MYKOBAKTERIE, PŘIROZENÁ REZISTENCE, IMUNITA

Transkript

1 MYKOBAKTERIE, PŘIROZENÁ REZISTENCE, IMUNITA Mycobacteria, Natural Resistance, Immunity Jan Krejsek, Otakar Kopecký, Karolína Jankovičová Ústav klinické imunologie a alergologie, LF UK v Hradci Králové SOUHRN M. tuberculosis je nejvýznamnějším bakteriálním původcem lidských infekčních onemocnění. Biologické vlastnosti M. tuberculosis, zvláště složení povrchových struktur, určují unikátní imunopatogenetické charakteristiky infekce. Na obraně se podílí genetická rezistence jedince, podmíněná například genem Nramp a slizniční imunitní systém dýchacích cest. Rozhodující podíl mají plicní makrofágy, které se spolu s T lymfocyty akumulují v místě infekce a vytvářejí granulom. Makrofágy jsou schopny usmrcovat intracelulárně lokalizované mikroby po stimulaci g-interferonem, produkovaným subsetem TH1 T lymfocytů. Makrofágy reagují na infekci M. tuberculosis především produkcí TNFa, který má rozsáhlé regulační a efektorové účinky. Předchozí expozice mykobakteriím vede ke vzniku tzv. DTH reakce, hodnocené Mantoux kožním testem, který však nevypovídá o úrovni imunity jedince vůči mykobakteriím. Klíčová slova: M. tuberculosis, imunopatogeneze, imunita, makrofágy, TH1 T lymfocyty, g-interferon SUMMARY Infection caused by M.tuberculosis and related mycobacteria are responsible for the substantial morbidity and mortality of human population. Biological parameters, particularly the composition of cell wall of M.tuberculosis delineate the unique characteristics of immunopathogenesis of mycobacterial infections. The genetic resistance factors such as Nramp gene product together with mucosal immune system of lung are clearly involved. The most important role in the protection against M.tuberculosis plays both alveolar macrophages and T cells which together form granuloma. Mycobacteria can survive and even multiplicate in a hostile microenvironment of monocyte-macrophage cells. The help provided by TH1 T cells via interferon g is necessary for macrophages to kill and eliminate mycobacterial infection. The delayed hypersensitivity reaction (DTH) is elicited in persons with previous contact with mycobacteria but no relevant information regarding to the level of protection could be read from the presence and intensity of DTH skin reactivity tested as Mantoux reaction. Key words: M. tuberculosis, immunopathogenesis, immunity,macrophages, TH1 T cells, interferon g Úvod Mykobakterie jsou v současnosti považovány z klinického pohledu za nejvýznamnějšího bakteriálního původce lidských onemocnění. Podle posledních údajů je Mycobacterium tuberculosis ročně odpovědné za smrt zhruba 3 milionů lidí. Lepra, další onemocnění způsobené mykobakteriemi, postihuje stále několik desítek milionů lidí. Vzrůstá klinický význam atypických mykobakterií a mykobakterií, které jsou považovány za podmíněně patogenní a způsobují onemocnění u imunosuprimovaných osob, zvláště lidí

2 s AIDS. Z globálního pohledu lze velmi zřetelně odlišit rozdíly v incidenci tuberkulózy ve vyspělém světě a v rozvojových zemích. Zatímco ve vyspělých zemích docházelo po několik desetiletí k postupnému snižování výskytu tuberkulózy a smrtnost tohoto onemocnění byla prakticky eliminována, v rozvojových zemích zůstává incidence, stejně jako smrtnost tuberkulózy vysoká a má nadále vzestupný charakter. Povzbudivé epidemiologické údaje z rozvinutých zemí jsou výsledkem dlouhodobého úsilí, které zahrnuje obvykle aktivní imunizaci osob, vyhledávání a léčbu klinicky manifestních onemocnění a v neposlední řadě také výrazné zlepšení socioekonomických podmínek lidí, žijících v těchto zemích (14). Negativními trendy posledních let jsou objevení se multirezistentních kmenů M. tuberculosis a nárůst osob s AIDS, které jsou zvláště vnímavé k mykobakteriálním infekcím. V rozvojových zemích, přes určitou snahu zlepšit epidemiologickou situaci plošnou aktivní imunizací, zůstává především z důvodu socioekonomických tuberkulóza stále výraznou hrozbou. S ohledem na výrazně vyšší mobilitu lidí třetího světa jsou ve vyspělých zemích v 90. letech zřetelné trendy zavlečení tuberkulózy migranty. Světová zdravotnická organizace považuje hrozbu mykobakteriálních infekcí pro lidstvo za velmi významnou a byla učiněna politická rozhodnutí jak situaci v této oblasti zlepšit. Je