Praktická cvičení z biologie Zimní semestr

Transkript

1 Univerzita Palackého v Olomouci Ústav biologie, Lékařská fakulta Praktická cvičení z biologie Zimní semestr Olomouc 2014

2 Podpořeno projektem EU: Implementace laboratorní medicíny do systému vzdělávání na Univerzitě Palackého v Olomouci, reg. č. CZ.1.07/2.2.00/ kolektiv autorů, Ústav biologie LF UP Olomouc 2 v

3 Obsah 1. Úvodní praktické cvičení Náplň předmětu Bezpečnostní pokyny Organizační pokyny Studijní materiály Mikroskopická technika Základy pozorování mikroskopických objektů Měření délky mikroskopických objektů (demonstračně) Měření výšky mikroskopických objektů Určení rozlišovací schopnosti mikroskopu Fluorescenční mikroskopie (demonstračně) Mikroorganismy Demonstrace: Zhodnocení nárůstu po odkryvu misek Demonstrace: Kultivace bakterií, kultivace kvasinek Bakterie ústní dutiny Prokaryontní buňka v nativním preparátu Prokaryontní buňka v trvalém preparátu Lidský vlas napadený dermatofytem Struktura buněk, kultivace savčích buněk Stanovení životaschopnosti (viability) buněk ve tkáňových kulturách Určení morfologického typu savčích buněk a manipulace s buněčnou kulturou Pozorování suspenzní buněčné kultury Pozorování kolonií krevních buněk na polotuhém médiu Genetická informace a její změny Replikace Transkripce Translace Transkripce a translace Komplementarita tripletů Alfa a beta globinový gen Beta globinový gen Genové mutace Mechanismus účinku chemomutagenu Hemoglobin srpkovité anémie Patologický hemoglobin HbC Posunová mutace Spontánní mutace v kultuře bakterií v

4 5.14 Mutace a kancerogeneze Proteiny Pozorování precipitovaného patologického hemoglobinu na trvalém preparátu Demonstrace: Detekce hemoglobinopatie pomocí gelové elektroforézy Imunohistochemická detekce buněčně specifického proteinu Důkaz hemoglobinu Enzymy Stanovení ph optima aktivity kyselé fosfatázy Průkaz slinné amylázy člověka Průkaz peroxidázy v krvi Biomembrány a osmóza Rozpad plazmatické membrány erytrocytů chemická hemolýza Změna tvaru krvinek v hypertonickém prostředí Průběh plazmolýzy a deplazmolýzy Vznik nadmolekulární struktury autoorganizací Traubeho měchýřek Buněčný cyklus, mitóza Analýza buněčného cyklu pomocí průtokové cytometrie Odhadování obsahu jaderné DNA pomocí světelného mikroskopu Mitóza rostlinné buňky Dělení buněk pučením Meióza a gametogeneze Meióza a spermatogeneze u sarančete Spermatogeneze u člověka Vliv cytostatika na spermatogenezi Buněčná diferenciace a apoptóza Rýhování zygoty a vývoj zárodku Měření aktivity kaspázy Pozorování morfologických změn u apoptotických buněk Biologie krve. Krevní elementy Odečet krevního diferenciálu Krevní nátěry Pozorování kolonií krevních buněk na polotuhém médiu Indukce diferenciace nádorových buněk linie K Onkogeny a tumor-supresorové geny (prezentace studentů) v

5 1. Úvodní praktické cvičení 1.1 Náplň předmětu Náplní zimního semestru je buněčná biologie stručná charakteristika mikroorganismů, dále biologie živočišné buňky. Učivo navazuje na gymnaziální biologii. 1.2 Bezpečnostní pokyny Studenti jsou povinni dbát pokynů vyučujícího, s elektrickými vodiči a přístroji zapojenými do elektrické sítě je nutno manipulovat se zvýšenou opatrností. Mimořádné události poranění, rozbití jakéhokoli skla (včetně preparátu), rozlití roztoku, poruchu přístrojů atd. studenti neprodleně nahlásí vyučujícímu. Rozbité sklo se vyhazuje do označené nádoby mimo běžný odpad. V učebně pro praktická cvičení je zakázáno jíst a pít. V učebně se chováme tak, abychom předcházeli případným nehodám. Batohy a tašky na stůl ani do uličky mezi stoly nepatří. 1.3 Organizační pokyny Do učebny přicházejí studenti přezuti, v bílém ochranném plášti a včas. Studenti jsou povinni nastudovat téma pro příslušné cvičení. Student je osobně odpovědný za svěřené přístroje, nástroje, preparáty a další pomůcky. Každý student má své stálé pracovní místo. Z každého cvičení student vypracuje protokol, který obsahuje: 1. název tématu cvičení a datum 2. pro každou úlohu zvlášť protokol obsahuje: a. název úlohy b. materiál, pomůcky c. postup (stručně, heslovitě) d. výsledek e. závěr Nahrazení zameškaného praktika je možné ve stejném výukovém týdnu po domluvě s vyučujícím, případně na konci semestru. Na konci semestru lze nahradit nejvýše 5 cvičení. Náhradu více než 5 cvičení na konci semestru musí schválit studijní oddělení. 1.4 Studijní materiály Jako studijní materiály pro zimní semestr slouží toto skriptum, dále prezentace ze cvičení a prezentace z přednášek (vše je průběhu semestru dostupné na webu Ústavu biologie). Kromě těchto výukových materiálů je doporučeno nastudovat příslušné kapitoly z učebnice Alberts, Bray, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter: Základy buněčné biologie. 5 v

