Využití analýzy celkových buněčných proteinů pomocí SDS-PAGE při charakterizaci fluorescentních pseudomonád izolovaných ze speleotém

Transkript

1 Využití analýzy celkových buněčných proteinů pomocí SDS-PAGE při charakterizaci fluorescentních pseudomonád izolovaných ze speleotém Mgr. Marcel Kosina Česká sbírka mikroorganismů Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta Brno 2008

2 Cíle: Izolace bakterií z nickamínku Charakterizace izolovaných kmenů

3 Speleotémy = jeskynní výplně Nickamínek (syn. horní mléko, měsíční mléko, vápenné mléko, angl. moonmilk či rockmilk, něm. Mondmilch) Odlišná struktura od krápníků (nickamínek je měkký) Až 80% H2O, zbytek CaCO3

4

5 Rod Pseudomonas Kmen: Proteobacteria; Třída: Gammaproteobacteria; Řád: Pseudomonadales; Čeleď: Pseudomonadaceae Gram-negativní rovné či zakřivené pohyblivé tyčky; 0,5-1,0 x 1,5-5,0 μm Chemoorganotrofní aerobové Akumulace polyhydroxybutyrátu METABOLICKÁ VARIABILITA A GENETICKÁ PLASTICITA Ekologie: půda, voda, povrchu rostlin, rhizosféa; mohou být pagotenní pro rostliny, živočichy a houby

6 Rod Pseudomonas 177 druhů FLUORESCENTNÍ PSEUDOMONÁDY - > 30 zástupců - produkce fluorescentních pigmentů/sideroforů

7 Původ vzorků a izolované kmeny Jeskyně Moravského krasu: Horní v Chobotu 12 kmenů Císařská jeskyně 5 kmenů Kateřinská 13 kmenů Suchožlebská zazděná 20 kmenů Celkem: 50 fluorescentních pseudomonád

8 Izolace a charakterizace kmenů Izolace NWRI-agar, Macromonas medium (nutričně chudá média) + King B medium 10 C, aerobní kultivace Charakterizace Základní biochemické a fyziologické testy (>35) Analýza celkových buněčných proteinů SDS - PAGE

9 Analýza celkových buněčných proteinů SDS-PAGE Extrakce proteinů z bakteriálních buněk Příprava gelu Elektroforéza zisk proteinového profilu kmene Softwarové zpracování digitalizovaného gelu Vyhodnocení získaných dat porovnání s databází

10 Izolace proteinů z bakteriálních buněk Promytí buněk v PBS pufru Přidání izolačního pufru lyze buněk 4% SDS lyze buněk, denaturace proteinů Merkaptoethanol zrušení S-S můstků II., III., IV. struktura narušena C - denaturační působení SDS Centrifugace rozpustné proteiny uchovány při -20 až -70 C

11 Elektroforéza Diskontinuální vertikální elektroforéza cca 8h Koncentrační gel (stacking) Separační gel (resolving) 11 cm Vzorek - proteiny + BFM (bromfenolová modř, trasovací barvivo), správné naředění Referenční vzorek 4x Psychrobacter immobilis SDS proteiny mají jednotný záporný náboj, rozdělení pouze na základě Mr.

12 Psychrobacter immobilis Psychrobacter immobilis Psychrobacter immobilis Psychrobacter immobilis Marker Typický gel

13 Zpracování gelu a vyhodnocení dat Digitalizace gelu - scanner Software BioNumerics Normalizace gelu Zařazení proteinových profilů do databáze Sestavení DENDROGRAMU - použit Pearsonův koeficient, metoda UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean)

14 Výsledek analýzy gelů Dendrogram: Izolované + sbírkové kmeny (celkem 117 kmenů)

15 hlavních shluků (podobnost proteinových profilů)

16 Shluky obsahující izolované kmeny

17 Shluky 2, 3, 4: izoláty z jeskyně Suchožlebská zazděná a Kateřinská = SHODA S PŮVODEM VZORKŮ Shoda s biochemickými testy: + dekarboxylace lyzinu!!! - dekarboxylace argininu Shluk 4 denitrifikující pseudomonády

18 Shluk 5: Izolát P/SJ/8 ESL + (hydrolýza eskulinu atypický znak pro pseudomonády) Sbírkové kmeny Pseudomonas fluorescens některé ESL +!!! Shluk 8: Izolát SJ/8/1 redukce nitrátů + Sbírkové kmeny: Ps. fluorescens, Ps. gessardii, Ps. taetrolens, Ps. brenneri

19 Shluk 12: Izoláty z jeskyně Horní v Chobotu Sbírkové kmeny: Ps. veronii, Ps. fluorescens Redukce nitrátů Hydrolýza Tweenu 80 a želatiny -

20 Shluk 13: Izoláty z jeskyně Suchožlebská zazděná Redukce nitrátů Hydrolýza Tweenu 80 a želatiny +

21 Shluk 14: 2 izoláty z jeskyně Suchožlebská zazděná a Kateřinská Sbírkové kmeny: Ps. jessenii, Ps. fluorescens, Ps. koreensis, Ps. putida

22 Shluk 15: Izoláty z jeskyně Císařská Redukce nitrátů +

23 Závěr Metoda potvrdila souvislost/shodu s: původem vzorků: 1 místo odběru (jeskyně) = 1 shluk biochemickými profily izolátů: 1 shluk = 1 charakterisktický biochemický znak Pravděpodobná identifikace: SJ/8/1, P/SJ/8 Pseudomonas fluorescens P/SJ/3 Pseudomonas jessenii

24 Děkuji za pozornost Podpořeno: MSM