však jasné, že k pokroku nemůže dojít bez lepšího poznání biologických vlastností původce a imunopatogenetických mechanizmů, které souvisejí s mykobakteriálními infekcemi (28). Historické poznámky Tuberkulóza je onemocnění se zřetelným sociálním rozměrem. Pro její šíření je nepochybně zapotřebí, aby v malém prostoru došlo k akumulaci většího počtu lidí. Proto nepřekvapuje, že známky TBC byly nalezeny na kosterních pozůstatcích z neolitu, kdy docházelo k vytváření prvních trvalých sídel. Klinická pozorování TBC byla učiněna v antickém světě i ve starověké Indii. Některými mysliteli byla zdůrazňována rodová dispozice a Galén poprvé rozpoznal přenosný charakter této nemoci. Ve velkých městských sídlech středozemní oblasti docházelo ve starověku k šíření této nemoci. Společenské podmínky raného středověku v Evropě neumožňovaly zřejmě výraznější šíření této infekce. Až v renesanční době, a zvláště v raném novověku dochází k vzestupu incidence, jistě opět v souvislosti s výraznou urbanizací, byly provedeny první vědecké klinické a patoanatomické popisy. Infekční povahu nemoci se však podařilo definitivně prokázat až francouzskému lékaři Villeminovi v 2. pol. 19. století. Bezesporu nejvýznamněji k poznání původce onemocnění přispěl Robert Koch, který v roce 1882 mikroskopicky popsal a později rovněž kultivoval M. tuberculosis. Jím popsaný způsob barvení je používán více než 100 let jako jednoduchý způsob průkazu acidorezistentních bakterií, zvláště ve sputu. Diagnostiku TBC výrazně zlepšilo použití Roentgenova přístroje. Ke snížení úmrtnosti na infekci M. tuberculosis, vedle včasné diagnostiky, přispěla také léčba TBC v horských sanatoriích, která byla typická pro 1. pol. 20. století. Za podstatnou událost je zapotřebí považovat zavedení aktivní imunizace aplikací BCG vakcíny v roce Cílená léčba TBC byla zahájena v roce 1944 antibiotiky (15). Biologické vlastnosti M. tuberculosis M. tuberculosis je mikrob s nízkou proliferační aktivitou. Nevykazuje faktory invazivity. Je ojedinělý svou schopností přežívat uvnitř fagocytujících buněk a odolávat působení proteolytických enzymů. Biologické vlastnosti mykobakteriálních buněk ve vztahu k imunitnímu systému jsou určovány především povrchovými bakteriálními strukturami. Imunitní odpověď na mykobakteriální infekci má mnohé výlučné charakteristiky. Jsou způsobeny především unikátním složením buněk mykobakterií. Imunogenní látky, které jsou lokalizovány jednak v cytoplazmě, a jednak v povrchových strukturách, jsou uvolňovány ve velkém množství v průběhu buněčné proliferace. Mykobakteriální povrchy mají neobvyklé fyzikálně chemické vlastnosti. Bakteriální tělo je ohraničeno typickou dvojvrstevnou fosfolipidickou biomembránou, která se nachází pod rigidní buněčnou stěnou, tvořenou peptidoglykanovou kostrou. V buněčné stěně a také v prostoru mezi membránou a buněčnou stěnou se nacházejí rozličné proteiny, z nichž některé jsou imunogenní. Na peptidoglykan je fosfodiesterovou vazbou navázán arabinogalactan, polymer arabinózy a galactózy. Na distální část arabinogalactanu jsou navázány velké rozvětvené mastné kyseliny, označované jako mykolové kyseliny (C 60 -C 90 ). Další významnou složkou mykobakteriálních povrchů je lipoarabinomanan, který je zakotven až v cytoplazmatické membráně a prochází celou buněčnou stěnou až na povrch. Lipoarabinomanan je heterogenní směsí vysokomolekulárních

3 fosforylovaných lipopolysacharidů, obsahujících arabinózu a manózu. Mastné kyseliny, palmitát a tuberculostearát se vyskytují ve formě diacylglycerolu, navázaného na rozvětvené polysacharidy, obsahující arabinózu a manózu. Peptidoglykan vykazuje adjuvantní působení na imunitní systém, prostřednictvím fragmentu muramyldipeptidu, který nespecificky stimuluje produkci protilátek vůči slabým nepříbuzným antigenům. Komplex arabinogalactanu-mykolátu tlumí imunitní odpověď (7). Klinické poznámky TBC je chronická granulomatózní choroba způsobená M. tuberculosis s velmi pestrými klinickými projevy, obvykle zahrnujícími plíce, zasaženy však mohou být i jiné orgány. Zdrojem infekce je vždy pouze infikovaný člověk. Nákaza se obvykle přenáší infekčním aerosolem, tvořeným částicemi menšími než 5 mm, překonávající obranné bariéry v bronších a dostávají se až do alveolů. Více než 90 % infikovaných osob eliminuje infekci