6 2. Mikroskopická technika Cíl cvičení Seznámit se s ovládáním mikroskopu, osvojit si základy správného mikroskopování, správného záznamu pozorování v mikroskopu, pochopit souvislosti nastavení jednotlivých parametrů mikroskopu s kvalitou obrazu u různých druhů pozorovaných objektů. 2.1 Základy pozorování mikroskopických objektů Materiál Optický mikroskop, podložní a krycí skla, mech měřík (Mnium sp.) nebo akvarijní rostlina Elodea canadensis nebo Egeria densa, suspenze fixovaných buněk linie K562, nůžky, pinzeta, Pasteurova pipeta, automatická pipeta, špičky. 1) Příprava nativního preparátu Na čisté podložní sklo nakápněte kapku vody. Z lodyžky mechové rostlinky utrhněte jeden lístek, pomocí pinzety nebo preparační jehly ho ponořte pod hladinu kapky a překryjte podložním sklem. Odstraňte přebytečnou tekutinu ústřižkem buničiny, aby krycí sklo neplavalo, ale ne příliš, aby pod krycím sklem nevznikly prázdné plochy bez vody. 2) Zaostření objektivem 10 zvětšujícím a) Zapněte osvětlení mikroskopu, otáčením šroubu pro hrubý posuv ( makrošroub ) snižte stolek a zařaďte do optické osy objektiv 10 zvětšující. Na stolek upevněte preparát a nastavte ho tak, aby byl lístek v ose paprsků, vycházejících z kondenzoru. Lístek lépe uvidíme, když zesílíme jas žárovky. Nastavte aperturní clonu na kondenzoru do přibližné pozice pro příslušný objektiv. b) Otáčením šroubu pro hrubý posuv posuňte stolek mikroskopu úplně nahoru. Pozorujte obraz v okulárech mikroskopu a zároveň postupně otáčejte šroubem pro hrubý posuv (stolek se bude pomalu posouvat dolů) až do chvíle, kdy přibližně zaostříte. U objektivu 10 zvětšujícího je vzdálenost mezi objektivem a preparátem větší a nemusíte se obávat, že byste při zaostřování poškodili preparát nebo objektiv vzájemným nárazem. c) Šroubem pro jemný posuv ( mikrošroub ) doostřete. Pokud je obraz příliš jasný (přezářený), ztlumte jas žárovky točítkem v noze stativu. Posunem stolku upravte polohu preparátu tak, aby obraz buněk lístku zcela vyplňoval zorné pole. 3) Plynulý přechod na vyšší zvětšení a) Pozorovaný objekt nastavte do středu zorného pole a můžete postupně přecházet na jiná zvětšení (objektivy 20 a 40 zvětšující; případně imerzní objektiv 100 zvětšující). Všechny objektivy jsou plynule zaměnitelné, takže při přechodu na jiná zvětšení pouze otáčíte revolverovým měničem a tím měníte objektiv. Při zařazení objektivu do optické osy mikroskopu revolverový měnič jemně zacvakne v této pozici. Imerzní objektiv zatím nepoužívejte. b) Uvědomte si, že více zvětšující objektiv poskytuje obraz s menší hloubkou ostrosti. Při přechodu na vyšší zvětšení je třeba následně doostřit obraz šroubem pro jemný posuv. Upravte nastavení clony na kondenzoru podle použitého objektivu. Pokud je obraz příliš jasný nebo tmavý, upravte jas žárovky točítkem v noze stativu mikroskopu. 4) Význam správného nastavení mikroskopu pro optimální zobrazení 6 v

7 a) Zařaďte do optické osy mikroskopu objektiv 40 zvětšující, doostřete a nastavte správně clonu na kondenzoru, upravte jas žárovky. Nyní si všimněte obrazu v mikroskopu jak vypadají jednotlivé chloroplasty, jak vidíte buněčnou stěnu. b) Nastavte clonu kondenzoru do krajní pozice (pro objektiv 4 zvětšující) a úbytek světla kompenzujte regulací jasu žárovky. Porovnejte obraz s předchozím (správným) zobrazením. c) Nastavte clonu kondenzoru do krajní pozice (pro objektiv 100 zvětšující) a přebytek světla kompenzujte regulací jasu žárovky. Porovnejte obraz se správným zobrazením buněk. Zapište pozorované rozdíly. d) Nativní preparát mechu sundejte ze stolku mikroskopu (stolek nechejte v posledně nastavené poloze, nesnižujte ho) a tento preparát si zatím odložte. Nyní místo nativního preparátu mechu použijeme suspenzi fixovaných buněk buněčné linie K562. Na čisté podložní sklíčko naneseme automatickou pipetou 10 µl buněčné suspenze fixovaných nebarvených buněk. Kapku překryjte krycím sklíčkem. Stolek mikroskopu nesnižujte ani jej nezvedejte. Použijte objektiv 10 nebo 20 zvětšující pro zaostření pokud jste stolek mikroskopu neposunuli dolů nebo nahoru, stačí doostřit šroubem pro jemný posuv. Upravte správně clonu kondenzoru (na hodnotu odpovídající použitému objektivu) a jas žárovky. Všimněte si, jaké struktury jste schopni rozeznat v nebarvené buňce. Nyní nastavte clonu kondenzoru postupně do obou krajních poloh a změny v intenzitě osvětlení kompenzujte regulací jasu žárovky stejně jako v bodech 4b), 4c). Zapište výsledky pozorování. 5) Do protokolu zodpovězte tyto otázky: Jaký je vztah mezi odcloněním/přicloněním a zobrazením barevných objektů (lístek mechu)? Jaký je vztah mezi odcloněním/přicloněním a zobrazením nebarevných objektů (nebarvené buňky linie K562)? Jaký je vztah mezi odcloněním/přicloněním a kontrastem obrazu? Jaký je vztah mezi odcloněním/přicloněním a hloubkou ostrosti? Pozn.: pro správné posouzení změn hloubky ostrosti je nutné pozorovat dostatečně silný objekt při zvětšení 40. Jaký vliv má zesílení nebo zeslabení zdroje světla na všechny výše zmíněné parametry obrazu (zobrazení barevných a nebarevných objektů, kontrast a hloubku ostrosti)? Jaký je vztah mezi použitým zvětšením a částí preparátu, která je zobrazena v zorném poli okuláru? 6) Výstižný a nezkreslený záznam pozorování Vezměte opět nativní preparát mechu a na základě souvislostí poznaných v bodě 4) nastavte optimální zobrazení pozorovaného objektu (rostlinného pletiva lístku) a zakreslete do protokolu. Respektujte následující zásady pro výstižný a nezkreslený záznam pozorování: pokud se objekt pozorování skládá ze stejných objektů (např. pletivo z buněk), zaznamenávejte obraz jen jednoho objektu obraz kreslete dostatečně velký (na formátu A4), využijte celou šířku stránky protože se zobrazení objektu mění se změnou parametrů optického systému, zaznamenávejte jen charakteristické vlastnosti, které jsou málo závislé na nastavení mikroskopu př.: nemá smysl zachycovat vzhled buněčné stěny stínováním, vystihujícím momentální 7 v

