37 C hynou!!). protože v kul tur-e rostou jejich procy klické formy, fyziologicky odpovídající

Transkript

1 IZOLACE KLONU BIČ:ÍKOYCU Z ČELEDI TRYPANOSOMATIDAE NA AGAROYÝCHPLOTNÁCI-I Některé trypanosomy obratlovcú a většinu kinetoplastid z bezobratlých (Crithidia, Blastocrithidia. Lcptomona::; aj.) lze pěstov<1-t na plotnách krevního agaru. Protože jsou to organismy aerobní. 111.:ní jejich rlj!:>l inhibován vzdušným kyslíkem. Rostou na povrchu agaru v podobč kolonií viditcln)' ch pouhým okem a lze s nimi pracovat běžnou bakteriologickou technikou. J?ro pa::;úzovúní kultur je v~ak vhodnější použít dvojfázová nebo tekutá média ve zkumavkách (pohodlnčjší manipulace, menší riziko kontaminace). Kultivační média musí obsahovat hemin, ktcr)' je pro tyto bičíkovce nezbytným růstovým faktorem. V komplexních médiích je zpravidla zdrojem heminu krev. Pozor: kultury kinetoplastid včetně druhů izolovaných z l:lovčka a teplokravných obratlovců je třeba pěstovat při teplotě C (při 37 C hynou!!). protože v kul tur-e rostou jejich procy klické formy, fyziologicky odpovídající stádiím z bczohrall)'ch pl\.:našečl'l. Kultury na agarov)'ch plotnách v Petriho miskách se osvědčily pro izolaci klonů a pro různé testy z<dllžcn~ na lwdnocení kvantitativních výsevů (plating efficicncy). Ulwl: Izolovat klony Crithiůia sp. výsevem na agarové plotny Kultura: Crithidia sp. REF-1 (Diamond) Médium: SN13-9 agar (Diamond, Herman 1954) NaCl g Neopcptonc (Dili.:n) g agar g I-hO dcstil ml Autoklávoval ph I :20 oc 20 min.. poschlazení na C přidat 25 ml sterilní defibrinované krve (králičí nl ho I idsk0 ). dob k promíchat, rozplnit do sterilních Petriho misek a nechat utuhnout. Skladnvat v ledničce v dobře uzavřených sáčcích z PVC.

2 IZOLACE KLONU METODOU MEZNÍHO ŘEDĚNÍ (limiting dilution) Metoda mezního ředění na mikrotitračních destičkách je operativní a spolehlivá technika vhodná pro izolaci klonů prvoků i buněk tkáilových kultur. Silně zředěné inokulum v tekutém kultivačním médiu se rozplní do jamek mikrotitrační destičky (96 jamek o objemu 250 ul). Buňky rozptýlené v médiu se tak dostanou jen do několika jamek (optimálně 2-5), zatímco většina jamek bude naplněna čistým médiem. Je přitom velmi pravděpodobné, že naočkované jamky budou obsahovat jen jedinou builku. Po vhodné inkubaci vyočkujeme klonové kultury z pozitivních jamek do média ve zkumavkách a pro zajištění klonové čistoty opakujeme izolační proceduru ( 1-2x). Optimální ředění in o kula pro izolaci klonu se může lišit u různých druhů prvoků i u různých kmenů téhož druhu. Ředění je proto třeba upravit podle "klonotvorné efektivnosti" (CFE, clone forming efficiency) dané populace. Pro stanovení CFE ředíme inokulum tak, aby bylo možno předpokládat, že všechny jamky budou naočkovány jednou buňkou (cca 100 buněk na destičku). počet pozitivních jamek CFE X 100 početnaočkovanýchjamek Úkol: Izolovat klony Trichomonas vaginalis metodou mezního ředění. Kultura: Axenická, Trichomonas vaginalis kmen TV Tl nebo TV Médium: Diamond TYM ph % koňského séra +antibiotika: penicilin 1000 I.U./ml streptomycin 500 ug/ml Další potřeby: Sterilní mikrotitrační destičky typu T Uamky s rovným dnem) Sterilní víčka na destičky Osmikanálová pipeta Anaerostat s vyvíječem plynů a indikátorem

3 Pracovní postup 1. Kulturu trichomonád v logaritmické fázi růstu spočítat v Biirkerově komůrce, upravit koncentraci sterilním médiem TYM ph 6.2 s antibiotiky na 5x 10 4 buněk/ml a dále ředit ve zkumavkách desítkovou řadou až do konečné koncentrace 5 buněk/ml. 2. Sterilní pipetou přenést 1 ml posledního ředění (tj. 5 buněk) do falkonky s 24 ml média TYM a dobře promíchat. 3. Pomocí osmikanálové pipety naplnit touto ředěnou suspensí sterilní mikrotitrační destičku (typ T, 250 )ll na jamku, tzn. pipetovat 2 x 125 )ll na jamku). 4. Poklopit destičku víčkem, označit a uložit do anaerobní nádoby s vyvíječem anaerobní atmosféry. Kultivovat 3 dny při 3't>C. 5. Po pomnožení izolované kultury opakovat izolaci klonu (1-2x) pro zajištění klonové čistoty.

4 ~edit kuliuru (Ji!J 5 buněk 1 '"' a 250 fl~o v.i d. ja"'..ac. ~ míchat --.. ' 1 l. 3 lt.. S' ' f., 'I 10 '\1 11. Aooooooooooo! cooooooooooo Dooooooooooo E O O O 0 O. O O 0 0 O O ~ o o o o o o o o o 00 Gooooooo oooo HOOOOOOOOOOO Anaerobní inkubace. 31 c_ 3 dru.f + i'olovat klon'i z. po2it.ivnich jamc.k

5 Izolace klonů zřcd'ovací metodou Kultura: Tetrahymena pyriformis Var. I, Mating type IV- axenická Médium: Peptonová voda: 2% Proteose pepton, Difco v destilované vodě +antibiotika: penicilin 1000 U/ml : amikacin 250 U/ml Úkol: Izolovat klony T. pyriformis zřeď ovací metodou a vypěstovat klonové kultury. 1) Půlená krycí sklíčka narovnat ve 2 řadách na podložní sklo tak, aby okraje sklíček mírně přesahovaly. Uložit do Petriho misky a sterilizovat horkým vzduchem. 2) Do 4 sterilních zkumavek napipetovat po 1 ml média. 3) Do prvé zkumavky sterilně přidat 0,1 ml kultury T. pyriformis, promíchat a přenést 0,1 ml do další zkumavky. Tímto způsobem pokračovat v sériovém ředění kultury až do poslední zkumavky. 4) Sterilní pastérkou nakapat vzorky jednotlivých ředění na podložní sklo. Zkontrolovat mikroskopicky a zvolit nejvhodnější ředění (cca 1 organismus v kapce). 5) Asepticky nakapat optimálně ředěnou kulturu na na krycí sklíčka v Petriho misce, vždy 1 malou kapku na 1 sklíčko. ' 6) Zkontrolovat pod mikroskopem. Sklíčko s kapkou, v níž je pouze jediný organismus,. přenést sterilní pinzetou do média. 7) Inkubovat při teplotě místnosti, pozorovat a zaprotokolovat růst klonu. '1, '

6 kul1urlf. Míkrosko pická J<ontrora {) o o o o iwlae-e. klohu