prostřednictvím alveolárních makrofágů a buňkami zprostředkované buněčné imunity. Nemoc se klinicky nemanifestuje a jedinou známkou expozice M. tuberculosis je pozitivita tuberkulinového kožního testu. Zhruba 5 % nakažených jedinců se nevyrovná s infekcí a po uplynutí několika týdnů až měsíců projeví příznaky primární TBC. Infekce se šíří do regionálních lymfatických uzlin a je diseminována krevní cestou do dalších orgánů (játra, ledviny, kostní dřeň, CNS). U části infikovaných osob se primární onemocnění nemusí projevit, imunitní systém není schopen infekci kompletně eliminovat a ohraničuje pouze infekční fokus. Při oslabení imunitní reaktivity jedince může dojít k reaktivaci infekce, která se může šířit i do extrapulmonálních lokalit (5). Předchozí expozici mykobakteriím (ne pouze patogenním, ale také expozici vakcinačnímu kmeni BCG, případně environmentálním nepatogenním mykobakteriím) je možné testovat pomocí tzv. tuberkulinového kožního testu. Tento test je jednoduchým, bezpečným, laciným a dostupným způsobem k určení tzv. opožděné hypersenzitivity, která následuje po expozici mykobakteriím. Spočívá v přísně intradermální aplikaci purifikovaného proteinového derivátu tuberkulinu (PPD). Tento podnět vede k akumulaci monocyto-makrofágových buněk a T lymfocytů v místě vpichu, což se projeví jako indurace. Protože se jedná o buněčnou reaktivitu, výsledek testu může být hodnocen až po 24 a 48 hodinách. Proměřuje se velikost indurace podle doporučených standardů. Pozitivní kožní reakce svědčí pro předchozí expozici mykobakteriím. V případě aktivní nemoci může u části nemocných dojít ke snížení kožní odpovídavosti, případně až anergii, která je způsobena imunosupresivními účinky infekce. Část nemocných s aktivní infekcí naopak může reagovat velkými kožními reakcemi. Negativita kožního testu po aplikaci PPD může být způsobena jednak absencí předchozího kontaktu s mykobakteriemi, nebo sníženou buňkami zprostředkovanou imunitou. Velikost kožní reakce nedovoluje rozlišit mezi aktivní nemocí a infekcí M. tuberculosis bez klinických projevů. Zvláštní obezřetnost vyžaduje interpretace testů u osob vyššího věku a osob s oslabenou buňkami zprostředkovanou imunitou (22). Obranná reakce na infekci M. tuberculosis Obranná reakce člověka na mykobakteriální infekci je mimořádně komplexní a zahrnuje jak faktory tzv. genetické rezistence jedince, tak fyziologické obranné bariéry a funkce nespecifické i specifické imunity (10). O genetickém základě rezistence či vnímavosti člověka k některým bakteriím, zvláště mikrobům s intracelulárním parazitizmem, jako je M. tuberculosis, jsou v současnosti již k dispozici alespoň rámcové informace. Ukazuje se, že tato rezistence je kódována skupinou genů, z nichž nejlépe prozkoumaný je gen Nramp-1 (natural resistance associated macrophage protein-1). Tento gen kóduje membránový protein, o molekulové hmotnosti 60 tisíc, který obsahuje 12 transmembránových domén. U člověka je exprimován především v monocyto-makrofágových buňkách a granulocytech. Ze struktury vyplývá, že se jedná o transportní membránový protein, který je asociován s fagosomální membránou. Zde pravděpodobně reguluje vytvoření fagosomu. Vyskytuje se také v pozdním endocytickém kompartmentu spolu s lysosomálním proteinem LAMP-1. Spekuluje se, že Nramp-1 by mohl odstraňovat ionty Fe 2+ z fagosómu. Tyto ionty jsou nezbytné pro přežití a množení pohlceného mikroorganizmu. Divalentní kationty jsou také důležitými kofaktory pro mnohé enzymy, jako jsou bakteriální superoxidismutáza a kataláza. Tyto enzymy neutralizují cytotoxické vlivy oxidativního vzplanutí makrofágů, souvisejících s produkcí vysoce reaktivních forem kyslíku ve stavu zrodu. Tak by mohl být mikrob uchráněn před cidními aktivitami těchto látek. Gen Nramp-1 vykazuje polymorfizmus (3). Na příkladu infekce M. leprae