8 kontrast obrazu; smysl má jednoduchá čára (resp. dvojčára) jako reprezentativní obraz buněčné stěny (jde nám o záznam schematicky věrného obrazu, nikoli o přesnou reprodukci nebo uměleckou impresi) při záznamu sledujte a zachovávejte správné proporce má-li např. v obraze kulovitý chloroplast průměr cca dvojnásobný oproti tloušťce buněčné stěny, musí být tento poměr správně reprodukován i ve schematickém nákresu; je-li např. při okrajích buňky více chloroplastů než ve středu, zachovejte tuto distribuci i ve svém nákresu (přesná poloha jednotlivých chloroplastů samozřejmě nemusí být reprodukována, v každé buňce je jiná) není nutné zaznamenávat objekty barevně; stačí černobílý nákres se slovní poznámkou o barevnosti objektů je správné zaznamenat ke každému obrázku celkové zvětšení mikroskopu (uvědomte si však, že jste obraz dále sekundárně subjektivně zvětšili při záznamu na papír) 2.2 Měření délky mikroskopických objektů (demonstračně) Materiál Optický mikroskop s digitální kamerou a software pro analýzu obrazu, podložní a krycí skla, mech měřík (Mnium sp.) Moderní mikroskopy mohou být vybaveny digitální kamerou a software pro analýzu obrazu, které umožňují zaznamenávat obraz skládající se z jednotlivých obrazových bodů (pixelů). Podle rozlišení tohoto systému se obraz skládá z většího či menšího počtu obrazových bodů. S použitím vhodného software pak můžeme určit velikost struktur i jejich plochu (software zaznamená počet obrazových bodů na délku nebo plošně). Skutečná velikost obrazového bodu je relativní závisí na použitém zvětšení mikroskopu. Pro každý objektiv je nutné po instalaci software provést kalibraci pomocí objektivního měřítka (jako měřítko slouží podložní sklo s vyrytými vrypy o rozestupech 10 µm). S použitím konkrétního objektivu zobrazíme pomocí software obraz tohoto měřítka na monitoru počítače. Dále pomocí myši označíme vybraný počet dílků měřítka (např. 40 dílků; každý dílek měří 10 µm) a jako údaj pro kalibraci objektivu uvedeme, že délka zvoleného objektu je 400 µm (40 10). Systém zaznamená počet obrazových bodů, odpovídající při daném zvětšení a rozlišení např. vzdálenosti úsečky 400 µm. Přepočtem poté program určí relativní velikost obrazového bodu (při použití tohoto konkrétního objektivu) a přepočítá velikost struktur při vlastním měření na hodnotu uvedenou v µm podle toho, kolika obrazovým bodům odpovídá velikost určitého objektu. Tento postup je třeba zopakovat pro všechny objektivy mikroskopu. Pokud již máme celý systém nakalibrovaný, můžeme jednoduchým způsobem měřit velikost objektů pozorovaných v mikroskopu pomocí software myší klikneme na ikonu měření objektů, dále ve vyfotografovaném obrazu označíme počátek a konec měřeného objektu a do objektu se automaticky vloží úsečka s údajem o délce měřené struktury. Je však třeba vždy před měřením zkontrolovat, zda jsme v software správně zvolili použitý objektiv. 8 v

9 2.3 Měření výšky mikroskopických objektů Materiál: Optický mikroskop, podložní a krycí skla, mech měřík (Mnium sp.) : a) Na stolek mikroskopu znovu umístěte nativní preparát mechu měříku. Zaostřete nejprve objektivem 10 zvětšujícím a poté otáčením revolverového měniče vyměňte za objektiv 40 zvětšující. Nastavte správné osvětlení (nastavením clony a regulací jasu žárovky). Doostřete obraz mikrošroubem. b) Několikrát mikrošroubem otáčejte v obou směrech a všímejte si, které chloroplasty vidíte zaostřeně a které vidíte rozostřeně. Chloroplasty, které zaostříte jako první a poslední, jsou chloroplasty na úplném vrchu a spodu buňky (záleží na směru otáčení mikrošroubu, zda nejprve zaostříte chloroplasty na vrchu nebo na spodu buňky). c) Mikrošroubem zvedněte stolek mikroskopu právě tak, aby byl ostře zobrazen povrch buňky. Obraz buněčné stěny je rozmazaný, ostře jsou zobrazeny chloroplasty ve svrchní části buňky. Odečtěte polohu mikrošroubu podle stupnice na pravém mikrošroubu a rysky na pravém makrošroubu. d) Nyní pomocí mikrošroubu zaostřete na spodek buňky. Znovu odečtěte polohu mikrošroubu. Spočítejte, o kolik dílků jste pootočili mikrošroubem. 1 dílek odpovídá zdvihu/snížení stolku o 2,5 µm. Počet dílků vynásobte koeficientem 2,5 a získáte výšku buňky v µm. Praktický význam Všimněte si, že při spodním, středním a horním zaostření určité buňky získáte o této buňce různý obraz, tedy nestejné informace. Mluvíme o horní, střední a spodní rovině ostrosti. Jsou to tři hlavní optické roviny z velkého počtu možných optických rovin protínajících objekt při zvedání a snižování stolku mikroskopu. Při pozorování preparátu stále doostřujte (jemně pohybujte mikrošroubem), jinak by byla vaše informace o objektu neúplná. Nahrazujete tím akomodaci lidského oka; optická soustava mikroskopu sama akomodovat neumí. 2.4 Určení rozlišovací schopnosti mikroskopu Cíl úkolu Definovat konkrétní omezení rozlišovací schopnosti používaného mikroskopu. Určete konkrétní rozlišovací schopnost mikroskopu při použití suchých objektivů 10 a 40 zvětšujících a imerzního objektivu 100 zvětšujícího (imerzní objektiv se používá s imerzním olejem index lomu cca 1,5). 2.5 Fluorescenční mikroskopie (demonstračně) 9 v

