-AN) patří mezi aminoderiváty polycyklických aromatických uhlovodíků (APAH), významných polutantů životního a pracovního prostředí. Polycyklickým aromatickým uhlovodíkům jsou přisuzovány karcinogenní, mutagenní a teratogenní účinky. 2-AN je prokázaný karcinogen 1 a u 1-AN byly prokázány slabé mutagenní účinky 2. Vzhledem k tomu, že aminoskupina je elektrochemicky oxidovatelná, je možné ke stanovení uvedených látek použít moderní voltametrické metody. Bórem dopovaný diamantový (BDD) film je relativně nový, oblíbený elektrodový materiál, mezi jehož výhodné vlastnosti patří široké potenciálové okno, mechanická i chemická stabilita, nízký zbytkový proud a biokompatibilita 3, 4. Kvůli svým vhodným mechanickým a elektrochemickým vlastnostem se používá i pro stanovení APAH 5 a nitrovaných polycyklických aromatických uhlovodíků (NPAH) 6. Elektrooxidace aromatických aminů na pevných elektrodách je často provázena jejich pasivací. Proto byla provedena základní charakterizace elektrochemického chování studovaných amino aromátů na BDD elektrodě metodou diferenční pulsní voltametrie. Především byl sledován vliv pasivace elektrodového povrchu a vliv ph na signály analytů. Experimentální část Materiál Zásobní roztoky 1-AN (98%, Aldrich) a 2-AN (95%, Sigma-Aldrich) o koncentraci mol dm 3 byly připraveny rozpuštěním přesně naváženého množství dané látky v 250 ml deionizované vody (Millipore Q-plus System, Millipore, USA) za pomoci ultrazvuku. Brittonův-Robinsonův pufr (BR pufr) o příslušném ph byl připraven smísením vodného roztoku hydroxidu sodného o koncentraci 0,2 mol dm 3 s roztokem obsahujícím kyselinu boritou, fosforečnou a octovou (vše p.a., Lach-Ner, Neratovice, ČR), každou o koncentraci 0,04 mol dm 3. Přesná hodnota ph byla měřena ph metrem 3510 (Jenway, UK) s kombinovanou skleněnou elektrodou. 159

162 I [na] Aparatura Voltametrická měření byla prováděna pomocí Eco-Tribo polarografu (Polaro-Sensors, Praha, ČR) se software PolarPro (verze 5.1). Jednotlivá měření byla prováděna v tříelektrodovém zapojení s BDD pracovní elektrodou, zkonstruovanou v naší laboratoři, s aktivní plochou 12,6 mm 2 v diskovém uspořádání 6. Pracovní elektroda byla ponořena v polarografické nádobce společně s Ag/AgCl (3 mol l 1 KCl) referentní elektrodou (ETP CZ-R00408), a platinovou drátkovou pomocnou elektrodou (obě Elektrochemické detektory, Turnov, ČR). Pracovní postupy Diferenční pulsní voltametrie (DPV) byla použita s následujícími parametry: polarizační rychlost 20 mv s 1, pulsy o šířce 100 ms a výšce +50 mv. Před prvním měřením a mezi měřením odlišných vzorků byla elektroda opláchnuta deionizovanou vodou, ponořena do acetonitrilu, který byl 3 min probubláván dusíkem, a znovu opláchnuta deionizovanou vodou. Následovala elektrochemická aktivace v 1M vodném roztoku kyseliny dusičné při vloženém potenciálu +2,4 V po dobu 1 min. Objem měřeného vzorku byl vždy 10 ml: Do 10ml odměrné baňky byl odpipetován 1 ml zásobního roztoku studované látky a poté doplněn BR pufrem o příslušném ph po značku. Všechny křivky byly měřeny nejméně třikrát a poté statisticky vyhodnoceny. Veškerá měření byla prováděna za laboratorní teploty. Výška píků sledovaných látek byla vyhodnocována od spojnice minim před a za píkem. Výsledky a diskuse Pasivace elektrodového povrchu BDD elektrody byla sledována v prostředí BR pufru o ph 5,0 metodou DPV. Z měření deseti následných skenů bez jakékoliv úpravy elektrodového povrchu mezi skeny (Obr. 1) lze usuzovat na základě poklesu výšky píku 1-AN, že dochází k pasivaci elektrodového povrchu. V předchozí práci 5 věnované optimalizaci DPV stanovení aminobifenylů byly reprodukovatelné výšky píků získány při 15s míchání měřeného roztoku mezi jednotlivými skeny. Tento postup však v případě 1-AN a 2-AN nevede k odstranění pasivačních produktů. Proto byl navržen program, který využívá kombinaci míchání roztokem a vložení aktivačního potenciálu +2,4 V po dobu 15 s. Při měření deseti opakovaných skenů je touto úpravou mezi jednotlivými skeny dosaženo reprodukovatelných výsledků s relativní směrodatnou odchylkou 2,0 % E [mv] Obr. 1. Pokles výšky píku 1-AN (c = mol dm 3 ) při měření deseti opakovaných skenů v prostředí BR pufru o ph 5,0. Měřeno metodou DPV na BDD elektrodě. 160