4 je prokázána vazba mezi formou Nramp-1 genu a vnímavostí k této infekci (1). Je dobře doloženo, že při nejčastější formě vstupu M. tuberculosis do organizmu, tj. dýchacími cestami, je většina infekčních ataků eliminována lokálně bez projevů infekce. První obrannou bariéru zprostředkují faktory nespecifické i specifické imunity na površích dolních dýchacích cest. Epiteliální struktury dolních dýchacích cest zajišťují výrazné samoočišťovací vlastnosti těchto povrchů (29). Případné adherující mykobakteriální buňky jsou rychle eliminovány plicními makrofágy. K účinnému nitrobuněčnému zabíjení mykobakterií v makrofázích je zapotřebí kooperace mezi specifickou T buněčnou imunitou a těmito buňkami. Protilátková odpověď nesehrává pravděpodobně protektivní úlohu v obraně proti mykobakteriím. Je třeba dobře rozlišit mezi protektivní imunitou a tzv. reakcí pozdní přecitlivělosti (DTH), která je odpovědna za kožní reaktivitu po aplikaci PPD. Tato pozdní přecitlivělost nevypovídá v žádném případě o individuální úrovni obrany vůči mykobakteriím, slouží pouze jako doklad předchozí expozice mykobakteriím (26). Časná fáze infekce M. tuberculosis Povrchové struktury M. tuberculosis představují pro přirozenou imunitu, která je první obrannou linií imunitního systému, odpovídající na tuto infekci, výrazný nebezpečný vzor. Podle současného chápání má i nespecifická imunita schopnost odlišit potenciálně nebezpečné podněty a reagovat na ně. Reaguje na již zmíněné nebezpečné vzory, které nazýváme PAMPs (pathogen associated molecular patterns). PAMPs lze charakterizovat jako kombinaci molekul, které jsou tvořeny pouze mikrobiálními patogeny. Molekuly tvořící PAMPs jsou vysoce konzervované a jsou esenciální pro život mikroba. Jsou obvykle sdíleny velkou skupinou mikroorganizmů. Pro G- bakterií je PAMPs LPS, pro G + bakterie lipoteichoová kyselina, pro mykobakterie lipoarabinomanan a muramyldipeptid. Charakter PAMPs určuje optimální typ nespecifické imunitní reakce. Tento vzor je identifikován prostřednictvím řady povrchových receptorů buněk monocyto-makrofágové linie, které jsou svojí regulační úlohou (produkce prozánětlivých cytokinů) i efektorovou funkcí (produkce cytotoxických látek) ústřední složkou nespecifické imunity (19). Paradoxně povrchové receptory plicních makrofágů rovněž umožňují vstup mykobakterií do nitra buňky. Receptorová výbava makrofágů je mimořádně rozmanitá (12). Na vstupu mykobakteria do buňky se podílejí povrchové receptory makrofágů, které jsou schopny vázat bílkoviny, patřící do rodiny tzv. collectinů. Ta zahrnuje například sérový, manózu vázající protein (MBP) a C1q složku komplementu. Na površích alveolů, kde probíhá počáteční inokulace M. tuberculosis, je přítomna další bílkovina této rodiny, která je nazývána povrchový protein A (Sp-A). Pro collectiny je typická přítomnost C-koncových struktur, které funkčně odpovídají lektinům. Vstup mykobakterií do nitra makrofágů zesiluje přítomnost receptorů pro manózu, prostřednictvím kterých je vázán lipoarabinomanan (LAM) mykobakterií. Povrchové mykobakteriální struktury jsou výrazným proaktivačním stimulem pro alternativní dráhu aktivace komplementu. Navázané aktivované složky komplementu potom umožní vazbu mikrobů na receptory pro komplement CR-1, CR-2, CR-3 a CR-4. Nejdůležitější pro vstup mykobakterií do nitra makrofágu je pravděpodobně receptor CR-1 (CD35) (18). Podobnou úlohu jako receptory pro komplement hrají ve vstupu mykobakterií do nitra buňky také receptory pro Fc fragment molekul imunoglobulinů. Dominantním receptorem makrofágů pro interakci s bakteriemi je molekula CD14. Molekula CD14 je membránový protein, vázaný fosfatidylinositolovou cukernou kotvou, který slouží jako vysokoafinní receptor pro vazbu komplexů LPS-LBP (lipopolysacharide-binding protein). Prostřednictvím této cesty dochází k mohutné aktivaci monocyto-makrofágových buněk a k výrazné produkci pluripotentních prozánětlivých cytokinů, zvláště TNFa. Přestože dosud nebyla v mykobakteriální stěně prokázána přítomnost LPS, mohou mykobakterie interagovat s molekulou CD14 prostřednictvím lipoarabinomananu. Poslední skupinou receptorů, vyjádřených na monocyto-makrofágových buňkách, které mohou zesilovat vstup mykobakterií do nitra buňky, jsou tzv. scavenger receptory, které vážou polyaniontové makromolekuly, včetně lipopolysacharidu a lipoteichoové kyseliny bakteriální stěny gram-pozitivních bakterií (4). Zcela nedávno byla na lidských buňkách objevena skupina receptorů, které jsou fylogeneticky vysoce konzervované a jejich homology byly původně nalezeny u rodu Drosophila. Tyto receptory se označují jako Toll-like receptory. Toll-like receptory využívají nitrobuněčné signální cesty, které jsou typické pro působení interleukinu-1. Přenos aktivačního signálu ústí v aktivaci transkripčního faktoru NF-kB, který reguluje přepis pro buňku důležitých genů. Extracelulární část receptorů Toll nemá žádnou strukturní