10 3. Mikroorganismy Studijní příprava Hierarchie živých soustav podle složitosti jedinců. Buňky prokaryontní a eukaryontní. Biologie virů virion, virový genom, reprodukce virů. Virogenie. Cíl cvičení Seznámíme se s charakteristickými znaky vybraných mikroorganismů. Kontrolní otázky: 1. Jaké jsou hlavní rozdíly mezi prokaryontní a eukaryontní buňkou? 2. Jak rychlé může být dělení bakterií? Jaké jsou důsledky? (množství buněk, evoluce) 3. Mohou se viry množit v mrtvých buňkách? Zkuste vysvětlit váš závěr. 3.1 Demonstrace: Zhodnocení nárůstu po odkryvu misek Materiál Petriho misky se ztuženým kultivačním médiem (SGA nebo krevní agar), které byly před týdnem ponechány 5-15 min. odkryté (na různých místech). Příprava SGA (studenti neprovádějí): 40 g glukózy/l; 10 g peptonu/l; 0,4 g kvasničného lyzátu/l; 15 g agaru/l. Po rozmíchání se vše autoklávuje (sterilizace v páře; 15 min při 121 C). Po částečném zchladnutí (na cca C) se médium rozlije do sterilních Petriho misek (ve sterilním prostředí). Příprava krevních agarů (studenti neprovádějí): složení vychází ze ztužených kultivačních médií; po autoklávování a částečném ochlazení (na cca 50 C) je přidáno cca 5-10 % defibrinované krve. Petriho misky s kultivačním médiem byly odkryty na 5-15 min a ponechány na různých místech (např. na lavici, na parapetu, na podlaze). Po odkryvu byly misky zavřeny, popsány a loženy v termostatu s teplotou nastavenou na 37 C. Po nárůstu kolonií mikroorganismů ze achycených buněk a spor byly misky přemístěny do pokojové teploty nebo do lednice (podle míry nárůstu kolonií). Při hodnocení misky neotvíráme, hodnotíme pouze pohledem přes víko. Výsledek Zapíšeme, jaké typy kolonií mikroorganismů jsme pozorovali v miskách (např. kolonie vláknitých hub, kolonie solidní; popíšeme velikost, barvu kolonií). Snažíme se spočítat nebo alespoň odhadnout počet kolonií na misce. 3.2 Demonstrace: Kultivace bakterií, kultivace kvasinek Materiál Petriho misky se ztuženým kultivačním médiem, na které byla roztěrem naočkována bakteriální kultura (například Escherichia coli); Petriho misky se ztuženým kultivačním médiem, na které byla roztěrem naočkována kultura kvasinky rodu Candida. Naočkování bakteriální nebo kvasinkové kultury se provádí ve sterilním boxu na sterilní kultivační médium v Petriho misce. Sterilní kličku lehce otřeme o bakteriální (kvasinkovou) kolonii narostlou na kultivačním médiu a touto kličkou provedeme několik souběžných tahů po povrchu nového sterilního média. Kličku sterilizujeme ožehnutím v plameni kahanu a po jejím vychladnutí 10 v

11 provedeme opět několik souběžných tahů kličkou tak, že vycházíme přibližně z místa, kde jsme skončili první tahy kličkou. Posléze ještě můžeme postup jednou nebo dvakrát zopakovat. Petriho misku zavřeme a necháme kultivovat v termostatu při vhodné teplotě (E. coli při teplotě 37 C) několik dní (zpravidla 2-5). Komentář Zmíněný postup je užíván v mikrobiologii pro přípravu tzv. bakteriálních nátěrů; obdobně se zpracovávají i některé kvasinky (např. rodu Candida). Cílem může být např. získání jednotlivých kolonií na konci stopy nátěru. Tak můžeme dále odebrat bakterie (kvasinky) pouze z jediné kolonie a dále je kultivovat, získáváme tak bakteriální (kvasinkový) klon pocházející z jediné původní buňky. 3.3 Bakterie ústní dutiny Materiál a chemikálie Sterilní vatový tampon na špejli, sterilní fyziologický roztok (0,9% roztok NaCl), roztok karbolfuchsinu (0,025 %), mikroskopické potřeby, mikroskop. Příprava roztoku karbolfuchsinu (studenti neprovádějí): do 10 ml 70% etanolu přidáme 0,5 g krystalického karbolfuchsinu, rozdrtíme jej skleněnou tyčinkou a zamícháme. Přidáme 90 ml destilované vody. Získáme 0,5 % zásobní roztok karbolfuchsinu. Tento zásobní roztok naředíme 20 destilovanou vodou (získáme tak 0,025% pracovní roztok karbolfuchsinu). Místo krystalického karbolfuchsinu lze použít také krystalický zásaditý fuchsin; potom bychom ale při přípravě zásobního roztoku museli použít místo destilované vody 5% vodný roztok fenolu. Tampon namočíme do fyziologického roztoku. Jemně (ale dostatečně) jej přitlačíme na bukální sliznici ústní dutiny a táhlým pohybem provedeme stěr. Setřené částečky sliznice přeneseme na suché podložní sklo otiskem tamponu: tampon lehce přitlačíme k podložnímu sklu a valivým pohybem jej otáčíme tak, aby se otisknul po celém obvodu na sklo. Pozor: buňky jsou ploché a snadno se deformují. Přikápneme 0,025% roztok karbolfuchsinu. Přikryjeme krycím sklem a necháme preparát probarvit. Je třeba dát pozor na vysychání preparátu (můžeme na podložní sklíčko k okraji krycího sklíčka přikápnout kapku barviva). Pozorujeme nejdříve za půl hodiny (případně i za hodinu, podle stáří připraveného roztoku barviva), kdy začíná být dostatečné i probarvení bakterií. Při pozorování nejprve najdeme s objektivem 10 zvětšujícím oblast, kde se nachází nejvíce epiteliálních buněk zbarvených růžově až červeně; vyměníme objektiv za 40 zvětšující a pozorně prohlédneme jednotlivé epiteliální buňky. Nespěcháme při pozorování, pozorně si prohlížíme buňky v preparátu a současně jemně proostřujeme mikrošroubem; neustálé proostřování je důležité, abychom mohli vidět bakterie na povrchu buněk (bakterie jsou zbarveny temně fialově). Máme-li zaostřeno např. na jádro epiteliální buňky, nejsou již bakterie na jejím povrchu zaostřené (leží mimo hloubku ostrosti) a můžeme se mylně domnívat, že na povrchu buňky žádné bakterie nejsou. Výsledek Zakreslíme a popíšeme epitelovou buňku bukální sliznice (pokud možno nedeformovanou) i jádrem a viditelnými organelami; zakreslíme také schematicky bakterie kolonizující povrch této buňky (podle našeho pozorování). Při zhotovení nákresu dbáme na zachování poměru velikostí bakteriální buňky a epitelové buňky včetně jejích organel. 11 v

