Transformace chlorbenzoových kyselin rostlinnými buňkami

Transkript

1 Transformace chlorbenzoových kyselin rostlinnými buňkami Blanka Vrchotová, Martina Macková, Jan Tříska, Tomáš Macek Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, Fakulta potravinářské a biochemické technologie, Ústav biochemie a mikrobiologie, Technická 3, Praha 6 Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, Flemingovo náměstí 2, Praha 6 Institut systémové biologie a ekologie AV ČR, Branišovská 5, 37 5 České Budějovice Inovativní sanační technologie ve výzkumu a praxi Ţďár nad Sázavou

2 Úvod Degradace chlorbenzoových kyselin Transformace chlorbenzoových kyselin rostlinnými buňkami kultivovanými in vitro Mikrobiální degradace chlorbenzoových kyselin Spolupráce rostlin a mikroorganizmů na degradaci chlorbenzoových kyselin

3 Herbicid Chlorbenzoové kyseliny Meziprodukt odbourávání některých léků, herbicidů a barviv Konečný produkt horní bakteriální dráhy odbourávání PCB chlorbenzoová kyselina PCB CH 2 5C-chlorovaná karboxylová kyselina

4 Degradace chlorbenzoových kyselin Mikrobiální - anaerobní - reduktivní dehalogenace - aerobní ortho meta para degradační dráha Fytoremediace

5 Mikrobiální anaerobní degradace 9-21 dní 2-CBA 2,6-CBA 2,5-CBA 2,4,6-CBA benzoová kyselina 3-CBA 3,5-CBA 3,4-CBA 2,3,5-CBA CBA - chlorbenzoová kyselina 4-CBA 2,4-CBA J. A. Field and R. Sierra-Alvarez: Microbial transformation of chlorinated benzoates: Reviews in Environmental Science and Biotechnology: Online first (28) DOI:1.17/s z

6 Mikrobiální aerobní degradace ortho degradační dráha 2-CBA NADH+H + O 2 NAD + HO CO 2 + H katechol meta degradační dráha HO NADH+H + NAD + O CO 2 2 O 2 3-CBA 3-chlorkatechol 2-chlormukonát para degradační dráha HSCoA COSCoA COSCoA O H O cis- dienlakton 4-CBA ATP ANP + PPi H - 2 O O 2 H HSCoA 4-chlorbenzoát-CoA 4-hydroxybenzoát-CoA 4-hydroxybenzoová 3,4-dihydroxybenzoová kyselina kyselina H 2 O

7 Fytoremediace Vzduch Rozpustná látka, metabolit nebo konjugát v roztoku Produkt nebo konjugát vázaný ve vakuole nebo buněčné stěně Uložení Konjugát vázaný nebo rozpuštěný Konjugace Metabolity v rostlinných tkáních Transformace Organické látky v xylému a v listech Fytodegradace Fytovolatilizace Rhizosféra tok xylémem Transport Organické kontaminanty a metabolity jejich degradace Příjem nebo transport Rhizodegradace exudáty, O 2, ţiviny Produkty, metabolity, CO 2 O. V. Singh, R.K.Jain: Phytoremediation of toxic aromatic pollutants from soil: Appl. Microbiol. Biotechnol. 63 (23)

8 Použité tkáňové kultury Tabák virţinský - amorfní kalus (Nicotiana tabacum) WSC 38 Lilek černý - hairy root (Solanum nigrum) SNC 9O Křen selský - embryogenní klon s výhonky (Armoracia rusticana) K 54

9 Sledování přeměny chlorbenzoových kyselin Zůstatek v médiu po 14 dnech kultivace [%] 2,4,6-triCBA 2,3,5-triCBA 3,5-diCBA 3,4-diCBA 2,6-diCBA 2,5-diCBA 2,4-diCBA 2,3-diCBA 4-CBA 3-CBA 2-CBA poč. konc. [mg/l] K 54 SNC 9O WSC K 54 - křen selský (Armoracia rusticana) WSC 38 - tabák virţinský (Nicotiana tabacum) SNC 9O - lilek černý (Solanum nigrum) CBA chlorbenzoová kyselina

10 Koncentrace 2-CBA [ug/gbiomasy] Koncentrace 2-CBA [mg/lmedia] Koncentrace 2,5-diCBA [ug/gbiomasy] Koncentrace 2,5-diCBA [mg/lmedia] koncentrace 2,3,5-triCBA [ug/gbiomasy] Koncentrace 2,3,5-triCBA [mg/lmedia] Koncentrace 2-CBA [ug/gbiomasy] Koncentrace 2-CBA [mg/lmedia] Koncentrace 2,5-diCBA [ug/gbiomasy] Koncentrace 2,5-diCBA [mg/lmedia Koncentrace 2,3,5-triCBA [ug/gbiomasy] Koncentrace 2,3,5-triCBA [mg/lmedia],3 Porovnání kinetiky transformace Křen selský (Armoracia rusticana),3 6 6,3 6,25 5,25 5,25 5,2 4,2 4,2 4,15 3,15 3,15 3,1 2,1 2,1 2,5 1,5 1, Den Den Den Lilek černý (Solanum nigrum),3 6,3 6,3 6,25 5,25 5,25 5,2 4,2 4,2 4,15 3,15 3,15 3,1 2,1 2,1 2,5 1,5 1,5 1, Den 2-CBA Den 2,5-di CBA Den 2,3,5-tri CBA biomasa vzorek kontrola medium vzorek kontrola

11 Identifikace degradačních produktů V mediu po kultivaci Solanum nigrum a Armoracia rusticana byly identifikovány methylestery 2,3-di a 2,4-dichlorbenzoové kyseliny V biomase po kultivaci Solanum nigrum s 2,5-dichlorbenzoovou kyselinou byl identifikován hydroxyderivát dichlorbenzoové kyseliny