5 podobnost s extracelulárními doménami IL-1R. Toll-like receptory na sebe vážou lipopolysacharidy, ale také mykobakteriální lipoproteiny a lipoglykany. Jejich aktivaci mohou způsobit i stresové proteiny hsp60. Aktivací NF-kB dochází k zesílenému přepisu genů pro cytokiny, které ovlivňují T buněčnou odpověď i syntézu oxidu dusnatého, jehož produkty jsou výrazně mykobaktericidní. Lze uzavřít, že mykobakterie využívají simultánně různé receptory na makrofázích pro svůj vstup do nitra buňky (20, 25). Aktivovaný makrofág je nejvydatnějším zdrojem pluripotentních a prozánětlivých cytokinů, které spolu s chemotakticky aktivními cytokiny určují tvorbu tzv. granulomu. Působením uvolněných cytokinů dochází ke změnám v adhezních vlastnostech leukocytů, je zesílena produkce monocyto-makrofágových buněk v kostní dřeni působením M-CSF. Monocyto-makrofágové buňky spolu s T lymfocyty pronikají mimo cévní řečiště a ohraničují infekční ložisko, obsahující mykobakterie. Selektivní migraci mononukleárních buněk a tvorbu granulomu regulují chemokiny ze skupiny C-C, například MCP1, MIP1a, RANTES. Mikroorganizmy jsou uvnitř granulomu inhibovány v růstu nebo i usmrcovány sníženým ph prostředí a snížením obsahu kyslíku. Intracelulární množení mykobakterií závisí na jejich schopnosti uniknout destrukci lysozomálními enzymy, reaktivními produkty kyslíku a dusíku. Klíčová pro přežití mykobakterií je jejich schopnost blokovat fúzi fagozómů s lysozómy. Mykobakteria jsou navíc schopna omezovat zpracování a prezentaci antigenních peptidů T lymfocytům. Makrofágy usmrcují mykobakterie pouze po aktivaci cytokiny, které jsou produkovány T lymfocytárním systémem. Cidní aktivita makrofágů výrazně vzrůstá především působením INFg a TNFa, které jsou secernovány subsetem TH1 T lymfocytů. Jejich vlivem se, mimo jiné, aktivuje NADPH oxidáza a s ní spojená tvorba reaktivních intermediárních forem kyslíku. Tyto cytokiny rovněž stimulují inducibilní formu NO syntázy (inos), která vede k produkci reaktivních intermediárních produktů dusíkového metabolizmu. Naopak aktivita inos je výrazně tlumena v přítomnosti cytokinů IL-10, IL-4 a TGFb. Tyto cytokiny jsou produkovány jednak subsetem TH2 T lymfocytů, jednak subsetem T lymfocytů se schopností tlumit aktivitu subsetu TH1, někdy označovaným jako Tc3. Jsou popsány rozdíly v cidní aktivitě plně diferencovaných plicních makrofágů, která je obvykle mnohem větší v porovnání s mykobaktericidní aktivitou mononukleárních fagocytů, které do plicního kompartmentu migrují v průběhu imunitní odpovědi z periferní krve, kam se ve zvýšené míře uvolňují z kostní dřeně, pod vlivem regulačních cytokinů. Tyto ne zcela diferencované monocyto-makrofágové buňky nejsou schopny usmrtit mykobakterie, stávají se místem rychlé replikace mykobakterií a mohou přispět i k jejich šíření v těle (viz obr.) (13). Pozdní fáze imunologické odpovědi Jak již bylo několikrát zdůrazněno, protektivní imunitní odpověď proti M. tuberculosis vyžaduje zapojení specifické, buňkami zprostředkované imunity. Aktivace této větve imunity je zajištěna makrofágy prostřednictvím cytokinů, které jednak zesilují vyzrávání T lymfocytů, jednak mění jejich povrchové vlastnosti tak, aby mohly pod vlivem C-C a C chemokinů (RANTES, lymphotactin) cíleně migrovat do míst s probíhající infekcí (21). Významná úloha v obraně proti M. tuberculosis je přisuzována populaci T

6 lymfocytům s receptorem pro antigen typu gd (24). Tato u člověka minoritní populace buněk sehrává úlohu na rozhraní mezi přirozenou a specifickou, buňkami zprostředkovanou imunitou. Akumulace T lymfocytů s TcR gd byla prokázána v infekčních lézích nemocných trpících leprou (17). Velmi zajímavý je nález zvýšeného podílu TcR gd+ T lymfocytů u zdravých osob s výraznou kožní reaktivitou v Mantoux testu, které byly v dlouhodobém kontaktu s pacienty infikovanými M. tuberculosis. Antigenní fragmenty jsou TcR gd+ T lymfocytům prezentovány po vazbě na non-hla molekuly, například CD1. Odlišná je také chemická podstata antigenů, jejichž fragmenty jsou TcR gd+ T lymfocyty schopny rozpoznávat. Jedná se, mimo běžné proteiny, i o neproteinové fosforylované sloučeniny, obsahující například