12 3.4 Prokaryontní buňka v nativním preparátu Materiál Kultura bakterií (nepatogenních), např. Clostridium butyricum (bakterie máselného kvašení); mikroskopické potřeby, mikroskop. Příprava kultury bakterií (studenti neprovádějí): Nakrájíme neloupané a nemyté brambory na kostičky (o velikosti cca 0,5 cm) a naplníme jimi asi 1 / 3 Erlenmeyerovy baňky (250 ml). Přidáme 1 g CaCO 3 a přelijeme vodou (do 2 / 3 baňky). Baňku zahřejeme na teplotu 80 C (10 min) tím usmrtíme méně odolné spory jiných druhů mikroorganismů. Baňku opatříme zátkou z buničiny a po vychladnutí kultivujeme ve tmě při pokojové teplotě. Po 2-3 dnech by mělo být přítomno dostatečné množství bakterií. V kultuře dominují bakterie Clostridium butyricum. Z kultury bakterií si připravíme nativní preparát. Preparát orientačně prohlédneme menším zvětšením (objektiv 20 zvětšující), podrobněji si bakterie prohlédneme větším zvětšením (objektiv 40 zvětšující). Ke kapce bakteriální suspenze je také možno přikápnout 0,025% roztok karbolfuchsinu. Bakterie přidáním roztoku karbolfuchsinu usmrtíme a přestanou se pohybovat, můžeme tak lépe pozorovat jejich tvar. Optimálně by byly probarveny až po min. Výsledek Do protokolu zakreslíme několik bakteriálních buněk. Všimneme si jejich tvaru a velikosti. 3.5 Prokaryontní buňka v trvalém preparátu Materiál Trvalé preparáty bakterie Escherichia coli a Staphylococcus sp. obarvené podle Grama; imerzní objektiv a olej, papírky na čočky, benzin (etanol), mikroskopické potřeby, mikroskop. Pro orientační prohlédnutí preparátu použijeme nejprve objektiv zvětšující 20, dále objektiv zvětšující 40 a s tímto objektivem doostříme. Ve výrazně obarveném bakteriálním nátěru se snažíme najít slabší vrstvu (bude se při pozorování v mikroskopu jevit jako nejsvětlejší) anebo okraje silnější vrstvy. Následně prohlížíme bakterie imerzním objektivem: pootočíme revolverový měnič objektivů, ale objektiv 100 zvětšující nezařadíme do optické osy necháme jej mírně vychýlený na krycí sklíčko kápneme 1 kapku imerzního oleje; dbáme na to, abychom olejem neznečistili objektiv 40 zvětšující nyní dokončíme zařazení imerzního objektivu do optické osy mikroskopu opatrně pootočíme revolverovým měničem objektivů tak, abychom měli imerzní objektiv ponořený do kapky oleje (revolverový měnič jemně zacvakne) nastavíme clonu na kondenzoru velmi opatrně zaostříme obraz šroubem pro jemný posuv; imerzní objektiv má velmi krátkou pracovní vzdálenost (cca 0,1 0,2 mm)!!! Nyní již nepoužívejte pro pozorování stávajícího preparátu objektiv zvětšující 40 (tento objektiv byste díky jeho krátké pracovní vzdálenosti namočili do imerzního oleje) 12 v

13 Po ukončeném pozorování vychýlíme imerzní objektiv na stranu a suchým čtverečkem buničiny velmi jemně setřeme olej z objektivu (na objektiv netlačíme). Pro dokonalé setření zbytku oleje nový kousek buničiny mírně navlhčíme etanolem a opět otřeme; nakonec čočku utřeme do sucha čistým čtverečkem buničiny. Výsledek Do protokolu zakreslíme několik bakteriálních buněk. Všimneme si jejich tvaru a velikosti. Komentář Bakterie E. coli jsou gramnegativní (G - ), bakterie rodu Staphylococcus jsou grampozitivní (G + ) bakterie. Toto barvení pouze rozlišuje bakteriální buňky na tzv. G - nebo G + podle biochemického složení buněčné stěny. 3.6 Lidský vlas napadený dermatofytem Materiál Trvalý preparát normálního lidského vlasu a vlasu napadeného in vitro dermatofytem Microsporum gypseum nebo Trichophyton ajelloi; mikroskopické potřeby. Při slabém a středním zvětšení prohlédneme preparáty zdravých lidských vlasů a vlasů napadených dermatofyty. Popíšeme rozdíly mezi normálním a napadeným vlasem. Zakreslíme část normálního a destruovaného vlasu při středním zvětšení. Výsledek Do protokolu zakreslíme vlas napadený dermatofytem. 13 v