12 Reakce s rostlinnými mikrosomy Izolace z biomasy lilku černého a křene selského Stanovení koncentrace cytochromu P45 metodou diferenčních spekter Stanovení celkové koncentrace bílkovin Měření aktivity CYP 1A1/2 Reakce mikrosomů s chlorbenzoovými kyselinami Úbytek 2,5-diCBA [%] Koncentrace 2,5-diCBA [mg/l] Koncentrace mikrosomálního proteinu [μg/ml] ,5 h 21 h 2,5 h 21 h 2,5 h 21 h

13 Izolace CBA degraderů Ze zeminy kontaminované PCB 3 mg/kg Delor 13 (Ţamberk) Izolovány kmeny A7, A8, A18 a A19 Identifikovány pomocí NEFERM testu A7, A8 Pseudomonas fluorescens A18 A19 Pseudomonas pseudoalcaligenes Pseudomonas stutzeri L. Pavlů, J. Vosáhlová, H. Klierová, M. Prouza, K. Demnerová and V. Brenner: Cheracterization of clorobenzoate degraders isolated from polychlorinated biphenyl-contaminated soil and sediment in the Czech Republic: Journal of Applied Microbiology 87 (1999)

14 Mikrobiální degradace CBA Počáteční koncentrace CBA 2 mg/l Zůstatek CBA po 5 denní kultivaci [%] A7 A8 A18 A19 2-CBA 3-CBA CBA ,3-diCBA 1 1 2,4-diCBA ,5-diCBA 2,6-diCBA ,4-diCBA ,5-diCBA ,3,5-triCBA ,4,6-triCBA CBA Chlorbenzoová kyselina A7, A8, A18, A19 Pseudomonas sp.

15 Porovnání rostlin a mikroorganismů Mikroorganismy Počáteční koncentrace 2 mg/l A7, A19-2-CBA; 2,3-diCBA; 2,5-diCBA A8, A18-2-CBA; 3-CBA; 2,3-diCBA; 2,5-diCBA Rostliny Počáteční koncentrace 2 mg/l Lilek - 2-CBA; 2,3-diCBA; 2,4-diCBA; 2,5-diCBA Křen - 2-CBA; 2,4-diCBA; 2,6-diCBA Tabák - ţádná metabolisace Počáteční koncentrace 5 mg/l Lilek + 3-CBA; 4-CBA; 2,3,5-triCBA Křen + 4-CBA; 2,3-diCBA; 2,5-diCBA; 2,3,5-triCBA; 2,4,6-triCBA

16 Spolupráce rostlin a mikroorganismů Zůstatek CBA [%] den 2 den 4 den 11 den 14 den SNC + 2,5-diCBA SNC + 2,5-diCBA + A SNC + 2,5-diCBA + A ,5-diCBA + A ,5-diCBA + A SNC + 3-CBA SNC + 3-CBA + A SNC + 3-CBA + A CBA + A CBA + A SNC + 2,3,5-triCBA SNC + 2,3,5-triCBA + A SNC + 2,3,5-triCBA + A ,3,5-triCBA + A ,3,5-triCBA + A CBA - chlorobenzoová kyselina SNC Lilek černý (Solanum nigrum) A7, A8 Pseudomonas sp.

17 Celkové počty mikroorganismů MO [cfu *1 5 ] SNC + 2,5-diCBA + A ,5-diCBA + A SNC + 2,5-diCBA + A ,5-diCBA + A8 4 2 SNC + 3-CBA + A CBA + A7 2 1 SNC + 3-CBA + A CBA + A SNC + 2,3,5-triCBA + A ,3,5-triCBA + A7 9 5 SNC + 2,3,5-triCBA + A ,3,5-triCBA + A Vypočítané kritérium pro ANOVA 51,83 25,59 2,13 1,98 8,3 S 95 % pravděpodobností lilek podporuje přeţití a mnoţení mikroorganosmů v označených případech CBA - chlorbenzoová kyselina SNC - Lilek černý (Solanum nigrum) A7, A8 - Pseudomonas sp. Analýza rozptylu (ANOVA) α =,5 F (1,16) = 4,5

18 Koncentrace CBA v biomase [µg/g suché biomasy ] SNC SNC + 2,5-diCBA SNC + 2,5-diCBA + A SNC + 2,5-diCBA + A SNC + 3-CBA SNC + 3-CBA + A SNC + 3-CBA + A SNC + 2,3,5-triCBA CBA - chlorbenzoová kyselina SNC Lilek černý (Solanum nigrum) A7, A8 Pseudomonas sp. SNC + 2,3,5-triCBA + A SNC + 2,3,5-triCBA + A

19 Závěr Rostlinné buňky jsou schopné metabolizovat CBA s různou účinností v závislosti na rostlinném druhu, koncentraci CBA počtu a poloze chlorů Ze zkoumaných druhů nejvyšší aktivitu prokázaly buňky lilku černého s mono a dicba Identifikovány - v médiu - methylester 2,3-diCBA a 2,4-diCBA - v biomase - hydroxyderivát dicba Křenové mikrosomy byly schopné katalyzovat přeměnu 2,5-diCBA Izolované bakt. kmeny degradovaly 2-; 3-; 2,3-di a 2,5-diCBA Kmeny A7 a A8 ve spolupráci s lilkem černým degradovaly 3- a 2,5-diCBA

20 Děkuji za pozornost Tato práce byla financována z grantů Centrum 1M611 a FRVŠ 1157/28, GAČR 23/6/563 a MŠM