isopentenylpyrofosfát, prenylpyrofosfáty, sloučeniny jako kyselina mykolová a lipoarabinomanan, které jsou produkovány mykobakteriemi a zřejmě také antigenní fragmenty vzniklé zpracováním stresových proteinů. U člověka TcR gd+ T lymfocyty představují největší populaci T lymfocytů, reagujících s mykobakteriemi, nacházejícími se v krvi. Fenotypově se jedná především o CD4-/CD8- T lymfocyty, část nese fenotyp CD8+ cytotoxických T lymfocytů. Drtivá většina TcR gd T lymfocytů exprimuje TcR kódovaný genovými segmenty typu Vg 9 Vd 2. Tyto T lymfocyty proliferují po stimulaci mykobakteriálními antigeny a uvolňují cytokiny (6). Bylo zjištěno, že u osob s progredující aktivní tuberkulózou dochází ke snížení zastoupení i funkční aktivity T lymfocytů gd+ a jejich podíl opět vzrůstá po úspěšné terapii. Buňkami zprostředkovaná imunita, zajišťovaná TcR ab T lymfocyty, se plně rozvíjí po cca 3 týdnech od začátku infekce. Její působení má výraznou dynamiku a je spojeno jak s eliminací mykobakteriální infekce, tak s poškozením infikovaných tkání cytotoxickou reakcí v průběhu imunitní odpovědi. Uzdravení nemocného je spojeno s vyváženou a dobře časovanou aktivitou subsetů TH1 a TH2 T lymfocytů (8). Význam TH1 T lymfocytů v antimykobakteriální imunitě je velmi dobře dokumentován. Preferenční vyzrávání prekurzorových TH0 T lymfocytů do subsetu TH1 je zesilováno v přítomnosti IL-12, který je produkován aktivovanými monocyto-makrofágovými buňkami. Úloha IL-12 pro vznik a rozvoj cytotoxické TH1 aktivity v obraně proti mykobakteriální je doložena v myším modelu, u něhož je vyřazen gen pro IL-12. U těchto experimentálních zvířat dochází k diseminaci mykobakteriální infekce a k neschopnosti vytvářet granulom. Nemocní s geneticky podmíněným defektem IL-12R jsou mimořádně vnímaví vůči mykobakteriálním infekcím, projevuje se u nich celkové onemocnění po aplikaci vakcinačního kmene BCG (2). Jejich T lymfocyty si však uchovávají schopnost produkovat INFg, byť ve velmi nízkém množství. Podobnou úlohu, jako IL-12, má i IL-18, který rovněž potencuje vyzrávání TH1 T lymfocytů a indukuje i tvorbu INFg. Klíčovými cytokiny, které jsou tvořeny subsetem TH1 T lymfocytů je INFg a TNFb. Tyto cytokiny výrazně potencují cytotoxické mechanizmy makrofágů. Nejzávažnější důkazy o úloze INFg v obraně proti mykobakteriím byly získány studiem osob s primární imunodeficiencí, způsobenou buď neschopností produkovat INFg nebo s nefunkčním receptorem pro INFg. Takto geneticky postižené osoby mají výrazně zvýšenou vnímavost na mykobakteriální infekce a diseminovaným formám mykobakteriálních infekcí i přes aplikaci rekombinantního INFg nakonec podléhají (9). Diferenciace funkčně odlišných subsetů T lymfocytů je, kromě cytokinového mikroprostředí, určována mnoha dalšími proměnnými faktory. Z nich je zřejmě na prvním místě třeba zdůraznit úlohu kostimulačních interakcí, o kterých je pro model infekce intracelulárními patogeny k dispozici největší množství informací. Bez současné kostimulační interakce jsou T lymfocyty, které rozpoznaly antigen prostřednictvím TcR anergizovány, či dokonce hynou apoptózou. Exprese kostimulačních molekul prodělává kvalitativní i kvantitativní změny. S jistými omezeními je uzavíráno, že kostimulační interakce mezi molekulami CD28 T lymfocytů a B7-1 (CD80) antigen prezentujících buněk vede k preferenčnímu vyzrávání TH0 T lymfocytů do subsetu TH1. Interakce mezi molekulami CD28 a B7-2 (CD86) vede k vyzrávání do subsetu TH2. V myším modelu infekce L. major kostimulace zprostředkovaná interakcí B7 a CTLA-4 (CD152), která antagonizuje kostimulační interakci mezi CD28 a B7, vede ke snížení aktivity subsetu TH1 a omezení protekce. O alternativních drahách kostimulace, jako je například interakce mezi molekulou CD40, patřící do rodiny TNFa/TNFaR a CD40L, je zatím v lidském systému málo informací. Budou však zřejmě sehrávat úlohu v obraně proti mikrobům s intracelulárním parazitizmem. U nemocných s defektem signální cesty CD40-CD40L (CD154) byla zjištěna vyšší vnímavost vůči těmto mikrobům, způsobená sníženou produkcí IL-12 a INFg. Informace o vlivu dalších faktorů určujících diferenciaci TH0 T lymfocytů do subsetů TH1 a TH2, například rozdílů v expresi receptorů pro chemokiny, či aktivace cestou rozdílných nitrobuněčných transkripčních faktorů z rodiny STAT, nejsou zatím u infekce M.