14 4. Struktura buněk, kultivace savčích buněk Teoretický úvod Kultivace buněk a tkání in vitro (tj. tzv. ve skle, tedy ve zkumavce, mimo živý organismus) se stala rutinní a důležitou metodou v medicínském výzkumu i v diagnostické praxi. Ve výzkumu se kultivace buněk in vitro používá např. ve farmakotoxikologii, při vývoji a testování nových léčiv. V klinické praxi se např. kultivací krevních kmenových buněk standardně vyhodnocuje kvalita tzv. štěpu pro transplantaci kostní dřeně. Co jsou buněčné (příp. tkáňové) kultury? V buněčných kulturách kultivujeme buňky mimo organismus v kultivačních médiích. V tkáňových kulturách kultivujeme mimo organismus část tkáně (tzv. tkáňový explantát). V buněčných kulturách již buňky nejsou dále organizovány do podoby tkáně a rostou jednotlivě. Buňky rostou ve speciálních plastových miskách nebo lahvích buď volně v roztoku (např. různé krevní buňky) nebo se přichycují (adherují) k povrchu plastikové misky či láhve (např. fibroblasty, tj. buňky vaziva). Primární buněčná kultura je tvořena buňkami, které byly odebrány z orgánů nebo tkání a byly přímo nasazeny do kultivačního média. Takovéto buňky mohou v kulturách přežívat jen krátkou dobu (dny, max. týdny), během které se mohou dělit a diferencovat, poté zaniknou. Jako každá savčí buňka mají totiž omezený potenciál dělení, jsou smrtelné. Naopak nesmrtelné (imortalizované) buněčné linie se mohou neomezeně dlouho dělit a proto je lze tzv. pasážovat (přenesením části buněk z jedné kultivační nádoby do druhé), mají neomezený potenciál dělení. Imortalizace buněk lze dosáhnout chemickými nebo fyzikálními karcinogeny, příp. virovou infekcí. Někdy může dojít k tomuto jevu spontánně. Transformované buněčné linie jsou imortalizované a navíc vykazují vlastnosti nádorových buněk. Co obsahují kultivační média? Savčí, tedy i lidské buňky rostou in vitro v médiích, která svým složením napodobují vnitřní prostředí organizmu, a proto obsahují: zdroj energie (glukózu), minerální látky, aminokyseliny, vitamíny a některé doplňkové látky (glutathion, lipidy, aj.), sérum (nejčastěji hovězí) jako zdroj stimulačních růstových faktorů a hormonů, pufr na bázi uhličitanu a barevný indikátor citlivý na změnu ph. Do kultivačních médií také většinou přidáváme antibiotikum a antimykotikum, abychom buněčnou kulturu ochránili před bakteriální nebo plísňovou infekcí. Standardní vybavení laboratoře tkáňových kultur: Sterilní boxy s laminárním prouděním vzduchu: slouží k dodržení aseptických podmínek při manipulaci s buněčnou kulturou. CO 2 inkubátory: savčí buňky jsou kultivovány při teplotě 37 C v 5-10% CO 2 atmosféře (pro udržení neutrálního ph) a při vysoké vlhkosti prostředí. Centrifugy, sady pipet, inverzní mikroskop pro tkáňové kultury. 4.1 Stanovení životaschopnosti (viability) buněk ve tkáňových kulturách Životaschopnost buněk je jedním ze základních parametrů, které se posuzují při práci s buněčnými nebo tkáňovými kulturami. Například při zakládání buněčných kultur by viabilita buněk měla dosahovat minimálně 90 %. Jako kritérium životaschopnosti buněk se nejčastěji používá neporušenost jejich cytoplazmatické membrány. Živé buňky mají neporušenou (intaktní) cytoplazmatickou membránu, která volně nepropouští ani malé molekuly nesoucí kladný nebo záporný náboj. Pro posouzení intaktnosti se proto používají různá barviva s nízkou molekulovou hmotností, jež nesou aspoň jeden kladný nebo záporný náboj a barví buď bílkoviny, nebo DNA. 14 v

15 Takové barvivo pak obarví pouze buňky, do kterých může vniknout, tj. mrtvé buňky s porušenou membránou. Podle povahy barviva lze viabilitu buněk posuzovat buď ve světelném, nebo fluorescenčním mikroskopu. Chemikálie, biologický materiál: 2% (w/v) roztok eosinu ve vodě, dvě buněčné suspenze (buněčná linie K562 nebo HL60) jedna s viabilními buňkami, druhá ovlivněná látkou, která indukuje buněčnou smrt. : 1. Do mikrozkumavky napipetujeme 200 µl buněčné suspenze a přidáme 10 µl 2% eosinu a protřepeme. 2. Po 5 min stání při laboratorní teplotě naneseme 10 µl obarvené suspenze na podložní sklíčko, překryjeme krycím sklíčkem a přebytek tekutiny odsajeme. 3. Pozorujeme pod mikroskopem (zvětšení 100 až 200 ) alespoň 200 buněk. Živé buňky se nebarví (zeleně opaleskují), mrtvé buňky jsou zbarveny červeně. 4. Spočítáme živé a mrtvé buňky a vyjádříme procentový podíl živých buněk. 4.2 Určení morfologického typu savčích buněk a manipulace s buněčnou kulturou Buňky adherentních buněčných linií mají typicky protáhlý nebo cípatý tvar. V kulturách takto rostou např. fibroblasty (buňky vaziva), endoteliální buňky (buňky vnitřní výstelky cév) nebo buňky hladkého svalstva. Z krevních buněk adherují k povrchům monocyty. Buňky, které neadherují k povrchům a rostou v médiu volně, mají zaoblený tvar a jsou většinou odvozeny z krevních lymfocytů nebo myeloidních krevních buněk. Přichycení buněk k povrchu je zprostředkováno extracelulárními proteiny (tzv. adhezivními proteiny) a ionty vápníku. Přichycené buňky se od plastu uvolní buď mechanicky nebo enzymaticky pomocí roztoku trypsinu a EDTA. Trypsin je proteolytický enzym ze slinivky břišní, který štěpí různé typy proteinů včetně povrchových buněčných proteinů. EDTA je chelatační činidlo, které váže ionty vápníku, což vede k narušení vazby adhezivních buněčných molekul k povrchu. Chemikálie, biologický materiál Roztok trypsinu/edta v kultivačním médiu, plastové misky s kulturami savčích buněk. 1. Savčí buňky rostly na miskách v kultivačním médiu, v inkubátoru při teplotě 37 C a v 5% CO 2 atmosféře. Budeme pozorovat dva různé typy buněčných linií: volně v médiu rostoucí buňky (nepřichycené k povrchu) a buňky přichycené k povrchu plastikové misky (adherentní). 2. Odejmeme vrchní díl plastové Petriho misky a pozorujeme buňky v růstovém médiu při zvětšení 100 (10 objektivem) a při téměř úplném zaclonění. Dbáme na to, abychom objektiv nesmočili v médiu. Popíšeme a zakreslíme morfologický typ pozorovaných savčích buněk. 3. U misky s adherentní buněčnou linií odsajeme médium buničitou vatou (přiložíme ji ze strany kapky) a místo s přichycenými buňkami zakápneme 50 μl roztoku trypsinu, vyhřátého na 37 C. Po 2-5 min pozorujeme v mikroskopu jako v bodě 2. Po 5 min můžeme reakci zastavit přidáním 100 μl 1% roztoku hovězího (bovinního) sérového albuminu (BSA). 4.3 Pozorování suspenzní buněčné kultury K562 je příkladem neadherující buněčné linie. Jedná se o první lidskou imortalizovanou leukemickou linii odvozenou již v roce 1975 z krevních buněk pacientky s chronickou myeloidní 15 v