163 I [na] I [na] Pasivace elektrodového povrchu je při elektrochemickém stanovení organických látek na pevných elektrodách běžným jevem, jelikož dochází velmi často k ireverzibilní adsorpci reakčních produktů či interferentů na povrchu elektrody. Primární aromatické aminy jsou látky elektrochemicky snadno oxidovatelné; mechanismus je založen na oxidaci aminové skupiny navázané na aromatickém uhlovodíku, kdy prvním krokem je jednoelektronová oxidace za tvorby kation radikálu. U studovaných aminoaromátů lze předpokládat vysoký počet reakčních produktů a meziproduktů a složitou strukturu vznikajících polymerních filmů vzhledem k vysokému počtu mesomerních forem radikál kationtu vzniklého prvotní jednoelektronovou oxidací. Např. pro 4-aminobifenyl byl na platinových elektrodách popsán vznik lineárního polymeru tvořeného bifenylovými skelety vzniklého coupling reakcí C-N konci 4-aminobifenylu 7. Dále byl studován vliv ph na DP voltamogramy 1-AN a 2-AN v prostředí BR pufru v rozsahu ph 2,0 12,0. Vybrané voltametrické křivky pro 1-AN znázorňuje Obr AN poskytuje v oblastech ph 2,0 6,0 celkem čtyři píky, při ph 7,0 12,0 pouze jeden pík. Tuto skutečnost zobrazuje Obr. 3, ze kterého je rovněž patrná závislost E p na ph roztoku. 2-AN poskytuje v oblastech ph 2,0 a 3,0 celkem čtyři píky, při ph 4,0 tři píky a při ph 5,0 12,0 pouze jeden pík. Jako optimální ph pro stanovení studovaných látek bylo vybráno ph 7,0 shodně pro obě látky vzhledem k přítomnosti jednoho symetrického píku. Tyto látky však vzhledem k blízkým potenciálům nelze stanovit pomocí DPV ve směsi vedle sebe: V prostředí BR pufru o ph 7 je E p (1-AN) = 502 mv a E p (2-AN) = 570 mv. Potenciál signálů 1-AN a 2-AN se s rostoucí hodnotou ph měřeného prostředí zpravidla posouvá k negativnějším potenciálům. Tento trend je obecně platný pro oxidaci aminoskupiny, jelikož vlivem její protonizace v kyselejších prostředí klesá elektronová hustota a je potřeba vynaložit vyšší energie (čili kladnějšího potenciálu) pro odebrání elektronu. V několika případech byla na BDD elektrodách pozorována lepší reprodukovatelnost signálu analytu pro zásaditá prostředí, což bylo vysvětleno vyšší rozpustností a tím pádem snadnějším odstraněním vzniklých polymerních filmů 5, A B E [mv] Obr. 2. DP voltamogramy 1-AN (c = mol dm 3 ) na BDD elektrodě v prostředí BR pufru: A ph 2,0 (1); 4,0 (2) a 6,0 (3); B ph 8,0 (1); 10,0 (2) a 12,0 (3). E [mv] 161

164 E [mv] pík pík pík 1 pík Obr. 3. Závislost potenciálu píku E p 1-AN (c = mol dm 3 ) na ph roztoku. Měřeno metodou DPV na BDD elektrodě v prostředí BR pufru. Závěr Na základě provedeného průzkumu elektrochemického chování 1-AN a 2-AN v prostředí BR pufru na BDD elektrodě metodou DPV bylo zjištěno, že dochází k pasivaci elektrodového povrchu a pro dosažení reprodukovatelných výsledků je nutné mezi jednotlivými skeny vložit na pracovní elektrodu potenciál +2,4 V po dobu 15 s. Optimálním prostředím pro DPV stanovení 1-AN a 2-AN je BR pufr o ph 7,0. Látky však nelze stanovit ve směsi vedle sebe vzhledem k blízkým oxidačním potenciálům. Poděkování Tato práce byla finančně podporována MŠMT ČR (projekt MSM ), Univerzitou Karlovou v Praze (projekt SVV ) a GA ČR (projekt P206/12/G151). JZ děkuje Univerzitě Karlově, Přírodovědecké fakultě (projekt STARS) za finanční podporu. Literatura 1. downloaded March 5 th Cheung Y., Lewis D. F. V., Ridd T. I., Gray T. J. B., Ioannides C.: Toxicology 118, 115 (1997). 3. Fujishima A., Einaga Y., Rao T. N., Tryk D. A.: Diamond Electrochemistry. Elsevier, Amsterdam Peckova K., Musilova J., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 148 (2009). 5. Barek J., Jandova K., Peckova K., Zima J.: Talanta 74, 421 (2007). 6. Cizek K., Barek J., Fischer J., Peckova K., Zima J.: Electroanalysis 19, 1295 (2007). 7. Guay J., Dao L. H.: J. Electroanal. Chem. 274, 135 (1989). 8. Mitadera M., Spataru N., Fujishima A.: J. Appl. Electrochem. 34, 249 (2004). ph 162