7 tuberculosis k dispozici (16). Cytotoxická aktivita monocyto-makrofágových buněk a T lymfocytů je bezesporu nezbytná k eliminaci mykobakteriální infekce a k uzdravení jedince. Tato cytotoxická reaktivita je však spojena s destrukcí buněk a tkání. Poškození plicní tkáně, které je pro TBC charakteristické, je nevyhnutelným důsledkem obranné reakce. Vyváženost obranného a poškozujícího zánětu reguluje subset TH2 T lymfocytů prostřednictvím cytokinu IL-4 a subset Tc3 T lymfocytů produkcí protizánětlivých cytokinů IL-10 a TGFb. Reaktivita buňkami zprostředkované specifické imunity jedince je bezesporu dána jeho genetickou dispozicí. Některé genové systémy, zahrnuté do této imunologické reaktivity, jsou polymorfní. Dobrým příkladem, který by mohl být relevantní pro patogenezi mykobakteriálních infekcí, je polymorfie v genu pro TNFa. Nevyvážená TH1 reaktivita, způsobená genovou dispozicí a jistě také shodou negenetických faktorů, může vést k přesmyku obranného zánětu v zánět poškozující (11). Buňkami zprostředkovaná imunita dosahuje ontogeneticky vrchol v časné dospělosti. Zřejmě ne náhodou byla v dřívějších dobách nejvyšší úmrtnost na infekci M.tuberculosis právě v této věkové kategorii, kde zánětlivá reakce může být spojena s masivní destrukcí tkání. Výsledkem imunitní reakce proti infekci M. tuberculosis je za optimálních podmínek eliminace infekce s minimálním poškozením funkční tkáně, vyhojení granulomu a vznik jizev. Tak tomu je pravděpodobně u většiny osob. Proces hojení, reparace s obnovou funkce, popřípadě remodelace se ztrátou funkce, je třeba vnímat jako terminální fázi zánětu. Především buňky imunitního systému působením cytokinů modulují například angiogenetické procesy (PDGF-1, VEGF, EGF), stimulují fibroblasty k tvorbě molekul mezibuněčné hmoty a bazální membrány cév (FGF) a přispívají k reparaci cytokiny s povšechně anabolickou aktivitou (IGF). Tato fáze obranné reakce nebyla u mykobakteriálních infekcí člověka dosud soustavně studována (27). U části nemocných imunitní reaktivita neumožňuje úplnou eliminaci mikrobů. Mikroby dále přežívají uvnitř buněk, především mononukleárních fagocytů, jejich množení je však pod kontrolou imunitního systému. Za situace, kdy je buňkami zprostředkovaná specifická imunita oslabena, může dojít k reaktivaci tohoto procesu. U malé části infikovaných je imunitní odpověď neúčinná, infekce M. tuberculosis se šíří prostřednictvím ne zcela vyzrálých makrofágů. Dlouhodobým působením akumulovaných mononukleárních buněk, které jsou součástí granulomu, vznikají kaverny a M. tuberculosis se může uvolňovat do sputa. Za těchto podmínek se nemocný stává velmi nebezpečným zdrojem infekce. Infekce se šíří do regionálních lymfatických uzlin a odtud se může hematogenní cestou rozsévat. Infekce M. tuberculosis je schopna tlumit specifickou buňkami zprostředkovanou imunitu. Jednoduše to lze demonstrovat na velikosti odpovědi v kožním testu opožděné přecitlivělosti po aplikaci PPD. Kožní reakce je u nemocných s aktivní, neléčenou tuberkulózou malá, nebo dokonce chybí. Po úspěšné léčbě dochází ke zvětšení kožní DTH reaktivity. Analýzou spektra cytokinů produkovaných lymfocyty periferní krve nemocných s infekcí M. tuberculosis, stimulovaných in vitro PPD, byla nalezena významně nižší produkce INFg, zároveň se zvýšenou tvorbou IL-10 a TGFb. Biologicky aktivní forma TGFb byla ve zvýšené míře prokázána i v bronchoalveolární lavážní tekutině nemocných s pokročilou plicní formou TBC. TGFb je multifunkční cytokin produkovaný i buňkami mimo imunitní systém. Z jeho pleiotropního účinku na imunitní systém vybíráme schopnost blokovat expresi molekul HLA II. třídy a proliferaci T a B lymfocytů. TGFb tlumí syntézu INFg a TNFa, indukuje fibrotické a remodelační procesy v plicní tkáni. Nezodpovězena je dosud otázka, zda výše popsané změny specifické buněčné imunity predisponují pro onemocnění způsobené M. tuberculosis, nebo se jedná o sekundární změny, způsobené mykobakteriální infekcí. Hledat bude třeba i individuální imunologické a genetické markery vnímavosti či rezistence vůči M. tuberculosis (23). Poděkování: Autoři děkují Janě Hrdinové za pomoc při sestavování rukopisu. Práce byla z části prezentována jako přednáška na 8. severočeském imunologickém semináři v Ústí nad Labem. Práce byla realizována s podporou MŠMT ČR, projekt č. LN00AO33: Proteinové centrum pro studium intracelulárního parasitismu bakterií.