16 leukémií (CML). Buňky linie K562 mají kulatý tvar a rostou volně v médiu. Tato buněčná linie má rozsáhlé použití v buněčné a molekulární biologii, např. v testech tumorigenicity a cytotoxicity nebo pro testování protinádorových léčiv, atd. 4.4 Pozorování kolonií krevních buněk na polotuhém médiu Dělící se buňky v polotuhém médiu mají omezený pohyb, dělící se buňky vytvářejí kolonie (kolonie = potomstvo jedné dělící se buňky, klon). U krevních buněk můžeme pozorovat hemoglobinizované kolonie červených krvinek a kolonie různých typů bílých krvinek. Chemikálie, biologický materiál Metylcelulozové kultivační médium, hematopoetické (= krvetvorné) růstové faktory, prekurzory lidských krevních buněk Plastové misky s kulturami lidských krevních buněk Prekurzory lidských krevních buněk byly smíchány s metylcelulozovým médiem a do kultury byly přidány hematopoetické růstové faktory, které umožnily růst a diferenciaci krevních prekurzorů do jednotlivých krevních buněčných typů. Kolonie krevních buněk rostly na miskách v polotuhém kultivačním médiu v inkubátoru při teplotě 37 C a v 5% CO 2 atmosféře po dobu 10 až 14 dnů. Při zvětšení 100 (použití 10 zvětšujícího objektivu) budeme pozorovat různé typy kolonií krevních buněk. Zakreslíme. Otázky 1. Co obsahuje kultivační médium? 2. Jaký typ buněčných kultur se jednalo v dnešním cvičení (primární buněčné kultury nebo imortalizovaná buněčná linie)? 3. Můžeme na základě morfologického tvaru buněk odhadnout buněčný typ, příp. tkáň, ze kterého byla příslušná buněčná linie odvozena? 4. Proč jsme použili k uvolnění adherentních buněk trypsin? Literatura Vachtenheim J., Duchoň J.: Molekulární biologie pro mediky a lékaře. Karolinum Praha, v

17 5. Genetická informace a její změny Studijní příprava Paměťový systém buňky. Exprese genetické informace. Transkripce. Translace. Replikace DNA. Genetický kód. Šum v genetické informaci mutace. Mutagenní faktory. Genové mutace, jejich molekulární podstata a důsledky. Detekce mutací v molekulách DNA. 5.1 Replikace Níže uvedený obrázek znázorňuje replikační vidlici (část replikačního oka): T - G - G - C - A - T 3 A C A G T A 5 A - G - T - T 3 T - C - A - A T A C T G T A - C - C - G - T - A 5 Přiřaďte příslušné nukleotidy (označené písmeny) k odděleným polynukleotidovým řetězcům replikující se molekuly DNA. Určete, který řetězec je starý a který nový. Může replikace DNA v buňce probíhat takovým jednoduchým přiřazováním nukleotidů? Uveďte, jak se liší skutečná replikace od našeho modelu. 5.2 Transkripce a) Zařazení aminokyseliny cysteinu do bílkovinné molekuly je v nekódujícím (matričním, templátovém) vlákně DNA určeno tripletem ACA. Určete odpovídající triplet v mrna. b) Triplet TTC na nekódujícím vlákně DNA určuje aminokyselinu lysin. Určete lysinový triplet v mrna. Proč se asi sekvence genu uvádí (publikuje) v podobě přítomné na kódujícím vlákně, když se při transkripci kopíruje vlákno protější (nekódující vlákno = matriční)? 17 v

18 5.3 Translace Polypeptidový řetězec obsahuje v jednom úseku pět aminokyselin: - arginin - glycin - fenylalanin - histidin - tyrosin - a) Jaké jsou odpovídající triplety (kodóny) v mrna, když víme, že arginin je na úrovni kódujícího vlákna DNA určen tripletem AGA, glycin GGA, fenylalanin TTT, histidin CAT a tyrosin TAC? a) Kolika molekul trna je zapotřebí k zařazení těchto aminokyselin? Určete antikodóny, které obsahují. 5.4 Transkripce a translace Část polypeptidového řetězce obsahuje tuto sekvenci aminokyselin: - valin - cystein - glycin - kys. glutamová Valin je v mrna kódován tripletem GUA, cystein UGU, glycin GGC, kys. glutamová GAA. a) Jaké triplety odpovídají těmto aminokyselinám v chromozomové DNA? Vezměte v úvahu existenci obou komplementárních vláken kódujícího a nekódujícího. 5.5 Komplementarita tripletů Část molekuly inzulínu obsahuje sekvenci aminokyselin, které jsou spolu s odpovídajícími kodóny mrna uvedeny v tabulce. Uveďte, jaké triplety těmto aminokyselinám odpovídají v trna a obou vláknech DNA. aminokyselina mrna antikodon trna nekódující vlákno DNA kódující vlákno DNA leucin tyrozin leucin valin cystein glycin CUU UAU CUA GUA UGU GGU k. glutamová GAA arginin glycin fenylalanin CGU GGC UUU 5.6 Alfa a beta globinový gen Alfa globin (součást lidského hemoglobinu) je polypeptid obsahující 141 aminokyselin. Je kódován genem v chromozomu 16. Jak veliký je tento gen? (uveďte počet nukleotidů) Beta globin lidského hemoglobinu je polypeptid obsahující 146 aminokyselin. Je kódován genem v chromozomu 11. Jak veliký je tento gen? Uveďte počtem nukleotidů. 18 v