165 tel.: fax: DETEKČNÍ SYSTÉM ÚNIKU ROPNÝCH LÁTEK AS-DETECTOIL Detekční zařízení určené ke zjišťování a monitorování přítomnosti ropných látek, olejů, apod. na hladině vody. Zařízení je certifikováno. Zařízení je využitelné zejm. v průmyslu (energetika, čističky odpadních vod, ap.), v odlučovačích ropných látek, v životním prostředí aj. jako kontrolní a bezpečnostní systém. POPIS ZAŘÍZENÍ Systém sestává ze sondy o rozměrech 70 x 70 x 30 mm, z vyhodnocovacího přístroje o rozměrech 220 x 50 x 150 mm (napájeného napětím 12 V akumulátor, trafo) a z výstupu pro instalaci signalizačního zařízení (zvonek, světlo) či pro napojení regulačního, záznamového a jiného systému. Zařízení umožňuje dlouhodobý, spolehlivý a bezúdržbový provoz, i v prostředí s nebezpečím výbuchu. Díky rozměrům sondy lze detektor instalovat např. i do vrtů nebo na odbočky z potrubí. TECHNICKÉ ÚDAJE připojením na síť 220/50 Hz; 3,5 ma; akumulátor nebo trafo; váha 1,9 kg 163

166 tel.: tel./fax: Osvědčený analyzátor do každé laboratoře, provozu i terénu, výzkumu i škol moderní, citlivý a široce využitelný s vlastními originálními US patenty, certifikovaný přístroj PC ECO - TRIBO voltametrický/polarografický analyzátor Metody Elektrody vysoká citlivost snadná automatizace ideální pro speciaci stolní nebo přenosná verze (připojení na stolní PC, laptop či notebook) verze pro DOS, Win 3.x, 9x, Me, 2000, XP DC a diferenční pulzní voltametrie (DCV a DPV), Cyklická voltametrie, DP a Tast polarografie Chronopotenciometrie s konstantním proudem Možnost návrhu vlastních metod podle potřeby uživatele Miniaturní tužková rtuťová Zlatá, uhlíková (pastová i filmová), stříbrná, měděná Pevné amalgamové: stříbrná, zlatá, měděná (menisková, leštěná, filmová) Použití Pro ekoanalýzu (polarografii a voltametrii) ve vodách, v roztocích a v různých materiálech (podle ČSN, DIN apod.), v běžných podmínkách pro vysoké obsahy i pro stopové koncentrace až mol/l stanovení kovů (Pb, Cd, Zn, Cu, Fe, Ni, Al, Cr, Hg, As, Mn, Mo, Be), resp. většiny prvků Mendělejevovy tabulky stanovení aniontů (dusičnanů, dusitanů, Cl -, CN -, Br -, J -, SO 4 2-, PO 4 3-, S 2- ) sledování velkého množství org. látek a škodlivin (saponátů, herbicidů, pesticidů, insekticidů, nitrolátek, barviv, biologicky aktivních látek, surfaktantů atd.). Hodnocení stavu a stupně opotřebení motorů, ropných olejů a maziv v běžných podmínkách, bez demontáže Oblasti aplikací - dosud nejširší laboratorní, provozní, dílenská i terénní praxe vodohospodářství, ekologie, hygiena, zemědělství a potravinářství, medicína, farmacie, geologie, hutnictví, chemické a jiné průmyslové závody, výzkum, školství atd. Analýza všech druhů vod a vodných roztoků; odpadních vod, vod z galvanizoven, průsaků, skládek odpadů, výluhů půd; geologických vzorků; rud; popílků a prachu; zemědělských, chemických a farmaceutických vzorků; pokrytí ČSN a vyhl. na vody z asi 80 % atd. Samozřejmostí je bezplatná konzultace a předvedení systému. Poskytujeme komplexní, odborný i pogaranční servis, odbornou pomoc a vývoj analytických metodik. Celý systém je, pro svou jednoduchou obsluhu, vhodný pro výukové účely. 164

167 165

168 166