8 LITERATURA 1. Abel, L, Sanchez, FO, Oberti, J, et al. Susceptibility to leprosy is linked to the human NRAMP1 gene. J. Infect. Diseases, 1998; 77: Altare, F, Durandy, A, Lammas, D, et al. Impairment of mycobacterial immunity in human interleukin-12 receptor deficiency. Science, 1998; 280: Bellamy, R, Ruwende C Corrah, T, et al. Variations in the NRAMP1 gene and susceptibility to tuberculosis in West Africans. New Eng. J. Med., 1998; 338: Borregaard, N, Elsbach, P, Ganz, T, et al. Innate immunity: from plants to humans. Immunol. Today, 2000; 21: Brändli, O. The clinical presentation of tuberculosis. Respiration, 1998; 65: Carding, SR, Egan, PJ. The importance of gd T cells in the resolution of pathogen-induced inflammatory immune responses. Immunol. Rev., 2000; 173: Cocito, C, Maes, H. Immunological relatedness of the protective mechanisms against tuberculosis and cancer. Eur. J. Clin. Invest., 1998; 28(1): Cooper, AM, Flynn, JL. The protective immune response to Mycobacterium tuberculosis. Cur. Opin. Immunol., 1995; 7: Dorman, SE, Holland, SM. Mutation in the signal-transducing chain of the interferon-gamma receptor and susceptibility to mycobacterial infection. J. Clin. Invest., 1998; 101: Ellner, JJ. Regulation of the human immune response during tuberculosis. J. Lab. Clin. Med., 1997; 130: Engwerda, ChR, Kaye, PM. Organ-specific immune responses associated with infectious disease. Immunol. Today, 2000; 21: Ernst, JD. Macrophage receptors for Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun., 1998; 66: Fenton, MJ, Vermeulen, MW. Immunopathology of tuberculosis: roles of macrophages and monocytes. Infect. Immun., 1996; 64: Frieden, TR, Lerner, BH, Rutherford, BR. Lessons from the 1800s: tuberculosis control in the new millennium. Lancet, 2000; 355: Herzog, H. History of tuberculosis. Respiration, 1998; 65: Hunter, ChA, Reiner, SL. Cytokines and T cells in host defense. Cur. Opin. Immunol., 2000; 12: Jacobson, RR, Krahenbuhl, JL. Leprosy. Lancet, 1999; 353: Lindahl, G, Sjöbring, U, Johnsson, E. Human complement regulators: a major target for pathogenic microorganisms. Cur. Opin. Immunol., 2000; 12: Medzhitov, R, Janeway, Ch. Innate immune recognition: mechanisms and pathways. Immunol. Reviews, 2000; 173: Modlin, R, Rickinson, A. Immunity to infection. Cur. Opin. Immunol., 2000; 12: Orme, IM, Cooper, AM. Cytokine/chemokine cascades in immunity to tuberculosis. Immunol. Today, 1999; 20: Ozuah, PO, Burton, W, Lerro, KA, et al. Assessing the validity of tuberculin skin test readings by trained professionals and patients. Chest, 1999; 116: Rook, GAW, Stanford, JL. Give us this day our daily germs. Immunol. Today, 1998; 19: Saunders, BM, Frank, AA, Cooper, AM, Orme, IM. Role of gd T cells in immunopathology of pulmonary Mycobacterium avium infection in mice. Infect. Immun., 1998; 66: Schuster, JM, Nelson, PS. Toll receptors: an expanding role in our understanding of human disease. J. Leukoc. Biol., 2000; 67: Sullivan, AL. Tuberculin skin testing. Chest, 1999; 115: Vaday, GG, Lider, O. Extracellular matrix moieties, cytokines, and enzymes: dynamic effects of immune cell behavior and inflammation. J. Leuk. Biol., 2000; 67: WHO. Framework for effective tuberculosis control. Geneva: WHO, WHO/TB/94.179, Zhang, P, Summer, WR, Bagby, GJ, Nelson, S. Innate immunity and pulmonary host defense. Immunol. Rev., 2000; 173:

9 doc. RNDr. Jan Krejsek, CSc. Ústav klinické imunologie a alergologie Fakultní nemocnice Hradec Králové ukia@fnhk.cz