19 Odpovídá údaj o délce genu, který jste vypočítali, skutečnosti? (Záleží na definici genu rozeberte.) 5.7 Beta globinový gen Začátek beta řetězce hemoglobinu obsahuje tuto sekvenci aminokyselin: NH 2 - val his leu thr pro glu glu lys S použitím tabulky genetického kódu určete odpovídající sekvenci tripletů v genu pro beta globin v 11. lidském chromozomu. Je možná jenom jediná sekvence? Mutageneze Mutace je dědičná změna genotypu, která není podmíněna rekombinací ani segregací či jinými zákonitými procesy v rámci životního cyklu. Může se týkat jednoho genu (genová mutace), chromozomu (chromozomová mutace čili aberace) nebo celé chromozomové sady (genomová mutace). Mutageneze je proces vzniku mutace. Mutagenizace je vystavení živé soustavy účinkům mutagenu. Mutagen je chemická látka nebo fyzikální faktor vyvolávající mutaci. Mezi mutageny vyskytující se v přírodě patří např. aflatoxiny produkované toxigenními kmeny plísně Aspergillus flavus ( Mutanta, mutant je organismus nesoucí mutantní alelu. Alela standardní je varianta genu (čili alela) početně převládající v přirozené populaci. Alela mutantní je varianta genu vzniklá ze standardní alely mutací. 5.8 Genové mutace Určete, jaké následky způsobí následující genové mutace ve stavbě a funkci nově syntetizované bílkoviny (jsou uvedeny triplety v kódujícím vlákně DNA): a) mutace tripletu TGT AGT b) mutace tripletu CTG CTA c) mutace tripletu GTG CTG d) mutace tripletu GTG GAG e) mutace tripletu CTG CGG Uvedené triplety přepište na kodóny v mrna a podle tabulky genetického kódu k nim přiřaďte odpovídající aminokyseliny. Následky a) záměnou aminokyseliny se ztrácí možnost tvorby S-S můstku (odůvodněte) b) jedná se o tichou mutaci vysvětlete. c) jedná se o záměnu dvou neutrálních aminokyselin. d) záměna neutrální za kyselou aminokyselinu. e) záměna neutrální za bazickou aminokyselinu. Otázka Jak mohou uvedené změny ovlivnit stavbu a funkci bílkoviny a proč? 19 v

20 5.9 Mechanismus účinku chemomutagenu a) 5-bromuracil (BU) je analogem thyminu. Je-li přidán k buňkám, u nichž probíhá replikace, začleňuje se do DNA a nahrazuje thymin, takže páry bází A-T jsou zaměněny za A-BU. BU v normální laktamové formě (párující se s adeninem) se vzácně spontánně mění v laktimovou formu BU +, párující se s guaninem. Znázorněte schématem, jakou mutaci BU + vyvolává. Odůvodněte, proč je mutační účinek závislý na replikaci. b) Aminopurin (AP) se páruje normálně s thyminem, ale ve své iminoformě AP + se váže s cytosinem. Znázorněte schematicky, jakou změnu AP + vyvolává Hemoglobin srpkovité anémie Hemoglobin srpkovité anémie u člověka se vyznačuje tím, že oproti hemoglobinu normálnímu má na šesté pozici beta globinového řetězce místo glutamové kyseliny valin (viz sekvenci v úkolu 5.7). Tripletem v mrna pro glutamovou kyselinu je GAG, pro valin GUG. Určete odpovídající kodóny (triplety) na úrovni obou vláken DNA. Jak lze vysvětlit vznik této choroby a proč je dědičná? 5.11 Patologický hemoglobin HbC U pacienta byl zjištěn výskyt abnormálního hemoglobinu HbC. Tento se od normálního hemoglobinu liší tím, že má na šesté pozici svého beta globinového řetězce glutamovou kyselinu nahrazenu lysinem (srovnej sekvenci v úkolu 5.7). Předpokládejme, že zařazení glutamové kyseliny určuje na úrovni mrna triplet GAG, zařazení lyzinu triplet AAG. Určete odpovídající triplety na úrovni DNA (na obou vláknech). Na které úrovni proběhla původní mutace v mrna nebo v DNA? Jaká mutace by mohla způsobit opět syntézu normálního hemoglobinu a vyléčit tuto hemoglobinopatii na genové úrovni? Co soudíte o reálnosti takové možnosti? 5.12 Posunová mutace Úsek DNA v určitém genu kóduje část bílkoviny, která je složena ze 7 aminokyselin: část proteinu: cys arg phe gly pro val asn úsek DNA (nekódující vlákno): ACG GCA AAA CCA GGA CAT TTA Mutací při replikaci vypadla 3. báze v tripletu pro cystein (G). Jaký následek bude mít tato mutace? Napište nové (posunuté) triplety v DNA. Vyjádřete jim odpovídající transkripty v mrna. Přiřaďte k nim odpovídající aminokyseliny podle tabulky genetického kódu. Porovnejte sekvenci aminokyselin se sekvencí původní, uvedenou v zadání úkolu. Vysvětlete, co způsobila delece jednoho nukleotidu. Co by způsobila adice nukleotidu? Co způsobí delece (adice) dvou nebo tří nukleotidů? 5.13 Spontánní mutace v kultuře bakterií Kultura získaná kultivací hnisu obsahuje mnoho miliard bakterií citlivých k penicilínu. Jak byste dokázali, že jsou mezi nimi také bakterie k penicilínu rezistentní? Bylo by možné zjistit jejich počet v určitém objemu bakteriální kultury? 20 v